CN101302498A - 一种分枝杆菌噬菌体的保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种分枝杆菌噬菌体的保存方法，该方法采用半固体培养基扩增分枝杆菌噬菌体，过滤法收集噬菌体，采用无细胞耻垢分枝杆菌菌苗作为保护剂，真空冷冻干燥法后室温或4℃保存。该方法工艺简单，稳定性好，保存效果佳，所保存的噬菌体在作生物治疗时兼具免疫刺激作用。

Description

一种分枝杆菌噬菌体的保存方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域和微生物制品领域，具体涉及一种新的噬菌体保存方法。

背景技术

随着分子生物学技术的发展，噬菌体已广泛应用于疾病的诊断，并用于疾病治疗的研究。在耐多药结核病(MDR-TB)成为结核病第三次大流行的原因之一时，快速诊断结核病、快速药物敏感性试验和结核病的新疗法已成为当今研究热点。利用噬菌体生物扩增法(PhaB assay)以及荧光素酶报告噬菌体(Luciferasereporter phage)的方法快速检测结核菌和药物敏感性试验在最近得到开发，亦有人认为有必要将细菌的天敌——噬菌体作为治疗耐药细菌感染性疾病的手段。随着噬菌体技术用于疾病快速诊断以及噬菌体作为一种有希望治疗细菌感染性疾病的生物武器，尤其在耐多药结核菌不断增加的形势下，研究分枝杆菌噬菌体的扩增和保存方法十分重要。

发明内容

本发明提供了一种分枝杆菌噬菌体的新型保存方法，所述的方法是以无细胞耻垢分枝杆菌菌苗作为保护剂，真空冷冻干燥后保存。

将噬菌体采用真空冻干后4℃和室温保存后比较，总体上4℃优于室温；而采用不同保护剂时，保存效果相差较大，当采用噬菌体宿主菌破碎制成的无细胞耻垢分枝杆菌菌苗作为保护剂时，冻干后室温或4℃保存，28周内效价均只下降10¹，保存效果理想。同时，用无细胞耻垢分枝杆菌疫苗作为保护剂保存的分支杆菌噬菌体因含有无细胞耻垢分枝杆菌疫苗而具有良好的免疫刺激作用，利于分枝杆菌噬菌体对结核病的治疗。

附图说明

图1液体法用不同保护剂、保存温度对噬菌体效价的影响A→E分别代表不同保护剂：7H9(10％OADC)+30％甘油、7H9(10％OADC)+1mmol/LCaCl₂、7H9(10％OADC)+10％甘油+1mmol/LCaCl₂+0.05％叠氮化钠、SM、4％小牛血清白蛋白；1代表保存温度为4℃，2代表保存温度为-70℃。

图2冻干法用不同保护剂、保存温度对噬菌体效价的影响A→G分别代表不同保护剂：10％灭菌脱脂牛奶、7H9(10％OADC)+1mmol/L CaCl₂、4％小牛血清白蛋白、SM、7％无细胞耻垢分枝杆菌菌苗(MS)蛋白、3.5％MS蛋白、1.75％MS蛋白；1代表4℃保存，2代表室温保存。

图3无细胞耻垢分枝杆菌菌苗免疫小鼠的脾脏T淋巴细胞体外培养产生的IFN-γ(N.S指生理盐水对照组，M.S指耻垢分枝杆菌菌苗免疫组)

*：指脾脏T淋巴细胞体外以PPD刺激时，耻垢组与对照组比较p＜0.05

具体实施方式

到现在为止，已经给出了本发明的一般性描述。借助于下列实施例，参照特定的实施方案，以下给出更详细的说明，目的是为了更好地理解本发明的目的、特征、优点和操作方法。然而，无意于将本发明的范围限定在此范围内。在如下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1：分枝杆菌噬菌体的增殖和收集方法

本实施例详细说明了噬菌体的具体增殖和收集方式。

1.1增殖方式

分别采用单层和双层Dubos琼脂培养基，单层培养基与双层培养基的上层均含有10⁶PFU噬菌体和1mg耻垢分枝杆菌。37℃培养24、48h后，分别取上层培养基于研磨器中加9mlSM(镁盐液)液研磨，然后4℃4000rpm离心20min，上清再用0.2μm无菌滤器过滤，得到的噬菌体扩增液进行效价检测。

1.2.不同噬菌体/宿主菌比例对增殖效率的影响

采用琼脂双层法，培养基上层加不同比例的噬菌体(PFU)/宿主菌(CFU)：10⁵/10⁹、10⁵/5×10⁸、10⁵/10⁸、10⁶/10⁹、10⁵/5×10⁸、10⁵/10⁸、10⁷/10⁹、10⁷/5×10⁸、10⁷/10⁸、10⁸/10⁹。37℃培养48h后采用孵育-过滤法收集扩增的噬菌体，并进行效价检测。

