BR112020011414B1 - Composições imunogênicas multivalentes compreendendo conjugados de proteína carreadora e polissacarídeo de s. pneumoniae - Google Patents

Abstract

A invenção se refere a composições imunogênicas multivalentes compreendendo mais de um conjugado de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae são conforme definidos na presente invenção. Em algumas modalidades, pelo menos um dos conjugados de proteína e polissacarídeo é formado por uma reação de conjugação compreendendo um solvente aprótico. Em modalidades adicionais, cada um dos conjugados de proteína e polissacarídeo é formado por uma reação de conjugação compreendendo um solvente aprótico. Também são fornecidos métodos para induzir uma resposta imune protetora em um paciente humano compreendendo administrar as composições imunogênicas multivalentes da invenção ao paciente. As composições imunogênicas multivalentes são úteis para fornecer proteção contra infecção por S. pneumoniae e doenças causadas por S. pneumoniae. As composições da invenção também são úteis como parte de regimes de tratamento que fornecem proteção complementar para pacientes que foram vacinados com uma vacina multivalente indicada para a prevenção de doença pneumocócica.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Não Aplicável

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção fornece composições imunogênicas multivalentes com conjugados de polissacarídeo-proteína distintos. Cada conjugado consiste em um polissacarídeo capsular preparado a partir de um sorotipo diferente de Streptococcus pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, de preferência, CRM197. As composições imunogênicas fornecem ampla cobertura contra doença pneumocócica.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] A Streptococcus pneumoniae é uma bactéria gram-positiva e a causa mais comum de doença bacteriana invasiva (como pneumonia, bacteremia, meningite e otite média) em bebês e crianças pequenas. O pneumococo é encapsulado com um polissacarídeo quimicamente ligado que confere especificidade de sorotipo. Existem mais de 90 sorotipos conhecidos de pneumococos, e a cápsula é o principal determinante de virulência para pneumococos, tendo em vista que a cápsula não apenas protege a superfície interna das bactérias do complemento, mas é por si própria pouco imunogênica. Os polissacarídeos são antígenos independentes de célula T e, na maioria dos casos, não podem ser processados ou apresentados em moléculas de MHC para interagir com células T. Os mesmos podem, entretanto, estimular o sistema imune através de um mecanismo alternado que envolve a reticulação de receptores superficiais em células B.

[004] As vacinas de polissacarídeo pneumocócicas multivalentes que foram licenciadas por muitos anos foram comprovadas como valiosas na prevenção de doença pneumocócica em adultos, particularmente, em idosos e aqueles em alto risco. Entretanto, bebês e crianças pequenas respondem deficientemente a polissacarídeos pneumocócicos não conjugados. A vacina conjugada pneumocócica, Prevnar®, contendo os 7 sorotipos mais frequentemente isolados (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) que provocam doença pneumocócica invasiva em crianças pequenas e bebês no momento, foi primeiramente licenciada nos Estados Unidos em fevereiro de 2000. Após o uso universal de Prevnar® nos Estados Unidos, houve uma redução significativa em doença pneumocócica invasiva em crianças devido aos sorotipos presentes em Prevnar®. Vide Centers for Disease Control and Prevention, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005, 54(36):893 a 7. Entretanto, existem limitações em cobertura de sorotipo com Prevnar® em certas regiões do mundo e alguma evidência de certos sorotipos emergentes nos Estados Unidos (por exemplo, 19A e outros). Vide O'Brien et al., 2004, Am J Epidemiol 159:634 a 44; Whitney et al., 2003, N Engl J Med 348:1737 a 46; Kyaw et al., 2006, N Engl J Med 354:1455 a 63; Hicks et al., 2007, J Infect Dis 196:1346 a 54; Traore et al., 2009, Clin Infect Dis 48:S181 a S189.

[005] A Publicação de Pedido de Patente dos EUA n° US 2006/0228380 descreve uma vacina conjugada de polissacarídeo-proteína pneumocócica 13- valente que inclui os sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F. A Publicação de Pedido de Patente chinesa n° CN 101590224 A descreve uma vacina conjugada de polissacarídeo-proteína pneumocócica 14-valente que inclui os sorotipos 1, 2, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F.

[006] Outras PCVs cobriram 7, 10, 11 ou 13 dos sorotipos contidos na PCV- 15 (Publicação n° US 2011/0195086), mas a interferência imune foi observada para alguns sorotipos (por exemplo, proteção inferior para sorotipo 3 em PCV-11 da GSK) e taxas de resposta inferiores para sorotipo 6B em PCV-13 da Pfizer (PREVNAR® 13). Vide Prymula et al., 2006, Lancet 367:740 a 48 e Kieninger et al., Safety and Immunologic Non-inferiority of 13-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Compared to 7-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Given as a 4- Dose Series in Healthy Infants and Toddlers, apresentada no 48° ICAAC/ISDA Anual, 465 Reunião Anual, Washington DC, EUA,25 a 28 de outubro de 2008.

[007] As vacinas pneumocócicas multivalentes atuais foram eficazes na redução da incidência de doença pneumocócica associada àqueles sorotipos presentes nas vacinas. Entretanto, a prevalência dos pneumococos que expressam sorotipos não presentes nas vacinas atualmente disponíveis tem aumentado. Consequentemente, há uma necessidade por composições de vacina pneumocócica adicionais que forneçam proteção contra diferentes conjuntos de sorotipos pneumocócicos e que possam fornecer proteção complementar contra sorotipos pneumocócicos não presentes em vacinas atualmente disponíveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] A invenção fornece composições imunogênicas multivalentes que compreendem conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae são conforme definido na presente invenção.

[009] Em modalidades particulares da invenção, os sorotipos de S. pneumoniae compreendem um conjunto de sorotipos selecionados a partir do grupo que consiste em: a) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B; b) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20; e c) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20,

[010] Em modalidades particulares adicionais da invenção, os sorotipos de S. pneumoniae compreendem um conjunto de sorotipos selecionados a partir do grupo que consiste em: a) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B; b) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A; e c) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A.

[011] Em modalidades particulares adicionais da invenção, os sorotipos de S. pneumoniae compreendem um conjunto de sorotipos selecionados a partir do grupo que consiste em: a) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B; b) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20B; e c) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20B.

[012] Em algumas modalidades, o conjunto de sorotipos de S. pneumoniae listados em a), b) ou c) compreende adicionalmente: sorotipo 6C, sorotipo 6A ou sorotipos 6A e 6B.

[013] Em algumas modalidades, pelo menos um dos conjugados de polissacarídeo-proteína é formado por uma reação de conjugação que compreende um solvente aprótico, por exemplo, dimetilsulfóxido (DMSO). Em modalidades específicas, cada um dos conjugados de polissacarídeo-proteína é formado por uma reação de conjugação que compreende um solvente aprótico. Conforme mostrado na presente invenção, o uso de DMSO como um solvente durante a aminação redutiva de conjugados de polissacarídeo-proteína resulta em estabilidade inesperadamente superior e imunogenicidade melhorada para aqueles sorotipos relacionados aos mesmos conjugados preparados sob condições aquosas.

[014] Também são fornecidos métodos para induzir uma resposta imune protetora em um paciente humano que compreende administrar as composições imunogênicas multivalentes da invenção ao paciente. Em algumas modalidades dos métodos da invenção, o paciente foi anteriormente tratado com uma vacina pneumocócica multivalente.

[015] Uma composição imunogênica multivalente da invenção pode ser usada como parte de um regime de tratamento com uma vacina pneumocócica complementar diferente. Consequentemente, a invenção fornece um método de induzir uma resposta imune protetora em um paciente humano que compreende administrar uma composição imunogênica multivalente da invenção ao paciente, que compreende adicionalmente administrar uma vacina pneumocócica multivalente ao paciente em qualquer ordem. Em modalidades particulares, a vacina pneumocócica multivalente é compreendida de múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora. Em outras modalidades, a vacina pneumocócica multivalente é compreendida de polissacarídeos capsulares não conjugados.

[016] Também são fornecidos métodos para preparar um conjugado de polissacarídeo-proteína de sorotipo 8 de Streptococcus pneumoniae utilizando uma reação de conjugação em um solvente aprótico, em que a reação de conjugação não usa cianoboroidreto.

[017] A invenção também fornece composições imunogênicas multivalentes que compreendem conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos particulares de S. pneumoniae fornecem reatividade cruzada com outros sorotipos particulares.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[018] A Figura 1 retrata o espectro de 1H RMN unidimensional de 600 MHz do polissacarídeo capsular de sorotipo 6C de S. pneumoniae em óxido de deutério (D2O) a 50 °C. Os sinais que surgem de padrões internos (DMSO e DSS- d6) e água residual (HOD) são marcados. Os sinais menores marcados com * são referentes a resíduos de parede celular de S. pneumoniae tais como C- polissacarídeo e/ou peptidoglicanos.

[019] A Figura 2 retrata o espectro de 1H RMN unidimensional de 600 MHz do polissacarídeo capsular de sorotipo 15A de S. pneumoniae em óxido de deutério (D2O) a 50 °C. Os sinais que surgem de padrões internos (DMSO e DSS- d6) e água residual (HOD) são marcados. Os sinais menores marcados com * são referentes a resíduos de parede celular de S. pneumoniae tais como C- polissacarídeo e/ou peptidoglicanos.

[020] A Figura 3 retrata o espectro de 1H RMN unidimensional de 600 MHz do polissacarídeo capsular O-desacetilado de S. pneumoniae sorotipo 15B em óxido de deutério (D2O) a 50 °C. Os sinais que surgem de padrões internos (DMSO e DSS-d6) e água residual (HOD) são marcados. Os sinais menores marcados com * são referentes a resíduos de parede celular de S. pneumoniae tais como C- polissacarídeo e/ou peptidoglicanos.

[021] A Figura 4 retrata o espectro de 1H RMN unidimensional de 600 MHz do polissacarídeo capsular de sorotipo 35B de S. pneumoniae em D2O a 50 °C. Os sinais que surgem de padrões internos (DMSO e DSS-d6) e água residual (HOD) são marcados. Os sinais menores marcados com * são referentes a resíduos de parede celular de S. pneumoniae tais como C-polissacarídeo e/ou peptidoglicanos.

[022] A Figura 5 retrata a região de identidade de 1H RMN útil para identificação de sorotipo do sorotipo 6C de S. pneumoniae. As posições de sinal de cada próton anomérico da unidade de repetição de cada resíduo de monossacarídeo são marcadas.

[023] A Figura 6 retrata a região de identidade de 1H RMN útil para identificação de sorotipo do sorotipo 15A de S. pneumoniae. As posições de sinal de cada próton anomérico da unidade de repetição de cada resíduo de monossacarídeo são marcadas.

[024] A Figura 7 retrata a região de identidade de 1H RMN útil para identificação de sorotipo de S. pneumoniae sorotipo 15B O-desacetilado. As posições de sinal de cada próton anomérico de cada resíduo de monossacarídeo são marcadas.

[025] A Figura 8 retrata a região de identidade de 1H RMN útil para identificação de sorotipo do sorotipo 35B de S. pneumoniae. As posições de sinal de cada próton anomérico da unidade de repetição de cada resíduo de monossacarídeo são marcadas.

[026] As Figuras 9A a 9C retratam o espectro de 1H RMN unidimensional de 600 MHz de polissacarídeo capsular nativo de sorotipo 15B de S. pneumoniae (Figura 9A), o polissacarídeo capsular O-desacetilado de S. pneumoniae sorotipo 15B (Figura 9B) e o polissacarídeo capsular de sorotipo 15C de S. pneumoniae (Figura 9C). Os espectros foram adquiridos em óxido de deutério (D2O) a 50 °C. Os sinais que surgem de padrões internos (DMSO e DSS-d6) e água residual (HOD) são marcados. Os sinais marcados com * são referentes a resíduos de parede celular de S. pneumoniae tais como C-polissacarídeo e/ou peptidoglicanos.

[027] As Figuras 10A a 10C mostram a região anomérica do espectro de 1H RMN unidimensional de 600 MHz de polissacarídeo capsular nativo de sorotipo 15B de S. pneumoniae (Figura 10A), o polissacarídeo capsular O-desacetilado de S. pneumoniae sorotipo 15B (Figura 10B) e o polissacarídeo capsular do sorotipo 15C de S. pneumoniae (Figura 10C). As Figuras 10D a 10F mostram regiões do espectro onde os sinais de metil O-acetila e N-acetila de polissacarídeo capsular nativo do sorotipo 15B de S. pneumoniae (Figura 10D), o polissacarídeo capsular O-desacetilado de S. pneumoniae sorotipo 15B (Figura 10E) e o polissacarídeo capsular do sorotipo 15C de S. pneumoniae (Figura 10F).

[028] A Figura 11 mostra o impacto de tempo e temperatura (até 12 semanas a 4 °C - losangos, até 4 semanas a 25 °C - quadrados, até 4 semanas a 37 °C - triângulos) na concentração de polissacarídeo de produtos de fármaco de uma PCV16 (0,128 mg/ml) ou PCV21 (0,084 mg/mL ou 0,169 mg/ml) usando HPSEC-UV/MALS/RI (vide EXEMPLO 39).

[029] A Figura 12 mostra o impacto de agitação com rotação horizontal e temperatura (1 semana em 4 °C, 25 °C ou 37 °C) em concentração de polissacarídeo de produtos de fármaco de uma PCV16 (0,128 mg/ml) ou PCV21 (0,084 mg/mL ou 0,169 mg/ml) dispensados em seringas pré-preenchidas (vide EXEMPLO 39).

[030] A Figura 13 mostra o impacto de concentração de PS por tempo e temperatura (até 4 semanas em 4 °C, 25 °C ou 37 °C) no peso molecular médio (Mw e Mn) de produtos de fármaco de PCV16 (0,128 mg/ml) ou PCV21 (0,084 mg/mL ou 0,169 mg/ml) usando HPSEC-UV/MALS/RI.

[031] As Figuras 14A e 14B mostram o impacto de tempo e temperatura (até 1 semana a 4 °C ou 37 °C) na estabilidade de uma vacina conjugada pneumocócica (PCV15 ou PCV16) preparada com substâncias de fármaco conjugadas em a) um solvente prótico (PCV15 formulado usando toda a conjugação aquosa) ou B) um solvente aprótico (PCV16 formulada usando toda a conjugação em DMSO a 0,064 mg/mL de PnPs) usando espectroscopia de fluorescência de proteína intrínseca com um comprimento de onda de excitação a 280 nm (EXEMPLO 40).

[032] A Figura 15 mostra títulos de diluição de anticorpo IgG de (pós-dose 2) para coelhos imunizados com sorotipos monovalentes de S. pneumoniae conjugados em CRM197 e formulados com adjuvante de fosfato de alumínio (APA). Os símbolos indicam os títulos individuais e as barras de erro representam os intervalos de confiança de 95% (CIs) dos títulos de média geométrica (GMTs).

[033] A Figura 16 fornece títulos de diluição de OPA específicos de sorotipo (pós-dose 2) para coelhos imunizados com os sorotipos monovalentes de S. pneumoniae conjugados em CRM197 e formulados com adjuvante de fosfato de alumínio (APA). Os símbolos indicam os títulos individuais e as barras de erro representam os intervalos de confiança de 95% (CIs) dos títulos de média geométrica (GMTs).

[034] A Figura 17 fornece títulos de diluição de anticorpo de IgG de ELISA (pós-dose 2) para coelhos imunizados com conjugados monovalentes de sorotipo 15 de S. pneumoniae . O eixo X indica a vacina usada para imunizar os coelhos. As linhas tracejadas separam três ensaios ELISA separados usando polissacarídeo pneumocócico separados como um antígeno de revestimento. Os símbolos indicam os títulos individuais e as barras de erro representam os intervalos de confiança de 95% (CIs) dos títulos de média geométrica (GMTs).

[035] A Figura 18 mostra títulos de diluição de OPA específicos de sorotipo (pré-imune, pós-dose 1 (PD1, agrupado) e pós-dose 2 (PD2)) para coelhos imunizados com conjugados monovalentes de sorotipo 15 de S. pneumoniae . O eixo X indica a vacina usada para imunizar os coelhos. As linhas tracejadas separam três ensaios de OPA usando cepas bacterianas de S. pneumoniae separadas. Os símbolos indicam os títulos individuais e as barras de erro representam os intervalos de confiança de 95% (CIs) dos títulos de média geométrica (GMTs).

[036] A Figura 19A fornece uma comparação de respostas de anticorpo PD1 em NZWR (5 por grupo) após vacinação com 4, 2, 1, 0,4, 0,08 ou 0,016 μg/dose de PCV21. Os símbolos indicam razões de título de média geométrica de PD1 (GMT) (Grupo 2 μg/dose vs. outros grupos de dose) com barras de erro representando o intervalo de confiança de 95% (CI). A Figura 19B fornece uma comparação de dose de PCV21 com razões de GMT de PD1 (CI de 95%) correspondentes à Figura 19A, as razões de GMT cujo limite de confiança de 95% inferior excede 1,0 são sombreadas em cinza claro e as razões de GMT cujo limite de confiança de 95% superior é menor que 1,0 são sombreadas em cinza escuro. Os dados de sorotipo 15B são incluídos para avaliar a proteção cruzada.

[037] A Figura 20A fornece uma comparação de respostas de anticorpo PD2 em NZWR (5 por grupo) após vacinação com 4, 2, 1, 0,4, 0,08 ou 0,016 μg/dose de PCV21. Os símbolos indicam razões de GMT de PD2 (Grupo 2 μg/dose vs. outros grupos de dose) com barras de erro representando o CI de 95%. A Figura 20B fornece uma comparação de dose de PCV21 com razões de GMT de PD2 (intervalo de confiança de 95%) correspondentes à Figura 20A, as razões de GMT cujo limite de confiança de 95% inferior excede 1,0 são sombreadas em cinza claro. Os dados de sorotipo 15B são incluídos para avaliar a proteção cruzada.

[038] A Figura 21A mostra os títulos de diluição de OPA de PD1 específicos de sorotipo para coelhos imunizados com PCV21 (2 μg/PnPs). Os símbolos indicam os títulos individuais e as barras de erro representam os intervalos de confiança de 95% (CIs) dos títulos de média geométrica (GMTs).* p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001, **** p<0,0001. A Figura 21B mostra títulos de diluição de OPA de PD2 específicos de sorotipo para coelhos imunizados com PCV21 (2 μg/PnPs). Os símbolos indicam os títulos individuais e as barras de erro representam os intervalos de confiança de 95% (CIs) dos títulos de média geométrica (GMTs), **** p<0,0001. Os dados de sorotipo 15B são incluídos para avaliar a proteção cruzada.

[039] As Figuras 22A a C mostram o impacto de tempo e temperatura (isto é, 7 Dias a 4oC, 1 Dia a 37oC ou 7 Dias a 37oC) em estabilidade de três vacinas Conjugadas Pneumocócicas (PCV1, PCV7 e PCV14), preparadas com todas as substâncias de fármaco conjugadas em solvente aquoso ou solvente de DMSO, usando espectroscopia de fluorescência de proteína intrínseca com um comprimento de onda de excitação a 280 nm. A Figura 22D mostra o impacto de tempo e temperatura (isto é, 7 Dias a 4 oC ou 37 oC) em estabilidade de uma vacina conjugada pneumocócica 21-valente (PCV21 a 0,084 mg/mL de PnPs), preparada com todas as substâncias de fármaco conjugadas em solvente de DMSO, usando espectroscopia de fluorescência de proteína intrínseca com um comprimento de onda de excitação a 280 nm.

[040] A Figura 23 mostra o impacto de temperatura (7 Dias a 4 oC ou 37 oC) e agitação a 4 oC na distribuição de tamanho de partícula analisada por Análise de Rastreamento de Nanopartícula (NTA) de seis (6) produtos de fármaco de vacina conjugada pneumocócica PCV21 formulados com PS-20 (0%, 0,025%, 0,05%, 0,1%, 0,15% ou 0,2%; todos p/v PS-20) a 0,084 mg/mL de PnPs.

[041] A Figura 24 mostra o impacto de temperatura (4 oC e 37 oC) e agitação em três pesos moleculares médios de fármaco de PCV21 conforme analisado por ensaio de HPSEC/UV/MALS/RI. Três produtos de fármaco de vacina conjugada pneumocócica PCV21 foram formulados com diferentes concentrações de PS-20 (0,05%, 0,1% e 0,15% p/v) a 0,084 mg/mL de PnPs.

[042] A Figura 25 mostra que os camundongos imunizados com PCV21 são protegidos contra desafio intratraqueal de S. pneumoniae 24F.

[043] A Figura 26A-B mostra títulos de diluição de anticorpo de IgG pré (agrupado), PD1 (agrupado) e PD2 conforme determinado por ECL para coelhos imunizados com PCV21 não adjuvante ou formulados com APA. As barras de erro representam os intervalos de confiança de 95% (CI) do título de média geométrica (GMT). Os dados de sorotipo 15B são incluídos para avaliar a proteção cruzada.

[044] A Figura 27A-C mostra títulos de diluição de anticorpo de IgG pré (agrupado), PD1 (agrupado) e PD2 conforme determinado por ECL para coelhos imunizados com PCV8 não adjuvante, PCV16 não adjuvante e PCV31 com APA. As barras de erro representam os intervalos de confiança de 95% (CI) do título de média geométrica (GMT). Os dados de sorotipo 15B são incluídos para avaliar a proteção cruzada.

[045] A Figura 28 mostra a comparação de respostas de anticorpo de ECL de PD2 em NZWR (5 por grupo) seguindo a vacinação com PCV21 com ou sem APA. Os símbolos indicam razões de GMT de PD2 com barras de erro que representam CIs de 95%. Os dados de sorotipo 15B são incluídos para avaliar a proteção cruzada.

[046] A Figura 29 mostra a comparação de respostas de anticorpo de ECL de PD2 em NZWR (5 por grupo) para sorotipos comuns e sorotipo de proteção cruzada 15B após a vacinação com PCV21, PCV8 ou PCV16. Os símbolos indicam razões de GMT de ECL de PD2 com barras de erro que representam o CIs de 95%.

[047] A Figura 30 mostra a comparação de respostas de anticorpo de ECL de PD2 em NZWR (5 por grupo) para sorotipos comuns e sorotipo de proteção cruzada 15B após a vacinação com PCV21/APA ou PCV31/APA. Os símbolos indicam razões de GMT de ECL de PD2 com barras de erro que representam CIs de 95%.

[048] Figura 31A-D mostra títulos de diluição de OPA de PD2 (C, D) e pré (agrupado) (A, B) específicos de sorotipo para coelhos imunizados com PCVs. As barras de erro representam CIs de 95% de GMTs. PCV21 foi usada como a referência para as comparações estatísticas, * p<0,05. As Figuras A e C mostram os dados para 8 sorotipos comuns em todas as PCVs avaliadas (6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B) e 8 sorotipos comuns adicionais em PCV16, PCV21 e PCV31 (8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20B). As Figuras B e D mostram dados para 16 sorotipos adicionais não incluídos nas Figuras A e C. Cinco dos mesmos também são sorotipos comuns em PCV21 e PCV31 (3, 7F, 19A, 22F, 33F), dez sorotipos estão contidos exclusivamente em PCV31 (1, 4, 5, 6A, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F). Os dados de sorotipo 15B são incluídos para avaliar a proteção cruzada.

[049] A Figura 32 mostra títulos de diluição de anticorpo de IgG pré, PD1, PD2 e PD3 conforme determinado por ECL para macacos adultos Rhesus (n=8) imunizados com PCV21, As barras de erro representam CIs de 95% de GMTs. Os dados de sorotipo 15B são incluídos para avaliar a proteção cruzada.

[050] A Figura 33 mostra títulos de diluição de OPA de pre, PD1 (agrupado) e PD3 de macacos adultos Rhesus imunizados com PCV21 (n=8). As barras de erro representam CIs de 95% de GMTs. Os dados de sorotipo 15B são incluídos para avaliar a proteção cruzada.

[051] A Figura 34 mostra títulos de OPA de pre e PD3 (dia 70) para quatro sorotipos não contidos na vacina PCV21 para macacos adultos Rhesus imunizados com PCV21.

[052] A Figura 35 mostra a comparação de respostas de anticorpo de ECL de PD1 em macacos adultos Rhesus (5 por grupo) após a vacinação com PCV21 com ou sem APA. Os símbolos indicam razões de GMT de ECL de PD1 (PCV21 vs. PCV21/APA) com barras de erro que representam CIs de 95%. Os dados de sorotipo 15B são incluídos para avaliar a proteção cruzada.

[053] A Figura 36 mostra respostas de anticorpo de IgG de PD1 para sorotipo 3, 7F, 19A, 22F e 33F em macacos adultos Rhesus (2 a 5 por grupo) após a vacinação com PCV21 em comparação a PCV15 ou Prevnar13. Os símbolos indicam razões de GMT de ECL de PD1 com barras de erro que representam CIs de 95%.

[054] A Figura 37 mostra títulos de diluição de anticorpo de IgG de ELISA para 6A, 6B e 6C ((pré-imune e PD1, agrupado) e PD2) para coelhos imunizados com produtos de fármaco monovalente de 6A-CRM197 (A) ou 6B-CRM197 (B). As barras indicam títulos de média geométrica (GMTs) e barras de erro representam os intervalos de confiança de 95% (CIs) de GMTs.

[055] A Figura 38 mostra títulos de diluição de OPA específicos de sorotipo para 6A, 6B e 6C ((pré-imune e PD1 agrupado) e PD2) para coelhos imunizados com produtos de fármaco monovalente de 6A-CRM197 (A) ou 6B-CRM197 (B). As barras indicam títulos de média geométrica (GMTs) e barras de erro representam os intervalos de confiança de 95% (CIs) de GMTs.

[056] A Figura 39 mostra títulos de diluição de OPA específicos de sorotipo para 20A e 20B (pré-imune (agrupado), PD1and PD2) para coelhos imunizados com 20A-CRM197/APA (A) ou PCV21 (B). As barras indicam títulos de média geométrica (GMTs) e barras de erro representam os intervalos de confiança de 95% (CIs) de GMTs.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[057] A presente invenção fornece composições imunogênicas multivalentes que compreendem conjugados de polissacarídeo-proteína pneumocócicos, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae são conforme definido na presente invenção. Em algumas modalidades, a composição imunogênica compreende um conjunto de sorotipos pneomocócicos selecionados a partir do grupo que consiste em: (a) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B; (b) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, e 20; e (c) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20. Em algumas modalidades, a composição imunogênica compreende um conjunto de sorotipos pneomocócicos selecionados a partir do grupo que consiste em: (a) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B; (b) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, e 20B; e (c) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20B. Em outras modalidades, a composição imunogênica compreende um conjunto de sorotipos pneomocócicos selecionados a partir do grupo que consiste em: (a) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B; (b) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, e 20A; e (c) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A. Em modalidades adicionais, a composição imunogênica compreende (i) sorotipo 6A; (ii) sorotipos 6A e 6B; ou (iii) sorotipo 6C. Em uma modalidade particular, a invenção compreende múltiplos conjugados pneumocócicos de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem sorotipos 3, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 19A, 20A, 22F, 23A, 23B, 24F, 31, 33F e 35B. A referida composição foi constatada como sendo imunogênica em coelhos e gera anticorpo funcional que exterminam cepas bacterianas do tipo vacina em todas as doses testadas (EXEMPLO 43). Em uma outra modalidade particular, a invenção compreende múltiplos conjugados pneumocócicos de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem sorotipos 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20, 6A, 15A, 15C, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B. Em uma outra modalidade particular, a invenção compreende múltiplos conjugados pneumocócicos de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem sorotipos 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20B, 6A, 15A, 15C, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B. Em uma outra modalidade particular, a invenção compreende múltiplos conjugados pneumocócicos de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem sorotipos 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 15A, 15C, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B.

[058] As composições imunogênicas multivalentes da invenção são úteis para imunizar um paciente contra sorotipos do tipo vacina de S. pneumoniae e como parte de um regime de tratamento com diferentes vacinas pneumocócicas complementares. Consequentemente, a invenção fornece um método de induzir uma resposta imune protetora em um paciente humano que compreende administrar uma composição imunogênica multivalente da invenção ao paciente, e que compreende adicionalmente administrar uma vacina pneumocócica multivalente ao paciente, em qualquer ordem. Em outras modalidades, as composições imunogênicas multivalentes da invenção são administradas a um paciente que foi anteriormente imunizado com uma vacina pneumocócica multivalente diferente.

[059] Em modalidades da invenção, os conjugados de pelo menos um sorotipo pneumocócico são preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico como DMSO. Em modalidades adicionais, a composição imunogênica multivalente compreende conjugados pneumocócicos que foram, cada um, preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico. É mostrado na presente invenção que os produtos de fármaco PCV1, PCV7, PCV14, PCV16 e PCV21 (conforme definido abaixo) que compreendem substâncias de fármaco que foram, cada uma, preparadas usando aminação redutiva em um solvente aprótico foram estáveis contra despolimerização ou degradação química do carboidrato e estáveis contra agregação da proteína na formulação de fármaco (vide EXEMPLO 40 e EXEMPLO 45). O uso de solvente de DMSO melhora as associações covalentes de polissacarídeo à proteína através do consumo direto de resíduos de lisina na superfície da proteína carreadora. A associação covalente aumentada tem um benefício direto de aumentar a estabilidade do conjugado de polissacarídeo-proteína de composições imunogênicas multivalentes que compreendem antígenos de polissacarídeo conjugados em DMSO.

I. Definições e Abreviaturas

[060] Conforme usado ao longo de todo o relatório descritivo e das reivindicações anexas, as seguintes abreviações se aplicam: APA - adjuvante de fosfato de alumínio APC - célula apresentadora de antígeno CI - intervalo de confiança DMSO - dimetilsulfóxido DS - Substância de Fármaco polissacarídeo-proteína GMC - Concentração de média geométrica GMT - título de média geométrica HPSEC - cromatografia por exclusão por tamanho de alta eficiência IM - intramuscular ou intramuscularmente LOS -lipo-oligossacarídeo LPS - lipopolissacarídeo MALS - difusão de luz de múltiplos ângulos MBC - conjugado concentrado monovalente MOPA - ensaios opsonofagocíticos multiplexados MW - peso molecular NMWCO - corte de peso molecular nominal NZWR - Coelho Branco da Nova Zelândia OPA - ensaio de opsonofagocitose PCV - vacina conjugada pneumocócica PD1 - pós-dose 1 PD2 - pós-dose 2 PnPs - Polissacarídeo pneumocócico Ps - polissacarídeo PS-20 - polissorbato-20 RI - índice de refração UV - ultravioleta p/v - peso por volume.

