RU2818959C1 - Штамм бактерии Pasteurella multocida "РМ - В" для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики пастереллеза (геморрагической септицемии) крупного рогатого скота, вызванного пастереллой серогруппы В - Google Patents
Штамм бактерии Pasteurella multocida "РМ - В" для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики пастереллеза (геморрагической септицемии) крупного рогатого скота, вызванного пастереллой серогруппы В Download PDFInfo
- Publication number
- RU2818959C1 RU2818959C1 RU2023128242A RU2023128242A RU2818959C1 RU 2818959 C1 RU2818959 C1 RU 2818959C1 RU 2023128242 A RU2023128242 A RU 2023128242A RU 2023128242 A RU2023128242 A RU 2023128242A RU 2818959 C1 RU2818959 C1 RU 2818959C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- multocida
- strain
- pasteurella
- pasteurellosis
- serogroup
- Prior art date
Links
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 title claims abstract description 104
- 206010034107 Pasteurella infections Diseases 0.000 title claims abstract description 32
- 201000005115 pasteurellosis Diseases 0.000 title claims abstract description 32
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 title claims abstract description 25
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 28
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 title claims description 23
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 title claims description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims description 14
- 208000032969 Hemorrhagic Septicemia Diseases 0.000 title claims description 13
- 208000014645 Pasteurella hemorrhagic septicemia Diseases 0.000 title claims description 13
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 claims description 3
- 244000037640 animal pathogen Species 0.000 claims description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 39
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 39
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 35
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 35
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 35
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 description 23
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 23
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 15
- 239000000463 material Substances 0.000 description 14
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 8
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 6
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 5
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 5
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 4
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 3
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000009304 pastoral farming Methods 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 229960002920 sorbitol Drugs 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 2
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 2
- 102000052812 Ornithine decarboxylases Human genes 0.000 description 2
- 108700005126 Ornithine decarboxylases Proteins 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 2
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 2
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 2
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 201000008283 Atrophic Rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 208000031462 Bovine Mastitis Diseases 0.000 description 1
- 206010006500 Brucellosis Diseases 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N Clavulanic acid Natural products OC(=O)C1C(=CCO)OC2CC(=O)N21 HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 208000032923 Lobar pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 108010048581 Lysine decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241001293418 Mannheimia haemolytica Species 0.000 description 1
- 208000005119 Necrotizing Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000606752 Pasteurellaceae Species 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 101000879212 Pseudomonas phage PAJU2 Structural protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 206010039088 Rhinitis atrophic Diseases 0.000 description 1
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 208000012873 acute gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical class [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 229960003324 clavulanic acid Drugs 0.000 description 1
- HZZVJAQRINQKSD-PBFISZAISA-N clavulanic acid Chemical compound OC(=O)[C@H]1C(=C/CO)/O[C@@H]2CC(=O)N21 HZZVJAQRINQKSD-PBFISZAISA-N 0.000 description 1
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 hydrogen ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 1
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 229960001855 mannitol Drugs 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 239000000123 paper Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 208000008423 pleurisy Diseases 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 208000005333 pulmonary edema Diseases 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000000601 reactogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000000859 sublimation Methods 0.000 description 1
- 230000008022 sublimation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940040944 tetracyclines Drugs 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 229960003487 xylose Drugs 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии. Предложен новый штамм бактерий Pasteurella multocida №492 –деп / 23-41 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Предложенный штамм по серогрупповой дифференциации относится к серогруппе В, является высоковирулентным, обладает антигенными и иммуногенными свойствами. Представленный штамм может быть использован для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики пастереллеза КРС. 2 табл., 7 пр.
Description
Изобретение относится к области ветеринарной бактериологии и биотехнологии, может быть использовано для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики пастереллеза (геморрагической септицемии) крупного рогатого скота, вызванного пастереллой серогруппы В.
Животноводство - стратегическая отрасль сельского хозяйства, обеспечивающая продовольственную независимость страны молочной и мясной продукцией [1]. Для стабильного развития животноводства необходимым является выполнение двух условий: во-первых, обеспечение сохранности и роста поголовья, во-вторых, обеспечение постоянного увеличения производимой продукции, ввиду увеличения потребителей и их потребностей. Сложность выполнения обоих условий заключается в необходимости предотвращения снижения продуктивности, массового падежа животных или вынужденного убоя в случаях развития эпизоотий. Среди всех инфекционных болезней в нашей стране на особом месте находится пастереллез как наиболее часто встречаемая инфекция разных видов сельскохозяйственных животных и птиц с обширной зоной распространения [2, 3, 4, 5].
Пастереллез - контагиозная болезнь большинства животных и птиц, вызываемая бактериями рода Pasteurella. Инфекция широко распространена во всем мире. При остром течении патологии наблюдаются септические процессы, крупозное воспаление легких, плевриты и отеки различной локализации. Подострое и хроническое течения болезни характеризуютсягнойно-некротизирующими пневмониями, поражением суставов, молочных желез, органов зрения и геморрагическим энтеритом [6].
Согласно «Руководству по диагностическим тестам и вакцинам для наземных животных» Международного эпизоотического бюро (МЭБ), существует три отдельных нозологических единицы, вызываемых Pasteurella multocida (P. multocida): геморрагическая септицемия крупного рогатого скота, атрофический ринит свиней и холера птиц [6]. По классификации МЭБ геморрагическая септицемия крупного рогатого скота включена в список В как менее опасное, но достаточно широко распространенное среди крупного рогатого скота, после лейкоза, туберкулеза, бруцеллеза инфекционное заболевание. Болезни списка В - контагиозные болезни, которые считаются опасными с социально-экономической и санитарной точек зрения. Занос возбудителей этих инфекций при международной торговле животными и продуктами животноводства может иметь крайне неблагоприятные последствия.
Возбудителем пастереллеза крупного рогатого скота (геморрагической септицемии) является бактерия вида P. multocida типов В и Е, при этом тип Е на территории России не встречается, но его циркуляция подтверждена в ряде зарубежных стран [7].
P. multocida представляет собой сферические, овальные или палочковидные клетки длиной 0,3-1,5 и шириной 0,15-0,25 мкм. При микроскопии мазков-отпечатков тканей животных, а также первичных культур, выделенных из патологического материала, пастереллы обычно имеют биполярное окрашивание, расположены одиночно, парно или в виде коротких цепочек [8].
На агаризированных питательных средах P. multocida формирует колонии трех типов: S, М, R. S форма имеет вид средних (1,0-2,0 мм), круглых, выпуклых полупрозрачных с гладкой поверхностью и ровными краями колоний, флюоресцирующих в косо проходящем свете. Колонии М формыболее крупные, слизистой консистенцией, с непрозрачным центром. R форма имеет вид шероховатых, не прозрачных колоний. На жидких питательных средах рост P. multocida характеризуется равномерным помутнением среды и выпадением слизистого осадка на дно емкости, который при встряхивании поднимается в виде косички [9].