1.3噬菌体的收集

孵育-过滤法：扩增平皿中加9ml SM液，37℃孵育1h后回收全部液体，用0.2μm无菌滤器过滤收集的液体，检测效价。

实施例2：分枝杆菌噬菌体的保存方法

本实施例详细说明了噬菌体的具体保存方法，包括不同保护剂、保存温度对分枝杆菌噬菌体稳定性的影响。

2.1保存工艺研究

将效价为10¹⁰PFU/ml的噬菌体分别用10％灭菌脱脂牛奶、含10％OADC的7H9(OADC，牛血清复合物)+1mmol/L CaCl₂、4％小牛血清白蛋白、SM、7％无细胞耻垢分枝杆菌菌苗(MS)蛋白、3.5％MS蛋白、1.75％MS蛋白等不同的液体保护剂进行10倍稀释，再分装于冷冻管中，分别保存于4℃、-70℃。真空冷冻干燥方法则是将效价为10¹⁰PFU/ml的噬菌体分别用不同的冻干保护剂进行10倍稀释，再分装于安瓶中，每支0.5ml。-30℃预冷过夜、真空干燥后封闭安瓶口。制备的冻干制品分别保存于4℃、室温(22℃～25℃)、37℃。分别在0、2、4、8、12、20、28周，采用双层琼脂法检测不同保藏方法保存的噬菌体的效价。

2.2不同保存方法对噬菌体稳定性的影响

采用不同保护剂分别在不同条件下进行液体保存与冻干保存，28周内的效价变化见图1和图2。

从图1可知，当噬菌体以液体形式4℃保存时，无论保护剂是什么，噬菌体的效价在28周内均未降低10¹数量级以上，稳定性好，操作方便，不需要特殊设备，如低温冰箱、冻干机等，-70℃保存效果不如4℃保存。

噬菌体真空干燥后37℃保存效果均较差(结果未列示)。从图2可以看出，噬菌体采用真空冻干后4℃、室温保存，总体上4℃优于室温；不同保护剂保存效果相差较大，当采用噬菌体的宿主菌破碎制成的无细胞耻垢分枝杆菌菌苗作为保护剂时，冻干后室温或4℃保存，28周内效价均只下降10¹，较为理想。

以上结果表明，所用噬菌体以液体4℃保存28周具有较好的稳定性，但冻干保存更适合于试剂盒中微生物的保存和运输。-70℃保存和真空冷冻干燥保存符合菌种的低温保藏原则，但保存噬菌体效果并不理想，对保护剂有较强的选择性。本研究发现采用一种以噬菌体宿主菌为主要成分的无细胞耻垢分枝杆菌菌苗作为冻干保护剂时，室温或4℃保存，噬菌体28周内均保持较好的稳定性。

实施例3：无细胞耻垢分枝杆菌菌苗的免疫刺激作用

以不同剂量的无细胞耻垢分枝杆菌菌苗免疫小鼠，同时以等体积的生理盐水注射另一组小鼠作为对照。末次免疫后1周，无菌取出脾脏淋巴细胞，调整细胞浓度分别为2.0×10⁶/ml，分装24孔板，每孔1ml，并添加100μlConA或PPD，37℃、5％CO₂全湿润培养72h后离心，取上清，-30℃保存。用小鼠IFN-γELISA试剂盒测定脾淋巴细胞培养上清中IFN-γ的含量。测定值经统计学处理，结果见图3。

此例结果说明无细胞耻垢分枝杆菌菌苗免疫小鼠IFN-γ的表达量，具有上调Th1类应答的免疫刺激作用，由此可以推测以无细胞耻垢分枝杆菌菌苗作保护剂的分支杆菌噬菌体具有较好的免疫刺激作用，利于其用于结核病的治疗。

Claims (6)

1、一种分枝杆菌噬菌体的保存方法，包括：以半固体培养方式培养噬菌体，离心过滤收集噬菌体，取无细胞耻垢分枝杆菌菌苗作为保护剂，真空冷冻干燥后保存。

2、根据权利要求1所述的方法，所述真空冷冻干燥保存包括下列步骤：向噬菌体液中加入蛋白浓度为3.5～7％的无细胞耻垢分枝杆菌菌苗，真空冷冻干燥后，在室温或4℃保存。

3、根据权利要求1所述的方法，其中过滤膜的孔径为0.2μm。

4、根据权利要求2所述的方法，其中所述的无细胞耻垢分枝杆菌菌苗的蛋白终浓度为3.5～7％。

5、一种根据权利要求1所述的保存方法制备的分枝杆菌噬菌体。

6、根据权利要求5所述的分枝杆菌噬菌体，具有无细胞耻垢分枝杆菌菌苗的免疫刺激作用。

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