[061] De modo que a invenção possa ser mais prontamente entendida, certos termos técnicos e científicos são especialmente definidos abaixo. A menos que especificamente definido em outra parte nesse documento, todos outros termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o significado comumente entendido por um técnico no assunto ao qual essa invenção pertence.

[062] Conforme usado no relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma”, “a” e “o” incluem várias referências a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[063] A referência a “ou” indica uma ou ambas as possibilidades a menos que o contexto indique uma das possibilidades indicadas. Em alguns casos, “e/ou” foi empregado para destacar uma ou ambas as possibilidades.

[064] Os termos “solvente aquoso” ou “condições aquosas” quando usados com conjugação, como aminação redutiva, se referem ao uso de água como o solvente para a reação de conjugação. A água pode conter tampões e outros componentes exceto pelo fato de que nenhum solvente orgânico está presente.

[065] Os termos “solvente aprótico”, “solvente de DMSO” ou “condições de DMSO” quando usados com conjugação, como aminação redutiva, se referem ao uso de um solvente aprótico, ou uma combinação de solventes apróticos, (ou DMSO, conforme aplicável) como o solvente para a reação de conjugação. O solvente aprótico pode ter alguma água presente, por exemplo, até 1%, 2%, 5%, 10% ou 20%.

[066] O termo "compreende" quando usado com a composição imunogênica da invenção se refere à inclusão de quaisquer outros componentes, como adjuvantes e excipientes, ou a adição de um ou mais conjugados de polissacarídeo-proteína que não são especificamente enumerados. O termo "que consiste em" quando usado com a mistura de conjugado de polissacarídeo- proteína multivalente se refere a uma mistura que tem aqueles conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae particulares e nenhum outro conjugado de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae de um diferente sorotipo. "Consiste essencialmente em" e variações como "consistem essencialmente em" ou "que consiste essencialmente em", indicam a inclusão de quaisquer elementos listados ou grupo de elementos, e a inclusão opcional de outros elementos, de natureza similar ou diferente daquela dos elementos listados, que não alteram materialmente as propriedades básicas ou novas do regime de dosagem específica, método ou composição.

[067] "Quantidade eficaz" de uma composição da invenção se refere a uma dose necessária para elicitar os anticorpos que reduzem significativamente a probabilidade ou gravidade de infectividade de um micróbio, por exemplo, S. pneumoniae, durante um desafio subsequente.

[068] Conforme usado na presente invenção, a frase “indicado para a prevenção de doença pneumocócica” significa que uma vacina ou composição imunogênica é aprovada por uma ou mais autoridades reguladoras, como o Food and Drug Administration dos EUA, para a profilaxia de uma ou mais doenças causadas por qualquer sorotipo de S. pneumoniae, que inclui, porém sem limitação: doença pneumocócica geralmente, pneumonia pneumocócica, meningite pneumocócica, bacteremia pneumocócica, doença invasiva causada por S. pneumoniae, e otite média causada por S. pneumoniae .

[069] Uma “vacina pneumocócica multivalente” é uma preparação farmacêutica que compreende mais que um agente ativo (por exemplo, polissacarídeo pneumocócico capsular ou conjugado de polissacarídeo-proteína pneumocócico) que fornece imunidade ativa à doença ou condição patológica causada por mais de um sorotipo de S. pneumoniae .

[070] O termo "polissacarídeo" é destinado a incluir qualquer elemento de sacárideo antigênico (ou unidade antigênica) comumente usado nas técnicas de vacina bacteriana e imunológica, que incluem, porém sem limitação, um "sacarídeo", um "oligossacarídeo", um "polissacarídeo", um "lipossacarídeo", um "lipo-oligossacarídeo (LOS)", um "lipopolissacarídeo (LPS)", um "glicosilato", um "glicoconjugado" e similares.

[071] “PCV1”, conforme usado na presente invenção, se refere a uma vacina conjugada pneumocócica 1-valente que compreende um conjugado de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae, compreendendo polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que o sorotipo de S. pneumoniae é 3 (conforme exemplificado nos Exemplos 38 e 45). Em modalidades específicas, a proteína carreadora é CRM197.

[072] “PCV7”, conforme usado na presente invenção, se refere a uma vacina conjugada pneumocócica 7-valente que compreende sete conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae, cada um compreendendo polissacarídeo capsulares de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae são: 3, 8, 9N, 11A, 19A, 15A e 10A. Em modalidades específicas, a proteína carreadora de um ou mais dos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae é CRM197. Em modalidades adicionais, a proteína carreadora de cada um dos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae é CRM197.

[073] “PCV8", conforme usado na presente invenção, se refere a uma vacina conjugada pneumocócica 8-valente que compreende oito conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae, cada um compreendendo polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae são: 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B. Em modalidades específicas, a proteína carreadora de um ou mais dos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae é CRM197. Em modalidades adicionais, a proteína carreadora de cada um dos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae é CRM197.

[074] “PCV14", conforme usado na presente invenção, se refere a uma vacina conjugada pneumocócica 14-valente que compreende quatorze conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae, cada um compreendendo polissacarídeo capsulares de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae são: 3, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 16F, 17F, 19A, 20, 22F e 33F. Em modalidades específicas, a proteína carreadora de um ou mais dos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae é CRM197. Em modalidades adicionais, a proteína carreadora de cada um dos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae é CRM197.

[075] “PCV15", conforme usado na presente invenção, se refere a uma vacina conjugada pneumocócica 15-valente que compreende quinze conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae, cada um compreendendo polissacarídeo capsulares de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae são: 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F. Em modalidades específicas, a proteína carreadora de um ou mais dos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae é CRM197. Em modalidades adicionais, a proteína carreadora de cada um dos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae é CRM197.

[076] “PCV16", conforme usado na presente invenção, se refere a um vacina conjugada pneumocócica 16-valente que compreende dezesseis conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae, cada um compreendendo polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae são: 6C, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 16F, 17F, 20A, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B e pelo menos um dos sorotipos do sorogrupo 15 a seguir: 15B, 15C ou 15B O-desacetilado. Em modalidades particulares, o sorotipo do sorogrupo 15 é o sorotipo 15C ou 15B O-desacetilado. Conforme mostrado na presente invenção (vide EXEMPLO 3 abaixo), o polissacarídeo pneumocócico O-desacetilado sorotipo 15B é equivalente ao polissacarídeo pneumocócico de sorotipo 15C e tem uma um espectro de RMN idêntico. Em modalidades específicas, a proteína carreadora de um ou mais dos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae é CRM197. Em modalidades adicionais, a proteína carreadora de cada um dos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae é CRM197.

[077] “PCV21", conforme usado na presente invenção, se refere a uma vacina conjugada pneumocócica 21-valente que compreende vinte e um conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae, cada um compreendendo polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae são: 3, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 16F, 17F, 19A, 20A, 22F, 23A, 23B, 24F, 31, 33F e 35B e pelo menos um dos sorotipos do grupo sorogrupo 15 a seguir: 15B, 15C ou 15B O-desacetilado. Em modalidades particulares, o sorotipo do sorogrupo 15 é o sorotipo 15C ou 15B O-desacetilado. Em modalidades específicas, a proteína carreadora de um ou mais conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae é CRM197. Em modalidades adicionais, a proteína carreadora de cada um dos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae é CRM197.

[078] Os sorotipos 20A e 20B de S. pneumoniae foram identificados (Cal, J.J. et al., J. Biol. Chem. (2012) 287(33): 27885 a 27894) em um sorogrupo 20 em 2012 através de análise genética. Conforme discutido por Calix J.J., et al., os métodos de sorotipificação convencionais e anticorpos comercialmente disponíveis não tiveram capacidade de distinguir esses dois sorotipos anteriormente e há atualmente informações limitadas relacionadas a esforços de sorotipificação para os sorotipos 20A e 20B. Adicionalmente, a prevalência de doença de 20A ou 20B em uma doença identificada causada pelo sorogrupo 20 não é bem entendida. Tal como, um técnico no assunto pode optar por incluir um ou ambos esses dois sorotipos (20A e/ou 20B) em uma composição de vacina de S. pneumoniae. É possível também que uma vacina de S. pneumoniae contendo um antígeno de polissacarídeo de sorotipo 20 possa proteger de modo cruzado contra um outro (por exemplo, uma vacina que inclui conjugados de proteína e polissacarídeo de sorotipo 20A de S. pneumoniae, e não sorotipo 20B, pode proteger de modo cruzado contra infecção com sorotipo de S. pneumoniae 20B). Portanto, “sorotipo 20” conforme usado na presente invenção pode se referir a uma composição contendo conjugados de polissacarídeo-proteína de sorotipo 20A e/ou sorotipo 20B.

[079] “nucleotídeo contendo CpG", "oligonucleotídeo contendo CpG", "oligonucleotídeo de CpG” e termos similares se referem a uma molécula de nucleotídeo de 6 a 50 nucleotídeos de comprimento que contém uma fração de CpG não metilada. Vide, por exemplo, Wang et al., 2003, Vaccine 21:4297, Os oligonucleotídeos contendo CpG incluem oligonucleotídeos modificados com o uso de quaisquer ligações de internucleosídeo sintético, base modificada e/ou açúcar modificado.

[080] Um "adjuvante", conforme definido na presente invenção, é uma substância que serve para melhorar a imunogenicidade de uma composição imunogênica da invenção. Um adjuvante imune pode melhorar uma resposta imune a um antígeno que é fracamente imunigênico quando administrado sozinho, por exemplo, induzindo a nenhum título de anticorpo ou títulos de anticorpo fracos ou resposta imune mediada por célula, aumentando títulos de anticorpo para o antígeno e/ou diminuindo a dose do antígeno eficaz para alcançar uma resposta imune no indivíduo. Assim, adjuvantes são dados frequentemente para aumentar a resposta imune e são bem conhecidos para o técnico no assunto.

[081] Um "paciente" (chamado alternativamente de "indivíduo” na presente invenção) se refere a um mamífero que tem capacidade de ser infectado com um S. pneumoniae. Nas modalidades preferenciais, o paciente é um ser humano. Um paciente pode ser tratado profilática ou terapeuticamente. O tratamento profilático fornece imunidade protetora suficiente para reduzir a probabilidade ou gravidade de um infecção pneumocócica ou os efeitos da mesma, por exemplo, pneumonia pneumocócica. O tratamento terapêutico pode ser realizado para reduzir a gravidade ou prevenir a recorrência de uma infecção por S. pneumoniae ou os efeitos clínicos da mesma. O tratamento profilático pode ser realizado com o uso de uma composição imunogênica multivalente da invenção conforme descrito na presente invenção. A composição da invenção pode ser administrada à população geral ou a essas pessoas com um risco de infecção pneumocócica aumentado, por exemplo, os idosos ou pessoas que vivem ou cuidam dos idosos.

[082] Essas pessoas “em necessidade de tratamento” incluem as pessoas expostas anteriormente ou infectadas com S. pneumoniae, as pessoas que foram vacinadas anteriormente contra S. pneumoniae, assim como as pessoas propensas a ter uma infecção ou qualquer pessoa na qual uma redução na probabilidade de infecção é desejada, por exemplo, a pessoa imunocomprometida, os idosos, crianças, adultos ou indivíduos saudáveis.

[083] Uma composição imunogênica multivalente "estável" é uma composição que não tem alterações significativas observadas a uma temperatura refrigerada (por exemplo, 2 a 8 °C ou 4 °C) por pelo menos 1 mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 12 meses e/ou 24 meses. Adicionalmente, uma composição "estável" inclui uma composição que exibe características desejadas a temperaturas incluindo 25 °C e 37 °C por períodos incluindo 1 mês, 3 meses, 6 meses, 12 meses e/ou 24 meses. Os critérios aceitáveis típicos para estabilidade são conforme a seguir: variabilidade de não mais de cerca 5%, cerca de 10%, cerca de 15% ou cerca de 20% em um ou mais dos seguintes: ( a) o peso molecular médio numérico (Mn) dos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae na composição, (b) o peso molecular médio ponderado (Mw) dos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae na composição, (c) a concentração de polissacarídeo total na composição, (d) a emissão máxima da composição medida com o uso de espectroscopia de fluorescência de proteína intrínseca em um comprimento de onda de excitação particular, por exemplo, 280 nanômetros, e (e) a intensidade de fluorescência da composição medida com o uso de espectroscopia de fluorescência de proteína intrínseca em um comprimento de onda de excitação particular. O termo “estável” pode ser usado também para se referir a um conjugado pneumocócico particular em uma composição imunogênica multivalente. Em tal uso, o termo se refere a um conjugado que exibe as propriedades desejadas ao longo do tempo a uma temperatura particular, e tais propriedades variam não mais que cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 15% ou cerca de 20% ao longo do tempo e à temperatura observada.

II. Composições Imunogênicas Multivalentes

[084] A invenção fornece composições imunogênicas multivalentes que compreendem múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora. Aspectos e modalidades diferentes das composições imunogênicas multivalentes da invenção são descritas abaixo.

[085] Em uma modalidade (Modalidade E1), a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae, cada um compreendendo polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem, consistem ou consistem essencialmente em: (1) 15A, (2) 16F, (3) um ou mais sorotipos do sorogrupo 23 selecionados a partir de: ( a) 23A e 23B, (b) 23A e 23F, (c) 23B e 23F, (d) 23A, (e) 23B e (f) 23F, (4) 24F, (5) 31 e (6) 35B.

[086] Em uma submodalidade da Modalidade E1, os um ou mais sorotipos do sorogrupo 23 são 23A e 23B (isto é, nenhum outro sorotipo do sorogrupo 23 está presente). Em uma submodalidade adicional da Modalidade E1, os um ou mais sorotipos do sorogrupo 23 são 23A e 23F. Em uma outra submodalidade da Modalidade E1, os um ou mais sorotipos do sorogrupo 23 são 23B e 23F. Ainda em uma outra submodalidade da Modalidade E1, 23A é o único sorotipo do sorogrupo 23. Em uma submodalidade adicional da Modalidade E1, 23B é o único sorotipo de sorogrupo 23. Ainda em uma submodalidade adicional da Modalidade E1, 23F é o único sorotipo do sorogrupo 23.

[087] Em um segunda modalidade (Modalidade E2), a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae compreendendo polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem os sorotipos apresentados na Modalidade E1 ou em qualquer submodalidade da Modalidade E1, e compreendem adicionalmente o sorotipo: (1) 6C, (2) 6A ou (3) 6A e 6B.

[088] Em uma submodalidade da Modalidade E2, a composição compreende o sorotipo 6C. Em uma submodalidade adicional da Modalidade E2, a composição compreende sorotipos 6A e 6B e não compreende o sorotipo 6C. Em uma outra submodalidade de Modalidade E2, a composição compreende o sorotipo 6A.

[089] Em uma terceira modalidade (Modalidade E3), a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae compreendendo polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem os sorotipos apresentados na Modalidades E1 ou em qualquer uma das submodalidades da Modalidade E1 ou Modalidade E2 ou em qualquer submodalidade da Modalidade E2, e compreendem adicionalmente os sorotipos: (1) 8, (2) 9N, (3) 11A, (4) 12F, (5) 15B ou 15C, (6) 17F e (7) 20A e/ou 20B.

[090] Em uma quarta modalidade (Modalidade E4), a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae compreendendo polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem os sorotipos apresentados em qualquer uma das Modalidades E1 a E3 ou em quaisquer submodalidades das mesmas, e compreendem adicionalmente os sorotipos: 10A ou 39.

[091] Em uma quinta modalidade (Modalidade E5), a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae conforme descrito acima, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem, consistem ou consistem essencialmente em: 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B.

[092] Em uma sexta modalidade (Modalidade E6), a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae conforme descrito acima, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem, consistem ou consistem essencialmente em: 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B.

[093] Em uma sétima modalidade (Modalidade E7), a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae conforme descrito acima, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem, consistem ou consistem essencialmente em: 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B.

[094] Em uma oitava modalidade (Modalidade E8), a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae conforme descrito acima, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem, consistem ou consistem essencialmente em: 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B.

[095] Em uma nona modalidade (Modalidade E9), a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae conforme descrito acima, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem os sorotipos apresentados em qualquer uma das Modalidades E1 a E8 (ou qualquer submodalidade das mesmas), e compreendem adicionalmente os sorotipos: 3, 7F e 19A.

[096] Em uma décima na modalidade (Modalidade E10), a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae conforme descrito acima, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem os sorotipos apresentados em qualquer uma das Modalidades E1 a E9 (ou qualquer submodalidade das mesmas), e compreendem adicionalmente o sorotipo 22F.

[097] Em uma décima primeira modalidade (Modalidade E11), a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae conforme descrito acima, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem os sorotipos apresentados em qualquer uma das Modalidades E1 a E10 (ou qualquer submodalidade das mesmas), e compreendem adicionalmente o sorotipo 33F.

[098] Em uma décima segunda modalidade (Modalidade E12), a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae conforme descrito acima, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem, consistem ou consistem essencialmente em um conjunto de sorotipos de S. pneumoniae selecionados a partir do grupo que consiste em: (1) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (2) 15A, 16F, 23F, 23B, 24F, 31 e 35B, (3) 15A, 16F, 23A, 23F, 24F, 31 e 35B, (4) 15A, 16F, 23A, 24F, 31 e 35B, (5) 15A, 16F, 23B, 24F, 31 e 35B, (6) 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (7) 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (8) 6C, 15A, 16F, 23F, 23B, 24F, 31 e 35B, (9) 6C, 15A, 16F, 23A, 23F, 24F, 31 e 35B, (10) 6C, 15A, 16F, 23A, 24F, 31 e 35B, (11) 6C, 15A, 16F, 23B, 24F, 31 e 35B, (12) 6C, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (13) 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (14) 6A, 15A, 16F, 23F, 23B, 24F, 31 e 35B, (15) 6A, 15A, 16F, 23A, 23F, 24F, 31 e 35B, (16) 6A, 15A, 16F, 23A, 24F, 31 e 35B, (17) 6A, 15A, 16F, 23B, 24F, 31 e 35B, (18) 6A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (19) 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (20) 6A, 6B, 15A, 16F, 23F, 23B, 24F, 31 e 35B, (21) 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23F, 24F, 31 e 35B, (22) 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 24F, 31 e 35B, (23) 6A, 6B, 15A, 16F, 23B, 24F, 31 e 35B, e (24) 6A, 6B, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B.

[099] Em uma décima terceira modalidade (Modalidade E13), a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae conforme descrito acima, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem, consistem ou consistem essencialmente em um conjunto de sorotipos de S. pneumoniae selecionados a partir do grupo que consiste em: (1) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (2) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (3) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (4) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (5) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (6) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (7) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (8) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (9) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (10) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (11) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (12) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (13) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (14) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (15) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (16) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (17) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (18) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (19) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (20) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (21) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (22) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (23) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (24) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (25) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (26) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (27) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (28) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (29) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (30) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (31) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, e (32) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B.

[0100] A décima terceira modalidade (Modalidade E13) compreende adicionalmente o conjunto de sorotipos de S. pneumoniae, fileiras (1) a (32) em que o sorotipo 20A em cada conjunto é substituído por sorotipo 20 ou sorotipo 20B.

[0101] Em uma décima quarta modalidade da invenção, (Modalidade E14), a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae conforme descrito acima, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem, consistem ou consistem essencialmente em um conjunto de sorotipos de S. pneumoniae selecionados a partir de qualquer um dos conjuntos de sorotipos apresentados na Modalidade E13, fileiras (17) a (32), e compreendem adicionalmente os sorotipos 23A e/ou 23B.

[0102] Em uma décima quinta modalidade (Modalidade E15), a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae conforme descrito acima, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem, consistem ou consistem essencialmente em um conjunto de sorotipos de S. pneumoniae selecionados a partir do grupo que consiste em: (1) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (2) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (3) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (4) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (5) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (6) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (7) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (8) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (9) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (10) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (11) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (12) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (13) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (14) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (15) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (16) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, (17) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (18) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (19) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (20) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (21) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (22) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (23) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (24) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (25) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (26) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (27) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (28) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (29) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (30) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (31) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (32) 3, 7F, 19A, 22F, 33F,8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 e 35B, (33) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20B, (34) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24B, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A, (35) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24B, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20B, (36) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20B, (37) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24B, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A, (38) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24B, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20B, (39) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20, (40) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24B, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20, (41) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24B, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20, (42) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20, (43) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24B, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20 e (44) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24B, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20.

[0103] Em uma décima sexta modalidade da invenção, (Modalidade E16), a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae conforme descrito acima, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem, consistem ou consistem essencialmente em um conjunto de sorotipos de S. pneumoniae selecionados a partir de qualquer um dos conjuntos de sorotipos apresentados na Modalidade E15, fileiras (17) a (32), e compreendem adicionalmente os sorotipos 23A e/ou 23B.

[0104] Em uma décima sétima modalidade (Modalidade E17), a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae compreendendo polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem um conjunto de sorotipos selecionados a partir do grupo que consiste em: i. 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, ii. 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A, e iii. 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A;

[0105] Em submodalidades da Modalidade E17, a composição imunogênica não compreende quaisquer conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae adicionais.

[0106] Em uma décima oitava modalidade (Modalidade E18), a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae compreendendo polissacarídeo capsular de sorotipos de S. pneumoniae 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B. Em submodalidades da Modalidade E18, a composição imunogênica não compreende quaisquer conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae adicionais.

[0107] Em uma décima nona modalidade (Modalidade E19), a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae compreendendo polissacarídeo capsular de sorotipos de S. pneumoniae 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A. Em submodalidades da Modalidade E19, a composição imunogênica não compreende quaisquer conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae adicionais .

[0108] Em uma vigésima modalidade (Modalidade E20), a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae compreendendo polissacarídeo capsular de sorotipos de S. pneumoniae 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A. Em submodalidades da Modalidade E20, a composição imunogênica não compreende quaisquer conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae adicionais .

[0109] Em uma outra modalidade, a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae compreendendo polissacarídeo capsular de sorotipos de S. pneumoniae 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A. Em submodalidades dessa modalidade (isto é, 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, e 20A), a composição imunogênica não compreende quaisquer conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae adicionais .

[0110] Em uma outra modalidade, a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae compreendendo polissacarídeo capsular de sorotipos de S. pneumoniae 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20. Em submodalidades dessa modalidade (isto é, 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20), a composição imunogênica não compreende quaisquer conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae adicionais .

[0111] Em uma outra modalidade, a invenção fornece uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae compreendendo polissacarídeo capsular de sorotipos de S. pneumoniae 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20B. Em submodalidades dessa modalidade (isto é, 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20B), a composição imunogênica não compreende quaisquer conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae adicionais .

[0112] Conforme mostrado na presente invenção (vide EXEMPLO 3 abaixo), o polissacarídeo pneumocócico O-desacetilado sorotipo 15B é equivalente ao polissacarídeo pneumocócico de sorotipo 15C e tem um espectro de RMN idêntico. O polissacarídeo pneumocócico O-desacetilado sorotipo 15B, conforme descrito e revelado na presente invenção, é equivalente ao polissacarídeo pneumocócico de sorotipo 15C e ambos têm um teor de O-Acetila por unidade de repetição na faixa de 0 a 5%, ou na faixa de 0 a 4%, ou na faixa de 0 a 3%, ou na faixa de 0 a 2%, ou na faixa de 0 a 1%, ou na faixa de 0 a 0,5%, ou na faixa de 0 a 0,1%, ou nenhum teor de O-Acetila. Em um relatório por Spencer B.L., et al., 15C pode ser levemente O-Acetilado (Spencer, B.L. et al., Clin. Vac. Immuno. (2017) 24(8): 1 a 13). Assim, em qualquer uma das modalidades das composições imunogênicas multivalentes na presente invenção, o sorotipo 15B O- desacetilado pode ser usado no lugar do sorotipo 15C. Processos de O- desacetilação são conhecidos na técnica, por exemplo, conforme descrito em Rajam et al., Clinical e Vaccine Immunology, 2007, 14(9):1223 a 1227.

[0113] Em certas modalidades de qualquer uma das composições imunogênicas multivalentes da invenção, incluindo as Modalidades E1 a E20 e qualquer submodalidade das mesmas, a composição compreende adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável.

Reatividade Cruzada

[0114] Em uma modalidade, a invenção fornece composições imunogênicas multivalentes que compreendem conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae, incluindo sorotipo 6C, conjugado a uma proteína carreadora, em que o sorotipo 6C de S. pneumoniae fornece proteção cruzada contra sorotipos 6A e 6B de S. pneumoniae .

[0115] Em uma outra modalidade, a invenção fornece composições imunogênicas multivalentes que compreendem conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae conforme selecionados a partir das Modalidades E1 a E20 em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae, incluindo sorotipo 6C, conjugado a uma proteína carreadora, em que o sorotipo 6C de S. pneumoniae fornece proteção cruzada contra sorotipos 6A e 6B de S. pneumoniae .

[0116] Em uma modalidade, a invenção fornece composições imunogênicas multivalentes que compreendem conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae, incluindo sorotipo 19A, conjugado a uma proteína carreadora, em que o sorotipo 19A de S. pneumoniae fornece proteção cruzada contra sorotipo 19F de S. pneumoniae .

[0117] Em uma outra modalidade, a invenção fornece composições imunogênicas multivalentes que compreendem conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae conforme selecionados a partir das Modalidades E1 a E20 em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae, incluindo sorotipo 19A, conjugado a uma proteína carreadora, em que o sorotipo 19A de S. pneumoniae fornece proteção cruzada contra sorotipo 19F de S. pneumoniae .

[0118] Em uma modalidade, a invenção fornece composições imunogênicas multivalentes que compreendem conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae, incluindo sorotipos 23A e/ou 23B, conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos 23A e/ou 23B de S. pneumoniae fornecem proteção cruzada contra sorotipo 23F de S. pneumoniae .

[0119] Em uma outra modalidade, a invenção fornece composições imunogênicas multivalentes que compreendem conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae conforme selecionados a partir das Modalidades E1 a E20 em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae, incluindo sorotipos 23A e/ou 23B, conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos 23A e/ou 23B de S. pneumoniae fornecem proteção cruzada contra sorotipo 23F de S. pneumoniae .

[0120] Em uma modalidade, a invenção fornece composições imunogênicas multivalentes que compreendem conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae, incluindo sorotipo 6A, conjugado a uma proteína carreadora, em que o sorotipo 6A de S. pneumoniae fornece proteção cruzada contra sorotipos 6B e/ou 6C de S. pneumoniae .

[0121] Em uma outra modalidade, a invenção fornece composições imunogênicas multivalentes que compreendem conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae conforme selecionados a partir das Modalidades E1 a E20 em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae, incluindo sorotipo 6A, conjugado a uma proteína carreadora, em que o sorotipo 6A de S. pneumoniae fornece proteção cruzada contra sorotipos 6B e/ou 6C de S. pneumoniae .

[0122] Em uma modalidade, a invenção fornece composições imunogênicas multivalentes que compreendem conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae, incluindo sorotipo 20A, conjugado a uma proteína carreadora, em que o sorotipo 20A de S. pneumoniae fornece proteção cruzada contra sorotipo 20B de S. pneumoniae .

[0123] Em uma outra modalidade, a invenção fornece composições imunogênicas multivalentes que compreendem conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae conforme selecionados a partir das Modalidades E1 a E20 em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae, incluindo sorotipo 20A, conjugado a uma proteína carreadora, em que o sorotipo 20A de S. pneumoniae fornece proteção cruzada contra sorotipo 20B de S. pneumoniae .

[0124] Em uma modalidade, a invenção fornece composições imunogênicas multivalentes que compreendem conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae, incluindo sorotipo 20B, conjugado a uma proteína carreadora, em que o sorotipo 20B de S. pneumoniae fornece proteção cruzada contra sorotipo 20A de S. pneumoniae .

[0125] Em uma outra modalidade, a invenção fornece composições imunogênicas multivalentes que compreendem conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae conforme selecionados a partir das Modalidades E1 a E20 em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae, incluindo sorotipo 20B, conjugado a uma proteína carreadora, em que o sorotipo 20B de S. pneumoniae fornece proteção cruzada contra sorotipo 20A de S. pneumoniae .

[0126] Em uma modalidade, a invenção fornece composições imunogênicas multivalentes que compreendem conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae, incluindo sorotipo 15C, conjugado a uma proteína carreadora, em que o sorotipo 15C de S. pneumoniae fornece proteção cruzada contra sorotipo 15B de S. pneumoniae .

[0127] Em uma outra modalidade, a invenção fornece composições imunogênicas multivalentes que compreendem conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae conforme selecionados a partir das Modalidades E1 a E20 em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae, incluindo sorotipo 15C, conjugado a uma proteína carreadora, em que o sorotipo 15C de S. pneumoniae fornece proteção cruzada contra sorotipo 15B de S. pneumoniae .

Proteína Carreadora

[0128] Em modalidades particulares da presente invenção, CRM197 é usada como a proteína carreadora. CRM197 é uma variante não tóxica (isto é, toxoide) de toxina diftérica que tem a sequência de aminoácidos a seguir: GADDVVDSSK SFVMENFSSY HGTKPGYVDS IQKGIQKPKS GTQGNYDDDW KEFYSTDNKY DAAGYSVDNE NPLSGKAGGV VKVTYPGLTK VLALKVDNAE TIKKELGLSL TEPLMEQVGT EEFIKRFGDG ASRVVLSLPF AEGSSSVEYI NNWEQAKALS VELEINFETR GKRGQDAMYE YMAQACAGNR VRRSVGSSLS CINLDWDVIR DKTKTKIESL KEHGPIKNKM SESPNKTVSE EKAKQYLEEF HQTALEHPEL SELKTVTGTN PVFAGANYAA WAVNVAQVID SETADNLEKT TAALSILPGI GSVMGIADGA VHHNTEEIVA QSIALSSLMV AQAIPLVGEL VDIGFAAYNF VESIINLFQV VHNSYNRPAY SPGHKTQPFL HDGYAVSWNT VEDSIIRTGF QGESGHDIKI TAENTPLPIA GVLLPTIPGK LDVNKSKTHI SVNGRKIRMR CRAIDGDVTF CRPKSPVYVG NGVHANLHVA FHRSSSEKIH SNEISSDSIG VLGYQKTVDH TKVNSKLSLF FEIKS (SEQ ID NO:1).