В Российской Федерации наиболее распространены три типа пастерелл: А, В и D. Тип А чаше всего вызывает пастереллезную инфекцию птиц, кроликов и пушных зверей, а также способствует развитию подострого или хронического течения энзоотической пневмонии у телят и поросят; тип В вызывает геморрагическую септицемию крупного рогатого скота и диких жвачных животных; тип D - пастереллез свиней. Типы P. multocida Е и F на территории РФ не распространены, при этом являются возбудителями геморрагической септицемии крупного рогатого скота и диких жвачных животных в ряде зарубежных стран.
Источником возбудителя являются больные и переболевшие животные-носители, не проявляющие каких-либо клинических признаков. Длительность бактерионосительства достигает нескольких лет, в связи с чем такие животные доживают до репродуктивного возраста и в случае использования их в качестве родительского поголовья могут распространять заболевание. Для пастереллеза свойственно формирование стационарного эпизоотического очага [5].
Пастереллез может развиваться как самостоятельное заболевание, но при этом наличие вирусных и/или иных бактериальных инфекций, проходящих в сочетанном виде, отягощают течение инфекции [10, 11].
Развитие патогенеза инфекции подразумевает проникновение возбудителя в организм восприимчивого животного респираторным или алиментарным путем. В первую очередь слабовирулентные изоляты колонизируют миндалины, которые являются основной локализацией Р. multocida, маскируясь от воспалительных клеток, а также действуют какдополнительный барьер для внешних факторов. В таком виде микроорганизм может длительное время сохраняться в организме животных, не приводя к развитию видимых признаков патологий, но при этом само животное длительное время будет бактерионосителем. Вирулентные культуры после колонизации верхних дыхательных путей могут сразу проникать в кровь и лимфу вызывая септицемию и приводя к гибели животных в течение 12-36 часов после заражения. Скорость развития септицемии зависит от вирулентности возбудителя и комплекса факторов вирулентности, которыми он обладает [4].
Пастереллез КРС имеет четыре типа течения: сверхострое, острое, подострое, хроническое. Сверхострое течение характерно для септической формы заболевания, вызванного P.multocida серогруппы В. При проявлении данного течения наблюдается резкое повышение температуры тела до 42°С, нарушения сердечной деятельности, отек легких и острый гастроэнтерит. Гибель при сверхостром течении наступает в течение нескольких часов. Зачастую патологоанатомические изменения при данном течении пастереллеза отсутствуют, ввиду скорости наступления гибели животного.
Геморрагическая септицемия животных и птиц регистрируется во всех регионах Российской Федерации, в том числе на территории Восточной Сибири [3]. Болезнь поражает животных всех возрастных групп, при этом наиболее восприимчивым к заболеванию является молодняк до шести месячного возраста. Болезнь протекает, как правило, в виде энзоотий, летальность может достигать 75% [3, 8, 12, 13].
В настоящее время проведение традиционной профилактики и терапии осуществляется на основе использования химиотерапевтических средств. Однако повсеместное применение антибиотиков способствует появлению побочных явлений у людей и животных. Также установлено, что антимикробные препараты оказывают негативное влияние на иммунологическую реактивность организма, что может снижатьэффективность лечения. Кроме того, многие лекарства чрезвычайно дороги, и не нашли широкого применения в ветеринарной практике. Повсеместное и бессистемное использование большого количества препаратов, содержащих антибиотики, привело к тому, что образовались лекарственно устойчивые резистентные штаммы микроорганизмов [14, 15, 16].
На протяжении нескольких десятков лет в нашей стране ведутся работы по созданию новых, высокоэффективных лекарственных средств антимикробного и противовоспалительного действия, допустимых к использованию в условиях современных животноводческих ферм. Однако их эффективность не всегда достаточно высокая и большинство препаратов имеют длительный период выведения [15, 16, 17].
Возбудитель P. multocida серогруппы В обладает целым комплексом факторов вирулентности, к которым относят: полисахариды капсулы, эндотоксины, липополисахариды, белки внешней мембраны, фимбрии, адгезины, липаза и гиалуронидаза. Поэтому эффективность специфической профилактики определяется наличием комбинации данных факторов в антигенном составе входящих в вакцину компонентов.
Известен способ повышения вирулентности бактерий Pasteurella multocida [18]. Способ включает в себя заражение животных с последующим выделением возбудителя. В исследовании использовались штаммы пастерелл: Х-73 - эталонный штамм из коллекции Хеддлестоуна, №55, №115, №712, №915, №1931 - контрольно-производственные штаммы из коллекции ФГБУ «ВГНКИ».
Известен способ получения аттенуированных иммуногенных штаммов Pasteurella multocida [19]. Способ включает посев культур пастерелл на питательные среды содержащие стрептомицин с последующим культивированием, тем самым получая стрептомицин устойчивые культуры.
Известен способ биологической изоляции патогенных пастерелл для сохранения к моменту использования [20]. Способ включает в себя заражениеживотных с последующим выделением возбудителя из сердца павшего животного. Данный способ позволяет получать культуру S-формы. В исследовании использовались штаммы пастерелл: Х-73 - эталонный штамм из коллекции Хеддлестоуна, США, №55, №115, №712, №915, №1931 -контрольно-производственные штаммы из коллекции ФГБУ «ВГНКИ».
Известен способ стандартизации контрольно-производственного штамма бактерий Pasteurella multocida [21]. Способ описывает условия и алгоритм восстановления возбудителя пастереллеза птиц Pasteurella multocida А:1 серовара. Способ отличающийся тем, что штамм пастерелл в S- или М- форме клонируют и при допустимой оптимальной температуре 20-22°С окружающей среды последовательно пассируют путем внутримышечного, затем интраназального введения в восприимчивый организм. В исследовании использовались контрольно-производственные штаммы пастерелл из коллекции ФГБУ «ВГНКИ»: №712, №55, №115, №712, №915, №1931.
Известен способ выделения чистой культуры возбудителя пастереллеза Pasteurella multocida [22]. Описано вскрытие зараженной и павшей от пастереллеза птицы или кроликов массой, взятие пробы крови из сердца, внесение в стерильную воду при (20,0±1,0)°С в соотношении 1:9 по объему. Затем осадок встряхивают, переводят во взвесь, центрифугируют при 1500 об/мин 5 мин; надосадочную жидкость как изолят пастерелл из крови в разведении 10-1 разводят до 10-2, 10-3, высевают при (20,0±1,0)°С на питательный бульон и питательный агар, посевы культивируют 9-19 ч при (37,0±0,5)°С и 1 ч при (20,0±1,0)°С. Способ обеспечивает выделение чистой культуры P. multocida с высокой вирулентностью. В исследовании использовались штаммы пастерелл: Х-73 - эталонный штамм из коллекции Хеддлестоуна, США; контрольно-производственные штаммы №55, №115, №712, №915, №1931- из коллекции ФГБУ «ВГНКИ» и пять полевых изолятов, относящихся к серовару А:1, также контрольно-производственные штаммы №116, №656, №79- из коллекции ФГБУ «ВГНКИ», относящихся к серовару В.