[0129] Em uma modalidade, CRM197 é isolada de culturas de cepa C7 de Corynebacterium diphtheria (β197) crescidas em casaminoácidos e meio à base de extrato de levedura. Em uma outra modalidade, CRM197 é preparada recombinantemente de acordo com os métodos descritos em US 5,614,382, Tipicamente, CRM197 é purificada através de uma combinação de ultrafiltração, precipitação com sulfato de amônio e cromatografia de troca iônica. Em algumas modalidades, CRM197 é preparada em Pseudomonas fluorescens usando Pfenex Expression Technology™ (Pfenex Inc., San Diego, CA).

[0130] Outras proteínas carreadoras adequadas incluem toxinas bacterianas inativadas adicionais como DT (toxoide diftérico) ou fragmento B de DT (DTFB), TT (toxoide tetânico) ou fragmento C de TT, toxoide de pertussis, toxoide de cólera (por exemplo, conforme descrito no WO 2004/083251), E. coli LT, E. coli ST e exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. As proteínas de membrana externa bacterianas como complexo de membrana externa c (OMPC), porinas, proteínas de ligação à transferrina, proteína de superfície pneumocócica A (PspA; Vide o documento WO 02/091998), proteína de adesina pneumocócica (PsaA), peptidase C5a de estreptococos do Grupo A ou Grupo B ou proteína D de Haemophilus influenzae, pneumolisina pneumocócica (Kuo et al., 1995, Infect Immun 63; 2706 a 13) incluindo ply desintoxicada de algum modo, por exemplo, dPLY-GMBS (Vide o documento WO 04/081515) ou dPLY-formol, PhtX, incluindo PhtA, PhtB, PhtD, PhtE e fusões de proteínas Pht, por exemplo, fusões de PhtDE, fusões de PhtBE (Vide os documentos WO 01/98334 e WO 03/54007) podem ser usadas também. Outras proteínas, como ovalbumina, hemacianina de lapa de fechadura (KLH), albumina sérica bovina (BSA) ou derivado de proteína purificado de tuberculina (PPD), PorB (de N. meningitidis), PD ( proteína D de Haemophilus influenzae; vide, por exemplo, EP 0 594 610 B) ou equivalentes imunologicamente funcionais dos mesmos, peptídeos sintéticos (Vide EP0378881 e EP0427347), proteínas de choque térmico (Vide WO 93/17712 e WO 94/03208), proteínas pertussis (Vide WO 98/58668 e EP0471177), citocinas, linfocinas, fatores ou hormônios de crescimento (Vide WO 91/01146), proteínas artificiais que compreendem múltiplos epítopos de célula T de CD4+ humana de vários antígenos derivados de patógeno (Vide Falugi et al., 2001, Eur J Immunol 31:3816 a 3824) como proteína N19 (Vide Baraldoi et al., 2004, Infect Immun 72:4884 a 7), proteínas de captação de ferro (Vide o documento WO 01/72337), toxina A ou B de C. difficile (Vide o documento WO 00/61761), e flagelina (Vide - Yedidia et al., 1998, Immunol Lett 64:9) podem ser usadas também como proteínas carreadoras.

[0131] Outros mutantes de DT podem ser usados como uma proteína carreadora, como CRM176, CRM228, CRM45 (Uchida et al., 1973, J Biol Chem 218:3838 a 3844); CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 e CRM107 e outras mutações descritas por Nicholls e Youle in Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; deleção ou mutação de Glu-148 para Asp, Gln ou Ser e/ou Ala 158 para Gly e outras mutações reveladas em US 4,709,017 ou US 4,950,740; mutação de pelo menos um ou mais resíduos de Lys 516, Lys 526, Phe 530 e/ou Lys 534 e outras mutações reveladas em US 5,917,017 ou na Patente n° US 6,455,673; ou fragmento revelado em US 5,843,711. Tais mutantes de DT podem ser usados também para produzir variantes de DTFB nas quais as variantes compreendem o fragmento B contêm as regiões de epítopo.

[0132] Em certas modalidades, a proteína carreadora é selecionada a partir do grupo que consiste em: Complexo de Proteína de Membrana Externa (OMPC), toxoide tetânico, toxoide diftérico, proteína D e CRM197.

[0133] Em algumas modalidades da invenção, uma segunda carreadora pode ser usada para um ou mais dos conjugados de polissacarídeo-proteína na composição imunogênica multivalente. A segunda proteína carreadora é, de preferência, uma proteína que é não tóxica e não reatogênica e obtenível em quantidade e pureza suficientes. A segunda proteína carreadora é também conjugada ou ligada com o S. pneumoniae polissacarídeo para melhorar a imunogenicidade do antígeno. As proteínas carreadoras devem ser tratáveis para procedimentos de conjugação padrão. Em uma modalidade, cada polissacarídeo capsular não conjugado na primeira proteína carreadora é conjugado na mesma segunda proteína carreadora (por exemplo, cada molécula de polissacarídeo capsular sendo conjugado em uma única proteína carreadora). Em uma outra modalidade, os polissacarídeos capsulares não conjugados na primeira proteína carreadora são conjugados em duas ou mais proteínas carreadoras (cada molécula de polissacarídeo capsular sendo conjugada em uma única proteína carreadora). Em tais modalidades, cada polissacarídeo capsular do mesmo sorotipo é conjugado tipicamente na mesma proteína carreadora.

[0134] Em modalidades da invenção, incluindo qualquer uma das Modalidades E1 a E20 e quaisquer submodalidades das mesmas, um ou mais sorotipos de polissacarídeo (incluindo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, quando aplicável) são conjugados em CRM197. Em modalidades adicionais da invenção, incluindo qualquer uma das Modalidades E1 a E20 e quaisquer submodalidades das mesmas, cada um dos sorotipos de polissacarídeo é conjugado em CRM197.

[0135] A formulação dos conjugados de polissacarídeo-proteína da presente invenção pode ser realizada com o uso de métodos reconhecidos na técnica. Por exemplo, os conjugados pneumocócicos individuais podem ser formulados com um veículo fisiologicamente aceitável para preparar a composição. Exemplos de tais veículos incluem, mas não se limitam a, água, solução salina tamponada, polióis (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol líquido) e soluções de dextrose.

[0136] Em uma modalidade preferencial, a composição de vacina é formulada em tampão de L-histidina com cloreto de sódio.

[0137] Em algumas modalidades da invenção, a composição imunogênica multivalente compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae compreendendo polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora e um adjuvante, em que os sorotipos de S. pneumoniae são conforme descritos na presente invenção. Adjuvantes adequados para melhorar a eficácia da composição incluem, mas não se limitam a: (45) sais de alumínio (alum), como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc.; (46) formulações de emulsão de óleo em água (com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos como peptídeos de muramil (definidos abaixo) ou componentes de parede celular bacteriana), como, por exemplo, ( a) MF59 (Publicação de Pedido de Patente Internacional n° WO 90/14837) contendo 5% de Esqualeno, 0,5% de Tween 80 e 0,5% de Span 85 (contendo opcionalmente várias quantidades de MTP-PE) formulado em partículas submicrônicas com o uso de um microfluidizador como microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF contendo 10% de Esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero bloqueado por purônico L121, e thr-MDP microfluidizado em uma emulsão submicrônica ou agitado para gerar uma emulsão de tamanho de partícula maior, (c) sistema adjuvante Ribi™ (RAS), (Corixa, Hamilton, MT) contendo 2% de Esqualeno, 0,2% de Tween 80, e um ou mais componentes de parede celular bacteriana do grupo que consiste em monofosforilipídeo A 3-O- desacilado (MPL™) descrito na Patente n° US 4,912,094, dimicolato de trealose (TDM) e esqueleto de parede celular (CWS), de preferência, MPL+CWS (Detox™); e (d) um Montanide ISA; (47) adjuvantes de saponina, como Quil A ou STIMULON™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (vide, por exemplo, Patente n° US 5.057.540) podem ser usados ou partículas geradas a partir dos mesmos como ISCOM (complexos imunoestimulantes formados pela combinação de proteínas de colesterol, saponina, fosfolipídeo e anfipáticas) e Iscomatrix® (que tem essencialmente a mesma estrutura que um ISCOM, mas sem a proteína); (48) lipopolissacarídeos bacterianos, análogos de lipídeo sintético A como compostos de aminoalquil glucosamina fosfato (AGP) ou derivados ou análogos dos mesmos que estão disponíveis a partir de Corixa e que são descritos na Patente n° US 6,113,918; tal AGP é 2-[(R)-3- tetradecanoiloxitetradecanoilamino]etil 2-Desoxi-4-O-fosfono-3-O-[(R)-3- tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3--tetradecanoiloxitetradecanoilamino]-b- D-glucopiranósido que é conhecido também como 529 (conhecido anteriormente como RC529) que é formulado como uma forma aquosa ou como uma emulsão estável (49) polinucleotídeos sintéticos como oligonucleotídeos contendo motivo(s) de CpG (Patente n° US 6,207,646); e (50) citocinas, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, etc.), interferons (por exemplo, interferon-gama), fator estimulante de colônia de macrófagos e granulócitos (GM-CSF), fator estimulador de colônia de macrófago (M-CSF), fator de necrose tumoral (TNF), moléculas coestimulatórias B7-1 e B7-2, etc; e (51) complemento, como um trímero de componente complementar C3d.

[0138] Em uma outra modalidade, o adjuvante é uma mistura de 2, 3 ou mais dos adjuvantes acima, por exemplo. SBAS2 (uma emulsão de óleo em água contendo também lipídeo A de monofosforila 3-desacilado e QS21).

[0139] Os peptídeos de muramil incluem, mas não se limitam a, N-acetil- muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanine-2- (1'-2' dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc.

[0140] Em certas modalidades, o adjuvante é um sal de alumínio. O adjuvante de sal de alumínio pode ser uma vacina precipitada por alum ou um vacina adsorvida com alum. OS adjuvantes de sal de alumínio são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Harlow, E. e D. Lane (1988; Antibodies: um Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory) e Nicklas, W. (1992; Aluminum sals. Research in Immunology 143:489 a 493). O sal de alumínio inclui, mas não se limita a, alumina hidratada, hidrato de alumina, tri-hidrato de alumina (ATH), hidrato de alumínio, tri-hidrato de alumínio, alhydrogel, Superfos, Amphogel, hidróxido de alumínio (III), hidroxifosfato de alumínio, Adjuvante de Fosfato de Alumínio (APA), alumina amorfa, alumina tri- hidratada ou tri-hidroxialumínio.

[0141] APA é uma suspensão aquosa de hidroxifosfato de alumínio. APA é fabricado ao misturar cloreto de alumínio e fosfato de sódio em uma razão volumétrica de 1:1 para precipitar hidroxifosfato de alumínio. Após o processo de mistura, o material é reduzido em tamanho com um misturador de alto cisalhamento para alcançar uma distribuição monodispersa de tamanho de partícula. Então, o produto é diafiltrado contra solução salina fisiológica e vapor d’água.

[0142] Em certas modalidades, um Al(OH)3 comercialmente disponível (por exemplo, Alhydrogel ou Superfos de Denmark/Accurate Chemical e Scientific Co., Westbury, NI) é usado para adsorver proteínas em um razão de 50 a 200 μg de proteína/mg de hidróxido de alumínio. A Adsorção de proteína é dependente, em uma outra modalidade, no pI (pH Isoelétrico) da proteína e no pH do meio. Uma proteína com um pI inferior adsorve o íon de alumínio positivamente carregado mais fortemente que uma proteína com um pI superior. Sais de alumínio podem estabelecer um depósito de antígeno que é liberado lentamente por um período de 2 a 3 semanas, estarem envolvidos em uma ativação de macrófagos não específica e ativação complementar, e/ou estimular o mecanismo imune inato (possivelmente, através de ácido úrico). Vide, por exemplo, Lambrecht et al., 2009, Curr Opin Immunol 21:23.

[0143] Os conjugados aquosos concentrados monovalentes são misturados tipicamente em conjunto e diluídos para atingir 4 μg/mL para todos os sorotipos exceto o 6B, que será diluído para atingir 8 μg/ml. Uma vez diluído, o lote será esterilizado por filtro, e um volume de adjuvante de fosfato de alumínio igual adicionado assepticamente para atingir uma concentração de alumínio final de 250 μg/ml. O lote formulado como adjuvante será preenchido em frascos de 0,5 ml/dose de único uso.

[0144] Em certas modalidades, o adjuvante é uma sequência de nucleotídeo contendo CpG, por exemplo, um oligonucleotídeo contendo CpG, em particular, um oligo-oxinucleotídeo contendo CpG (CpG ODN). Em uma outra modalidade, o adjuvante é ODN 1826 que pode ser adquirido a partir de Coley Pharmaceutical Group.

[0145] Os métodos para uso de oligonucleotídeos de CpG são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Sur et al., 1999, J Immunol. 162:6284 a 93; Verthelyi, 2006, Methods Mol Med. 127:139 a 58; e Yasuda et al., 2006, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 23:89-110.

[0146] Em modalidades alternativas, a composição imunogênica compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae conforme descrito na presente invenção, por exemplo, em qualquer uma das Modalidades E1 a E20 ou em qualquer submodalidade das mesmas, e não compreende um adjuvante.

Formulações

[0147] A composição da invenção pode ser formulada como frascos de doses únicas, frascos de múltiplas doses ou como seringas de vidro ou plástico pré-preenchidas.

[0148] Em uma outra modalidade, as composições da presente invenção são administradas oralmente, e são, assim, formuladas em uma forma adequada para administração oral, isto é, como uma preparação sólida ou líquida. As formulações orais sólidas incluem comprimidos, cápsulas, pílulas, grânulos, péletes e similares. As formulações orais líquidas incluem soluções, suspensões, dispersões, emulsões, óleos e similares.

[0149] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis para formulações líquidas são soluções aquosas ou não aquosas, suspensões, emulsões ou óleos. Exemplos de solventes não aquosos são propilenoglicol, polietilenoglicol e ésteres orgânicos injetáveis como oleato de etila. Os carreadores aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões que incluem solução salina ou meio tamponado. Exemplos de óleos são óleos de origem animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, 'óleo de soja, azeite, óleo de girassol, óleo de fígado de peixe, um outro óleo marinho ou um lipídeo de leite ou ovos.

[0150] A composição farmacêutica pode ser isotônica, hipôtonica ou hipertônica. Entretanto, é frequentemente preferencial que uma composição farmacêutica para infusão ou injeção seja essencialmente isotônica, quando é administrada. Por conseguinte, para armazenamento, a composição farmacêutica pode ser, de preferência, isotônica ou hipertônica. Se a composição farmacêutica for hipertônica, para armazenamento a mesma pode ser diluída para se tornar uma solução isotônica antes da administração.

[0151] O agente isotônico pode ser um agente isotônico iônico como um sal ou um agente isotônico não iônico como um carboidrato. Exemplos de agentes isotônicos iônicos incluem, mas não se limitam a, NaCl, CaCl2, KCl e MgCl2, Exemplos de agentes isotônicos não iônicos incluem, mas não se limitam a, manitol, sorbitol e glicerol.

[0152] É preferencial também que pelo menos um aditivo farmaceuticamente aceitável seja um tampão. Para alguns propósitos, por exemplo, quando a composição farmacêutica serve para infusão ou injeção, é frequentemente desejável que a composição compreenda um tampão que tem capacidade de tamponar uma solução para um pH na faixa de 4 a 10, como 5 a 9, por exemplo, 6 a 8.

[0153] O tampão pode ser, por exemplo, selecionado a partir do grupo que consiste em tampão de TRIS, acetato, glutamato, lactato, maleato, tartarato, fosfato, citrato, carbonato, glicinato, histidina, glicina, succinato e trietanolamina.

[0154] O tampão pode ser selecionado a partir de tampões compatíveis com USP para uso parenteral, em particular, quando a formulação farmacêutica é para uso parenteral. Por exemplo, o tampão pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em ácidos monobásicos como acético, benzoico, glucônico, glicérico e láctico; ácidos dibásicos como acotínico, adípico, ascórbico, carbônico, glutâmico, málico, succínico e tartárico, ácidos polibásicos como cítrico e fosfórico; e bases como amônia, dietanolamina, glicina, trietanolamina e TRIS.

[0155] Os veículos parenterais (para injeção subcutânea, intravenosa, intra-arterial ou intramuscular) incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, solução de Ringer com lactato e óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluido e nutriente, reabastecedores de eletrólito como esses à base de dextrose de Ringer e similares. Exemplos são líquidos estéreis como água e óleos com ou sem a adição de um tensoativo e outros adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis. Em geral, água, solução salina, dextrose aquosa e soluções de açúcar relacionadas, glicóis como propilenoglicóis ou polietilenoglicol, polissorbato 80 (PS-80), polissorbato 20 (PS-20), e Poloxâmero 188 (P188) são carreadores líquidos preferenciais, particularmente, para soluções injetáveis. Exemplos de óleos são óleos de origem animal, vegetal ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, 'óleo de soja, azeite, óleo de girassol, óleo de fígado de peixe, um outro óleo marinho ou um lipídeo de leite ou ovos.

[0156] As formulações da invenção podem conter também um tensoativo. Os tensoativos preferenciais incluem, mas não se limitam a: o tensoativos de ésteres de polioxietileno sorbitano (chamado comumente de Tweens), especialmente PS-20 e PS-80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO) e/ou óxido de butileno (BO) sob nome comercial DOWFAX™, copolímeros de bloco de EO/PO lineares; octoxinóis, que podem variar no número de grupos etóxi repetidos (oxi-l,2-etanodi-ila), com octoxinol-9 (Triton X100 ou t-octilfenoxipolietoxietanol) sendo de interesse particular; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolipídeos como fosfatidilcolina (lecitina); etoxilatos de nonilfenol, como a série Tergitol™ NP; ésteres graxos de polioxietileno derivados de álcoois laurílicos, cetílicos, estearílicos e oleílicos (conhecidos como tensoativos Brij), como éter trietilenoglicol monolaurílico (Brij 30); e ésteres de sorbitano (conhecidos comumente como SPANs), como trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato de sorbitano. Um tensoativo preferencial para inclusão na emulsão é PS-80.

[0157] Misturas de tensoativos podem ser usadas, por exemplo, misturas de PS-80/Span 85. Uma combinação de um éster de polioxietinelo sorbitano como mono-oleato de polioxietileno sorbitano (PS-80) e um octoxinol como t- octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100) é adequado também. Uma outra combinação útil compreende laureth 9 mais um éster de polioxietileno sorbitano e/ou um octoxinol.

[0158] As quantidades de tensoativos preferenciais (% em peso) são: 0,01 a 1% de ésteres de polioxietileno sorbitano (como PS-80), em particular, cerca de 0,1 %; 0,001 a 0,1 % de octil- ou nonilfenoxi polioxietanóis (como Triton X-100 ou outros detergentes da série Triton), em particular, 0,005 a 0,02%; 0,1 a 20 % de éteres de polioxietileno (como laureth 9), de preferência, 0,1 a 10 % e, em particular, 0,1 a 1 % ou cerca de 0,5%.

[0159] Em certas modalidades, a composição consiste essencialmente em histidina (20mM), solução salina (150mM) e 0,2% de PS-20 ou 0,04% de PS-80 em um pH de 5,8 com 250 μg/mL de APA (adjuvante de Fosfato de Alumínio). PS- 20 pode se situar na faixa de 0,005% a 0,3% (p/v) com a presença de PS-20 ou PS-80 na formulação que controla a agregação durante a fabricação simulada e no transporte com o uso de embalagem primária. Em uma outra modalidade, PS- 20 pode se situar na faixa de 0,025% a 0,8% (p/v). Em uma outra modalidade, PS- 20 pode se situar na faixa de 0,05% a 0,8% (p/v). Em uma outra modalidade, PS- 20 pode se situar na faixa de 0,05% a 0,2% (p/v). O processo consiste em combinar uma mistura de até 24 sorotipos em histidina, solução salina e PS-20 ou PS-80, então, combinar esse material misturado com APA e solução salina com ou sem conservantes antimicrobianos.

[0160] Em modalidades particulares, a composição imunogênica multivalente compreende conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae nos conjugados de polissacarídeo-proteína compreendem qualquer um dos conjuntos de sorotipos apresentados na presente invenção, e compreende adicionalmente histidina 20 a 80 mM com pH 5,8 e NaCl a 150 mM. Em algumas modalidades, a composição imunogênica multivalente compreende adicionalmente de 0,2% a 0,8% p/v de polissorbato 20.

[0161] A escolha de tensoativo pode precisar ser otimizada para produtos de fármaco e substâncias de fármaco diferentes. Para vacinas multivalentes tendo 15 ou mais sorotipos, PS-20 e P188 são preferenciais. A escolha da química usada para fabricar o conjugado pode ter também um papel importante na estabilização da formulação. Em particular, quando as reações de conjugação usadas para preparar conjugados de polissacarídeo-proteína diferentes em uma composição multivalente incluem tanto solvente aquoso quanto solvente de DMSO, sistemas de tensoativo particulares fornecem diferenças significativas na estabilidade. A estabilidade aprimorada de conjugados de polissacarídeo- proteína foi observada com polissorbato 20 sozinha ou com poloxâmero 188 em combinação com um poliol.

[0162] O mecanismo exato de como um detergente específico protege um elemento bioterapêutico é pouco conhecido e não pode ser previsto previamente. Os mecanismos de estabilização possíveis incluem hidratação preferencial, exclusão preferencial, competição de interface de ar/líquido entre o elemento bioterapêutico e a superfície, tensão superficial e/ou associação direta do detergente com o elemento bioterapêutico para mascarar manchas hidrofóbicas que servem como sementes para agregação.

[0163] Poloxâmero pode ser usado também nas composições da invenção. Um poloxâmero é um copolímero de tribloco não iônico composto por uma cadeia hidrofóbica central de polioxipropileno (poli(óxido de propileno)) flanqueada por duas cadeias hidrofílicas de polioxietileno (poli(óxido de etileno)). Poloxâmeros são conhecidos também pelo nome comercial Pluronic®. Devido aos comprimentos dos blocos poliméricos poderem ser customizados, existem muitos poloxâmeros diferentes que têm propriedades levemente diferentes. Para o termo genérico "poloxâmero", esses copolímeros são denominados comumente com a letra "P" (para poloxâmero) seguida por três dígitos, os primeiros dois dígitos x 100 gera a massa molecular aproximada do núcleo de polioxipropileno, e o último dígito x 10 gera a porcentagem de teor de polioxietileno (por exemplo, P407 = Poloxâmero com um massa molecular de polioxipropileno de 4,000 g/mol e um teor de polioxietileno de 70%). Para o nome comercial Pluronic®, a codificação desses copolímeros inicia com uma letra para definir sua forma física à temperatura ambiente (L = líquido, P = pastoso, F = floco (sólido)) seguida por dois ou três dígitos. O primeiro dígito (dois dígitos em um número de três dígitos) na designação numérica multiplicado por 300 indica o peso molecular aproximado do hidrófobo; e o último dígito x 10 gera a porcentagem de teor de polioxietileno (por exemplo, L61 = Pluronic® com uma massa molecular de polioxipropileno de 1.800 g/mol e um teor de polioxietileno de 10%). Vide a Patente n° US 3740421.

[0164] Exemplos de poloxâmeros têm a fórmula geral: HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH, em que os blocos a e b têm os valores a seguir:

[0165] As unidades de peso molecular, conforme usado na presente invenção, são em Dalton (Da) ou g/mol.

[0166] De preferência, o poloxâmero tem, em geral, um peso molecular na faixa de 1.100 a 17.400 Da, de 7.500 a 15.000 Da ou de 7.500 a 10.000 Da. O poloxâmero pode ser selecionado a partir de poloxâmero 188 ou poloxâmero 407. A concentração final do poloxâmero nas formulações é de 0,001% a 5% peso/volume, ou 0,025% a 1% peso/volume. Em certos aspectos, o poliol é propilenoglicol e está na concentração final de 1% a 20% peso/volume. Em certos aspectos, o poliol é polietilenoglicol 400 e está na concentração final de 1% a 20% peso/volume.

[0167] Os polióis adequados para as formulações da invenção são polióis poliméricos, particularmente, dióis de poliéter que incluem, mas não se limitam a, propilenoglicol e polietilenoglicol, éteres monometílicos de polietilenoglicol. O propilenoglicol está disponível em uma faixa de pesos moleculares de ~425 a ~2.700. O polietilenoglicol e o éter monometílico de polietilenoglicol estão também disponíveis em uma faixa de pesos moleculares que se situam na faixa de ~200 a ~35000 que incluem, mas não se limitam a, PEG200, PEG300, PEG400, PEG1000, PEG MME 550, PEG MME 600, PEG MME 2000, PEG MME 3350 e PEG MME 4000. Um polietilenoglicol preferencial é o polietilenoglicol 400. A concentração final de poliol nas formulações da invenção pode ser 1% a 20% peso/volume ou 6% a 20% peso/volume.

[0168] A formulação contém também uma solução salina tamponada com pH. O tampão pode ser, por exemplo, selecionado a partir do grupo que consiste em tampão de TRIS, acetato, glutamato, lactato, maleato, tartarato, fosfato, citrato carbonato glicinato, histidina, glicina, succinato, HEPES (ácido 4-(2- hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfônico), MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanosulfônico), MES (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfônico) e trietanolamina. O tampão tem capacidade de tamponar uma solução em um pH na faixa de 4 a 10, 5,2 a 7,5 ou 5,8 a 7,0. Em certo aspecto da invenção, o tampão é selecionado a partir do grupo que consiste em fosfato, succinato, histidina, MES, MOPS, HEPES, acetato ou citrato. Adicionalmente, o tampão pode ser, por exemplo, selecionado a partir de tampões compatíveis com USP para uso parenteral, em particular, quando a formulação farmacêutica é para uso parenteral. As concentrações de tampão se situarão na faixa de 1 mM a 100 mM. As concentrações de tampão se situarão na faixa de 10 mM a 80 mM. As concentrações de tampão se situarão na faixa de 1 mM a 50 mM ou 5 mM a 50 mM. Em certos aspectos, o tampão é histidina em uma concentração final de 5 mM a 50 mM, ou succinato em uma concentração final de 1 mM a 10 mM. Em certos aspectos, a histidina está em uma concentração final de 20 mM ± 2 mM.

[0169] Embora a solução salina (isto é, uma solução contendo NaCl) seja preferencial, outros sais adequados para formulação incluem, mas não se limitam a, CaCl2, KCl e MgCl2 e combinações dos mesmos. Os agentes isotônicos não iônicos incluem, mas não se limitam a, sacarose, trealose, manitol, sorbitol e glicerol podem ser usados em vez de um sal. As faixas de sal adequadas incluem, mas não se limitam a, 25 mM a 500 mM ou 40 mM a 170 mM. Em um aspecto, a solução salina é NaCl opcionalmente presente em uma concentração de 20 mM a 170 mM.

[0170] Em uma modalidade preferencial, as formulações compreendem um tampão de L-histidina com cloreto de sódio.

[0171] Em uma outra modalidade, a composição farmacêutica é distribuída em um sistema de liberação controlado. Por exemplo, o agente pode ser administrado com o uso de infusão intravenosa, um adesivo transdérmico, lipossomos ou outros modos de administração. Em uma outra modalidade, os materiais poliméricos são usados; por exemplo, em microesferas ou em um implante.

[0172] A quantidade de conjugado em cada dose de vacina é selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetora sem efeitos adversos significativos. Tal quantidade pode variar dependendo do sorotipo pneumocócico. Em geral, para conjugados à base de polissacarídeo, cada dose compreenderá 0,08 a 100 μg de cada polissacarídeo. Em algumas modalidades da invenção, a dose de cada conjugado de polissacarídeo é de 0,08 a 10 μg. Em modalidades adicionais, a dose é de 1 a 5 μg, de 0,4 a 4 μg, de 0,4 a 3 μg, de 0,4 a 2 μg ou de 0,4 a 1 μg. Em algumas modalidades, a dose de um ou mais conjugados de polissacarídeo é 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 ou 750 ng ou 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,75, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7,5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 μg.

[0173] Em algumas modalidades das composições da invenção, todos os conjugados de polissacarídeo estão presentes na composição na mesma quantidade. Em modalidades adicionais, os conjugados de polissacarídeo estão presentes na composição em quantidades diferentes (isto é, pelo menos um conjugado de polissacarídeo está presente em uma quantidade que é diferente dos um ou mais outros conjugados de polissacarídeo da composição).

[0174] As quantidades ótimas de componentes para uma vacina particular podem ser determinadas por estudos padrão envolvendo observação de respostas imunes apropriadas em indivíduos. Por exemplo, em uma outra modalidade, a dosagem para vacinação humana é determinada por extrapolação de estudos em animais para dados humanos. Em uma outra modalidade, a dosagem é determinada empiricamente.

[0175] Em uma modalidade, a dose do sal de alumínio é 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70, 100, 125, 150, 200, 300, 500 ou 700 μg ou 1, 1,2, 1,5, 2, 3, 5 mg ou mais. Ainda em outra modalidade, a dose de sal de alum descrita acima é por μg de proteína recombinante.

[0176] As composições dessa invenção podem incluir também uma ou mais proteínas de S. pneumoniae. Exemplos de proteínas de S. pneumoniae adequadas para inclusão incluem as proteínas identificadas nas Publicações de Pedido de Patente Internacional n° WO 02/083855 e n° WO 02/053761.

[0177] Em certas modalidades, as composições da invenção são administradas a um indivíduo através de um ou mais métodos conhecidos por um técnico no assunto, como parenteral, transmucosal, transdérmico, intramuscular, intravenoso, intradérmico, intranasal, subcutâneo, intraperitonealmente, e formuladas em conformidade. Em uma modalidade, as composições da presente invenção são administradas através de injeção epidérmica, injeção intramuscular, injeção intravenosa, intra-arterial, subcutânea ou injeção na mucosa intra-respiratória de uma preparação líquida. As formulações líquidas para injeção inluem soluções e similares.

III. Métodos de Fabricação

[0178] Os polissacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae podem ser preparados através de técnicas padrão conhecidas pelos técnicos no assunto. Por exemplo, os polissacarídeos podem ser isolados a partir de bactérias e podem ser dimensionados até certo ponto através de métodos conhecidos (vide, por exemplo, Patente europeia n° EP497524 e n° EP497525); e, de preferência, através de microfluidização realizada com o uso de um homogeinizador ou através de hidrólise química. Em uma modalidade, cada sorotipo de polissacarídeo pneumocócico é crescido em meio à base de soja. Então, os polissacarídeos individuais são purificados através de etapas padrão que incluem centrifugação, precipitação e ultrafiltração. Vide, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente de n° US 2008/0286838 e a Patente US 5,847,112. Os polissacarídeos podem ser dimensionados a fim de reduzir viscosidade em amostras de polissacarídeo e/ou aprimorar a filtrabilidade para produtos de conjugado com o uso de técnicas como dimensionamento mecânico ou químico. A hidrólise química pode ser conduzida com o uso de ácido acético. O dimensionamento mecânico pode ser conduzido com o uso de Cisalhamento de Homogenização a Alta Pressão.

[0179] Os polissacarídeos purificados podem ser ativados quimicamente para fabricar os sacarídeos que têm capacidade de reagir com a proteína carreadora. Os polissacarídeos purificados podem ser conectados a um ligante. Uma vez ativado ou conectado a um ligante, cada polissacarídeo capsular é conjugado separadamente em uma proteína carreadora para formar um glicoconjugado. Os conjugados de polissacarídeo podem ser preparados através de técnicas de acoplamento conhecidas.

[0180] O polissacarídeo pode ser acoplado a um ligante para formar um intermediário de polissacarídeo-ligante no qual o terminal livre do ligante é um grupo éster. Portanto, o ligante é um ligante no qual pelo menos um terminal é um grupo éster. O outro terminal é selecionado de modo que possa reagir com o polissacarídeo para formar o intermediário de polissacarídeo-ligante.

[0181] O polissacarídeo pode ser acoplado a um ligante com o uso de um grupo amina primário no polissacarídeo. Nesse caso, o ligante tem tipicamente um grupo éster em ambos os terminais. Isso permite que o acoplamento ocorra ao reagir um dos grupos éster com o grupo amina primário no polissacarídeo através de substituição de acila nucleofílica. A reação resulta em um intermediário de polissacarídeo-ligante no qual o polissacarídeo é acoplado ao ligante através de uma ligação amida. Portanto, o ligante é um ligante bifuncional que fornece um primeiro grupo éster para reagir com o grupo amina primário no polissacarídeo e um segundo grupo éster para reagir com o grupo amina primário na molécula carreadora. Um ligante típico é diéster de hidroxissuccimida de ácido adípico (SIDEA).

[0182] O acoplamento pode ocorrer também indiretamente, isto é, com um ligante adicional que é usado para derivatizar o polissacarídeo antes de acoplar ao ligante.

[0183] O polissacarídeo é acoplado ao ligante adicional com o uso de um grupo carbonila no terminal redutor do polissacarídeo. Esse acoplamento compreende duas etapas: (a1) reagir o grupo carbonila com o ligante adicional; e (a2) reagir o terminal livre do ligante adicional com o ligante. Nessas modalidades, o ligante adicional tem tipicamente um grupo amina primário em ambos os terminais, permitindo, desse modo, que a etapa (a1) ocorra ao reagir um dos grupos amina primários com o grupo carbonila no polissacarídeo através de aminação redutiva. É usado um grupo amina primário que é reativo com o grupo carbonila no polissacarídeo. Os grupos hidrazida ou hidroxilamino são adequados. O mesmo grupo amina primário está tipicamente presente em ambos os terminais do ligante adicional. A reação resulta em um intermediário de polissacarídeo-ligante adicional no qual o polissacarídeo é acoplado ao ligante adicional através de uma ligação C—N.

[0184] O polissacarídeo pode ser acoplado ao ligante adicional com o uso de um grupo diferente no polissacarídeo, particularmente, um grupo carboxila. Esse acoplamento compreende duas etapas: (a1) reagir o grupo com o ligante adicional; e (a2) reagir o terminal livre do ligante adicional com o ligante. Nesse caso, o ligante adicional tem tipicamente um grupo amina primário em ambos os terminais, permitindo, desse modo, que a etapa (a1) ocorra ao reagir um dos grupos amina primários com o grupo carboxila no polissacarídeo através de ativação de EDAC. É usado um grupo amina primário que é reativo com o grupo carboxila ativado por EDAC no polissacarídeo. Um grupo hidrazida é adequado. O mesmo grupo amina primário está tipicamente presente em ambos os terminais do ligante adicional. A reação resulta em um intermediário de polissacarídeo-ligante adicional no qual o polissacarídeo é acoplado ao ligante adicional através de uma ligação amida.

[0185] Em uma modalidade, a ativação química dos polissacarídeos e a conjugação subsequente em uma proteína carreadora através de aminação redutiva podem ser alcançados por meios descritos nas Patente n° US 4.365.170, n° US 4,673,574 e n° US 4,902,506, nas Publicações de Pedido de Patente n° US 2006/0228380, n° US 2007/184072, n° US 2007/0231340 e n° US 2007/0184071 e nos documentos WO2006/110381, WO2008/079653 e WO2008/143709). A química pode incluir a ativação de polissacarídeo pneumocócico através de reação com qualquer agente oxidante que oxida um grupo hidroxila terminal em um aldeído, como periodato (incluindo periodato de sódio, periodato de potássio ou ácido periódico). A reação leva a uma clivagem oxidativa aleatória de grupos hidroxila vizinhos dos carboidratos com a formação de grupos aldeído reativos.

[0186] O acoplamento a uma proteína carreadora ocorre por aminação redutiva através de aminação direta para um grupo lisila de uma proteína. Por exemplo, a conjugação pode ser executada ao reagir uma mistura do polissacarídeo ativado e uma proteína carreadora com um agente redutor como cianoboroidreto de sódio na presença de níquel. A reação de conjugação pode ocorrer em solução aquosa ou na presença de DMSO. Vide, por exemplo, os documentos US2015/0231270, US2011/0195086 e EP 0471 177 B1. Então, os aldeídos não reagidos são deslocados de modo extensivo com a adição de um agente redutor forte, como boroidreto de sódio.

[0187] A aminação redutiva envolve duas etapas, (1) oxidação do polissacarídeo para formar aldeídos reativos, (2) redução da imina (base de Schiff) formada entre o polissacarídeo ativado e uma proteína carreadora para formar uma ligação conjugada de amina estável. Antes da oxidação, o polissacarídeo é reduzido opcionalmente em tamanho. Os métodos mecânicos (por exemplo, homogenização) ou a hidrólise química podem ser empregados. A hidrólise química pode ser conduzida com o uso de ácido acético. A etapa de oxidação pode envolver a reação com periodato. Para o propósito da presente invenção, o termo "periodato" inclui tanto periodato quanto ácido periódico; o termo inclui também tanto metaperiodato (IO4-) quanto ortoperiodato (IO6-) e inclui os vários sais de periodato (por exemplo, periodato de sódio e periodato de potássio). Em uma modalidade, o polissacarídeo capsular é oxidado na presença de metaperiodato, de preferência, na presença de periodato de sódio (NaIO4). Em uma outra modalidade, o polissacarídeo capsular é oxidado na presença de ortoperiodato, de preferência, na presença de ácido periódico.

[0188] Em uma modalidade, o agente oxidante é um composto radical nitroxila ou nitróxico estável, como compostos de piperidina-N-oxi ou pirrolidina- N-oxi, na presença de um oxidante para oxidar seletivamente hidroxilas primárias (conforme descrito no WO 2014/097099). Na referida reação, o oxidante real é o sal de N-oxoamônio em um ciclo catalítico. Em um aspecto, o referido composto radical nitroxila ou nitróxido estável são compostos de piperidina-N- oxi ou pirrolidina-N-oxi. Em um aspecto, o referido composto radical nitroxila ou nitróxido estável apresenta uma fração de TEMPO (2,2,6,6-tetrametil-1- piperidiniloxi) ou PROXYL (2,2,5,5-tetrametil-1-pirrolidiniloxi). Em um aspecto, o referido composto radical nitroxila estável é TEMPO ou um derivado do mesmo. Em um aspecto, o referido oxidante é uma molécula que apresenta uma fração de N-halo. Em um aspecto, o referido oxidante é selecionado a partir do grupo que consiste em N-Clorosuccinimida, N-Bromosuccinimida, N-lodosuccinimida, Ácido Dicloroisocianúrico, 1,3,5-tricloro-1,3,5-triazinano-2,4,6-triona, Ácido Dibromoisocianúrico, 1,3,5-tribromo-1,3,5-triazinano-2,4,6-triona, Ácido Di- iodoisocianúrico e 1,3,5-tri-iodo-1,3,5-triazinano-2,4,6-triona. De preferência, o referido oxidante é N-Clorosuccinimida.

[0189] Em certos aspectos, o agente oxidante é o radical livre 2,2,6,6- Tetrametil-1-piperidiniloxi (TEMPO) e N-Clorosuccinimida (NCS) como o co- oxidante (conforme descrito no WO 2014/097099). Portanto, em um aspecto, os glicoconjugados de S. pneumoniae são obteníveis através de um método que compreende as etapas de: a) reagir um sacarídeo com 2,2,6,6-tetrametil-1- piperidiniloxi (TEMPO) e N-clorosuccinimida (NCS) em um solvente aquoso para produzir um sacarídeo ativado; e b) reagir o sacarídeo ativado com uma proteína carreadora que compreende um ou mais grupos amina (o referido método é designado "aminação redutiva de TEMPO/NCS" doravante na presente invenção).

[0190] Opcionalmente, a reação de oxidação é arrefecida através de adição de um agente de arrefecimento. O agente de arrefecimento pode ser selecionado a partir de dióis vizinhos, 1-,2-aminoálcoois, aminoácidos, glutationa, sulfeto, bissulfato, ditionita, metabissulfeto, tiossulfato, fosfitos, hipofosfitos ou ácido fosfórico (como glicerol, etilenoglicol, propan-1,2-diol, butan-1,2-diol ou butan- 2,3-diol, ácido ascórbico).

[0191] Em certas modalidades, a presente invenção fornece um método para preparar um conjugado de polissacarídeo-proteína de Streptococcus pneumoniae de sorotipo 8 utilizando uma reação de conjugação em um solvente aprótico, em que a reação de conjugação não usa cianoboroidreto. Em modalidades adicionais, a reação de conjugação é uma redução de base de Schiff ou aminação redutiva. Em modalidades adicionais, a proteína é toxoide tetânico, toxoide diftérico ou CRM197. Ainda em modalidades adicionais, a proteína é CRM197. Em modalidades adicionais, a reação de conjugação é aminação redutiva. Em modalidades adicionais, a aminação redutiva é realizada em dimetilssulfóxido (DMSO).

[0192] Em algumas modalidades, os polissacarídeos oxidados antes da conjugação têm um peso molecular de entre 30 kDa e 1,000 kDa. O peso molecular pode ser calculado por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) combinada com detector de dispersão de luz em vários ângulos (MALS) e detector de índice de refração (RI). Em algumas modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular de entre 50 kDa e 300 kDa. Em algumas modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular de entre 50 kDa e 1.000 kDa. Em modalidades adicionais, o polissacarídeo tem um peso molecular de entre 70 kDa e 900 kDa. Em outras modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular de entre 100 kDa e 800 kDa. Em outras modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular de entre 200 kDa e 600 kDa. Em modalidades adicionais, o polissacarídeo tem um peso molecular de 100 kDa a 1,000 kDa; 100 kDa a 900 kDa; 100 kDa a 800 kDa; 100 kDa a 700 kDa; 100 kDa a 600 kDa; 100 kDa a 500 kDa; 100 kDa a 400 kDa; 100 kDa a 300 kDa; 150 kDa a 1,000 kDa; 150 kDa a 900 kDa; 150 kDa a 800 kDa; 150 kDa a 700 kDa; 150 kDa a 600 kDa; 150 kDa a 500 kDa; 150 kDa a 400 kDa; 150 kDa a 300 kDa; 200 kDa a 1,000 kDa; 200 kDa a 900 kDa; 200 kDa a 800 kDa; 200 kDa a 700 kDa; 200 kDa a 600 kDa; 200 kDa a 500 kDa; 200 kDa a 400 kDa; 200 kDa a 300; 250 kDa a 1,000 kDa; 250 kDa a 900 kDa; 250 kDa a 800 kDa; 250 kDa a 700 kDa; 250 kDa a 600 kDa; 250 kDa a 500 kDa; 250 kDa a 400 kDa; 250 kDa a 350 kDa; 300 kDa a 1,000 kDa; 300 kDa a 900 kDa; 300 kDa a 800 kDa; 300 kDa a 700 kDa; 300 kDa a 600 kDa; 300 kDa a 500 kDa; 300 kDa a 400 kDa; 400 kDa a 1,000 kDa; 400 kDa a 900 kDa; 400 kDa a 800 kDa; 400 kDa a 700 kDa; 400 kDa a 600 kDa; 500 kDa a 600 kDa.

[0193] A segunda etapa do processo de conjugação é a redução da ligação de imina (base de Schiff) entre o polissacarídeo ativado e uma proteína carreadora para formar uma ligação de conjugado estável (denominada de aminação redutiva) com o uso de um agente redutor. Os agentes redutores que são adequados incluem os cianoboroidretos (como cianoboroidreto de sódio ou boroidreto de sódio). Em uma modalidade, o agente redutor é cianoboroidreto de sódio.

[0194] Em certas modalidades, a reação de aminação redutiva é executada em solvente aprótico (ou em uma mistura de solventes apróticos). Em uma modalidade, a reação de redução é executada em solvente de DMSO ou DMF (dimetilformamida). O solvente de DMSO ou DMF pode ser usado para reconstituir o polissacarídeo ativado e a proteína carreadora caso sejam liofilizados. Em uma modalidade, o solvente aprótico é DMSO.

[0195] No final da reação de redução, pode haver grupos de aldeídos não reagidos que permanecem nos conjugados que podem ser deslocados com o uso de um agente de deslocamento adequado. Em uma modalidade, esse agente de deslocamento é boroidreto de sódio (NaBH4). Alternativas adequadas incluem triacetoxiboroidreto de sódio ou boroidreto de sódio ou zinco na presença de ácidos de Bronsted ou Lewis), amina boranos como piridina borano, 2-Picolina Borano, 2,6-diborano-metanol, dimetilamina-borano, t-BuMe'PrN-BH3,benzilamina-BH3 ou 5-etil-2-metilpiridina borano (PEMB) ou resina de troca de boroidreto. Após a conjugação (a reação de redução e, opcionalmente, o deslocamento), os glicoconjugados podem ser purificados (enriquecidos em relação à quantidade de conjugado de polissacarídeo-proteína) através de uma variedade de técnicas conhecidas pelo técnico no assunto. Essas técnicas incluem diálise, operações de concentração/diafiltração, filtração de fluxo tangencial, precipitação/eluição, cromatografia de coluna (cromatografia de troca iônica, cromatografia de troca iônica multimodal, DEAE ou cromatografia de interação hidrofóbica) e filtração em profundidade. Em uma modalidade, os glicoconjugados são purificados através de diafilitração ou cromatografia de troca iônica ou cromatografia de exclusão por tamanho.

[0196] Os glicoconjugados preparados com o uso de aminação redutiva em um solvente aprótico são, em geral, usados na vacina conjugada pneumocócica multivalente. Assim, em certas modalidades para composições multivalentes em que nem todos os sorotipos são preparados em um solvente aprótico, a reação de redução para os sorotipos remanescentes é executada em solvente aquoso (por exemplo, selecionado a partir de PBS (solução salina tamponada com fosfato), MES (ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico), HEPES (ácido 4-(2- hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico), Bis-tris, ADA (ácido N-(2-Acetamido)iminodiacático), PIPES (ácido piperazina-N,N‘-bis(2-etanossulfônico)), MOPSO (ácido 3-Morfolino-2-hidroxipropanossulfônico), BES (ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanossulfônico), MOPS (3-(ácido N- morfolino)propanossulfônico), DIPSO (ácido 3-Bis(2-hidroxietil) amino-2- hidroxipropano-1-sulfônico), MOBS (4-(N-morfolino)butanossulfônico), HEPPSO (ácido N-(2-Hidroxietil)piperazina-N-(2-hidroxipropanossulfônico)), POPSO (Piperazina-1,4-bis(2-hidroxi-3-propanossulfônico)), TEA (trietanolamina), EPPS (4-(ácido 2-Hidroxietil)piperazina-1-propanossulfônico), Bicina em um pH entre 6,0 e 8,5, 7,0 e 8,0 ou 7,0 e 7,5).

[0197] Os conjugados de polissacarídeo capsular de S. pneumoniae e proteína que podem ser preparados com o uso de aminação redutiva em um solvente aprótico incluem, mas não se limitam a, sorotipos: 3, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 19A, 20A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 31, 33F, 35B e 39. Os conjugados de polissacarídeo capsular de S. pneumoniae e proteína que podem ser preparados com o uso de aminação redutiva em um solvente aprótico incluem, mas não se limitam a, sorotipos: 3, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 19A, 20, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 31, 33F, 35B e 39. Os conjugados de polissacarídeo capsular de S. pneumoniae e proteína que podem ser preparados com o uso de aminação redutiva em um solvente aprótico incluem, mas não se limitam a, sorotipos: 3, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 19A, 20B, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 31, 33F, 35B e 39. Os polissacarídeos podem ser usados na forma de oligossacarídeos. Esses são formados convenientemente através de fragmentação de polissacarídeo purificado (por exemplo, através de hidrólise), que pode ser seguida pela purificação dos fragmentos do tamanho desejado.

[0198] Em certas modalidades, os conjugados de polissacarídeo-proteína pneumocócicos de um ou mais de sorotipos 3, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 19A, 20A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 31, 33F, 35B e 39 são preparados com o uso de aminação redutiva em um solvente aprótico. Em certas modalidades, conjugados de polissacarídeo-proteína pneumocócicos de um ou mais de sorotipos 3, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 19A, 20, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 31, 33F, 35B e 39 são preparados com o uso de aminação redutiva em um solvente aprótico. Em certas modalidades, os conjugados de polissacarídeo-proteína pneumocócicos de um ou mais de sorotipos 3, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 19A, 20B, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 31, 33F, 35B e 39 são preparados com o uso de aminação redutiva em um solvente aprótico. Em certas modalidades, cada um dos sorotipos na composição imunogênica multivalente é preparado com o uso de aminação redutiva em um solvente aprótico. Em certas modalidades, os polissacarídeos de um ou mais sorotipos em uma composição multivalente são conjugados com o uso de aminação redutiva em um solvente aprótico e os polissacarídeos de um ou mais sorotipos são conjugados com o uso de aminação redutiva em um solvente aquoso. Em certas modalidades, os polissacarídeos de dois ou mais sorotipos em uma composição multivalente são conjugados com o uso de aminação redutiva em um solvente aprótico. Em outras modalidades, os polissacarídeos de três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais, sete ou mais, oito ou mais, nove ou mais, dez ou mais, onze ou mais, doze ou mais, treze ou mais, quatorze ou mais, quinze ou mais, dezesseis ou mais, dezessete ou mais, dezoito ou mais, dezenove ou mais, vinte ou mais ou vinte e um ou mais sorotipos em uma composição multivalente são conjugados com o uso de aminação redutiva em um solvente aprótico. Em certas modalidades, os polissacarídeos de um ou mais sorotipos em uma composição multivalente são conjugados com o uso de outras químicas que podem ser em um solvente aprótico ou em um solvente aquoso.

[0199] Assim, a invenção se refere a uma composição imunogênica multivalente que compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae, cada um compreendendo polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae são conforme descrito na presente invenção (isto é, na Seção II, “Composições Imunogênicas Multivalentes ”), em que a reação de conjugação pela qual o polissacarídeo de um ou mais dos conjugados de polissacarídeo-proteína é conjugado à proteína carreadora é em um solvente aprótico. Em certas modalidades, pelo menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100% dos sorotipos em uma composição multivalente são preparados em um solvente aprótico. O restante dos sorotipos é preparado com o uso de uma química alternativa e/ou em um solvente aquoso.

[0200] Se for determinado que o uso de DMSO como um solvente durante a aminação redutiva de conjugados de polissacarídeo-proteína resulta na estabilidade inesperadamente superior e na imunogenicidade melhorada para esses sorotipos relacionados aos mesmos conjugados preparados sob condições aquosas (Vide o Pedido n° de série 62/463.216 e 62/555.444). Conforme mostrado na presente invenção (vide o EXEMPLO 40), as formulações de fármaco contendo o conjugados pneumocócicos da invenção preparados com o uso de aminação redutiva em um solvente aprótico (por exemplo, DMSO) resultaram em estabilidade química e física superior quando em comparação a uma vacina que utiliza substâncias de fármaco preparadas com o uso de um solvente prótico (isto é, aquoso) durante a aminação redutiva no processo de conjugação. Assim, em algumas modalidades, todos os conjugados de polissacarídeo pneumocócico na composição multivalente são preparados em um solvente aprótico.

[0201] Em certas modalidades da invenção, a concentração de polissacarídeo total na composição é de cerca de 0,02 a cerca de 0,175 mg/ml. Em certas modalidades da invenção, a concentração de polissacarídeo total na composição é de cerca de 0,03 a cerca de 0,175 mg/ml. Em certas modalidades da invenção, a concentração de polissacarídeo total na composição é de cerca de 0,04 a cerca de 0,175 mg/ml. Em outras modalidades, a concentração de polissacarídeo total na composição é de cerca de 0,065 a cerca de 0,085 mg/ml, cerca de 0,070 a cerca de 0,080 mg/ml, cerca de 0,065 a cerca de 0,080 mg/ml,cerca de 0,070 a cerca de 0,085 mg/ml, cerca de 0,110 a cerca de 0,128 mg/ml,cerca de 0,110 a cerca de 0,175 mg/ml, cerca de 0,10 a cerca de 0,175 mg/ml, cerca de 0,110 a cerca de 0,170 mg/ml, cerca de 0,115 a cerca de 0,15 mg/ml, cerca de 0,110 a cerca de 0,15 mg/ml, cerca de 0,110 a cerca de 0,125 mg/ml, cerca de 0,150 a cerca de 0,170 mg/ml, cerca de 0,150 a cerca de 0,165 mg/ml,cerca de 0,140 a cerca de 0,170 mg/ml, cerca de 0,130 a cerca de 0,170 mg/ml,cerca de 0,150 a cerca de 0,175 mg/ml, cerca de 0,070 a cerca de 0,170 mg/ml,cerca de 0,065 a cerca de 0,175 mg/mL ou cerca de 0,065 a cerca de 0,180 mg/ml.

[0202] Em modalidades da invenção em que um ou mais ou todos os conjugados de polissacarídeo-proteína nas composições imunogênicas multivalentes são preparadas em um solvente aprótico, a concentração de polissacarídeo total na composição é estável por 4 semanas ou mais a 37 °C, por 4 semanas ou mais a 25 °C e por 12 semanas ou mais a 4 °C.

[0203] Em certas modalidades da invenção em que um ou mais ou todos os conjugados de polissacarídeo-proteína nas composições imunogênicas multivalentes são preparados em um solvente aprótico, o peso molecular médio ponderado (Mw) de todos os conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae na composição (média de todos os conjugados na composição) é de cerca de 3.500 a cerca de 4.700 kDa, de cerca de 3.500 a cerca de 4.600 kDa, de cerca de 3.500 a cerca de 4.500 kDa, de cerca de 3.500 a cerca de 4.400 kDa, de cerca de 3.500 a cerca de 4.300 kDa, de cerca de 3.500 a cerca de 4.200 kDa, de cerca de 3.600 a cerca de 4.700 kDa, de cerca de 3.600 a cerca de 4.600 kDa, de cerca de 3.600 a cerca de 4.500 kDa, de cerca de 3.600 a cerca de 4.400 kDa, de cerca de 3.600 a cerca de 4.300 kDa, de cerca de 3.600 a cerca de 4.200 kDa, de cerca de 3.700 a cerca de 4.700 kDa, de cerca de 3.700 a cerca de 4.600 kDa, de cerca de 3.700 a cerca de 4.500 kDa, de cerca de 3.700 a cerca de 4.400 kDa, de cerca de 3.700 a cerca de 4,300 kDa, de cerca de 3,700 a cerca de 4,200 kDa, de cerca de 3.800 a cerca de 4.700 kDa, de cerca de 3.800 a cerca de 4.600 kDa, de cerca de 3.800 a cerca de 4.500 kDa, de cerca de 3.800 a cerca de 4.400 kDa, de cerca de 3.800 a cerca de 4.300 kDa, de cerca de 3.800 a cerca de 4,200 kDa, de cerca de 3,900 a cerca de 4,700 kDa, de cerca de 3.900 a cerca de 4.600 kDa, de cerca de 3.900 a cerca de 4.500 kDa, de cerca de 3.900 a cerca de 4.400 kDa, de cerca de 3.900 a cerca de 4.300 kDa ou de cerca de 3.900 a cerca de 4.200 kDa.

[0204] Em certas modalidades da invenção em que os conjugados de polissacarídeo-proteína nas composições imunogênicas multivalentes são preparados em um solvente aprótico, o Mw de cada um dos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae na composição (para um único sorotipo) é de cerca de 1.000 a cerca de 10.000 kDa, de cerca de 1.500 a cerca de 5.500 kDa, de cerca de 1.500 a cerca de 5.600 kDa, de cerca de 1.500 a cerca de 5.700 kDa, de cerca de 1.500 a cerca de 5.800 kDa, de cerca de 1.500 a cerca de 5.900 kDa, de cerca de 1.500 a cerca de 6.000 kDa, de cerca de 1.000 a cerca de 5.500 kDa, de cerca de 1.000 a cerca de 5.000 kDa, de cerca de 1.000 a cerca de 4.000 kDa, de cerca de 1.000 a cerca de 4.500 kDa, de cerca de 1.000 a cerca de 4.000 kDa ou de cerca de 1.000 a cerca de 3.500 kDa. Em outras modalidades, o Mw de um conjugado de um único sorotipo na composição é cerca de 1.000 kDa, cerca de 1.100 kDa, cerca de 1.200 kDa, cerca de 1.300 kDa, cerca de 1.400 kDa, cerca de 1.500 kDa, cerca de 1.600 kDa, cerca de 1.700 kDa, cerca de 1.800 kDa, cerca de 1.900 kDa, cerca de 2.000 kDa, cerca de 2.100 kDa, cerca de 2.200 kDa, cerca de 2.300 kDa, cerca de 2.400 kDa, cerca de 2.500 kDa, cerca de 2.600 kDa, cerca de 2.700 kDa, cerca de 2.800 kDa, cerca de 2.900 kDa, cerca de 3.000 kDa, cerca de 3.100 kDa, cerca de 3.200 kDa, cerca de 3.300 kDa, cerca de 3.400 kDa, cerca de 3.500 kDa, cerca de 3.600 kDa, cerca de 3.700 kDa, cerca de 3.800 kDa, cerca de 3.900 kDa, cerca de 4.000 kDa, cerca de 4.100 kDa, cerca de 4.200 kDa, cerca de 4.300 kDa, cerca de 4.400 kDa, cerca de 4.500 kDa, cerca de 4.600 kDa, cerca de 4.700 kDa, cerca de 4.800 kDa, cerca de 4.900 kDa, cerca de 5.000 kDa, cerca de 5.100 kDa, cerca de 5.200 kDa, cerca de 5.300 kDa, cerca de 5.400 kDa ou cerca de 5.500 kDa.

[0205] Em certas modalidades da invenção, os conjugados de polissacarídeo-proteína nas composições imunogênicas multivalentes são preparadas em um solvente aprótico. As composições contendo porcentagens superiores de polissacarídeos de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora em um solvente aprótico (em oposição a serem preparadas em um solvente prótico) podem ser preferenciais. Em certas modalidades, a porcentagem (conforme calculado pelo número de sorotipos de polissacarídeo preparados em um solvente aprótico dividido pelo número total de sorotipos de polissacarídeo, em que o número total inclui os sorotipos preparados em um solvente aprótico ou em um solvente prótico) de conjugados de sorotipo de S. pneumoniae específicos preparados em um solvente aprótico pode ser maior que 50% ou maior que 60% ou maior que 70% ou maior que 80% ou maior que 90% ou é 100%.

[0206] Em certas modalidades da invenção, o conjugado de proteína e polissacarídeo de sorotipo 3 na composição é preparado em um solvente aprótico e o Mw de referido conjugado é de cerca de 1,000 a cerca de 5.000 kDa, ou de cerca de 1.000 a cerca de 4.000 kDa ou de cerca de 1.000 a cerca de 3.000 kDa ou de cerca de 1.000 a cerca de 2.500 kDa ou de cerca de 1.000 a cerca de 2.000 kDa.

[0207] Em certas modalidades da invenção em que um ou mais ou todos os conjugados de polissacarídeo-proteína nas composições imunogênicas multivalentes são preparados em um solvente aprótico, o peso molecular médio numérico (Mn) dos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae na composição (média de todos os conjugados na composição) é de cerca de 900 a cerca de 3.000 kDa, de cerca de 1.000 a cerca de 3.000 kDa, de cerca de 1.000 a cerca de 2.500 kDa, de cerca de 1.500 a cerca de 2.500 kDa, de cerca de 1.800 a cerca de 2.500 kDa, de cerca de 1.900 a cerca de 2.500 kDa ou de cerca de 2.000 a cerca de 2.500 kDa.

[0208] Em certas modalidades da invenção em que um ou mais ou todos os conjugados de polissacarídeo-proteína nas composições imunogênicas multivalentes são preparados em um solvente aprótico, o Mn de cada um dos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae na composição (para um único sorotipo) é de cerca de 700 a cerca de 7.000 kDa, de cerca de 1.000 a cerca de 6.000 kDa, de cerca de 1.000 a cerca de 5.000 kDa, de cerca de 1.000 a cerca de 4.000 kDa, de cerca de 1.000 a cerca de 3.000 kDa, de cerca de 900 a cerca de 5.500 kDa, de cerca de 900 a cerca de 5.000 kDa, de cerca de 900 a cerca de 4.500 kDa, de cerca de 900 a cerca de 4.000 kDa, de cerca de 900 a cerca de 3.500 kDa ou de cerca de 900 a cerca de 3.000 kDa.