Известна живая аттенуированная бактерия Pasteurella multocida, вакцина на ее основе, способ получения вакцины и применения этой бактерии для получения вакцины для защиты животных или человека [23]. Описано получение живой аттенуированной бактерии Pasteurella multocida модифицированной внесением мутации в ген Orf-15. Мутация представляет собой инсерцию и/или делецию в гене Orf-15, без нарушения иммунной реактивности штамма. В результате модификации бактерия не способна экспрессировать функциональный белок Orf-15, что приводит к ее аттенуации. В данном патенте не указан, какой именно штамм P. multocida подвергли мутации, однако для создания вакцины использовали свежие культуры штамма Р15.
Известен штамм Pasteurella multocida КМИЭВ-13-Х - штамм-антиген [24], выделенный в 1990 году в колхозе «Рассвет» Несвижского района Минской области из легочной ткани телят возрастом 1-1,5 месяцев. Штамм бактерий P. multocida 90-Д (КМИЭВ-13-Х) депонирован в коллекции РНИУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского Национальной академии наук Беларуси». Данный штамм относится к виду Pasteurella multocida серотипа Д.
Известен аттенуированный иммуногенный штамм Pasteurella multocida SMI, используемый для приготовления препарата живой вакцины против пастереллеза кур и индеек [25]. В данной заявке не описано какие именно штаммы P. multocida используются в данном изобретении.
Известна «Вакцина ассоциированная инактивированная гидроокисьалюминиевая против инфекционной пневмонии и сальмонеллеза свиней и способ ее изготовления» [26]. При изготовлении данной вакцины используют бактериальные массы из штаммов Haemophilus pleuropneumoniae серогрупп 1 и 2, стрептококков серогрупп С и R, и Pasteurella multocida серовариантов А №1231, В №681 и Д №Т-80.
В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие штамм микроорганизма Pasteurella multocida «РМ-В» аналогичное заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию «новизны».
Выделение штамма микроорганизма при пастереллезе в форме геморрагической септицемии, и использование его в качестве производственного штамма, способствующего формированию иммунитета к циркулирующим патогенам, вызывающих пастереллез, который оказывал бы положительный экономический эффект, является актуальным направлением и будет способствовать обеспечению страны безопасной продукцией, снижению применения антибактериальных препаратов в животноводстве и за счет этого выходом продукции на экспорт.
Техническая проблема заключается в расширении арсенала актуальных производственных штаммов вида Pasteurella multocida обладающих новыми биологическими характеристиками и пригодных для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики пастереллеза крупного рогатого скота.
Указанная проблема решена путем получения штамма Pasteurella multocida «РМ-В», который может использоваться для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики пастереллеза в форме геморрагической септицемии.
Технический результат достигается использованием штамма Pasteurella multocida «РМ-В» серогруппы В для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики пастереллеза крупного рогатого скота, путем получения высоко иммуногенных вакцинных препаратов.
Изолят P. multocida серогруппы В, послуживший источником для получения штамма Pasteurella multocida «РМ-В», был выделен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2021 г. при проведении бактериологических исследований проб патологического материала от крупного рогатого скота.
Штамм P. multocida «РМ-В» депонирован во Всероссийскую государственную коллекцию экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №492 - деп/23-41 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Экспериментально подтверждена возможность использования штамма P. multocida «РМ-В» для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики, экспериментально показана выработка антител на введение моновакцины, изготовленной из антигена данного штамма, лабораторным животным.
Штамм P. multocida «РМ-В» характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологическая характеристика
Штамм P. multocida «РМ-В» относится к семейству Pasteurellaceae, роду Pasteurella, виду P. multocida, серогруппы В, обладает морфологическими признаками, характерными для бактерий рода Pasteurella.
При микроскопии P. multocida представляет собой полиморфные, короткие грамотрицательные, неподвижные эллипсовидные палочки, располагающиеся изолированно, парами или реже цепочками, спор не образуют; являются аэробами или факультативными анаэробы. При окраске мазка по методу Гинса обнаруживают отчетливую, хорошо выраженную капсулу.
На агаризированных питательных средах P. multocida формирует колонии трех типов: S, М, R. S форма имеет вид средних (1,0-2,0 мм), круглых, выпуклых полупрозрачных с гладкой поверхностью и ровными краями колоний, флюоресцирующих в косо проходящем свете. Колонии М формы более крупные, слизистой консистенцией, с непрозрачным центром. R форма имеет вид шероховатых, не прозрачных колоний.
На жидких питательных средах рост P. multocida характеризуется равномерным помутнением среды и выпадением слизистого осадка на дно емкости, который при встряхивании поднимается в виде косички.
Кулътуралъные свойства - неподвижный факультативный анаэроб, оптимальная температура роста (37,0±0,5)°С;
На агаризированных питательных средах P. multocida «РМ-В» формирует:
- на сердечно-мозговом агаре (СМА) с добавлением 5% сыворотки крови лошади имеют вид полупрозрачных колоний с ровными, округлыми краями достигающих до 3 мм в диаметре;
- на кровяном агаре образует круглые полупрозрачные с сероватым оттенком колонии, без зоны гемолиза;
На жидкой среде:
- на сывороточном сердечно-мозговом бульоне (СМБ) - характеризуется равномерным помутнением среды с выпадением слизистого осадка, который при встряхивании поднимается в виде косички.
Бактерии рода Pasteurella обладают зависимостью от наличия сыворотки крови лошади в питательной среде. Без сыворотки отмечен слабый рост на поверхности агаровой среды в виде напыления, видимый только при рассмотрении под лупой. Общепринятыми средами для выращивания пастерелл являются сывороточный СМА, СМБ, мясо-пептоный бульон (МПБ), мясо-пептоный агар (МПА), агар или бульон по Хоттингеру (рН 7,2-7,8).
Хорошо сохраняется при условии лиофильного высушивания с сахарозо-желатиновой средой, а также при быстром замораживании и хранении при минус 40°С.
Ферментативные свойства
При посеве на среды Гисса P. multocida «РМ-В» проявляет следующие биохимические свойства, представленные в таблице 1, в которой показано: не обладает каталазной и оксидазной активностями; разжижает желатин; ферментирует глюкозу, сорбит, сахарозу, маннит, D-сорбитол, инозит, ксилозу; не ферментирует лактозу, рафинозу и дульцид; отмечено наличие орнитиндекарбоксилазы.
Антигенные свойства
Стимулирует образование в сыворотке крови типоспецифичных антител, обладающих защитным действием против пастереллеза, выявляемых в реакции агглютинации (РА) и иммуноферментным анализом (ИФА) (табл. 2).