[0209] Em modalidades da invenção, o Mw e/ou Mn dos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae na composição é estável por 4 semanas ou mais a 37 °C, por 4 semanas ou mais a 25 °C e/ou por 12 semanas ou mais a 4 °C.

[0210] Em modalidades da invenção, a concentração de polissacarídeo, Mw, e/ou Mn são determinados com o uso de HPSEC UV/MALS/RI.

[0211] Em algumas modalidades da invenção em que um ou mais ou todos os conjugados de polissacarídeo-proteína nas composições imunogênicas multivalentes são preparados em um solvente aprótico, a emissão máxima da composição medida com o uso de espectroscopia de fluorescência de proteína intrínseca com um comprimento de onda de excitação a 280 nanômetros (nm) é de cerca de 335 nm a cerca de 342 nm. Em algumas modalidades, a emissão máxima permanece em cerca de 335 nm a cerca de 342 nm e a intensidade de fluorescência é estável por pelo menos 1 semana a 37 °C. Em algumas modalidades, a emissão máxima permanece em cerca de 335 nm a cerca de 342 nm e a intensidade de fluorescência é estável por 1 semana a 37 °C.

[0212] Em algumas modalidades, todos os conjugados de polissacarídeo pneumocócico na composição multivalente são preparados com o uso de aminação redutiva em DMSO. Em certas submodalidades, a composição multivalente que compreende conjugados de polissacarídeo que foram todos preparados com o uso de DMSO não compreende um adjuvante.

[0213] Sem estar vinculado a qualquer teoria, um mecanismo possível para a imunogenicidade aprimorada observada com glicoconjugados preparados em DMSO inclui um número aumentado de ligações entre o carboidrato (polissacarídeo capsular) e resíduos de lisina na superfície da proteína carreadora, o que resultaria em pontos de ligação adicionais entre a proteína e o polissacarídeo para conferir estabilidade e impedir a despolimerização química ou rompimento da ligação peptídica de carboidratos. Vide, por exemplo, Hsieh, Characterization of Saccharide-CRM197 Conjugate Vaccinas in Brown F, Corbel M, Griffiths E (eds): Physico-Chemical Procedures for the a Characterization of Vaccines. Dev. Biol. Basel, Karger, 2000, vol. 103, págs. 93 a 104. Um benefício adicional das ligações de polissacarídeo-proteína aumentadas que são criadas durante a conjugação no solvente de DMSO podem ser oportunidades adicionais para apresentação bem sucedida de peptídeo-carboidratos para células T. Pode ser observado que, devido à variabilidade genética na população humana que resulta em várias capacidades e sensibilidade de carga ou associação às sequências peptídicas específicas conjugadas com antígenos de carboidratos, esses pontos adicionais de ligação na proteína carreadora permitiriam chances aumentadas para apresentação de antígeno bem sucedida na superfície de uma célula que apresenta antígeno (APC) para permitir que uma resposta dependente de célula T a um antígeno dependente de célula T. Um outro mecanismo possível de imunogenicidade melhorada observada por conjugação no solvente de DMSO poderia ser devido à desnaturação de CRM197 em solvente orgânico que expõe lisinas adicionais a ligações de polissacarídeo gerando chances aumentadas para apresentação de glicopeptídeo na superfície de uma APC para resposta dependente de célula T a epítopos peptídicos diferentes. Vide Avci et al., 2011, Nature Medicine 17: 1602-1610.

[0214] Ainda um outro benefício de conjugação em um solvente orgânico que gera CRM197 desnaturada nos conjugados poderia reduzir interferência imunológica de anticorpos contra epítopos de CRM197 nativos. Um benefício adicional das ligações de polissacarídeo-proteína aumentadas que são criadas durante a conjugação no solvente de DMSO poderia ser a formação de conjugados de polissacarídeo-proteína de tamanhos maiores que resulta na imunogenicidade melhorada. Acredita-se que as composições da invenção forneçam vantagens significativas na obtenção de uma resposta humana.

[0215] Em certas modalidades, a reação de conjugação é realizada através de aminação redutiva em que níquel é usado para maior eficiência de reação de conjugação e para auxiliar na remoção de cianeto livre. Os metais de transição são conhecidos por formar complexos estáveis com cianeto e são conhecidos por aprimorar a metilação redutora de grupos proteína amino e formaldeído com cianoboroidreto de sódio (S Gidley et al., Biochem J. 1982, 203: 331 a 334; Jentoft et al. Anal Biochem. 1980, 106: 186 a 190). Ao complexar o cianeto inibitório residual, a adição de níquel aumenta o consumo de proteína durante a conjugação e leva à formação de conjugados maiores e potencialmente mais imunogênicos.

[0216] As diferenças nos níveis de cianeto iniciais em muitos reagente de cianoboroidreto de sódio levam também ao desempenho de conjugação inconsistente, resultando em atributos de produto variáveis, como tamanho de conjugado e razão de conjugado Ps a CRM197. A adição de níquel reduziu a inconsistência de conjugação ao complexar cianeto, eliminando diferenças em lotes de cianoboroidreto de sódio.

[0217] As químicas alternativas adequadas incluem a ativação do sacarídeo com tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino piridínio (CDAP) para formar um éster cianato. Assim, o sacarídeo ativado pode ser acoplado diretamente ou através de um grupo de espaçador (ligante) a um grupo amino em uma proteína carreadora. Por exemplo, o espaçador poderia ser cistamina ou cisteamina para gerar um polissacarídeo tiolado que poderia ser acoplado a um carreador através de uma ligação de tioéter obtida após a reação com uma proteína carreadora ativada por maleimida (por exemplo, com o uso de GMBS) ou um proteína carreadora haloacetilada (por exemplo, com o uso de iodoacetimida [por exemplo, etil iodoacetimida HCl] ou bromoacetato de N-succinimidila ou SIAB ou SIA, ou SBAP). De preferência, o éster cianato (fabricado opcionalmente através de química de CDAP) é acoplado com hexano diamina ou di-hiudrazida de ácido adípico (ADH) e o sacarídeo derivado de amino é conjugado na proteína carreadora com o uso de química de carbodi-imida (por exemplo, EDAC ou EDC) através de um grupo carboxila em uma proteína carreadora. Tais conjugados são descritos nas Publicações de Pedido de Patente Internacional n° WO 93/15760, n° WO 95/08348 e n° WO 96/29094; e em Chu et al., 1983, Infect. Immunity 40:245 a 256.

[0218] Outras técnicas adequadas usam carbodi-imidas, hidrazidas, ésteres ativos, norborano, ácido p-nitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S--NHS, EDC, TSTU. Muitas são descritas na Publicação de Pedido de Patente Internacional n° WO 98/42721. A conjugação pode envolver um ligante de carbonila que pode ser formado por uma reação de um grupo hidroxila livre do sacarídeo com CDI (Vide Bethell et al., 1979, J. Biol. Chem. 254:2572 a 4; Hearn et al., 1981, J. Chromatogr. 218:509 a 18) seguida pela reação de com uma proteína para formar uma ligação carbamato. Isso pode envolver redução do terminal anomérico em um grupo hidroxila primário, proteção/desproteção opcional do grupo hidroxila primário, reação do grupo hidroxila primário com CDI para formar um intermediário de carbamato de CDI e acoplamento do intermediário de carbamato de CDI com um grupo amino em uma proteína.

[0219] Após a conjugação do polissacarídeo capsular a uma proteína carreadora, os conjugados de polissacarídeo-proteína são purificados (enriquecidos em relação à quantidade de conjugado de polissacarídeo-proteína) através de uma ou mais dentre uma variedade de técnicas. Exemplos dessas técnicas são bem conhecidos pelo técnico no assunto e incluem operações de concentração/diafiltração, ultrafiltração, precipitação/eluição, cromatografia de coluna e filtração em profundidade. Vide, por exemplo, Pat. n° U.S. 6,146,902.

[0220] Após os glicoconjugados individuais serem purificados, os mesmos são compostos para formular uma composição imunogênica da presente invenção. Esses conjugados pneumocócicos são preparados através de processos separados e formulados por antígeno concentrado em uma formulação de dosagem única.

[0221] Um método alternativo para caracterizar os glicoconjugados da invenção ocorre pelo número de resíduos de lisina na proteína carreadora (por exemplo, CRM197) que se tornam conjugados no sacarídeo que pode ser caracterizado como uma faixa de lisinas conjugadas (grau de conjugação). A evidência para a modificação de lisina da proteína carreadora devido a ligações covalentes aos polissacarídeos pode ser obtida através de análise de aminoácido com o uso de métodos de rotina conhecidos pelos técnicos no assunto. A conjugação resulta em uma redução no número de resíduos de lisina recuperado em comparação ao material de partida de proteína carreadora usado para gerar os materiais conjugados. Em uma modalidade preferencial, o grau de conjugação do glicoconjugado da invenção é entre 2 e 15, entre 2 e 13, entre 2 e 10, entre 2 e 8, entre 2 e 6, entre 2 e 5, entre 2 e 4, entre 3 e 15, entre 3 e 13, entre 3 e 10, entre 3 e 8, entre 3 e 6, entre 3 e 5, entre 3 e 4, entre 5 e 15, entre 5 e 10, entre 8 e 15, entre 8 e 12, entre 10 e 15 ou entre 10 e 12. Em uma modalidade, o grau de conjugação do glicoconjugado da invenção é cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de (11) cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14 ou cerca de 15. Em uma modalidade preferencial, o grau de conjugação do glicoconjugado da invenção é entre 4 e 7. Em algumas tais modalidades, a proteína carreadora é CRM197.

[0222] Os glicoconjugados das composições da invenção podem ser caracterizados também pela razão (peso/peso) de sacarídeo para proteína carreadora (Ps:Pr). Em algumas modalidades, a razão de polissacarídeo para proteína carreadora dos glicoconjugados (p/p) na composição é entre 0,5 e 3,0 (por exemplo, cerca de 0,5, cerca de 0,6, cerca de 0,7, cerca de 0,8, cerca de 0,9, cerca de 1,0, cerca de 1,1, cerca de 1,2, cerca de 1,3, cerca de 1,4, cerca de 1,5, cerca de 1,6, cerca de 1,7, cerca de 1,8, cerca de 1,9, cerca de 2,0, cerca de 2,1, cerca de 2,2, cerca de 2,3, cerca de 2,4, cerca de 2,5, cerca de 2,6, cerca de 2,7, cerca de 2,8, cerca de 2,9 ou cerca de 3,0). Em outras modalidades, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) está entre 0,5 e 2,5, entre 0,5 e 1,5, entre 0,8 e 2,5, entre 0,5 e 1,0, entre 1,0 e 1,5, entre 1,0 e 2,0, entre 0,8 e 2,4, entre 0,8 e 2,3, entre 0,8 e 2,2, entre 0,8 e 2,1, entre 0,8 e 2,0, entre 0,8 e 1,9, entre 0,8 e 1,8, entre 0,8 e 1,7, entre 0,8 e 1,6, entre 0,8 e 1,5, entre 0,8 e 1,4, entre 0,8 e 1,3, entre 0,9 e 2,4, entre 0,9 e 2,3, entre 0,9 e 2,2, entre 0,9 e 2,1, entre 0,9 e 2,0, entre 0,9 e 1,9, entre 0,9 e 1,8, entre 0,9 e 1,7, entre 0,9 e 1,6, entre 0,9 e 1,5, entre 0,9 e 1,4, entre 0,9 e 1,3, entre 0,9 e 1,2, entre 1,0 e 2,4, entre 1,0 e 2,3, entre 1,0 e 2,2, entre 1,0 e 2,1, entre 1,0 e 2,0, entre 1,0 e 1,9, entre 1,0 e 1,8, entre 1,0 e 1,7, entre 1,0 e 1,6, entre 1,0 e 1,5, entre 1,0 e 1,4, entre 1,0 e 1,3 ou entre 1,0 e 1,2. Em modalidades adicionais, razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) é entre 0,8 e 1,2. Em algumas tais modalidades, a proteína carreadora é CRM197. Os glicoconjugados e as composições imunogênicas da invenção podem conter sacarídeo livre que não é conjugado covalentemente na proteína carreadora, mas está, entretanto, presente na composição de glicoconjugado. O sacarídeo livre pode ser associado de modo não covalente (isto é, ligado de modo não covalente a, adsorvido para ou retido em ou com) ao glicoconjugado.

[0223] Em modalidades específicas, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) para o conjugado de sorotipo 15A é de cerca de 1,0 a cerca de 2,0, de cerca de 1,25 a cerca de 1,75 ou de cerca de 1,3 a cerca de 1,7. Em outras modalidades, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) para sorotipo 15A é cerca de 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7 ou 1,8.

[0224] Em modalidades específicas, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) para o conjugado de sorotipo 15C é de cerca de 1,0 a cerca de 2,0, de cerca de 1,25 a cerca de 1,75 ou de cerca de 1,3 a cerca de 1,7. Em outras modalidades, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) para sorotipo 15C é cerca de 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7 ou 1,8.

[0225] Em modalidades específicas, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) para o conjugado de sorotipo 33F é de cerca de 1,0 a cerca de 2,0, de cerca de 1,25 a cerca de 1,75 ou de cerca de 1,3 a cerca de 1,7. Em outras modalidades, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) para sorotipo 33F é cerca de 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7 ou 1,8.

[0226] Em modalidades específicas, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) para o conjugado de sorotipo 35B é de cerca de 1,25 a cerca de 2,25, de cerca de 1,25 a cerca de 2,0 ou de cerca de 1,3 a cerca de 1,8. Em outras modalidades, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) para sorotipo 33B é cerca de 1,2, 1,3, 1,3, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 ou 2,0.

[0227] Em modalidades específicas, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) para o conjugado de sorotipo 24F é de cerca de 0,5 a cerca de 1,5, de cerca de 0,75 a cerca de 1,25 ou de cerca de 0,8 a cerca de 1,0. Em outras modalidades, a razão de sacarídeo para proteína carreadora (p/p) para sorotipo 24F é cerca de 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0.

[0228] Em uma modalidade preferencial, o glicoconjugado compreende menos de cerca de 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% ou 15% de polissacarídeo livre em comparação à quantidade total de polissacarídeo. Em uma modalidade preferencial, o glicoconjugado compreende menos de cerca de 25% de polissacarídeo livre em comparação à quantidade total de polissacarídeo. Em uma modalidade preferencial, o glicoconjugado compreende menos de cerca de 20% de polissacarídeo livre em comparação à quantidade total de polissacarídeo. Em uma modalidade preferencial, o glicoconjugado compreende menos de cerca de 15% de polissacarídeo livre em comparação à quantidade total de polissacarídeo.

IV. Métodos de Uso

[0229] As modalidades da invenção incluem também um ou mais composições imunogênicas multivalentes descritas na presente invenção (i) para uso em, (ii) para uso como um medicamento ou composição para, ou (iii) para uso na preparação de um medicamento para: ( a) terapia (por exemplo, do corpo humano); (b) remédio; (c) inibição de infecção com Streptococcus pneumoniae; (d) indução de uma resposta imune ou uma resposta imune protetora contra S. pneumoniae ; (e) profilaxia de infecção por S. pneumoniae ; (f) prevenção de recorrência de infecção por S. pneumoniae ; (g) redução da progressão, início ou gravidade de sintomas patológicos associadas à infecção por S. pneumoniae que inclui a prevenção de complicações associadas como dano cerebral, perda de audição e convulsões, (h) redução da probabilidade de uma infecção por S. pneumoniae ou, (i) tratamento, profilaxia ou atraso no início, gravidade ou progressão de doença pneumocócica (ou doenças pneumocócicas) que inclui, mas não se limita a: pneumonia pneucócica, bacteremia pneumocócica, meningite pneumocócica, otite média e sinusite. Nesses usos, as composições de conjugado de polissacarídeo pneumocócico multivalentes da invenção podem ser empregadas opcionalmente em combinação com um ou mais adjuvantes ou sem um adjuvante.

[0230] Consequentemente, a invenção fornece métodos para o tratamento profilático de (isto é, proteção contra) infecção por S. pneumoniae ou doença pneumocócica que compreende administrar uma ou mais composições de conjugado de polissacarídeo pneumocócico-proteína imunogênicas multivalentes da invenção a um paciente em necessidade de tratamento.

[0231] As composições e as formulações da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um ser humano suscetível à infecção, por exemplo, uma infecção pneumocócica, por meio de administração de uma composição da invenção através de uma rota sistêmica ou mucosa.

[0232] Em uma modalidade, a invenção fornece um método de indução de uma resposta imune ao S. pneumoniae que compreende administrar a um paciente uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica multivalente da invenção. Em uma outra modalidade, a invenção fornece um método de vacinação de um ser humano contra uma infecção pneumocócica que compreende a etapa de administrar ao ser humano uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica multivalente da invenção.

[0233] Assim, em um aspecto, a invenção fornece um método para (1) induzir uma resposta imune em um paciente humano, (2) induzir uma resposta imune protetora em um paciente humano, (3) vacinar um paciente humano contra uma infecção com S. pneumoniae, ou (4) reduzir a probabilidade de uma infecção por S. pneumoniae em um paciente humano, o método compreendendo administrar uma composição imunogênica multivalente da invenção ao paciente (isto é, qualquer composição imunogênica multivalente descrita na presente invenção, como as composições imunogênicas multivalentes descritas na Seção II, intitulada “Composições Imunogênicas Multivalentes " supracitada).

[0234] Em uma modalidade, a invenção fornece um método para a prevenção de pneumonias pneumocócicas e doença invasiva em adultos de 18 anos ou mais. Em uma outra modalidade, a invenção fornece um método para a prevenção de pneumonias pneumocócicas e doença invasiva causadas por 24 cepas de Streptococcus pneumoniae (3, 6A, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 19A, 20A, 20B, 22F, 23A, 23B, 24F, 31, 33F e 35B).

[0235] Em uma modalidade dos métodos acima, o composição compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem o conjunto de sorotipos: 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A. Em uma modalidade dos métodos acima, o composição compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem o conjunto de sorotipos: 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20. Em uma modalidade dos métodos acima, o composição compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae compreendem o conjunto de sorotipos: 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20B. Em uma outra modalidade de o métodos acima, a composição compreende adicionalmente um conjugado de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae de sorotipo 6A ou 6C.

[0236] Foi mostrado que uma vacina conjugada pneumocócica que compreende sorotipo 6A pode fornecer alguma proteção cruzada contra sorotipo 6C (Cooper et al., Vaccine 29 (2011) 7207 a 7211). Portanto, em algumas modalidades dos métodos supracitados, a invenção fornece também o uso de composições imunogênicas multivalentes que não compreendem sorotipo 6C, mas, em vez disso, compreendem sorotipo 6A ou sorotipos 6A e 6B. Em outras modalidades, a composição imunogênica compreende conjugados pneumocócicos de sorotipos 6A, 6B, e 6C. Em modalidades particulares de o métodos acima, os sorotipos de S. pneumoniae compreendem um conjunto de sorotipos selecionado a partir do grupo que consiste em: I-a) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A; I-b) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A; I-c) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A; e I-d) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A.

[0237] Em modalidades particulares do conjunto de sorotipos acima (I-a a I-d), o sorotipo 20 ou 20B pode ser substituído pelo sorotipo 20A.

[0238] Em modalidades adicionais dos métodos acima, os sorotipos de S. pneumoniae compreendem um conjunto de sorotipos selecionado a partir do grupo que consiste em: II-a) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B; II-b) 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B; II-c) 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B; II-d) 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B; II-e) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A; II-f) 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A; II-g) 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A; e II-h) 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A.

[0239] Em modalidades particulares do conjunto de sorotipos supracitado (II-e a II-h), o sorotipo 20 ou 20B pode ser substituído pelo sorotipo 20A.

[0240] Em modalidades adicionais dos métodos supracitados, os sorotipos de S. pneumoniae compreendem um conjunto de sorotipos conforme apresentado em qualquer uma das modalidades I- a), II- a) ou II-e) e compreendem adicionalmente sorotipos 6A, 6B e 6C.

[0241] Foi mostrado também que uma vacina conjugada pneumocócica que compreende sorotipo 10A pode fornecer alguma proteção cruzada contra sorotipo 39 (vide o documento WO 2017/085586). Portanto, em algumas modalidades dos métodos supracitados, a invenção fornece também o uso de composições imunogênicas multivalentes que não compreendem sorotipo 10A, mas, em vez disso, compreendem sorotipo 39. Em outras modalidades, a composição imunogênica compreende conjugados pneumocócicos de sorotipos 10A e 39. Em modalidades particulares dos métodos acima, os sorotipos de S. pneumoniae compreendem um conjunto de sorotipos selecionado a partir do grupo que consiste em: III-a) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A; III-b) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A; III-c) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A; III-d) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A; III-e) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A; III-f) 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A; III-g) 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A; e III-h) 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F e 20A.

[0242] Em modalidades particulares do conjunto de sorotipos supracitado (II-a a III-h), o sorotipo 20 ou 20B pode ser substituído pelo sorotipo 20A.

[0243] Em modalidades adicionais dos métodos supracitados, os sorotipos de S. pneumoniae compreendem um conjunto de sorotipos conforme apresentado em qualquer uma das modalidades III-a) a III-h) e compreendem adicionalmente sorotipo 10A.

[0244] Foi mostrado também que os conjugados imunogênicos que compreende o polissacarídeo capsular de sorotipo 15B de S. pneumoniae ligado covalentemente a uma proteína carreadora podem fornecer alguma proteção cruzada contra sorotipo 15C e/ou sorotipo 15A (vide o documento WO 2015/110942). Portanto, em algumas modalidades dos métodos supracitados, a invenção fornece também o uso de composições imunogênicas multivalentes que não compreendem sorotipo 15C (ou 15B O-desacetilado), mas, em vez disso, compreendem sorotipo 15B (isto é, o polissacarídeo de sorotipo 15B é não O- desacetilado). Em outras modalidades, a composição imunogênica compreende conjugados pneumocócicos de sorotipos 15B e 15C (ou 15B O-desacetilado). Em modalidades particulares dos métodos acima, os sorotipos de S. pneumoniae compreendem um conjunto de sorotipos selecionado a partir do grupo que consiste em: IV-a) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F e 20A; IV-b) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F e 20A; IV-c) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F e 20A; IV-d) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F e 20A; IV-e) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F e 20A; IV-f) 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F e 20A; IV-g) 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F e 20A; e IV-h) 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F e 20A.

[0245] Em modalidades particulares do conjunto de sorotipos supracitado (IV-a a IV-h), o sorotipo 20 ou 20B pode ser substituído pelo sorotipo 20A.

[0246] Em modalidades adicionais dos métodos supracitados, os sorotipos de S. pneumoniae compreendem um conjunto de sorotipos conforme apresentado em qualquer uma das modalidades IV-a) a IV-h) e compreendem adicionalmente sorotipo 15C (e/ou 15B O-desacetilado).

[0247] As composições da invenção são úteis nos métodos para fornecer proteção complementar contra S. pneumoniae em pacientes que receberam anteriormente uma vacina pneumocócica multivalente. Nesse uso, as composições da invenção podem fornecer proteção contra sorotipos particulares de S. pneumoniae que um paciente não foi vacinado anteriormente contra, podem fornecer proteção adicional contra sorotipos de S. pneumoniae que um paciente foi vacinado anteriormente contra, ou podem fornecer proteção tanto contra sorotipos de S. pneumoniae que um paciente não foi vacinado anteriormente contra ambos os sorotipos de S. pneumoniae que um paciente foi vacinado anteriormente contra.

[0248] Assim, a invenção fornece um método de indução de uma resposta imune, vacinação ou indução de uma resposta imune protetora contra S. pneumoniae em um paciente que compreende administrar uma composição imunogênica multivalente ao paciente, a composição compreendendo múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae, em que os conjugados de polissacarídeo-proteína compreendem polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que o paciente foi vacinado anteriormente contra S. pneumoniae . Em modalidades desse aspecto da invenção, a composição imunogênica multivalente pode ser qualquer composição imunogênica multivalente descrita na presente invenção. Em modalidades particulares dos métodos da invenção, a composição imunogênica multivalente é administrada a um paciente que foi tratado anteriormente com uma vacina pneumocócica multivalente. A vacina imunogênica multivalente pode ser qualquer vacina que é indicada para a prevenção de doença pneumocócica causada por mais de um sorotipo de S. pneumoniae.

[0249] Em modalidades específicas do método supracitado, o paciente foi tratado anteriormente com uma vacina pneumocócica multivalente que é indicada para a prevenção de doença pneumocócica causada por sorotipos de S. pneumoniae selecionados a partir do grupo que consiste em: a) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F; b) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 6A, 7F e 19A; c) 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F; d) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 6A, 7F, 19A, 22F e 33F; e) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 7F, 19A, 22F, 33F, 2, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F e 20; e f) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 6A, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 10A, 11A, 12F e 15B.

[0250] Em modalidades específicas do método supracitado, a vacina pneumocócica multivalente compreende polissacarídeos capsulares de sorotipos de S. pneumoniae 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 7F, 19A, 22F, 33F, 2, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F e 20A. Em modalidades específicas do método supracitado, a vacina pneumocócica multivalente compreende polissacarídeos capsulares de sorotipos de S. pneumoniae 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 7F, 19A, 22F, 33F, 2, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F e 20. Em modalidades específicas do método supracitado, a vacina pneumocócica multivalente compreende polissacarídeos capsulares de sorotipos de S. pneumoniae 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 7F, 19A, 22F, 33F, 2, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F e 20B.

[0251] Em modalidades específicas do método supracitado, a vacina pneumocócica multivalente compreende múltiplos conjugados de polissacarídeo-proteína, em que os conjugados de polissacarídeo-proteína compreendem polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora. Em outras modalidades, a vacina pneumocócica multivalente compreende múltiplos polissacarídeos capsulares de S. pneumoniae que não são conjugados a uma proteína carreadora.

[0252] Em modalidades adicionais do método supracitado, o paciente foi tratado anteriormente com PREVNAR® 13 (vacina conjugada 13-valente pneumocócica [proteína CRM197 de Difteria], Pfizer, Inc., Filadélfia, PA, EUA).

[0253] Em modalidades adicionais do método supracitado, o paciente foi tratado anteriormente com PNEUMOVAX® 23 (vacina pneumocócica polivalente, Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, EUA).

[0254] Ainda em modalidades adicionais do método supracitado, o paciente foi tratado anteriormente com SYNFLORIX™ (vacina de conjugado de polissacarídeo pneumocócica (adsorvida), GlaxoSmithKline Biologicals s. a., Rixensart, Bélgica).

[0255] Em modalidades do método supracitado, a composição imunogênica multivalente da invenção é administrada a um paciente em qualquer momento após o paciente ter recebido uma vacina pneumocócica multivalente, de acordo com o regime de tratamento fornecido pelo profissional médico, por exemplo, um médico. Em modalidades particulares, a composição imunogênica multivalente da invenção é administrada a um paciente de 1 mês a 5 anos após o paciente ter recebido a vacina pneumocócica multivalente, alternativamente, de 1 mês a 1 ano, de 1 mês a 2 anos, de 1 mês a 3 anos, de 1 mês a 4 anos, de 1 mês a 6 meses, e 2 meses a 6 meses, de 2 meses a 1 ano, de 1 ano a 5 anos, de 6 meses a 5 anos, de 6 meses a 4 anos, de 6 meses a 3 anos, de 6 meses a 2 anos, de 6 meses a 1 ano, de 1 ano a 4 anos, de 1 ano a 3 anos ou de 1 ano a 2 anos, após o paciente ter recebido a vacina pneumocócica multivalente. Em modalidades adicionais, a composição imunogênica multivalente é administrada ao paciente cerca de 1 mês, cerca de 2 meses, cerca de 3 meses, cerca de 4 meses, cerca de 5 meses, cerca de 6 meses, cerca de 7 meses, cerca de 8 meses, cerca de 9 meses, cerca de 10 meses, cerca de 11 meses, cerca de 1 ano, cerca de 1,25 anos, cerca de 1,5 anos, cerca de 1,75 anos, cerca de 2 anos, cerca de 2,25 anos, cerca de 2,5 anos, cerca de 2,75 anos, cerca de 3 anos, cerca de 3,25 anos, cerca de 3,5 anos, cerca de 3,75 anos, cerca de 4 anos, cerca de 4,25 anos, cerca de 4,5 anos, cerca de 4,75 anos ou cerca de 5 anos após o paciente ter recebido a vacina pneumocócica multivalente.

[0256] Em modalidades adicionais, a invenção fornece um método para (1) induzir uma resposta imune em um paciente humano, (2) induzir uma resposta imune protetora em um paciente humano, (3) vacinar um paciente humano contra uma infecção com S. pneumoniae, ou (4) reduzir a probabilidade de uma infecção por S. pneumoniae em um paciente humano, o método compreendendo administrar uma composição imunogênica multivalente da invenção e administrar uma vacina pneumocócica multivalente ao paciente em qualquer ordem. A vacina pneumocócica multivalente pode ser qualquer vacina indicada para a prevenção de doença pneumocócica causada por mais de um sorotipo de S. pneumoniae.

[0257] Em modalidades específicas do método supracitado, o paciente é tratado com uma composição imunogênica multivalente da invenção e uma vacina pneumocócica multivalente que é indicada para a prevenção de doença pneumocócica causada por sorotipos de S. pneumoniae selecionados a partir do grupo que consiste em: g) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F; h) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 6A, 7F e 19A; i) 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F; j) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 6A, 7F, 19A, 22F e 33F; k) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 7F, 19A, 22F, 33F, 2, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F e 20; e l) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 6A, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 10A, 11A, 12F e 15B.

[0258] Em modalidades específicas do método supracitado, a vacina pneumocócica multivalente compreende polissacarídeos capsulares de sorotipos de S. pneumoniae 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 7F, 19A, 22F, 33F, 2, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F e 20A.

[0259] Em modalidades específicas do método supracitado, a vacina pneumocócica multivalente compreende múltiplos conjugados de polissacarídeo-proteína, em que os conjugados de polissacarídeo-proteína compreendem polissacarídeo de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora. Em outras modalidades, a vacina pneumocócica multivalente compreende múltiplos polissacarídeos capsulares de S. pneumoniae que não são conjugados a uma proteína carreadora.

[0260] Em modalidades do método supracitado, o paciente é tratado com uma composição imunogênica multivalente da invenção e é tratado com PREVNAR® 13 vacina conjugada 13-valente pneumocócica [proteína CRM197 de Difteria], Pfizer, Inc., Filadélfia, PA, EUA) em qualquer ordem. Em uma modalidade, é primeiramente administrado PREVNAR® 13 ao paciente e, em segundo lugar, é administrado uma composição imunogênica multivalente da invenção ao paciente. Em modalidades alternativas, é primeiramente administrado uma composição imunogênica multivalente da invenção ao paciente e, em segundo lugar, é administrado PREVNAR® 13.

[0261] Em modalidades adicionais do método supracitado, o paciente é tratado com uma composição imunogênica multivalente da invenção e é tratado com PNEUMOVAX® 23 (vacina pneumocócica polivalente, Merck & Co., Inc., Kenilworth, NJ, EUA) em qualquer ordem. Em uma modalidade, o paciente é primeiramente administrado PNEUMOVAX ® 23 e, em segundo lugar, o paciente é administrado uma composição imunogênica multivalente da invenção. Em modalidades alternativas, o paciente é primeiramente administrado uma composição imunogênica multivalente da invenção e, em segundo lugar, é administrado PNEUMOVAX ® 23.

[0262] Ainda em modalidades adicionais do método supracitado, o paciente é tratado com uma composição imunogênica multivalente da invenção e é tratado com SYNFLORIX™ (vacina conjugada de polissacarídeo pneumocócica (adsorvida), GlaxoSmithKline Biologicals s. a., Rixensart, Bélgica) em qualquer ordem. Em uma modalidade, é primeiramente administrado SYNFLORIX™ ao paciente e, em segundo lugar, é administrado uma composição imunogênica multivalente da invenção ao paciente. Na modalidade alternativa, é primeiramente administrado uma composição imunogênica multivalente da invenção ao paciente e, em segundo lugar, é administrado SYNFLORIX™.

[0263] Em algumas modalidades do método supracitado, a composição imunogênica multivalente e a vacina pneumocócica multivalente são administradas concomitantemente. Conforme usado na presente invenção, “administração simultânea” não se limita a dosagem de duas composições ao mesmo tempo, mas inclui administração uma após a outra em qualquer ordem. Em algumas modalidades, a composição imunogênica multivalente e a vacina pneumocócica multivalente são administradas através de administração intramuscular ou subcutânea em sítios anatômicos separados, por exemplo, dois braços diferentes.

[0264] Em algumas modalidades do método supracitado, a quantidade de tempo entre a administração da composição imunogênica multivalente da invenção e a vacina pneumocócica multivalente é de cerca de 4 semanas a cerca de 1 ano. Em modalidades alternativas, a quantidade de tempo é de cerca de 1 mês a cerca de 5 anos.

[0265] Em uma modalidade, é primeiramente administrado ao paciente a vacina pneumocócica multivalente e, em segundo lugar, a composição imunogênica multivalente da invenção. Em modalidades alternativas, é primeiramente administrado ao paciente uma composição imunogênica multivalente da invenção e, em segundo lugar é administrado a vacina pneumocócica multivalente.

[0266] Também é fornecido um método de indução de uma resposta imune, vacinação ou indução de uma resposta imune protetora contra S. pneumoniae em um paciente que compreende: (13) administrar uma composição imunogênica multivalente ao paciente, a composição compreendendo múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae, em que cada um dos conjugados de polissacarídeo-proteína compreende polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, (14) esperar uma quantidade de tempo predeterminada passar, e (15) administrar uma vacina pneumocócica multivalente ao paciente.

[0267] Nesse método, a composição imunogênica multivalente pode compreender qualquer combinação de conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae apresentados na presente invenção e a vacina pneumocócica multivalente pode ser qualquer vacina indicada para a prevenção de doença causada por mais de um sorotipo de S. pneumoniae.

[0268] Também é fornecido pela invenção um método de indução de uma resposta imune, vacinação ou indução de uma resposta imune protetora contra S. pneumoniae em um paciente que compreende: (1) administrar uma vacina pneumocócica multivalente ao paciente, (2) esperar uma quantidade de tempo predeterminada passar, e (3) administrar uma composição imunogênica multivalente ao paciente, a composição compreendendo múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae, em que cada um dos conjugados de polissacarídeo-proteína compreende polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora.

[0269] Nesse método, a composição imunogênica multivalente pode compreender qualquer combinação de conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae apresentados na presente invenção e a vacina pneumocócica multivalente pode ser qualquer vacina indicada para a prevenção de doença causada por mais de um sorotipo de S. pneumoniae.

[0270] Em algumas modalidades dos métodos supracitados, a vacina pneumocócica multivalente compreende múltiplos conjugados de proteína e polissacarídeo de S. pneumoniae, em que os conjugados de polissacarídeo- proteína compreendem polissacarídeo capsular de um sorotipo de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora. Em modalidades alternativas, a vacina pneumocócica multivalente compreende polissacarídeos capsulares de S. pneumoniae que não são conjugados a uma proteína carreadora.

[0271] Em quaisquer modalidades dos métodos da invenção (isto é, qualquer um dos métodos descritos na presente invenção), o método pode compreender adicionalmente administrar uma ou mais doses adicionais de uma composição imunogênica multivalente da invenção ao paciente. Em tais métodos, o paciente já pode ter recebido uma vacina pneumocócica multivalente antes de receber uma primeira dose de uma composição imunogênica multivalente da invenção supracitada, ou pode não ter sido vacinado contra S. pneumoniae antes de receber uma composição imunogênica multivalente da invenção. Assim, em uma modalidade, um paciente que recebeu uma vacina pneumocócica multivalente indicada para a prevenção de doença pneumocócica causada por S. pneumoniae é administrado duas ou mais doses de uma composição imunogênica multivalente da invenção. Em modalidades alternativas, um paciente que não foi tratado anteriormente com qualquer vacina indicada para a prevenção de doença pneumocócica é administrado duas ou mais doses de uma composição imunogênica multivalente da invenção.

[0272] Em modalidades do método supracitado, as duas ou mais doses são da mesma composição imunogênica multivalente da invenção. Em modalidades alternativas, as duas ou mais doses são de composições imunogênicas multivalentes diferentes da invenção.

[0273] Em modalidades específicas de qualquer um desses métodos, o paciente é administrado duas, três ou quatro doses de uma composição imunogênica multivalente da invenção. Em modalidades particulares, o paciente é imunocomprometido (por exemplo, em um regime imunossupressor após o transplante de uma célula-tronco) e o número de doses é três.

[0274] Em algumas modalidades, a quantidade de tempo entre a administração de cada dose de composição imunogênica multivalente da invenção é de cerca de 4 semanas a cerca de 1 ano. Na modalidade alternativa, a quantidade de tempo entre a administração de cada dose de composição imunogênica multivalente da invenção é de cerca de 1 mês a cerca de 5 anos.

[0275] Em modalidades de qualquer um dos métodos da invenção, o paciente a ser tratado com a composição (ou composições) da invenção é um ser humano. Em certas modalidades, o paciente humano é um bebê (aproximadamente 12 a 24 meses) ou uma criança pequena (aproximadamente 2 a 5 anos). As composições dessa invenção são adequadas também para uso com crianças mais velhas, adolescentes e adultos (por exemplo, com 18 a 45 anos, com 18 a 50 anos, com 18 a 55 anos, com 18 a 60 anos ou 18 a 65 anos). Em outras modalidades de qualquer um dos métodos da invenção, o paciente é de cerca de 2 a cerca de 18 anos. Em modalidades adicionais de qualquer um dos métodos da invenção, o paciente tem 18 anos ou mais.

[0276] Em modalidades adicionais dos métodos da invenção, o paciente humano é idoso. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos da invenção, o paciente tem 50 anos ou mais. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos da invenção, o paciente tem 55 anos ou mais. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos da invenção, o paciente tem 60 anos ou mais. Ainda em outras modalidades adicionais de qualquer um dos métodos da invenção, o paciente tem 65 anos ou mais. Em modalidades adicionais de qualquer um dos métodos da invenção, o paciente tem 70 anos ou mais.

[0277] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos da invenção, o paciente a ser tratado com uma composição imunogênica da invenção é imunocomprometido.

[0278] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos da invenção, a composição imunogênica multivalente é administrada concomitantemente com uma vacina contra influenza. Em certas modalidades, a vacina contra influenza é uma “vacina da gripe para idosos", uma vacina da gripe para idosos de dose alta indicada para idosos, por exemplo, pessoas com 65 anos e mais.

[0279] A invenção fornece um método para induzir uma resposta imune protetora em um paciente contra uma infecção pneumocócica que compreende a etapa de administrar ao paciente uma quantidade imunologicamente eficaz de qualquer uma das composições de polissacarídeo pneumocócico-proteína conjugado imunogênicas multivalentes descritas na presente invenção. As quantidades de componentes ideais para uma vacina particular (isto é, composição imunogênica multivalente) podem ser determinadas por estudos padrão envolvendo observação de respostas imunes apropriadas em indivíduos. Por exemplo, em uma outra modalidade, a dosagem para vacinação humana é determinada por extrapolação de estudos em animais para dados humanos. Em uma outra modalidade, a dosagem é determinada empiricamente.

[0280] Os métodos da invenção podem ser usados para a prevenção e/ou redução de síndromes clínicas primárias causadas por micróbios, por exemplo, S. pneumoniae, incluindo, tanto infecções invasivas (meningite, pneumonia e bacteremia) quanto infecções não invasivas (otite média aguda e sinusite).

[0281] A administração das composições da invenção pode incluir uma ou mais dentre: injeção através de rota intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea; ou através de administração mucosa para tratos orais/alimentares, respiratórios ou genituritários. Em uma modalidade, a administração intranasal é usada para o tratamento de pneumonia ou otite média aguda (visto que o transporte de nasofaringe de pneumococos pode ser mais prevenido de modo mais eficaz, atenuando, desse modo, a infecção em seu estágio inicial). Em modalidades específicas, as composições da invenção são administradas ao paciente através de administração intramuscular ou subcutânea.

[0282] Todas as publicações mencionadas na presente invenção são incorporadas a título de referência com o propósito de descrever metodologias e materiais que podem ser usados em conjunto com a presente invenção.

[0283] Ao descrever modalidades diferentes da invenção na presente invenção com referência aos desenhos anexos, deve ser entendido que a invenção não se limita a essas modalidades precisas, e que várias alterações e modificações podem ser efetuadas nas mesmas por um técnico no assunto na técnica sem se afastar do escopo ou espírito da invenção conforme definido nas reivindicações anexas.

[0284] Os exemplos a seguir ilustram, mas não limitam a invenção.

EXEMPLO 1 Preparação de Polissacarídeos Capsulares de S. pneumoniae

[0285] Métodos para cultivar pneumococos são bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52. Métodos para preparar polissacarídeos pneumocócicos capsulares também são bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Patente europeia n° EP 0 497 524 B1. O processo descrito abaixo em geral segue o método descrito na Patente europeia n° EP 0 497 524 B1 e é, em geral, aplicável a todos sorotipos pneumocócicos.

[0286] Isolados de cepas pneumocócicas para sorotipos 6C, 23B e 31 foram obtidos a partir dos Centros para Controle e Prevenção de Doença (Atlanta, GA, EUA). Cepas para sorotipos 3, 8, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F e 33F foram obtidas a partir da Universidade da Pensilvânia (Dr. Robert Austrian). Cepas para sorotipos 17F e 19A foram obtidas a partir de FDA Office of Biologics (Dr. John Robbins). Sorotipo 7F foi obtido a partir da Universidade do Estado de Nova York, Downstate Medical Center (Dr. Gerald Schiffman). Isolados de sorotipos pneumocócicos não listados acima foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). Onde necessário, os subtipos foram diferenciados com base em reação de Quellung usando antissoros específicos. Vide, por exemplo, Pat. n° U.S. 5.847.112. Os isolados obtidos foram adicionalmente isolados de modo clonal plaqueando-se serialmente em dois estágios em placas de ágar que consistem em um meio livre de componente animal contendo peptona de soja, extrato de levedura e glicose sem hemina. Para o sorotipo 7F, as placas de ágar usadas também continham hemina. Isolados clonais para cada sorotipo foram adicionalmente expandidos em cultura líquida usando meios livres de componente animal contendo peptona de soja, extrato de levedura, HEPES, cloreto de sódio, bicarbonato de sódio, fosfato de potássio, glicose e glicerol para preparar os bancos de célula pré-master.

[0287] A produção de cada sorotipo de polissacarídeo pneumocócico consistiu em uma expansão celular e fermentação de produção em batelada seguida de inativação química antes da purificação a jusante. Um frasco de banco de células descongeladas de cada sorotipo foi expandido usando um frasco de agitação ou recipiente de cultura contendo um meio de crescimento livre de componente animal pré-esterilizado contendo peptona de soja ou ultrafiltrado de peptona de soja, extrato de levedura ou ultrafiltrado de extrato de levedura, HEPES, cloreto de sódio, bicarbonato de sódio, fosfato de potássio e glicose. A cultura de expansão celular foi crescida em um recipiente ou frasco de agitação vedado para minimizar a troca gasosa com controle de temperatura e agitação. Para sorotipos 3, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 19A, 20, 22F e 33F, um frasco de banco de células descongeladas foi expandido usando um fermentador contendo o mesmo meio. Durante a expansão celular desses sorotipos, temperatura, pH, pressão e agitação foram controlados. A sobreposição de fluxo de ar também foi controlada visto que a pulverização não foi usada. Após alcançar uma densidade de cultura específica, como medido pela densidade óptica a 600 nm, uma porção da cultura de expansão celular foi transferida a um fermentador de produção contendo meio de crescimento livre de componente animal pré-esterilizado contendo peptona de soja ou ultrafiltrado de peptona de soja, extrato de levedura ou ultrafiltrado de extrato de levedura, cloreto de sódio, fosfato de potássio e glicose. Temperatura, pH, pressão e agitação foram controlados. A sobreposição de fluxo de ar também foi controlada visto que a pulverização não foi usada.

[0288] A fermentação em batelada foi terminada através da adição de um agente químico de inativação, fenol, quando a glicose estava quase esgotada. O fenol puro foi adicionado a uma concentração final de 0,8 a 1,2% para inativar as células e liberar o polissacarídeo capsular da parede celular. A inativação primária ocorre por um tempo específico dentro do fermentador em que temperatura e agitação continuam a ser controladas. Após inativação primária, o lote foi transferido para um outro vaso em que foi retido por um tempo específico adicional à temperatura controlada e agitação para inativação completa. Isso foi confirmado por técnicas de plaqueamento microbiana ou por verificação da concentração de fenol e tempo específico. O caldo inativado foi, então, purificado.

EXEMPLO 2 Purificação de Polissacarídeos Pneumocócicos

[0289] O processo de purificação para os polissacarídeos pneumocócicos consistiu em várias operações de centrifugação, filtração de profundidade, concentração/diafiltração e etapas de precipitação. Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente a menos que especificado de outro modo.

[0290] O caldo inativado das culturas fermentadoras de S. pneumoniae foi floculado com um polímero catiônico (como BPA-1000, TRETOLITE® (Baker Hughes Inc., Houston, TX, EUA), Espectro 8160, poli(etilenoimina) e Millipore pDADMAC). Os polímeros catiônicos se ligam às proteínas de impureza, ácidos nucleicos e débris celulares. Após a etapa de floculação e um período de envelhecimento, os sólidos floculados foram removidos através de centrifugação e múltiplas etapas de filtração de profundidade. O caldo clarificado foi concentrado e diafiltrado usando um filtro de MWCO (peso molecular de corte) de 100 kDa a 500 kDa. A diafiltração foi realizada usando tampão de Tris, MgCl2 e tampão de fosfato de sódio. A diafiltração removeu proteína e ácido nucleico residual.

[0291] A remoção de impurezas adicionais foi realizada por reprecipitação do polissacarídeo em acetato de sódio e fenol com isopropanol e/ou álcool desnaturado. Durante a etapa de precipitação de fenol, o acetato de sódio em tampão de solução salina de fosfato de sódio e fenol (fenóis liquefeitos ou fenóis sólidos) foram carregados para o retentato diafiltrado. O fracionamento de álcool do polissacarídeo foi, então, conduzido em dois estágios. No primeiro estágio, um baixo percentual de álcool foi adicionado à preparação para precipitar débris celulares e outras impurezas indesejadas, enquanto o polissacarídeo bruto permaneceu em solução. As impurezas foram removidas através de centrifugação seguida de uma etapa de filtração de profundidade. O polissacarídeo foi, então, recuperado da solução pela adição de isopropanol adicional ou álcool desnaturado ao lote. O pélete de polissacarídeo precipitado foi recuperado por centrifugação, triturado e seco como um pó e armazenado congelado a -70 °C.

EXEMPLO 3 Análise de Identidade de Estrutura de Certos Sorotipos Pneumocócicos por Testagem de RMN

[0292] As amostras para análise de RMN foram preparadas pela dissolução de pó de polissacarídeo em solução de 5mg de pó/mL em óxido de deutério (D2O) contendo 0,01% dimetilsulfóxido (DMSO) e 0,01% de Sal de 2,2-dimetil-2- silapentano-5-sulfonato-d6 de sódio (DSS-d6). DMSO é um padrão interno que foi usado para análise quantitativa e DSS-d6 foi usado para definir a escala de desvio químico para 0 ppm. Um conjunto de dados de RMN de próton unidimencional foi adquirido a 50 °C e uma porção de espectro contendo as ressonâncias anoméricas foi, então, seletivamente escrita como coordenadas x, y para um arquivo de ASCII para análise usando uma apostila de Microsoft Excel. As coordenadas Y (isto é, perfil espectral) foram, então, comparadas aos perfis espectrais de polissacarídeos bacterianos capsulares em uma base de dados de referência. Os perfis de referência foram gerados de uma maneira similar em preparações selecionadas de cada sorotipo posteriormente designadas como o lote de referência. Uma comparação em pares foi feita dos valores y a partir da amostra e do espectro de referência para produzir um coeficiente de correlação (p x,y) como uma medida de similaridade entre o espectro. Um valor p de > 0,95 com qualquer um dos espectros de referência foi tomado como identificação positiva da estrutura de polissacarídeo.

[0293] As Figuras 1 a 4 fornecem o espectro de 1H RMN unidimensional de 600 MHz de polissacarídeos capsulares de sorotipos de S. pneumoniae 6C, 15A, 15B O-desacetilado e 35B, respectivamente. As regiões de identidade de 1H RMN usadas para a identificação de sorotipo de sorotipos de S. pneumoniae 6C, 15A, 15B O-desacetilado e 35B são fornecidas nas Figuras 5 a 8, respectivamente.Estrutura de polissacarídeos capsulares de S. pneumoniae dos sorotipos 15B O-desacetilados e 15C.

[0294] Estudos de imunogenicidade foram conduzidos usando PCV21 em coelhos brancos da Nova Zelândia (vide EXEMPLO 43, abaixo). Nesses estudos, o sorotipo 15B de polissacatídeos O-desacetilado foi usado na composição polivalente no lugar do sorotipo 15C. Estudos de RMN foram conduzidos para confirmar que o polissacarídeo O-desacetilado 15B foi equivalente ao polissacarídeo de sorotipo 15C.

[0295] As diferenças estruturais entre sorotipos de polissacarídeo capsular aparecem como diferenças de desvio químico no espectro de RMN. A região anomérica (aproximadamente 4,4 ppm a 6,0 ppm) é sensível a toda característica estrutural na unidade de repetição do polissacarídeo. As diferenças em estereoquímica, composição de monossacarídeo, O-acetilação e ligação gliosídica impactam os desvios químicos dos sinais anoméricos que deixam essa região do espectro exclusiva para cada sorotipo. Para polissacarídeo O- desacetilado de sorotipo 15B, o espectro de 1H RMN completo é idêntico ao espectro de 1H RMN do polissacarídeo de sorotipo 15C, indicando que a unidade de repetição de ambos os polissacarídeos consiste nos mesmos substituintes de monossacarídeo e sítios de ligação gliosídica (vide as Figuras 9B a 9C e 10B a 10C). Também é claramente mostrado que etapa de de-O-acetilação removeu o grupo de O-Acetato presente no 15B polissacarídeo, e que não há essencialmente grupos de O-Acetato restantes observados (vide as Figuras 10A a 10F).

EXEMPLO 4 Preparação de Conjugado de Sorotipo 3 para Estudo Polivalente Usando Conjugação em DMSO

[0296] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. O polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO). As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0297] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 38 MPa (380 bar)/5 passagens.

[0298] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0299] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 0,25 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 12 horas a 22 °C.

[0300] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0301] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada por 0,2 mícron.

[0302] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 2 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 10% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0303] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 1,0 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,3. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu por 1 hora a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0304] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1,6 horas a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto

[0305] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0306] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron, então, diluída com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 1. Atributos de conjugado de sorotipo 3 para estudo polivalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 5 Preparação de Sorotipo 6C para Estudo Monovalente de Conjugado Usando Conjugação com DMSO

[0307] O polissacarídeo foi dissolvido, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação de Polissacarídeo

[0308] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido filtrado foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0309] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 0,10 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0310] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. A ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0311] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0312] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0313] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 2,2 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,4. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 15 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0314] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 3 horas a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto

[0315] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0316] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron, então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 2. Atributos de conjugado de sorotipo 6C para estudo monovalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 6 Preparação de Conjugado de Sorotipo 6C para Estudo Polivalente Usando Conjugação em DMSO

[0317] O polissacarídeo foi dissolvido, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação de Polissacarídeo

[0318] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido filtrado foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0319] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 0,10 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0320] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0321] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0322] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0323] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 1,9 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,4. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 15 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0324] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 3 horas a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto

[0325] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0326] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron, então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 3. Atributos de conjugado de sorotipo 6C para estudo polivalente da conjugação em DMSO

Preparação de Conjugado de Sorotipo 6A para Estudos Monovalentes Usando Conjugação em DMSO

[0327] O polissacarídeo foi dissolvido, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0328] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 200 bar (20 MPa)/5 passagens. O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0329] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 0,10 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0330] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0331] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0332] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0333] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 1,5 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,4. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 15 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0334] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 3 horas a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4 °C. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4 °C contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto

[0335] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0336] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron, então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 3a. Atributos de conjugado de sorotipo 6A para estudo monovalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 7 Preparação de Conjugado de Sorotipo 7F para Estudo Polivalente Usando Conjugação em DMSO

[0337] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0338] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 150 bar (15 MPa)/7 passagens.

[0339] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0340] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 0,24 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 4 horas a 4°C.

[0341] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0342] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0343] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0344] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 2,6 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 4 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0345] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 3 horas a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto

[0346] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0347] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron, então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 4. Atributos de conjugado de sorotipo 7F para estudo polivalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 8 Preparação de Conjugado de Sorotipo 8 para Estudo Polivalente Usando Conjugação em DMSO

[0348] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0349] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 600 bar (60 MPa)/5 passagens.

[0350] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

[0351] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 0,18 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 4 horas a 22 °C.

[0352] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0353] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0354] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0355] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 4,0 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. Após a mistura, a reação de conjugação prosseguiu por 2 horas a 22 °C. O cianoboroidreto de sódio não foi adicionado à reação de conjugação devido ao fato de que foi observado que a adição de cianoboroidreto de sódio pode resultar em precipitação irreversível durante a reação de conjugação para sorotipo 8. A omissão de cianoboroidreto de sódio da reação evitou a precipitação sem impactar significativamente os atributos de conjugado.

Redução com boroidreto de sódio

[0356] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto

[0357] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0358] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 5. Atributos de conjugado de sorotipo 8 para estudo polivalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 9 Preparação de Conjugado de Sorotipo 9N para Estudo Polivalente Usando Conjugação em DMSO

[0359] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0360] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 250 bar (25 MPa)/5 passagens.

[0361] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0362] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 0,16 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 4 horas a 22 °C.

[0363] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0364] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0365] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0366] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 3,25 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu por 1 hora a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0367] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto

[0368] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0369] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron, então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 6. Atributos de conjugado de sorotipo 9N para estudo polivalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 10 Preparação de Conjugado de Sorotipo 10A para Estudo Monovalente usando Conjugação em DMSO

[0370] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração.Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0371] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 200 bar (20 MPa)/5 passagens seguido de 600 bar (60 MPa)/5 passagens para atingir uma massa molecular alvo.

[0372] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0373] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 0,15 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0374] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0375] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0376] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0377] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 5,0 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 2,0. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 4 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0378] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto

[0379] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0380] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 7. Atributos de conjugado de sorotipo 10A para estudo monovalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 11 Preparação de Conjugado de Sorotipo 10A para Estudo Polivalente Usando Conjugação em DMSO

[0381] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0382] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 600 bar (60 MPa)/5 passagens.

[0383] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0384] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 0,16 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0385] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0386] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0387] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0388] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 4,0 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,75. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 4 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0389] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto

[0390] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0391] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 8. Atributos de conjugado de sorotipo 10N para estudo polivalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 12 Preparação de Conjugado de Sorotipo 11A para Estudo Polivalente Usando Conjugação em DMSO

[0392] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0393] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido teve tamanho reduzido por hidrólise ácida pela adição de ácido acético a 200 mM, pela incubação a 92 °C por 75 minutos, então, neutralização pela adição de tampão de pH 7 de fosfato de potássio frio a 400 mM.

[0394] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

[0395] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 0,13 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0396] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0397] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0398] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0399] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO contendo 25 mM de cloreto de sódio. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 3,5 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 4 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0400] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto

[0401] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0402] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 9. Atributos de conjugado de sorotipo 11N para estudo polivalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 13 Preparação de Conjugado de Sorotipo 12F para Estudo Polivalente Usando Conjugação em DMSO

[0403] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0404] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido teve tamanho reduzido por hidrólise ácida pela adição de ácido acético a 200 mM, pela incubação a 90°C por 45 minutos, então, neutralização pela adição de tampão de pH 7 de fosfato de potássio frio a 400 mM.

[0405] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

[0406] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 0,26 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0407] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0408] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0409] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0410] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO contendo 25 mM de cloreto de sódio. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 3,0 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 4 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0411] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 3 horas a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto

[0412] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0413] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron, então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 10. Atributos de conjugado de sorotipo 12F para estudo polivalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 14 Preparação de Conjugado de Sorotipo 15A para Estudo Monovalente usando Conjugação em DMSO

[0414] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0415] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 200 bar (20 MPa)/5 passagens.

[0416] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0417] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 1,75 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 20 horas a 22 °C.

[0418] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0419] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0420] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0421] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO contendo 25 mM de cloreto de sódio. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 6,0 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 2,0. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 2,5 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0422] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto

[0423] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0424] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 11. Atributos de conjugado de sorotipo 15A para estudo monovalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 15

[0425] Preparação de Conjugado de Sorotipo 15A para Estudo de Proteção Cruzada de 15A/B/C Usando Conjugação Aquosa.

[0426] O polissacarídeo foi dissolvido, teve tamanho reduzido, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. CRM197 purificada foi, então, conjugada no polissacarídeo ativado utilizando cloreto de níquel na mistura de reação aquosa, e o conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0427] O pó de polissacarídeo pneumocócico capsular purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 200 bar (20 MPa)/5 passagens para atingir uma massa molecular alvo. O polissacarídeo de tamanho reduzido foi, então, concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0428] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 0,45 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo. A reação de oxidação prosseguiu por 20 horas a 22 °C. O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C. A ativação adicional foi alcançada pelo ajuste do produto ultrafiltrado a 22 °C e pH 5. A ativação foi conduzida com a adição de 100 mM de solução de metaperiodato de sódio com uma carga de 2,0 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 20 horas a 22 °C. O segundo produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0429] A solução oxidada de polissacarídeo foi misturada com água e 1,5 M de fosfato de potássio pH 6,0, O pH de tampão selecionado consistiu em melhorar a estabilidade de polissacarídeo ativado durante a reação de conjugação. CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi filtrada com 0,2 mícron e combinada com a solução de polissacarídeo tamponada em uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 0,6. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. As concentrações de polissacarídeo e fosfato foram 9,75 g/L e 100 mM respectivamente. A concentração de polissacarídeo foi selecionada para controlar o tamanho do conjugado resultante. O cloreto de níquel foi adicionado para aproximadamente 2 mM usando um 100 mM de solução de cloreto de níquel. O cianoboroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado. A conjugação prosseguiu por 148 horas a 10 °C para maximizar o consumo de polissacarídeo e proteína.

Redução com boroidreto de sódio

[0430] Após a reação de conjugação, o lote foi diluído até uma concentração de polissacarídeo de aproximadamente 3,0 g/L, resfriado para 2 a 8 °C, e filtrado com 1,2 mícrons. O lote foi diafiltrado contra 100 mM de fosfato de potássio, pH 7,0 a 2 a 8 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 100 kDa. O lote, recuperado no retentato, foi, então, diluído para aproximadamente 2,0 g de polissacarídeo/L e ajustado por pH com a adição de 1,2 M de bicarbonato de sódio, pH 9,4. O boroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado. 1,5 M de fosfato de potássio, pH 6,0 foi posteriormente adicionado.

Filtração final e armazenamento de produto

[0431] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de L- histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa. O polissorbato 20 foi adicionado ao lote de retentato a uma concentração de 0,05% (p/v), então, o lote foi filtrado com 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron).

[0432] O lote foi ajustado até uma concentração de polissacarídeo de 1,0 g/L com mais 10 mM de L-histidina em 150 mM de cloreto de sódio, tampão de pH 7,0 com 0,03% (p/v) de polissorbato 20, O lote foi distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 12. Atributos de Conjugado de Sorotipo 15A para estudo de proteção cruzada de 15A/B/C da conjugação aquosa

EXEMPLO 16

[0433] Preparação de Conjugado de Sorotipo 15A para Estudo Polivalente Usando Conjugação em DMSO.

[0434] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0435] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 200 bar (20 MPa)/5 passagens.