Биотехнологические свойства
Оптимальными условиями культивирования штамма P. multocida «РМ-В» являются следующие:
- чашки Петри с питательными средами: сывороточный СМА, кровяной СМА; посевы инкубируют в течение 24 ч при температуре (37,0±0,5)°С;
- флаконы с жидкой питательной средой (сывороточный СМБ); посев инкубируют при температуре (37,0±0,5)°С в течение 18-24 ч.
Чистоту культуры проверяют методом световой микроскопии мазков, окрашенных по Граму.
По завершении культивирования агаровую культуру штамма P. multocida «РМ-В» смывают стерильным физиологическим раствором в объеме 5,0 см3 на одну чашку, определяют концентрацию бактериальной суспензии по оптическому стандарту мутности. По результатам визуальной стандартизации доводят концентрацию исходной бактериальной суспензии до 109 м.к./см3.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм P. multocida «РМ-В» чувствителен к амоксициллину, амоксициллину с клавулановой кислотой, цефалоспоринам, аминогликозидам, тетрациклинам.
Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.
Антигенная активность - штамм в составе инактивированной вакцины индуцирует в организме животного образование специфических антител.
Реактогенность - реактогенными свойствами в составе инактивированной вакцины не обладает.Иммунизация кроликов в удвоенной терапевтической дозе вакцины, в соответствии с ГОСТ 31926, не вызывает местной-раздражительной и воспалительной реакций после инъекции.
Патогенные свойства - штамм P. multocida «РМ-В» патогенен для белых мышей.
Вирулентность - высоковирулентен.
Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами - штамм бактерий P. multocida «РМ-В» не контаминирован другими бактериями, грибами, микоплазмами.
Условия хранения.
При хранении штамма в нативном состоянии при температуре минус (70±5)°С допустимая длительность хранения без освежения составляет 12 мес, а при хранении в лиофилизированном состоянии при той же температуре - 5 лет.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Культивирование штамма бактерий P. multocida «РМ-В», с целью получение инактивированного антигена данного штамма
Для культивирования P. multocida «РМ-В» использовали питательную среду СМБ с добавлением 5% сыворотки крови лошади.
Для получения бактериальной массы был использован ферментер «Biotron LiFlus GX», оснащенный системами регистрации и регулирования основных параметров культивирования: температуры, концентрации водородных ионов, скорости вращения мешалки и расхода кислорода дляаэрации. Объем питательной среды в аппарате составлял 7,0 л с добавлением сыворотки крови лошади в количестве 0,35 л. Культивирование проводили в течение 24 часов при температуре (37,0±0,5)°С с постоянной подачей кислорода в количестве 1 л/ч.
Через 24 ч культивирования в бактериальную суспензию добавляли 0,2% формалина по объему. Инактивацию проводили 24 часа при непрерывном перемешивании 100 об/мин и поддержании температуры в диапазоне (37,0±0,5)°С.
Для определения полноты инактивации через 24 часа после внесения формалина бактериальную суспензию высевали «газоном» в количестве 1,0 см3 на чашку Петри с сывороточным СМА. Инкубацию чашек Петри проводили в течение 48 часов при температуре (37,0±0,5)°С в условиях обычной атмосферы. При просмотре чашек Петри рост культур бактерий Р. multocida отсутствовал, что характеризовало положительное проведение инактивации.
Таким образом, получен инактивированный антиген штамма бактерий P. multocida «РМ-В», пригодный для изготовления биопрепарата для специфической профилактики пастереллеза крупного рогатого скота.
Пример 2. Определение патогенных свойств штамма P. multocida «РМ-В» проводили на белых мышах и естественно-восприимчивых животных (КРС)
Для заражения были использованы 18-20 часовые бульонные культуры штамма P. multocida «РМ-В», выращенной на сывороточном СМБ.
Для заражения использовали 20 белых мышей массой 14-18 гр., которых разделили на 2 группы (10 голов на заражение+10 голов контрольная группа). Суточную бульонную культуру штамма P. multocida «РМ-В» вводили животным опытной группы подкожно в объеме 0,2 см3. Наблюдение за подопытными животными вели в течение 5 сут. Культуру признают патогенной при гибели через 24-72 ч половины животных в опытной группе.
Для подтверждения специфической гибели белых мышей делали посевы на сывороточный СМА образцов спинного мозга, крови, сердце, печени и селезенки от павших мышей.
В опыте с целевыми животными использовали 4 головы КРС массой 250-300 кг, опытная группа - 2 головы на заражение и 2 головы контрольной группы. Из суточной культуры P. multocida «РМ-В» методом центрифугирования получали осадок, который разбавляли в изотоническом фосфатно-буферном растворе до концентрации 500 млн микробных клеток в 1,0 см3. Животным опытной группы заражающую дозу вводили внутривенно в объеме 0,2 см3. Наблюдение за подопытными животными вели в течение 5 сут. Культуру признают патогенной при гибели через 24-72 ч всех животных в опытной группе. Для подтверждения специфической гибели животных делали посевы на сывороточный СМА образцов крови.
В ходе установления специфичности гибели при проведении бактериологического исследования проб от всех павших животных была выделена чистая культура штамма P. multocida «РМ-В».
Штамм P. multocida «РМ-В» патогенен для белых мышей. Вирулентность штамма P. multocida «РМ-В» - высокая. Летальность составила в группе 100% в течение 24 ч.
Штамм P. multocida «РМ-В» патогенен для КРС. Вирулентность штамма P. multocida «РМ-В» - высокая, летальность составила в группе 100% в течение 36 ч.
Пример 3. Определение стабильности штамма P. multocida «РМ-В» при хранении
Для получения бактериальной массы, штамм P. multocida «РМ-В» высевали на чашки Петри с сывороточным СМА. Посевы инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С в течение 24 ч. По завершению инкубирования агаровую культуру смывали стерильной сахарозо-желатозной средой (стабилизирующая среда) в объеме 5,0 см3 на одну чашку. Определяликонцентрацию бактериальной суспензии по стандартному образцу мутности бактерийных взвесей «ОРМЕТ». По результатам визуальной стандартизации доводили концентрацию исходной бактериальной суспензии до 109 м.к./см3.
Бактериальную суспензию фасовали по 0,5 см3 в ампулы соответствующей вместимости.
Процесс лиофилизации после внесения стабилизаторов сушки включает стадии замораживания, высушивания, досушивания и запаивания ампул.
Замораживание: бактериальную суспензию перед лиофилизацией промораживали. Для этого устанавливали три датчика контроля температуры материала в процессе сушки. При достижении температуры в материале минус (60,0±1,0)°С его выдерживали при внешней температуре не выше минус (70,0±1,0)°С в течение 24 ч, после чего процесс замораживания бактериальной суспензии считали законченным. Холодильную камеру сублиматора перед постановкой кассет с замороженным материалом дезинфицировали 70%-ным этиловым спиртом и охлаждали до температуры не выше минус (50,0±1,0)°С.