[0436] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0437] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 1,75 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 20 horas a 22 °C.

[0438] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0439] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0440] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0441] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO que foi pré-aquecido a 34 °C. A solução de polissacarídeo foi misturada com cloreto de sódio até uma concentração de 50 mM. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 5,0 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 2,0. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 2 horas a 34°C.

Redução com boroidreto de sódio

[0442] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto

[0443] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0444] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron, então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 13. Atributos de Conjugado de Sorotipo 15A para estudo polivalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 17 Preparação de Conjugado de Sorotipo 15B para Estudo de Proteção Cruzada de 15A/B/C Usando Conjugação em DMSO

[0445] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0446] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 300 bar (30 MPa)/5 passagens.

[0447] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0448] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 0,20 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 4 horas a 22 °C.

[0449] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0450] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0451] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0452] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 3,0 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 2,0. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 5 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0453] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto

[0454] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0455] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 14. Atributos de Conjugado de Sorotipo 15B para estudo de proteção cruzada de 15A/B/C da conjugação em DMSO

EXEMPLO 18

[0456] Preparação de Conjugado de Sorotipo 15C para Estudo Monovalente e Estudo de Proteção Cruzada de 15A/B/C Usando Conjugação em DMSO.

[0457] O polissacarídeo derivado de sorotipo de Streptococcus pneumoniae 15B foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, submetido à hidrólise de base leve para liberar grupos O-acetila, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho de polissacarídeo, hidrólise de base e oxidação

[0458] O pó de Ps capsular penumocócio de sorotipo 15B purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 300 bar (30 MPa)/5 passagens.

[0459] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0460] A solução de polissacarídeo foi aquecida a 60 °C e tampão de bicarbonato de sódio pH 9 foi adicionado até uma concentração final de 50 mM. O lote foi incubado com a mistura por 13 horas a 60 °C para liberar grupos O- acetila. O tampão de pH 6 de fosfato de potássio foi adicionado até uma concentração final de 136 mM para neutralizar o pH e a solução foi resfriada à temperatura ambiente. A solução foi, então, concentrada e diafiltrada contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0461] A solução de polissacarídeo foi ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 0,20 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0462] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0463] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0464] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0465] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 3,0 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 2,0. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 4 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0466] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto

[0467] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0468] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 15. Atributos de conjugado de sorotipo 15C para estudo monovalente e estudo de proteção cruzada de 15A/B/C da conjugação em DMSO

EXEMPLO 19 Preparação de Conjugado de Sorotipo 15C para Estudo Polivalente Usando Conjugação em DMSO

[0469] O polissacarídeo derivado de sorotipo de Streptococcus pneumoniae 15B foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, submetido à hidrólise de base leve para liberar grupos O-acetila, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Redução de tamanho de polissacarídeo, hidrólise de base e oxidação

[0470] O pó de Ps capsular penumocócio de sorotipo 15B purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 300 bar (30 MPa)/5 passagens.

[0471] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0472] A solução de polissacarídeo foi aquecida a 60 °C e tampão de bicarbonato de sódio pH 9 foi adicionado até uma concentração final de 50 mM. O lote foi incubado com a mistura por 13 horas a 60 °C para liberar grupos O- acetila. O tampão de pH 6 de fosfato de potássio foi adicionado até uma concentração final de 136 mM para neutralizar o pH e a solução foi resfriada à temperatura ambiente. A solução foi, então, concentrada e diafiltrada contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0473] A solução de polissacarídeo foi ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 0,20 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0474] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0475] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0476] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0477] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 3,0 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,75. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 8 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0478] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto

[0479] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0480] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 16. Atributos de conjugado de sorotipo 15C para estudo polivalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 20 Preparação de Conjugado de Sorotipo 16F para Estudo Monovalente Usando Conjugação Aquosa

[0481] O polissacarídeo foi dissolvido, teve tamanho reduzido, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. CRM197 purificada foi, então, conjugada no polissacarídeo ativado utilizando cloreto de níquel na mistura de reação aquosa, e o conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0482] O pó de polissacarídeo pneumocócico capsular purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 200 bar (20 MPa)/5 passagens seguido de 500 bar (50 MPa)/5 passagens para atingir uma massa molecular alvo. O polissacarídeo de tamanho reduzido foi, então, concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0483] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 0,15 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0484] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0485] A solução oxidada de polissacarídeo foi misturada com água e 1,5 M de fosfato de potássio pH 7,0, O pH de tampão selecionado consistiu em melhorar a estabilidade de polissacarídeo ativado durante a reação de conjugação. CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi filtrada com 0,2 mícron e combinada com a solução de polissacarídeo tamponada em uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 0,7. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. As concentrações de polissacarídeo e fosfato foram 7,5 g/L e 100 mM respectivamente. A concentração de polissacarídeo foi selecionada para controlar o tamanho do conjugado resultante. A solução foi, então, filtrada com 0,2 mícron. O cloreto de níquel foi adicionado para aproximadamente 2 mM usando um 100 mM de solução de cloreto de níquel. O cianoboroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado. A conjugação prosseguiu por 122 horas a 22°C para maximizar o consumo de polissacarídeo e proteína.

Redução com boroidreto de sódio

[0486] Após a reação de conjugação, o lote foi diluído até uma concentração de polissacarídeo de aproximadamente 3,0 g/L, resfriado para 2 a 8 °C, e filtrado com 1,2 mícrons. O lote foi diafiltrado contra 100 mM de fosfato de potássio, pH 7,0 a 2 a 8 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 100 kDa. O lote, recuperado no retentato, foi, então, diluído para aproximadamente 2,0 g de polissacarídeo/L e ajustado por pH com a adição de 1,2 M de bicarbonato de sódio, pH 9,4. O boroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado. 1,5 M de fosfato de potássio, pH 6,0 foi posteriormente adicionado.

Filtração final e armazenamento de produto

[0487] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de L- histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa. O polissorbato 20 foi adicionado ao lote de retentato a uma concentração de 0,05% (p/v), então, o lote foi filtrado com 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron).

[0488] O lote foi ajustado até uma concentração de polissacarídeo de 1,0 g/L com mais 10 mM de L-histidina em 150 mM de cloreto de sódio, tampão de pH 7,0 com 0,03% (p/v) de polissorbato 20, O lote foi distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 17. Atributos de conjugado de sorotipo 16F para estudo monovalente da conjugação aquosa

EXEMPLO 21

[0489] Preparação de Conjugado de Sorotipo 16F para Estudo Polivalente Usando Conjugação em DMSO.

[0490] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0491] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 1000 bar (100 MPa)/5 passagens.

[0492] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0493] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 0,15 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0494] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0495] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0496] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0497] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. A solução de polissacarídeo foi misturada com cloreto de sódio até uma concentração de 50 mM. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 2,0 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0498] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kD.

Filtração final e armazenamento de produto

[0499] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0500] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron, então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 18. Atributos de conjugado de sorotipo 16F para estudo polivalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 22 Preparação de Conjugado de Sorotipo 17F para Estudo Monovalente Usando Conjugação em DMSO

[0501] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0502] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 200 bar (20 MPa)/5 passagens.

[0503] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0504] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 0,11 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0505] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0506] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0507] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0508] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. A solução de polissacarídeo foi misturada com cloreto de sódio até uma concentração de 50 mM. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 2,0 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0509] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto

[0510] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0511] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron, então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 19. Atributos de conjugado de sorotipo 17F para estudo monovalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 23 Preparação de Conjugado de Sorotipo 17F para Estudo Polivalente Usando Conjugação em DMSO

[0512] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0513] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 200 bar (20 MPa)/5 passagens.

[0514] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0515] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 0,11 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0516] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0517] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0518] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0519] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. A solução de polissacarídeo foi misturada com cloreto de sódio até uma concentração de 20 mM. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 2,1 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0520] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto

[0521] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0522] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 20. Atributos de conjugado de sorotipo 17F para estudo polivalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 24 Preparação de Conjugado de Sorotipo 19A para Estudo Polivalente Usando Conjugação em DMSO

[0523] O polissacarídeo foi dissolvido, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação de Polissacarídeo

[0524] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0525] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. A quantidade de metaperiodato de sódio adicionado foi 0,26 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 20 horas a 22 °C.

[0526] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0527] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0528] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0529] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 3,8 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,33. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 1,5 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0530] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 3 horas a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kDa.

Filtração final e armazenamento de produto

[0531] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0532] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron, então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 21. Atributos de Conjugado de Sorotipo 19A para estudo polivalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 25 Preparação de Conjugado de Sorotipo 20A para Estudo Monovalente usando Conjugação em DMSO

[0533] O polissacarídeo anteriormente determinado como sorotipo 20A (Calix et al., Biochemical, Genetic, and Serological Characterization of Two Capsule Subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 Strains, J. Biol. Chem. 287(33): 27885-27894, (2012)) foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0534] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 200 bar (20 MPa)/5 passagens.

[0535] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0536] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. Metaperiodato de sódio adicionado a 0,11 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0537] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0538] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0539] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0540] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 2,0 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 6 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0541] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kD.

Filtração final e armazenamento de produto

[0542] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0543] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 22. Atributos do conjugado de sorotipo 20A para estudo monovalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 26 Preparação de Conjugado de Sorotipo 20A para Estudo Polivalente Usando Conjugação em DMSO

[0544] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração.Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0545] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 220 bar (22 MPa)/5 passagens.

[0546] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0547] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. Metaperiodato de sódio adicionado a 0,16 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0548] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0549] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0550] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0551] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. A solução de polissacarídeo foi misturada com cloreto de sódio até uma concentração de 20 mM. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 1,4 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 4 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0552] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kD.

Filtração final e armazenamento de produto

[0553] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0554] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 23. Atributos de Conjugado de Sorotipo 20A para estudo polivalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 27

[0555] Preparação de Conjugado de Sorotipo 22F para Estudo Polivalente Usando Conjugação em DMSO.

[0556] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0557] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 400 bar (40 MPa)/5 passagens.

[0558] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0559] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. Metaperiodato de sódio adicionado a 0,12 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0560] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0561] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0562] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0563] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 1,8 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu por 1 hora a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0564] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kD.

Filtração final e armazenamento de produto

[0565] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0566] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron, então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 24. Atributos de conjugado de sorotipo 22F para estudo polivalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 28

[0567] Preparação de Conjugado de Sorotipo 23A para Estudo Monovalente usando Conjugação em DMSO.

[0568] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0569] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido teve tamanho reduzido por hidrólise ácida pela adição de ácido acético a 200 mM, pela incubação a 90°C por 1,5 horas, então, neutralização pela adição de tampão de pH 7 de fosfato de potássio frio a 400 mM.

[0570] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

[0571] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. O metaperiodato de sódio adicionado foi 0,20 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0572] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0573] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0574] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0575] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. A solução de polissacarídeo foi misturada com cloreto de sódio até uma concentração de 50 mM. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 3,0 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado e a conjugação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0576] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 3 horas a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kD.

Filtração final e armazenamento de produto

[0577] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0578] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron, então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 25. Atributos de conjugado de sorotipo 23A para estudo monovalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 29 Preparação de Conjugado de Sorotipo 23A para Estudo Polivalente Usando Conjugação em DMSO

[0579] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0580] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido teve tamanho reduzido por hidrólise ácida pela adição de ácido acético a 200 mM, pela incubação a 90°C por 1,5 horas, então, neutralização pela adição de tampão de pH 7 de fosfato de potássio frio a 400 mM.

[0581] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

[0582] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. O metaperiodato de sódio adicionado foi 0,20 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0583] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0584] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0585] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0586] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 3,5 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado e a conjugação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0587] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kD.

Filtração final e armazenamento de produto

[0588] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0589] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron, então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 26. Atributos de Conjugado de Sorotipo 23A para estudo polivalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 30 Preparação de Conjugado de Sorotipo 23B para Estudo Monovalente Usando Conjugação em DMSO

[0590] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0591] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 400 bar (40 MPa)/5 passagens.

[0592] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0593] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. Metaperiodato de sódio adicionado a 0,10 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0594] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0595] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0596] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0597] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. A solução de polissacarídeo foi misturada com cloreto de sódio até uma concentração final de 50 mM. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 5,0 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. Ocianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0598] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kD.

Filtração final e armazenamento de produto

[0599] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0600] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron, então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.

[0601] Tabela 27. Atributos de conjugado de sorotipo 23B para estudo monovalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 31 Preparação de Conjugado de Sorotipo 23B para Estudo Polivalente Usando Conjugação em DMSO

[0602] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0603] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 400 bar (40 MPa)/5 passagens.

[0604] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0605] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. Metaperiodato de sódio adicionado a 0,13 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0606] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0607] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0608] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0609] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 5,0 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 4 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0610] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kD.

Filtração final e armazenamento de produto

[0611] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0612] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron, então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 28. Atributos de conjugado de sorotipo 23B para estudo polivalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 32 Preparação de Conjugado de Sorotipo 24F para Estudos Monovalentes e Polivalentes Usando Conjugação em DMSO

[0613] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0614] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido teve tamanho reduzido por hidrólise ácida pela adição de ácido acético a 200 mM, pela incubação a 92 °C por 50 minutos, então, neutralização pela adição de tampão de pH 7 de fosfato de potássio frio a 400 mM.

[0615] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

[0616] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. O metaperiodato de sódio adicionado foi 0,18 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0617] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0618] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0619] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 2 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 10% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0620] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. A solução de polissacarídeo foi misturada com cloreto de sódio até uma concentração final de 50 mM. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 1,5 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. Ocianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0621] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kD.

Filtração final e armazenamento de produto

[0622] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0623] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron, então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C. Tabela 29. Atributos de conjugado de sorotipo 24F para estudos monovalentes e polivalentes da conjugação em DMSO

EXEMPLO 33 Preparação de Conjugado de Sorotipo 31 para Estudo Monovalente Usando Conjugação em DMSO

[0624] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0625] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido teve tamanho reduzido por hidrólise ácida pela adição de ácido acético a 200 mM, pela incubação a 90°C por 30 minutos, então, neutralização pela adição de tampão de pH 7 de fosfato de potássio frio a 400 mM.

[0626] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa.

[0627] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. O metaperiodato de sódio adicionado foi 0,16 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0628] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0629] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0630] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0631] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 4,0 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado e a conjugação prosseguiu por 1 hora a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0632] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kD.

Filtração final e armazenamento de produto

[0633] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0634] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron, então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 30. Atributos de conjugado de sorotipo 31 para estudo monovalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 34 Preparação de Conjugado de Sorotipo 31 para Estudo Polivalente Usando Conjugação em DMSO

[0635] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0636] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 400 bar (40 MPa)/5 passagens.

[0637] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0638] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. Metaperiodato de sódio adicionado a 0,12 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0639] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0640] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0641] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0642] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. A solução de polissacarídeo foi misturada com cloreto de sódio até uma concentração final de 50 mM. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 3,5 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. Ocianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e a conjugação prosseguiu por 1 hora a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0643] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kD.

Filtração final e armazenamento de produto

[0644] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20 a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0645] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron, então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 31. Atributos de conjugado de sorotipo 31 para estudo polivalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 35 Preparação de Conjugado de Sorotipo 33F para Estudo Polivalente Usando Conjugação em DMSO

[0646] O polissacarídeo foi dissolvido, dimensionado para uma massa molecular alvo, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação e redução de tamanho de polissacarídeo

[0647] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo dissolvido foi homogeneizado para reduzir a massa molecular do Ps. A pressão de homogenização e número de passagens através do homogeneizador foram controlados para 350 bar (35 MPa)/4 passagens.

[0648] O polissacarídeo de tamanho reduzido foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0649] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. Metaperiodato de sódio foi adicionado a 0,12 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0650] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0651] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0652] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0653] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Os materiais de CRM197 e Ps liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 1,8 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 1,75. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. O cianoboroidreto de sódio (1 mol por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado, e conjugação prosseguiu por 4 horas a 22 °C.

Redução com boroidreto de sódio

[0654] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kD.

Filtração final e armazenamento de produto

[0655] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0656] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 32. Atributos de conjugado de sorotipo 33F para estudo polivalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 36 Preparação de Conjugado de Sorotipo 35B para Estudo Monovalente Usando Conjugação em DMSO

[0657] O polissacarídeo foi dissolvido, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação de Polissacarídeo

[0658] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0659] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. O metaperiodato de sódio adicionado foi 0,05 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0660] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0661] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0662] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0663] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Ps e CRM197 liofilizados foram redissolvidos individualmente em volumes iguais de DMSO contendo 25 mM de cloreto de sódio. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 10 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 4,0. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. A conjugação prosseguiu por 2,5 horas a 22 °C. O boroidreto de sódio (0,025 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado ao longo de dois picos durante a incubação de conjugação.

Redução com boroidreto de sódio

[0664] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1,5 horas a 22 °C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kD.

Filtração final e armazenamento de produto

[0665] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0666] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 33. Atributos de conjugado de sorotipo 35B para estudo monovalente da conjugação em DMSO

EXEMPLO 37 Preparação de Conjugado de Sorotipo 35B para Estudo Polivalente Usando Conjugação em DMSO

[0667] O polissacarídeo foi dissolvido, quimicamente ativado e trocado com tampão por ultrafiltração. Polissacarídeo ativado e CRM197 purificada foram individualmente liofilizados e redissolvidos em DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo redissolvido foram, então, combinadas e conjugadas conforme descrito abaixo. O conjugado resultante foi purificado por ultrafiltração antes de uma filtração de 0,2 mícron final. Vários parâmetros de processo dentro de cada etapa, como pH, temperatura, concentração e tempo foram controlados para gerar conjugados com atributos desejados.

Oxidação de Polissacarídeo

[0668] O pó de Ps capsular pneumocócio purificado foi dissolvido em água e filtrado com 0,45 mícron. O polissacarídeo foi concentrado e diafiltrado contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 10 kDa.

[0669] A solução de polissacarídeo foi, então, ajustada para 22 °C e pH 5 com um tampão de acetato de sódio para minimizar a redução de tamanho de polissacarídeo devido à ativação. A ativação de polissacarídeo foi iniciada com a adição de uma solução de metaperiodato de sódio a 100 mM. O metaperiodato de sódio adicionado foi 0,05 mols de metaperiodato de sódio por mol de unidade de repetição de polissacarídeo para alcançar um nível-alvo da ativação de polissacarídeo (mols de aldeído por mol de unidade de repetição de polissacarídeo). A reação de oxidação prosseguiu por 2 horas a 22 °C.

[0670] O produto ativado foi diafiltrado contra 10 mM de fosfato de potássio, pH 6,4 seguido de diafiltração contra água usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa. Ultrafiltração foi conduzida a 2 a 8 °C.

Conjugação de polissacarídeo a CRM197

[0671] CRM197 purificada, obtida através da expressão em Pseudomonas fluorescens conforme anteriormente descrito (WO 2012/173876 A1), foi diafiltrada contra 2 mM de tampão de fosfato, pH 7,2 usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 5 kDa e filtrada com 0,2 mícron.

[0672] Os polissacarídeos ativados foram formulados para liofilização a 6 mg de Ps/mL com concentração de sacarose de 5% em p/v. CRM197 foi formulada para liofilização a 6 mg de Pr/mL com concentração de sacarose de 1% em p/v.

[0673] As soluções de CRM197 e Ps formuladas foram individualmente liofilizadas. Ps liofilizado foi redissolvido em DMSO contendo 50 mM de cloreto de sódio. CRM197 liofilizada foi redissolvida em um volume igual de DMSO. As soluções de CRM197 e polissacarídeo foram misturadas para alcançar uma concentração de polissacarídeo de 5,25 g de Ps/L e uma razão de massa entre polissacarídeo e CRM197 de 3,5. A razão de massa foi selecionada para controlar a razão entre polissacarídeo e CRM197 no conjugado resultante. A conjugação prosseguiu por 3 horas a 34 °C. O boroidreto de sódio (0,0375 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado ao longo de três picos durante a incubação de conjugação.

Redução com boroidreto de sódio

[0674] O boroidreto de sódio (2 mols por mol de unidade de repetição de polissacarídeo) foi adicionado seguindo a reação de conjugação e incubado por 1 hora a 34°C. O lote foi diluído em 150 mM de cloreto de sódio, com aproximadamente 0,025% (p/v) de polissorbato 20, a aproximadamente 4OC. O tampão de fosfato de potássio foi, então, adicionado para neutralizar o pH. O lote foi concentrado e diafiltrado a aproximadamente 4OC contra 150 mM de cloreto de sódio, 25 mM de fosfato de potássio pH 7, usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 30 kD.

Filtração final e armazenamento de produto

[0675] O lote foi, então, concentrado e diafiltrado contra 10 mM de histidina em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0, com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, a 4 °C usando uma membrana de ultrafiltração de fluxo tangencial de NMWCO de 300 kDa.

[0676] O lote de retentato foi filtrado com 0,2 mícron (com pré-filtro de 0,5 mícron), então, diluído com 10 mM de histidina adicional em 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,0 com 0,015% (p/v) de polissorbato 20, distribuído em alíquotas e congelado a < -60 °C.Tabela 34. Atributos de conjugado de sorotipo 35B para estudo polivalente da conjugação em DMSO

[0677] Alguns métodos de conjugação não foram descritos para todos os sorotipos nos Exemplos 38 a 51. Para esses métodos de conjugação aquosa não descritos na presente invenção, métodos similares podem ser encontrados no WO2018/156491.

EXEMPLO 38 Formulação de vacinas de conjugado pneumocócico

[0678] Os conjugados de polissacarídeo-proteína pneumocócicos individuais preparados que utilizam diferentes químicas conforme descrito nos Exemplos, supra, foram usados para a formulação de vacinas de conjugado pneumocócico 1-, 7-, 8-, 14-, 15-, 16-, 21- e 31-valente referidas como PCV1, PCV7, PCV8, PCV14, PCV15, PCV16, PCV21 e PCV31, respectivamente.

[0679] A formulação de fármaco de vacina PCV1 continha sorotipo 3 conjugado usando aminação redutiva em um solvente prótico (aquoso) ou um solvente aprótico (DMSO) e formulado em L-Histidina a 20 mM pH 5,8, NaCl a 150 mM e 0,1% (p/v) de PS-20 até uma concentração-alvo final de 84 μg/mL (p/v) de Polissacarídeo Pneumocócico (PnPs) na vacina.

[0680] A formulação de fármaco de vacina PCV7 continha sorotipos 3, 8, 9N, 10A, 11A, 15A e 19A conjugados usando aminação redutiva em um solvente prótico (aquoso) ou aprótico (por exemplo, DMSO) e formulados em L-Histidina a 20 mM pH 5,8, NaCl a 150 mM e 0,1% (p/v) de PS-20. Cada conjugado de polissacarídeo-proteína em PCV7 foi formulado a 12 μg/mL (p/v) de Polissacarídeo Pneumocócico (PnPs) até uma concentração-alvo final de 84 μg/mL de PnPs na vacina.

[0681] O fármaco de vacina PCV8 continha sorotipos 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B conjugados usando aminação redutiva em um solvente aprótico (por exemplo, DMSO) e formulados em 20 mM de L-Histidina pH 5,8, NaCl a 150 mM e 0,2% (p/v) de PS-20. Cada conjugado de polissacarídeo-proteína em PCV8 foi formulado a 4 μg/mL (p/v) de Polissacarídeo Pneumocócico (PnPs) até uma concentração-alvo final de 32 μg/mL de PnPs na vacina.

[0682] O fármaco de vacina de PCV14 continha sorotipos 3, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 16F, 17F, 19A, 20A, 22F e 33F conjugados usando aminação redutiva em um solvente prótico (aquoso) ou aprótico (por exemplo, DMSO)e formulados em 20 mM de L-Histidina pH 5,8, NaCl a 150 mM e 0,1% (p/v) de PS- 20. Cada conjugado de polissacarídeo-proteína em PCV14 foi formulado a 6 μg/mL (p/v) de Polissacarídeo Pneumocócico (PnPs) até uma concentração-alvo final de 84 μg/mL de PnPs na vacina.

[0683] O fármaco de vacina PCV15 continha sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F conjugados em um solvente prótico (aquoso) solvente e formulado em 20 mM de L-Histidina pH 5,8, NaCl a 150 mM e 0,2% (p/v) de PS-20. Cada conjugado de polissacarídeo-proteína foi formulado a 4 μg/mL (p/v) de Polissacarídeo Pneumocócico (PnPs), exceto para 6B, que foi formulado a 8 μg/ml, até uma concentração-alvo final de 64 μg/mL de PnPs na vacina.

[0684] O fármaco de vacina PCV16 continha sorotipos 6C, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 20A, 23A, 23B, 24F, 31, e 35B, conjugados usando aminação redutiva em um solvente aprótico (por exemplo, DMSO) e formulados em 20 mM de L-Histidina pH 5,8 NaCl a 150 mM e 0,2% (p/v) de PS-20. Cada conjugado de polissacarídeo-proteína foi formulado a 4 μg/mL (p/v) ou 8 μg/mL (p/v) de Polissacarídeo Pneumocócico (PnPs) até uma concentração-alvo final de 64 μg/mL ou 128 μg/mL de PnPs na vacina.

[0685] O fármaco de vacina PCV21 continha sorotipos 3, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 19A, 20A, 22F, 23A, 23B, 24F, 31, 33F e 35B, conjugados usando aminação redutiva em um solvente aprótico (por exemplo, DMSO) e formulados em 20 mM de L-Histidina pH 5,8 NaCl a 150 mM e várias concentrações de PS-20 conforme definido em cada exemplo. Cada conjugado de polissacarídeo-proteína foi formulado a 4 μg/mL (p/v) ou 8 μg/mL (p/v) de Polissacarídeo Pneumocócico (PnPs) até uma concentração-alvo final de 84 μg/mL ou 168 μg/mL de PnPs na vacina. Em alguns exemplos, PCV21 foi formulada com 250 μg [Al]/mL na forma de Fosfato de Alumínio.

[0686] O fármaco de vacina PCV31 continha sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 31, 33F e 35B conjugados usando aminação redutiva em um solvente prótico (aquoso) ou um solvente aprótico (por exemplo, DMSO) e formulados em 20 mM de L-Histidina pH 5,8 NaCl a 150 mM e 0,2% PS-20. Cada conjugado de polissacarídeo-proteína foi formulado a 4 μg/mL (p/v) de Polissacarídeo Pneumocócico (PnPs), exceto para 6B, que foi formulado a 8 μg/mL de PnPs, até uma concentração-alvo final de 128 μg/mL de PnPs na vacina. Em alguns exemplos, PCV31 foi formulado com 250 μg [Al]/mL na forma de Fosfato de Alumínio.

[0687] As formulações adicionais de fármaco de PCV monovalente foram preparadas utilizando sorotipos de conjugado de polissacarídeo-proteína pneumocócico 6A, 6B, 6C, 10A, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 20A, 23A, 23B, 24F, 31 ou 35B. Detalhes adicionais são descritos nos exemplos específicos para essas formulações.

[0688] Para preparar a formulação de fármaco de PCV, os volumes necessários de conjugados concentrados necessários para obter a concentração final indicada de (p/v) Polissacarídeo Pneumocócico (também referida como PnPs) foram calculados com base no volume de lote e a concentração de polissacarídeo concentrado.

[0689] O processo de formulação consistiu em uma preparação de mistura concentrada de conjugado a 1X a 4X de concentração final de misturas de PnPs em 10 a 80 mM de Histidina, 0,0 a 0,8% (p/v) de PS-20 e 150 mM de cloreto de sódio, pH 5,8.

[0690] Histidina pH 5,8, PS-20 (se utilizado) e 150 mM de cloreto de sódio soluções foram preparados e adicionados ao vaso de formulação. Os conjugados de polissacarídeo-proteína pneumocócicos individuais, armazenados congelados, foram descongelados a 2 a 8 °C e, então, adicionados ao vaso de formulação. Durante a adição de conjugado de polissacarídeo-proteína no tampão de formulação (mistura de conjugado), o vaso foi misturado para garantir a homogeneidade usando uma barra magnética ou impulsor magnético. Após todas as adições terem sido feitas e a solução tiver sido agitada, a mistura de conjugado foi passada através de filtros de esterilização e coletada em um vaso com ou sem adjuvante de Fosfato de alumínio. Em alguns casos, os filtros de esterilização foram abertos com 150 mM de cloreto de sódio para ajustar o lote para atingir a concentração.

[0691] As formulações foram preenchidas em seringas de plástico, seringas de vidro ou frascos.

EXEMPLO 39 Avaliação de Estabilidade de Vacinas de Conjugado Pneumocócico

[0692] Dois produtos de fármaco de vacina conjugada pneumocócica PCV21 (84 μg/mL ou 168 μg/mL de PnPs) ou PCV16 (128 μg/mL de PnPs) foram preenchidos em seringas ou frascos. Os conjugados de polissacarídeo-proteína foram feitos através de aminação redutiva em um solvente aprótico (por exemplo, DMSO) e foram formulados em 20 mM de L-Histidina, pH 5,8, NaCl a 150 mM e 0,2% (p/v) de PS-20. Esses produtos de fármaco foram colocados a 25 °C ou 37 °C por até quatro semanas e a 4oC por até doze semanas. Em alguns casos, as seringas foram colocadas em uma plataforma de rotação horizontal e agitadas por até 18 horas após armazenamento por 1 semana a 4 °C, 25 °C ou 37 °C. Isso foi feito para simular os estresses de transporte e manuseio que podem acompanhar a distribuição e fabricação de fármaco. Para avaliar a estabilidade dos produtos de fármaco de PCV16 ou PCV21, HPSEC UV/MALS/RI foi usado. Cromatografia por Exclusão por tamanho de Alto Desempenho (HPSEC), usando duas colunas Shodex (803 e 806), acopladas em conjunto em série e detecção de índice de refração (RI) e difusão de luz de múltiplos ângulos (MALS) ultravioleta (UV) para medir a concentração e massa molar de formulações de fármaco de PCV durante o armazenamento. A concentração é calculada para cada intervalo de tempo através do pico e é, então, integrada em todos os intervalos para atingir o valor de concentração final. A difusão de luz é proporcional ao produto da massa molecular e a concentração do analito. Massas molares ou peso molecular em cada intervalo é calculado da partir dos sinais de detector. A massa molecular média numérica (Mn) e média ponderada (Mw) é calculada através de todos os intervalos para o pico e relatada como peso molecular médio.