Высушивание: замороженный материал незамедлительно перегружали в камеру сублиматора. Сублимационная установка перед загрузкой должна находиться в режиме:
- температура полок - минус (50,0±1,0)°С;
- температура конденсора - минус (60,0±1,0)°С;
- вакуум-насос - в рабочем состоянии, отключен.
После загрузки камеры подключали вмороженные в материал датчики контроля температуры, камеру герметизировали и вакуумировали до остаточного давления 80-90 мм рт. ст., проводили процесс высушивания согласно установленному режиму: температура конденсора - минус 50-80°С, вакуум в камере - 80-90 мм рт. ст., время сушки - до 48 ч.
Досушивание проводили при температуре материала 24-27°С в течение 12-16 ч. Давление в камере не должно быть выше 90 мм рт. ст. Общее время сушки с досушиванием составляет 60-64 ч.
Запаивание ампул: после завершения процесса сублимационного высушивания камеру сублиматора через стерилизующий фильтр заполняли стерильным воздухом, открывали и ампулы с материалом быстро перекладывали в эксикатор с осушенным силикагелем. Ампулы с материалом запаивали незамедлительно в день разгрузки в условиях стерильного бокса.
Датой изготовления лиофилизированной бактериальной культуры штамма P. multocida «РМ-В», считали дату проведения пассажа на питательной среде перед смывом культуры.
Штамм P. multocida «РМ-В» хранят в лиофилизированном виде в запаянных ампулах, упакованных в коробки из картона и металлические контейнеры, при температуре минус (40,0-70,0)°С.Срок хранения штамма P. multocida «РМ-В» с даты лиофилизации - 5 лет.
При хранении (по истечении 6 мес.) проводили вскрытие 5 ампул с лиофилизированной культурой штамма P. multocida «РМ-В» и определяли физико-химические и биологические показатели штамма. Все показатели соответствовали требуемым нормам, т.е. штамм при хранении в течение 6 мес.не изменил свои свойства.
Пример 4. Определение биохимических свойств штамма P. multocida «РМ-В»
Биохимические свойства штамма P. multocida «РМ-В» (предлагаемое изобретение) определяли с помощью набора API 20Е (BioMerieux) для идентификации Enterobacteriaceae и других неприхотливых грамотрицательных палочек по ферментации Сахаров: глюкозы, сахарозы, маннита, сорбита; газообразованию индола; продукции каталазы, орнитиндекарбоксилазы, отсутствию продукции: уреазы, лизиндекарбоксилазы, аргининдегидролазы, β-галактозидазы.
В контейнер для инкубации (поднос и крышку) вносят 5 см3 очищенной воды для создания влажной атмосферы. Помещали в контейнер для инкубации стрип.В пробирку, содержащую 5 см3 стерильного физиологическогораствора с помощью бактериологической петли вносили 2-3 изолированных колонии предлагаемого штамма P. multocida «РМ-В» и тщательно растирали в пробирке. Пипеткой распределяли суспензию по лункам стрипа, избегая образования пузырьков. Поднос накрывали крышкой и инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С в течение 18-24 ч.
Продукцию каталазы определяли в тесте с 3%-ным раствором перекиси водорода.
Биохимические свойства штамма представлены в таблице 1, соответствуют свойствам описанным в определителе Берджи - штамм бактерий P. multocida «РМ-В» относится к виду P. multocida, роду Pasteurella.
Пример 5. Проведение генетической идентификации и определение серогрупповой принадлежности штамма P. multocida «РМ-В»
Генетическую идентификацию штамма P. multocida «РМ-В» проводят с использованием «Методики выявления P. multocida и определения типа капсульного антигена бактерии с использованием полимеразной цепной реакции» [27]. Размер ампликона для P. multocida серогруппы В должен составлять 540 пар нуклеотидов (п. н.).
Отбирали отдельные колонии штамма P. multocida «РМ-В» с питательной среды из которых проводили выделение ДНК с использованием 6М гуанидинтиоцианата и стекловолокнистых фильтров GF/F. Выделение ДНК проводили в стерильных условиях в отдельном помещении с использованием индивидуального комплекта пипеток.
Выделенную ДНК использовали для постановки ПЦР. Для проведения ПЦР в отдельной пробирке готовили общую реакционную смесь. Для ее изготовления реактивы вносили в количестве, приведенном ниже.
Деионизованная вода - 15,3 мкл.
Смесь праймеров - 1,0 мкл.
дНТФ - 1,0 мкл.
10×буфер для ПЦР - 2,5 мкл.
Taq ДНК-полимеразам - 0,2 мкл.
ДНК (ГПМ или РПМ) - 5,0 мкл.
Встряхивали пробирки на смесителе, все капли со стенок собирали центрифугированием в течение 5-10 с.
Сбор инкубационной смеси проводили в стерильных условиях в боксе для ПЦР с использованием индивидуального комплекта пипеток.
Переносили пробы в амплификатор и проводили ПЦР при следующих температурно-временных режимах: предварительная денатурация - 95°С в течение 2 мин., далее 35 циклов: денатурация - 95°С в течение 30 сек., отжиг праймеров - 55°С в течение 30 сек., элонгация цепи - 72°С в течение 40 сек., и один цикл заключительной элонгации - 72°С в течение 3 мин.
В каждой серии анализов ставили два контрольных образца: положительный контроль (с контрольной ДНК P. multocida), и отрицательный контроль (с деионизованной водой).
Анализ продуктов амплификации проводили методом электрофореза в 2% агарозном геле.
Электрофорез продуктов амплификации проводили следующим образом. Из пробирок с исследуемыми образцами после завершения амплификации отбирали по 5 мкл реакционной смеси, добавляли 3 мкл красителя (0,25% раствор бромфенолового синего в 50% глицерине), перемешивали наконечником для пипеточных дозаторов и вносили в лунки агарозного геля.
Электрофорез проводили при напряжении 15 В/см длины геля в течение 20 мин.
Результаты электрофореза учитывали на трансиллюминаторе в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Амплифицированные фрагменты ДНК выявляются в виде светящихся оранжевых полос.
Заключение о типе выявленной P. multocida делали по результатам мультиплексной ПЦР. Размер ампликона для серотипов Е, D, А, В и F составляет 243, 308, 405, 540 и 700 п. н. соответственно.
Амлифицированный фрагмент ДНК в исследуемых пробах располагался на уровне, соответствующем ампликону серотипа В (540 п. н.).
Пример 6. Определение антигенных свойств штамма P. multocida «РМ-В»
Полученный препарат антигена, как описано в примере 1, исследовали в РА микрометодом для выявления агглютинирующей активности антигена по ниже описанной методике.
Принцип реакции агглютинации на планшете микрометодом заключается в склеивании антиген-антитело и выпадении в осадок антигенов P. multocida под действием специфических антител (агглютининов) в специфической сыворотке крови кролика в присутствии солей электролитов, что визуально регистрируется образованием четко оформленного зонтика на дне лунки планшета. При отрицательной реакции агглютинации (отсутствие специфических антител в сыворотке крови) антиген оседает на дно в виде точки.
Использовали иммуноспецифические компоненты реакции:
- специфическая сыворотка крови кролика, двукратно иммунизированных антигеном P. multocida серогруппы В (положительный контроль);
- нормальная сыворотка крови кролика, не содержащая антител к P. multocida серогруппы В (отрицательный контроль);
- исследуемый антиген штамма P. multocida «РМ-В» (бактериальная суспензия, полученная методом культивирования в жидкой питательной среде, инактивированная формалином). Общую концентрацию микробных клеток в бактериальной суспензии определяли визуально по стандарту (эталону) мутности. Для постановки РА использовали инактивированныйантиген из штамма P. multocida «РМ-В» концентрацией микробных клеток 1×109 в см3.
Для постановки РА готовили двукратные разведения антигена от 1:2 до 1:4096. Для этого во все лунки планшета вносили фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБР) рН 7,2-7,4 - в объеме 0,05 см3. В первую лунку добавляли подготовленные пробы антигена штамма P. multocida «РМ-В» в объеме 0,05 см3, трехкратно пипетировали и переносили 0,05 см3 во вторую лунку и т.д. Из последней лунки после трехкратного пипетирования 0,05 см3 испытуемого материала удаляли в 2%-ый раствор едкого натрия или другой подобный дезинфектант.
Готовили рабочее разведение положительной и отрицательной контрольных сывороток (1:100) и вносили их во все лунки планшета с разведениями антигена в объеме 0,05 см3. Одновременно ставили контроли реакции:
- контроль антигена - в две лунки планшета вносили по 0,05 см3 ФСБР разведения антигена. Агглютинация антигена должна полностью отсутствовать;
- контроль сывороток на спонтанную агглютинацию - к 0,05 см3 контрольной сыворотки крови добавляли 0,05 см3 ФСБР. Спонтанная агглютинация сывороток крови должна отсутствовать.
Планшеты с компонентами реакции инкубировали в течение 18 часов при температуре (37±0,5)°С в статическом состоянии в шейкере-инкубаторе, затем выдерживали в бытовом холодильнике при температуре 4°С в течение 1 часа, после чего производили визуальный учет реакции.
Реакцию учитывали после полного оседания бактериальных клеток в лунках с контролем антигена.
Титром исследуемого антигена считали его наибольшее разведение, которое дает четкую видимую агглютинацию («зонтик»).
Результат реакции считали положительным, если в лунке наблюдали четко выраженную агглютинацию в виде «зонтика», с титром в РА≥1:16 (4 log2).
Результат считали отрицательным, если антиген оседал на дно лунки в виде точки («пуговки»), с титром в РА<1:16 (4 log2).
Для определения специфичности сыворотки ставили РА с антигенами Streptococcus agalactiae (S. agalactiae), Staphylococcus aureus (S. aureus).
Агглютинирующий титр бактериальной суспензии штамма бактерий P. multocida «РМ-В» составил 1:512 (9 log2).
Полученные препараты антигена, как описано выше, дополнительно исследовали в ИФА для определения титра антител при помощи «Набора для определения антител к Pasteurella multocida иммуноферментным методом», производства ФГБУ «ВНИИЗЖ» по ниже описанной методике.
Из комплекта набора брали планшет, сенсибилизированный антигеном бактерий вида P. multocida серогруппы В.
Для исследования в лунки первого и второго ряда планшета, за исключением лунок А1 и А2 вносили по 0,05 см3 рабочий буферный раствор для разведения проб.
В лунку Al, А2 вносили по 0,01 см3, предварительно разведенных положительного и отрицательного контролей.
Внесенные в лунки А1 и А2 контрольные сыворотки пипетировали трижды и переносили по 0,05 см3 полученного разведения в следующий ряд лунок (В1 и В2, С1 и С2 и тд.) с двукратным шагом, получая тем самым разведения сывороток от 1:100 до 1:12800.
Планшет, накрытый крышкой, инкубировали в термостате при температуре (37,0±1,0)°С в течение 60 минут.
По окончании инкубации лунки планшета освобождали от содержимого резким встряхиванием и трехкратно промывали приготовленным буфернымраствором в объеме по 0,30 см3 в каждую лунку. Затем жидкость окончательно удаляли, постукивая по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.
Во все используемые лунки планшета вносили по 0,05 см3 рабочего разведения конъюгата, планшет накрывали крышкой и инкубировали 60 минут при температуре (37,0±1,0)°С. По окончании инкубации повторяли процедуру промывки планшета.
Во все используемые лунки планшета вносили по 0,05 см3 субстрата, накрывали крышкой и выдерживали 10-15 минут в темном месте при температуре (21,0±5,0)°С.
Реакцию останавливали добавлением в каждую используемую лунку по 0,05 см3 ”стоп-раствора”.
Учет результатов ИФА проводили сразу после остановки реакции, используя спектрофотометр (ридер) с вертикальным лучом света при длине волны 405 нм.
Результаты теста считаются достоверными, если:
- значение оптической плотности контроля К1 в рабочем разведении не превышает 0,400 оптических единиц (о.е.).
- значение оптической плотности контроля К2 в рабочем разведении не ниже 0,600 о.е.
Для определения специфичности сыворотки ставили непрямой вариант ИФА с использованием «Набора для выявления антител к возбудителям мастита крупного рогатого скота (КРС) в сыворотках крови лабораторных животных в непрямом варианте иммуноферментного анализа» (планшеты с антигенами S. agalactiae, S. aureus).
Результаты ИФА показали, что титр антител в сыворотке крови кроликов находится в диапазоне 1:800-1:1600.
Пример 7. Получение экспериментальной модели вакцины на основе антигена штамма бактерий P. multocida «РМ-В»
В качестве антигена при изготовлении вакцины против пастереллеза в форме геморрагической септицемии КРС использовали бактериальную суспензию штамма P. multocida «РМ-В», полученный по примеру 1.
Для получения клеточного антигена из бактериальной суспензии использовали высокоскоростную проточную центрифугу BR 105BRLL, скорость подачи бактериальной суспензии составляла 1 л/час при вращении ротора 14000 об/мин. Общее время центрифугирования составило 15 мин. По окончанию работы ротор извлекали и перемещали в зону чистоты класса А.
Работу по стерильному извлечению бактериальной массы проводили в локальной чистой зоне 3W. Бактериальную массу снимали с внутренних стенок ротора центрифуги стерильным металлическим шпателем и погружали в стерильный стеклянный стакан. Предварительно в стакан был внесен стерильный фосфатно-солевой буферный раствор в объеме 0,05 л. После снятия всей бактериальной массы суспензию гомогенизировали в лабораторном гомогенизаторе Silverson L4R при комнатной температуре в течение 15 мин при частоте вращения мешалки 2500-2700 об/мин.
Полученную бактериальную суспензию фильтровали через стерильный многослойный марлевый фильтр в стерильную бутыль и определяли концентрацию клеток. При постоянном перемешивании бактериальную суспензию разбавляли стерильным фосфатно-буферным раствором до концентрации 1000 ОЕ/см3 (по стандартному образцу мутности бактерийных взвесей «ОРМЕТ»). Готовую суспензию клеточного антигена штамма бактерий P. multocida «РМ-В» до компоновки вакцины хранили в стеклянной бутыли под резиновой пробкой в комнате-рефрижераторе при температуре (4-8)°С. Перед перемещением на хранение антигены проверяли на стерильность в соответствии с ГФ XIV, т.1, стр. 1201-1222 (ОФС.1.2.4.0003.15).
Для создания экспериментальной серии препарата в количестве 1,0 тыс.доз было использовано:
- инактивированный антиген штамма бактерий P. multocida «РМ-В» - 0,01 дм3;
- стерильный физиологический раствор - 0,49 дм3;
- адъювант Montanide ISA 206 VG - 0,5 кг;
- тиомерсал - 0,002 дм3.
С целью получения эмульсионного препарата, специфический иммуностимулятор (антиген) соединяли со стерильным физиологическим раствором, заявленное выше количество антигена сопоставимо с 1×109 м.к./доза. Масло предварительно было перелито в бутыль. Данный адъювант не пригоден для автоклавирования, поэтому перед эмульгированием подвергался холодной стерилизации через капсульный фильтр (0,22 мкм). Все компоненты вакцины были нагреты до 35,0°С. Адъювант соединяли с антигеном при низких оборотах мешалки (250 об/мин) в течение 15 мин. Для получения стабильной эмульсии полуфабрикат вакцины охлаждали до 12°С и проводили повторное эмульгирование в течение 15 мин.
Данной вакциной было иммунизировано 5 кроликов внутримышечно прививной дозой 1,0 см3. У кроликов до иммунизации и через 21 день после вакцинации были отобраны пробы сыворотки крови. Данные сыворотки проверили на наличие антител к бактериям штамма P. multocida «РМ-В» в РА и ИФА. Результаты исследований представлены в таблице 2.
Установлено, что через 21 сутки после однократной иммунизации кроликов инактивированной цельной вакциной, изготовленной из штамма P. multocida «РМ-В» в сыворотке крови кроликов обнаружены антитела к P. multocida в диапазоне титров от 9,64 до 10,64. log2. Показано, что полученный штамм P. multocida «РМ-В» обладает антигенными свойствами, т.к. на введение вакцины, изготовленной из штамма бактерий P. multocida «РМ-В» проходит выработка специфических антител.
Таким образом, заявляемый штамм бактерий Pasteurella multocida «РМ-В» может быть использован для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики пастереллеза в форме геморрагической септицемии КРС.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Штамм бактерии Pasteurella multocida «РМ-В» для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики пастереллеза (геморрагической септицемии) крупного рогатого скота, вызванного пастереллой серогруппы В»:
1. Hendriksen, R.S. Prevalence of antimicrobial resistance among bacterial pathogens isolated from cattle in different European countries. / R.S. Hendriksen, D.J. Mevius, A. Schroeter et.al. // Acta Vet. Scand. - 2008.
2. Аблов, A.M. Пастереллез животных и птиц в Иркутской области / A.M. Аблов, А.С.Батомункуев, А.А. Плиска, Е.В. Анганова // Достижения науки и техники АПК. - 2013. - №9. - С. 68-69.
3. Вахрушева Т.И. Геморрагическая септицемия телят: патоморфологические аспекты / Вахрушева Т.И. // Проблемы современной аграрной науки, Материалы международной научной конференции. -Красноярск, 2020, с. 121-123.
4. Джупина СИ. Особенности профилактики пастереллеза и геморагической септицемии / Джупина СИ. // Ветеринарная патология, 2016, №1 (55), с. 5-11.
5. Kapustin, A.V. Pasteurellosis of cattle caused by Mannheimia haemolytica / A.V. Kapustin, A.I. Laishevtcev // Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences. 2016. - T. 52. - №4. - P. 3-12.
6. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. Paris, 2022.
7. Капустин A.B. Диагностика пастереллеза сельскохозяйственных животных, птиц и пушных зверей. // Методические указания, Москва.- 2016.
8. Ермагамбетова С.Е. Изучение биологических свойств производственных штаммов пастерелл / Ермагамбетова С.Е. и др. // В сборнике: Наука и образование: опыт, проблемы, перспективы развития. Материалы международной научно-практической конференции. Красноярск, 2021. С. 43-46.
9. Гадзевич Д.В. Культурально-морфологические и биохимические особенности пастерелл / Гадзевич Д.В. и др. // Ветеринарная медицина. 2011. №95. С. 95-97.
10. Ленченко Е.М. Этиологическая структура и дифференциальная диагностика бактериальных болезней телят./ Ленченко Е.М. и др. // Аграрная наука. 2017. №5. С. 27-30.
11. Сох A.J. Functional characterization of HgbB, a new haemoglobin binding protein of Pasterella multocida. / Cox A J. et.al. // Microbiology pathology, 2003, №34, p.287-296.
12. Красникова Е.Л. Чувствительность и специфичность MULTIPLEX ПЦР Pasteurella multocida А, В, D для выявления серовариантов пастерелл / Красникова Е.Л. и др. // Эпизоотология, иммунобиология, фармакология и санитария. 2018. №2. С. 53-58.
13. Полковниченко А.П. Особенности биологических свойств культур P. multocida, выделенных от животных в условиях Астраханской области / Полковниченко А.П. и др. // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. 2017. Т. 232. №4. С. 112-116.
14. Галка В.И. Резистентность бактерий к антибиотикам как одна из глобальных экологических проблем и некоторые пути ее решения / Галка В.И., Миськевич С.В. // Сборник: Всемирный день охраны окружающей среды. Материалы Международной научно-практической конференции. 2014. С. 20-26.
15. Гасанов A.M. Чувствительность микроорганизмов, выделенных при пастереллезной инфекции, к антибактериальным препаратам / Гасанов A.M. // Аграрная наука. 2019. №2. С. 20-21.
16. Патент RU 2 278 668 С1, от 08.12.2004.
17. Манжурина О.А. Комплексная терапия пастереллеза телят в условиях скотоводческого комплекса Белгородской области / Манжурина О.А., Калядина А.А. // Сборник: Теория и практика инновационных технологий в АПК. Материалы национальной научно-практической конференции. Воронеж, 2022. С. 144-146.
18. Патент RU 2123531 С1, от 15.06.1993.
19. Патент RU 2103355 С1, от 23.11.1995.
20. Патент RU 2286391 С2, от 19.07.2004.
21. Патент RU 2445367 С2, от 21.06.2010.
22. Патент RU 2717535 С1, от 27.03.2019.
23. Патент RU 2415 926С2, от 21.12.2005.
24. Патент BY 10966 С1, от 30.08.2008.
25. Заявка на изобретение RU №0095117747 А, от 10.10.1997.
26. Патент RU 2246316 С1, от 20.02.2005.
27. «Методика выявления P. multocida и определения типа капсульного антигена бактерии с использованием полимеразной цепной реакции» / Щербаков А.В., Тимина A.M., Яковлева А.С, Ковалишин В.Ф. // Владимир - 2005.
Claims (1)
- Штамм бактерий Pasteurella multocida «РМ - В», депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №492 - деп / 23-41 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики пастереллеза (геморрагической септицемии) крупного рогатого скота, вызванного пастереллой серогруппы В.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2818959C1 true RU2818959C1 (ru) | 2024-05-07 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2415926C2 (ru) * | 2004-12-22 | 2011-04-10 | Интервет Интернэшнл Б.В. | ЖИВАЯ АТТЕНУИРОВАННАЯ БАКТЕРИЯ Pasteurella multocida, ВАКЦИНА НА ЕЕ ОСНОВЕ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ И ПРИМЕНЕНИЯ ЭТОЙ БАКТЕРИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЖИВОТНЫХ ИЛИ ЧЕЛОВЕКА |
| RU2744744C1 (ru) * | 2020-04-17 | 2021-03-15 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук" (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) | Вакцина против манхеймиоза, биберштейниоза и пастереллёза крупного и мелкого рогатого скота ассоциированная инактивированная, способ её получения |
| RU2750865C1 (ru) * | 2020-04-09 | 2021-07-05 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук" (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) | Поливалентная инактивированная вакцина против риемереллёза, пастереллёза и сальмонеллёза индеек, уток и гусей, способ её получения |
| RU2763991C1 (ru) * | 2021-06-15 | 2022-01-12 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук" (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) | Вакцина против инфекционного атрофического ринита и пастереллеза свиней инактивированная, способ её получения |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2415926C2 (ru) * | 2004-12-22 | 2011-04-10 | Интервет Интернэшнл Б.В. | ЖИВАЯ АТТЕНУИРОВАННАЯ БАКТЕРИЯ Pasteurella multocida, ВАКЦИНА НА ЕЕ ОСНОВЕ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ И ПРИМЕНЕНИЯ ЭТОЙ БАКТЕРИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЖИВОТНЫХ ИЛИ ЧЕЛОВЕКА |
| RU2750865C1 (ru) * | 2020-04-09 | 2021-07-05 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук" (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) | Поливалентная инактивированная вакцина против риемереллёза, пастереллёза и сальмонеллёза индеек, уток и гусей, способ её получения |
| RU2744744C1 (ru) * | 2020-04-17 | 2021-03-15 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук" (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) | Вакцина против манхеймиоза, биберштейниоза и пастереллёза крупного и мелкого рогатого скота ассоциированная инактивированная, способ её получения |
| RU2763991C1 (ru) * | 2021-06-15 | 2022-01-12 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный научный центр - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук" (ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН) | Вакцина против инфекционного атрофического ринита и пастереллеза свиней инактивированная, способ её получения |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Thorley | A Simplified Method for the Isolation of Bacteroides nodusus from Ovine Foot‐rot and Studies on its Colony Morphology and Serology | |
| MacOwan | A mycoplasma from chronic caprine pleuropneumonia in Kenya | |
| Gutierrez et al. | Interrelationship between certain bacteria and the rumen ciliate Dasytricha ruminantium | |
| Rahman et al. | Development of experimental oil based inactivated HS vaccine from field Isolates of Pasteurella multocida from Cattle in Bangladesh | |
| RU2818959C1 (ru) | Штамм бактерии Pasteurella multocida "РМ - В" для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики пастереллеза (геморрагической септицемии) крупного рогатого скота, вызванного пастереллой серогруппы В | |
| CN115887631A (zh) | 一种副猪嗜血杆菌和猪链球菌二联疫苗 | |
| Šula | WHO Co-operative studies on a simple culture technique for the isolation of mycobacteria: 1. Preparation, lyophilization and reconstitution of a simple semi-synthetic concentrated liquid medium; culture technique; growth pattern of different mycobacteria | |
| Mussayeva et al. | Salmonella sheep abortion: Distribution, diagnosis, and control measures | |
| RU2388489C1 (ru) | Способ изготовления вакцины ассоциированной против псевдомоноза и энтерококковой инфекции нутрий | |
| RU2799603C1 (ru) | Штамм "SA-21" бактерии рода Streptococcus вида Streptococcus agalactiae для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики мастита коров | |
| RU2538158C1 (ru) | Способ изготовления вакцины, ассоциированной против эшерихиоза, стрептококкоза и стафилококкоза крупного рогатого скота | |
| RU2818361C1 (ru) | Штамм бактерий Streptococcus dysgalactiae для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики мастита коров | |
| RU2820305C1 (ru) | Штамм "SAU-21Л" бактерий Staphylococcus aureus для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики мастита коров | |
| RU2316345C1 (ru) | Способ изготовления вакцины ассоциированной против колибактериоза, сальмонеллеза, стрептококкоза и энтерококковой инфекции нутрий | |
| Corbel | Microbiological aspects | |
| RU2787392C1 (ru) | Штамм бактерий gallibacterium anatis, предназначенный для получения моно- и поливалентных иммуногенных композиций, направленных на специфическую профилактику галлибактериоза сельскохозяйственных птиц | |
| RU1092947C (ru) | Штамм pseudomonas acruginosa серотип 11 n 48, используемый для изготовления псевдомонозного антигена | |
| RU2521651C1 (ru) | ШТАММ БАКТЕРИЙ, Moraxella bovoculi "СХ-Ч6 N-ДЕП" ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМОВ И ВАКЦИН ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО КЕРАТОКОНЪЮКТИВИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА | |
| RU2288002C1 (ru) | Способ изготовления вакцины против энтерококковой инфекции нутрий | |
| MR et al. | Preparation of dried antigen and antiserum for the agglutination-inhibition test for virus influenza. | |
| Farooq et al. | A novel approach for development, standardization, and safety testing of enriched alum-precipitated vaccine against hemorrhagic septicemia in different breeds of cattle | |
| RU2269570C2 (ru) | Штамм haemophilus parasuis ил-1 - возбудитель гемофилезного полисерозита свиней для изготовления диагностических и вакцинных препаратов | |
| RU2754005C1 (ru) | Штамм бактерий histophilus somni, предназначенный для получения моно- и поливалентных иммуногенных композиций, направленных на специфическую профилактику гистофилеза (стадного бесплодия) рогатого скота | |
| RU2802251C1 (ru) | Вакцинная композиция для профилактики энзоотического аборта у овец | |
| RU2406532C1 (ru) | Способ изготовления вакцины ассоциированной против стрептококкоза и стафилококкоза крупного рогатого скота |