[0693] O armazenamento pode resultar em danos à proteína e/ou carboidrato de uma vacina conjugada. Os antígenos de carboidrato que possuem ligações de cadeia principal de fosfodiéster ou outras instabilidades na unidade de repetição do polissacarídeo podem ser suscetíveis à despolimerização através da hidrólise sob armazenamento por tempo estendido e temperatura. Além disso, o carboidrato e a proteína carreadora que é usada na vacina conjugada pode ser suscetível à agregação sob armazenamento e estresses físicos.

[0694] Conforme mostrado na Figura 11, os produtos de fármaco de PCV16 e PCV21 ficaram estáveis por 4 semanas a 25 °C e 37 °C e até 12 semanas a 4oC independentemente da concentração de polissacarídeo. Ademais, mediante a agitação horizontal após estresse térmico, os produtos de fármaco de PCV16 e PCV21 foram mostrados como estáveis. Nenhuma perda de quantidade de antígeno devido à absorção não específica ao lado dos recipientes ou vasos foi observada sob esses estresses térmicos e físicos. Adicionalmente, nenhuma agregação do fármaco foi observada o que impactaria seu desempenho na coluna (por exemplo, ligação irreversível à coluna ou incapaz de entrar/sair das colunas de resolução) na estimativa de dose total da vacina (Figura 12).

[0695] HPSEC UV/MALs/RI foi usado para medir o peso molecular de um conjugado de polissacarídeo-proteína. Se os conjugados de polissacarídeo- proteína no fármaco degradarem ou despolimerizarem, uma diminuição em peso molecular estaria evidente e se a agregação do fármaco ocorrer, um aumento no peso molecular ocorreria. Essa medição fornece caracterização adicional na qualidade do intermediário ou fármaco de vacina. Conforme mostrado na Figura 13, os produtos de fármaco de PCV16 e PCV21 que compreendem substâncias de fármaco que foram cada um preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico (por exemplo, DMSO) foram estáveis contra despolimerização ou degradação química do carboidrato e estáveis contra agregação da proteína na formulação de fármaco. Isso indica que os produtos de fármaco de PCV16 e PCV21 usando conjugados de polissacarídeo-proteína preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico, como DMSO, são estáveis à temperatura elevada e estresses físicos. As formulações demonstraram estabilidade excelente em termos tanto de quantidade quanto de qualidade. A formulação não perde a dose total devido à absorção não específica ao lado dos recipientes ou outras superfícies e a formulação não degrada ou agrega conforme indicado pelo peso molecular estável do fármaco de vacina (peso molecular médio ponderado (Mw) e peso molecular médio numérico (Mn)).

EXEMPLO 40 Impacto da Química de Conjugação na Estabilidade de uma vacina conjugada pneumocócica

[0696] Os conjugados de polissacarídeo-proteína pneumocócicos individuais preparados utilizando diferentes químicas conforme descrito nos Exemplos, supracitados, foram usados para a formulação de vacinas de conjugado pneumocócico 15- e um 16-valente referidas como PCV15 e PCV16 a 64 μg/ml. O fármaco de vacina PCV15 continha sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F, conjugados usando aminação redutiva em um solvente prótico (todo aquoso) e formulados em 20 mM de L-Histidina, pH 5,8, NaCl a 150 mM e 0,2% em p/v de PS-20 (vide EXEMPLO 38). O fármaco continha sorotipos de PCV16 6C, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 20A, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, conjugados usando aminação redutiva em um solvente aprótico (por exemplo, todo DMSO) e formulados em 20 mM de L-Histidina, pH 5,8, NaCl a 150 mM, e 0,2% (p/v) de PS-20 (vide EXEMPLO 38). Cada conjugado de polissacarídeo-proteína foi formulado a 4 μg/mL (p/v) de Polissacarídeo Pneumocócico (PnPs) exceto para 6B em PCV15, que foi formulado a 8 μg/ml, para uma concentração final de 64 μg/mL de PnPs em cada vacina.

[0697] Os recipientes preenchidos com vacina foram colocados a 4 °C ou 37 °C por até 1 semana. A espectroscopia de fluorescência de proteína intrínseca (IPFS) foi usada para avaliar a estabilidade de proteína carreadora conjugada com polissacarídeo pneumocócico, CRM197, nas composições de PCV15 ou PCV16 mediante o armazenamento por até 1 semana a 4 °C e a 37 °C. Os espectros de emissão de fluorescência (Em 290 a 400 nm) de amostras não diluídas foram coletados com o uso de um Espectrofluorômetro Jasco FP-6500 à temperatura ambiente em uma cubeta de quartzo de 1 cm de comprimento. Um comprimento de onda de excitação de 280 nm foi usado com uma velocidade de varredura de 100 nm/min e excitação e uma passagem de banda de emissão de 3nm.

[0698] Conforme mostrado na Figura 14, a formulação de fármaco contendo substâncias de fármaco preparadas usando aminação redutiva em um solvente aprótico (por exemplo, todo DMSO) Resultou em estabilidade física e química superior em comparação a uma vacina que utiliza substâncias de fármaco preparadas usando um solvente prótico durante aminação redutiva no processo de conjugação (toda conjugação aquosa). Em apenas 16 horas a 37 °C, a intensidade de fluorescência do fármaco de PCV15, em 64 μg/mL de PnPs, preparado usando aminação redutiva em um solvente prótico (todo aquoso) para o processo de conjugação foi reduzida e a emissão máxima da vacina alterou de 332 nm para 338 nm. O fármaco de vacina PCV16, em 64 μg/mL de PnPs, utilizando as substâncias de fármaco preparadas com química de aminação redutiva em um solvente aprótico (por exemplo, todo DMSO) não mostrou uma mudança de intensidade de fluorescência ou emissão máxima de 338 nm. Deve ser entendido que a intensidade de sinal resultante e a emissão máxima adquirida a partir da medição de IPFS se devem à estabilidade coletiva das substâncias de fármaco individuais em um fármaco de complexo multivalente. Foi mostrado que um fármaco de vacina que utiliza todas as substâncias de fármaco preparadas em um solvente aprótico é estável enquanto um fármaco de vacina que utiliza todas as substâncias de fármaco preparadas em um solvente prótico não é estável.

[0699] Sem se ater a qualquer teoria particular, essa estabilidade pode ser devido à conjugação em DMSO resultante do desdobramento e desnaturação da proteína carreadora. A conjugação a proteína carreadora desnaturada pode bloquear a conformação em estado desnaturado após a conjugação. Se houver, esse estudo poderia também sugerir que a conformação final é estável sob o estudo de estresse avaliado aqui. Portanto, é preferencial usar uma vacina com conjugado principalmente preparado com os solventes apróticos para fornecer um fármaco de vacina consistente e estável.

[0700] Se uma composição de fármaco de vacina tiver incluído uma mistura de substâncias de fármaco, glicoconjugados ou conjugados de polissacarídeo- proteína que utilizam diferentes solventes de aminação redutiva (aquoso ou DMSO) nos processos de conjugação, a intensidade ou emissão máxima média medida a partir da formulação de fármaco seria ponderada devido à contribuição de cada emissão de conjugado de polissacarídeo-proteína aquoso em 332 nm e cada emissão de conjugado de polissacarídeo-proteína não aquoso em 338 nm. Seria esperado que uma mudança ocorresse, tanto em máxima de emissão quanto intensidade, sob temperatura elevada para uma mistura de modo que não use todos os conjugados de polissacarídeo-proteína, preparados usando aminação redutiva em um solvente aprótico, na formulação de fármaco multivalente. Portanto, é preferencial usar uma vacina com conjugado principalmente preparado com solventes apróticos para fornecer um fármaco de vacina consistente e estável.

EXEMPLO 41 Estudos de Imunogenicidade de Coelho Monovalente Compilada para Sorotipos Selecionados

[0701] Os coelhos brancos da Nova Zelândia adultos (NZWR, n=3/grupo) foram imunizados de modo intramuscular (IM) com 0,25 mL ou 0,5 mL (para apenas 15C) da respectiva vacina de conjugado monovalente no dia 0 e no dia 14 (lados alternados). As vacinas pneumocócicas monovalentes, formuladas em 20 mM de L-Histidina, pH 5,8, NaCl a 150 mM, e 0,2% (p/v) de PS-20 e processo de formulação descrito no Exemplo 38, foram dosadas da seguinte forma: (1) 1 μg de PnPs (6C, 10A, 15A, 16F, 17F, 20A, 23A, 23B, 24F, 31 ou 35B, cada conjugado em CRM197) com 62,5 μg de adjuvante de fosfato de alumínio (APA) por imunização, ou (2) 2 μg PnPs (15C- CRM197com 125 μg APA por imunização. Os soros foram coletados antes do início do estudo (pré-imune) e nos dias 14 (pós- dose 1, PD1) e 28 (pós-dose 2, PD2). Os NZWRs foram observados pelo menos diariamente pela equipe de cuidado animal treinada para quaisquer sinais de doença ou angústia. Considera-se que as formulações de vacina em NZWRs sejam seguras e bem toleradas, já que nenhum evento adverso relacionado à vacina foi observado. Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade estrita com as recomendações no Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo experimental de NZWR foi aprovado pelos Comitês Institucionais de Uso e Cuidado Animal tanto da Merck & Co., Inc. (Kenilworth, NJ) and Covance (Denver, PA).

[0702] Os soros de NZWR foram testados em ensaios de ELISA para avaliar a imunogenicidade de IgG com o uso de uma respectiva concentração de revestimento de PnPs de 1 a 2 mg/ml. O anticorpo funcional foi determinado através de ensaios de opsonofagocitose (OPA) com base nos protocolos anteriormente descritos disponíveis online no Laboratório de Referência de Patógeno Respiratório Bacteriano na Universidade de Alabama em Birmingham usando software de Opsotiter® 3 (UAB Research Foundation, Caro-Aguilar et al. Immunogenicity differences of a 15-valent pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (PCV15) based on vaccine dose, route of immunization and mouse strain. Vaccine 35(6):865-72 (2017); Burton et al. Development and validation of a fourfold multiplexed opsonization assay (MOPA4) for pneumococcal antibodies. Clin Vaccine Immunol 13(9):1004-9 (2006)).

[0703] Constatou-se que todas as vacinas de conjugado pneumocócico monovalentes sejam imunogênicas em coelhos (Figura 15) e geram anticorpo funcional que exterminou a respectiva cepa bacteriana (Figura 16).

EXEMPLO 42 Avaliação de Proteção Cruzada de sorotipos 15A, 15B, 15C

[0704] Os coelhos foram imunizados com 15A- CRM197/APA, 15B- CRM197/APA ou 15C- CRM197/APA para avaliar a reatividade cruzada entre cada sorotipo.

[0705] Os coelhos brancos da Nova Zelândia adultos (NZWR, n=3/grupo) foram imunizados intramuscularmente (IM) com 0,5 mL da respectiva vacina de conjugado monovalente no dia 0 e no dia 14 (lados alternados). A vacina conjugada pneumocócica monovalente formulada em 20 mM de L-Histidina com pH 5,8, NaCl a 150 mM e 0,2% (p/v) de PS-20 e o processo de formulação descrito no Exemplo 38, foi dosado em 2 μg de PnPs (15A, 15B ou 15C, cada um sendo conjugado em CRM197) com 125 μg de APA por imunização. Os soros foram coletados antes do início do estudo (pré-imune) e nos dias 14 (pós-dose 1, PD1) e 28 (pós-dose 2, PD2). Os NZWRs foram observados pelo menos diariamente pela equipe de cuidado animal treinada para quaisquer sinais de doença ou angústia. Considera-se que as formulações de vacina em NZWRs sejam seguras e bem toleradas, já que nenhum evento adverso relacionado à vacina foi observado. Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade estrita com as recomendações no Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo experimental de NZWR foi aprovado pelos Comitês Institucionais de Uso e Cuidado Animal tanto da Merck & Co., Inc quanto da Covance (Denver, PA).

[0706] Os soros de NZWR foram testados em ensaios de ELISA para avaliar a imunogenicidade de IgG com o uso de uma respectiva concentração de revestimento de PnPs de 1 a 2 mg/ml. O anticorpo funcional foi determinado através de OPA com base nos protocolos anteriormente descritos disponíveis no Bacterial Respiratory Pathogen Reference Laboratory na University de Alabama at Birmingham com o uso de software Opsotiter® 3 (UAB Research Foundation (Caro-Aguilar et al., 2017; Burton et al., 2006).

[0707] Constatou-se que todas as três vacinas de conjugado pneumocócico monovalentes do sorogrupo 15 são imunogênicas em coelhos (Figura 17) e geram anticorpo funcional que exterminaram a respectiva cepa bacteriana (Figura 18). Além disso, os coelhos imunizados com vacina conjugada pneumocócicas monovalentes do sorogrupo 15 tiveram títulos equivalentes de PD2 IgG e OPA à cepa de polissacarídeo homólogo e heterólogo e bacteriana respectivamente. Os coelhos imunizados com 15A-CRM197/APA, 15B- CRM197/APA ou 15C-CRM197/APA, todos tiveram reatividade cruzada com cada polissacarídeo pneumocócico (15A, 15B, 15C) (Figura 17). Ao usar dados de IgG transformados em log pós-dose 2 (PD2) analisados por uma ANOVA de uma via com múltiplos testes de comparação de Tukey (valor P=0,354), não houve diferença significativa nos títulos de IgG no sorogrupo 15. Além disso, os coelhos imunizados com 15A-CRM197/APA, 15B-CRM197/APA ou 15C-CRM197/APA, todos tiveram reatividade cruzada com cada cepa bacteriana de S. pneumoniae, (15A, 15B, 15C), pois todos os soros de coelho hiperimune tiveram anticorpo funcional para cada cepa avaliada e exterminaram as bactérias (Figura 18). Similarmente, ao usar os dados de OPA transformados em log pós-dose 2 (PD2) analisados por uma NOVA de uma via com múltiplos testes de comparação de Tukey (Valor de P=0,054), não houve diferença significativa nos títulos de OPA no sorogrupo 15.

EXEMPLO 43 Imunogenicidade de PCV21 em Coelhos Brancos da Nova Zelândia

[0708] Os coelhos brancos da Nova Zelândia (NZWR, n=5/grupo) foram imunizados intramuscularmente (IM) com 0,1 a 0,5 mL de vacina conjugada pneumocócica no dia 0 e no dia 14 (lados alternados). Uma vacina pneumocócica de PCV21 formulada em 20 mM de L-Histidina com pH 5,8, NaCl a 150 mM e 0,2% (p/v) de PS-20 e o processo de formulação descrito no Exemplo 38 foi dosada em 4, 2, 1, 0,4, 0,08 ou 0,016 μg de PnPs (3, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 19A, 20A, 22F, 23A, 23B, 24F, 31, 33F ou 35B, cada um sendo conjugado em CRM197) por imunização. Os soros foram coletados antes do início do estudo (pré-imune) e nos dias 14 (pós-dose 1, PD1) e 28 (pós-dose 2, PD2). Os NZWRs foram observados pelo menos diariamente pela equipe de cuidado animal treinada para quaisquer sinais de doença ou angústia. Considera-se que as formulações de vacina em NZWRs sejam seguras e bem toleradas, já que nenhum evento adverso relacionado à vacina foi observado. Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade estrita com as recomendações no Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo experimental de NZWR foi aprovado pelos Comitês Institucionais de Uso e Cuidado Animal tanto da Merck & Co., Inc quanto da Covance (Denver, PA).

[0709] Os soros de NZWR foram avaliados quanto à imunogenicidade de IgG com o uso de um ensaio eletroquimioluminescente multiplexado (ECL). Esse ensaio foi desenvolvido para uso com soro de coelho com base no ensaio humano descrito por Marchese et al. (Optimization and validation of a multiplex, electrochemiluminescence-based detection assay for the quantitation of immunoglobulin G serotype-specific antipneumococcal antibodies in human serum. Clin Vaccine Immunol. 16(3): 387 a 96 (2009)) com o uso de tecnologia desenvolvida por MesoScale Discovery (uma divisão de MesoScale Diagnostics, LLC, Gaithersburg, MD) que utiliza uma marca SULFO-TAG™ que emite luz após o estímulo eletroquímico. O IgG anticoelho marcado com SULFO-TAG™foi usado como o anticorpo secundário para testar amostras de soro de coelho. O anticorpo funcional foi determinado através de ensaios de opsonofagocitose multiplexados (MOPA) com base nos protocolos anteriormente descritos disponíveis no Bacterial Respiratory Pathogen Reference Laboratory na University de Alabama at Birmingham com o uso de software Opsotiter® 3 (UAB Research Foundation (Caro-Aguilar et al. supracitado, 2017; Burton et al. supracitado, 2006).

[0710] Constatou-se que as vacinas de conjugado pneumocócico de PCV21 são imunogênicas em coelhos (Figuras 19A, 19B, 20A, e 20B) e geram anticorpo funcional que exterminou cepas bacterianas do tipo vacina (Figuras 21A e 21B) em todas as doses testadas.

[0711] A imunogenicidade de PD1 comparável foi observada para PCV21 dosado em 4, 2, 1 e 0,4 μg por PnPs, com exceção de 24F que teve imunogenicidade superior na dose de 2 μg em comparação às doses de 4 ou 1 μg e 15A, 15B e 15C que tiveram imunogenicidade superior na dose de 0,4 μg em comparação à dose de 2 μg (Figuras 19A e 19B). Portanto, não houve muita resposta à dose de vacina nas doses superiores de PnPs (0,4 a 4 μg/PnPs). A imunogenicidade inferior foi observada nas doses de vacina de PnPs de 0,08 e 0,016 μg, pois muitos sorotipos foram significativamente inferiores quando em comparação à dose de vacina de 2 μg.

[0712] A imunogenicidade de PD2 comparável foi observada para PCV21 dosado em 4, 2, 1 e 0,4 μg por PnPs (Figuras 20A e 20B).

[0713] Em geral, os títulos de PD2 MOPA comparáveis foram observados para PCV21 dosado em 4, 2, 1 e 0,4 μg por PnPs com títulos de MOPA que tendem a ser inferiores para as doses de vacina de PnPs de 0,08 e 0,016 μg, embora muitas atinjam significância estatística (dados não mostrados). O PCV21 dosado em 2 μg por PnPs foi selecionado como um conjunto de dados representativo para MOPA. Especificamente, os coelhos imunizados com PCV21 na dose de 2 μg tiveram títulos de PD1 MOPA significativamente superiores a todos os sorotipos em comparação aos soros de coelho pré-imunes com excepção do sorotipo 3 (Figura 21A). Deve ser observado que os soros pré-imunes de coelho desse estudo tiveram títulos pré-existentes superiores aos sorotipos 16F, 31 e 35B. Os coelhos imunizados com PCV21 na dose de 2 tiveram títulos de PD2 MOPA significativamente superiores a todos os sorotipos em comparação aos soros de coelhos pré-imunes (Figura 21B). Os dados transformados em log foram analisados por uma ANOVA de uma via com teste de Dunnett para determinar significância.

EXEMPLO 44 Materiais e Métodos Teste de polissacarídeo livre

[0714] O polissacarídeo livre (polissacarídeo que não é conjugado com CRM197) na amostra de conjugado é medido ao precipitar primeiramente a proteína livre e os conjugados com desoxicolato (DOC) e ácido hidroclorídrico. Então, os precipitados são filtrados e os filtrados são analisados para concentração de polissacarídeo livre por HPSEC/UV/MALS/RI. O polissacarídeo livre é calculado como uma porcentagem de polissacarídeo total medido por HPSEC/UV/MALS/RI.

Teste de proteína livre

[0715] O polissacarídeo livre, o conjugado de polissacarídeo-CRM197 e a CRM197 livre em amostras de conjugado são separados por eletroforese capilar no modo de cromatografia de eletrocinética micelar (MEKC). Brevemente, as amostras são misturadas com tampão em execução de MEKC contendo 25mM de borato, 100mM de SDS, pH 9,3, e são separadas em um capilar de sílica fundida convencional pré-condicionada. A separação é monitorada a 200 nm e a CRM197 livre é quantificada com uma curva padrão de CRM197. Os resultados de proteína livre são relatados como uma porcentagem de teor de proteína total determinado pelo procedimento de HPSEC/UV/MALS/RI.

Análise de peso molecular e concentração de conjugados como uso de ensaio de HPSEC/UV/MALS/RI

[0716] As amostras de conjugado foram injetadas e separadas através de cromatografia de exclusão por tamanho de alta eficiência (HPSEC). A detecção foi realizada com detectores ultravioletas (UV), dispersão de luz em vários ângulos (MALS) e de índice de refração (RI) em série. A concentração de proteína foi calculada a partir de UV280 com o uso de um coeficiente de extinção. A concentração de polissacarídeo foi desconvolucionada a partir do sinal de RI (contribuído tanto para a proteína quanto para o polissacarídeo) com o uso dos fatores de dn/dc que são a alteração em um índice de refração de solução com uma alteração na concentração de soluto relatada em mL/g. O peso molecular médio das amostras foi calculado por software Astra (Wyatt Technology Corporation, Santa Bárbara, CA) com o uso das informações de concentração medida e dispersão de luz em todo o pico da amostra. Há múltiplas formas de valores médios de peso molecular para moléculas polidispersadas. Por exemplo, peso molecular médio numérico Mn, peso molecular médio ponderado Mw e z- peso molecular médio z Mz (Molecules, 2015, 20, 10313a 10341). Salvo se especifico, os pesos moleculares são peso molecular médio ponderado.

[0717] Determinação de consumo de lisina na proteína conjugada como uma medida do número de ligações covalentes entre o polissacarídeo e a proteína carreadora.

[0718] A análise de aminoácidos Waters AccQ-Tag (AAA) foi usada para medir a extensão de conjugação em amostras de conjugado. As amostras foram hidrolisadas com o uso de hidrólise ácida em fase de vapor na estação de trabalho Eldex para romper as proteínas carreadoras em seus aminoácidos componentes. Os aminoácidos livres foram derivados com o uso de carbamato de 6-aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidila (AQC). Então, as amostras derivadas foram analisadas com o uso de UPLC com detecção UV em uma coluna C18. A concentração de proteína média foi obtida com o uso de aminoácidos representativos diferentes de lisina. O consumo de lisina durante a conjugação (isto é, perda de lisina) foi determinado pela diferença entre a quantidade de lisina medida média no conjugado e a quantidade de lisina esperada na proteína de partida.

EXEMPLO 45 Impacto de Processo de Conjugação na estabilidade de uma vacina conjugada pneumocócica

[0719] Os conjugados de polissacarídeo-proteína pneumocócicos individuais preparados com a utilização de solventes de aminação redutiva diferentes (aquosos ou DMSO), conforme descrito nos Exemplos supracitados, foram usados para a formulação de um fármaco de vacina de conjugados pneumocócicos 1-, 7-, 14- e 21-valente chamados de PCV1, PCV7, PCV14 e PCV21 a 84 μg/ml.

[0720] Os recipientes preenchidos com fármaco de vacina foram colocados a 4 °C ou 37 °C por até 7 dias. A espectroscopia de fluorescência de proteína intrínseca (IPFS) foi usada para avaliar a estabilidade de proteína carreadora conjugada com polissacarídeo pneumocócico, CRM197, nas composições de PCV1, PCV7, PCV14 ou PCV21 após o armazenamento até a 4 °C e a 37 °C. Os espectros de emissão de fluorescência (Em 290 a 400 nm) de amostras não diluídas foram coletados com o uso de um Espectrofluorômetro Jasco FP-6500 à temperatura ambiente em uma cubeta de quartzo de 1 cm de comprimento. Um comprimento de onda de excitação de 280 nm foi usado com uma velocidade de varredura de 100 nm/min e excitação e uma passagem de banda de emissão de 3nm.

[0721] Conforme mostrado nas Figuras 22 A a C, as formulações de fármaco contendo todos os conjugados de polissacarídeo-proteína preparados com o uso de aminação redutiva em um solvente aprótico (por exemplo, DMSO) resultaram em estabilidade química e física superior quando em comparação a uma vacina que utiliza todos os conjugados de polissacarídeo-proteína preparados com o uso de solvente aquoso durante a aminação redutiva no processo de conjugação (prótico). Em apenas 16 horas a 37 °C, a intensidade de fluorescência dos produtos de fármaco PCV1, PCV7 e PCV14 preparados com o uso de todos os conjugados de polissacarídeo-proteína que foram preparados com o uso de aminação redutiva em um solvente aquoso a 84 μg/mL de PnPs foi reduzida e a emissão máxima da vacina passou de 332 nm para 338 nm. Os produtos de fármaco de vacina PCV1, PCV7 e PCV14 a 84 μg/mL de PnPs que utilizam substâncias de fármaco preparadas com química de aminação redutiva em um solvente aprótico (por exemplo, DMSO) não mostraram uma alteração na intensidade de fluorescência ou na emissão máxima a 338 nm. Além disso, um fármaco PCV21 foi estudado também. O mesmo foi formulado em 20 mM de L- Histidina com pH 5,8, NaCl a 150 mM, e 0,1% (p/v) PS-20 conforme descrito no Exemplo 38 contendo conjugados de polissacarídeo-proteína preparados com o uso de aminação redutiva em um solvente aprótico (por exemplo, DMSO). O estudo mostrou estabilidade física e química superior após o armazenamento a 37 °C. O PCV21 não mostrou uma alteração na intensidade de fluorescência ou na emissão máxima de 338 nm (Figura 22D).

[0722] Deve ser entendido que a intensidade de sinal resultante e a emissão máxima adquirida a partir da medição de IPFS (EXEMPLO 40) ocorre devido à estabilidade coletiva dos conjugados de polissacarídeo-proteína individuais em um fármaco de complexo multivalente. Foi mostrado que um fármaco de vacina que utiliza todos os conjugados de polissacarídeo-proteína preparados em um solvente aprótico é estável enquanto um fármaco de vacina que utiliza todas as substâncias de fármaco preparadas em um solvente prótico é não estável sob condições de tensão. Se uma composição de fármaco de vacina incluída uma mistura de conjugados de polissacarídeo-proteína tanto com processo de conjugação de prótico quanto com processo de conjugação de aprótico, a emissão máxima ou a intensidade média medida do fármaco seria ponderada devido à contribuição de cada emissão de conjugados de polissacarídeo-proteína próticos a 332 nm e cada aprótico de conjugado de polissacarídeo-proteína a 338 nm. Seria esperado que uma alteração ponderada ocorreria na intensidade ou na emissão máxima após a temperatura elevada para tal mistura devido à presença dos conjugados de polissacarídeo-proteína preparados com o uso de um processo de conjugação prótica.

[0723] Conforme mostrado na Figura 23, para avaliar a estabilidade do fármaco PCV21 preparado em 0,084 mg/mL de PnPs, a Análise de Rastreamento de Nanopartícula (NTA) foi utilizada. A técnica coleta vídeos de populações de nanopartículas diretamente rastreadas à medida que se movem pelo movimento browniano para extrapolar o tamanho e a concentração de partícula. Um laser de classe 1 e 635 nm focaliza um feixe de laser vermelho de 80 mícron através da amostra líquida, iluminando partículas como os pontos de luz se difundem rapidamente. Uma câmera CCD grava um vídeo de 30 quadros por segundo para rastrear o movimento de cada partícula iluminada individual ao longo do tempo. O software do sistema identifica o centro de partícula individual do vídeo e rastreia a distância independentemente percorrida para determinar o deslocamento quadrado médio. Esse rastreamento é realizado simultaneamente para cada partícula na população de amostras em cada quadro até os dados brutos coletados de todo o vídeo serem analisados. Ao medir simultaneamente o deslocamento quadrado médio de cada partícula individual rastreada, seu coeficiente de difusão (Dt) e o raio hidrodinâmico equivalente esférico (rh) são determinados ao aplicar a equação de Stokes-Einstein. Então, o software representa esses dados acumulados como um tamanho e a distribuição de concentração de partícula. São coletadas as informações de dados brutos apenas sobre o tamanho e a concentração de partícula, mas também sobre a intensidade ou brilho da partícula. Os dados considerados juntos são ajustados e plotados individualmente como a intensidade de partícula em relação ao tamanho de partícula, e a concentração de partícula em relação ao tamanho de partícula, e, então, em gráficos de contorno tridimensional comparando o tamanho, a concentração e a intensidade de partícula de todas as populações de partículas.

[0724] Uma vacina de conjugado compreendida de proteína carreadora e antígeno de polissacarídeo pode ser suscetível em conjunto ou separadamente à agregação na faixa de tamanho de partícula de 10 a 1000 nm, tornando, desse modo, a NTA uma estabilidade adequada que indica a técnica para avaliar e quantificar o fenônemo de agregação. Após a exposição de fármaco a 4 °C e a 37 °C por 1 semana, nenhuma agregação significativa de fármaco foi observada por NTA para formulações contendo PS-20 a concentrações de 0,025% p/v, 0,05% p/v, 0,1% p/v, 0,15% p/v e 0,2% p/v de PS20 (conforme mostrado na Figura 23). Entretanto, após submeter as formulações à agitação por 6 h a 4 °C, a formulação sem polissorbato 20 foi ineficaz na mitigação de agregação induzida por agitação do fármaco conforme evidenciado pelo tamanho de partícula D90 aumentado, maior distribuição de tamanho de partícula e intensidade de partícula aumentada conforme fornecido pela NTA. Portanto, é preferencial manter o polissorbato 20 a 0,025 a 0,2% ou a níveis superiores (p/v) para estabilizar o fármaco durante a fabricação de rotina, armazenamento, transporte e manuseio.

[0725] Conforme descrito no Exemplo 39, HPSEC UV/MALS/RI foi usado para medir o peso molecular de um fármaco de conjugado de polissacarídeo- proteína 21-valente (PCV21) formulado em 20 mM de L-Histidina com pH 5,8, NaCl a 150 mM e 0 a 0,2% (p/v) de PS-20 e o processo de formulação descrito no Exemplo 38. As formulações foram colocadas a 4 °C ou a 37 °C por até uma semana. Em alguns casos, as seringas foram colocadas em uma plataforma de rotação horizontal e agitadas por até 6 horas após o armazenamento por 1 semana a 4 °C ou a 37 °C. Isso foi feito para simular as tensões de transporte e manuseio que podem acompanhar a fabricação e a distribuição de fármaco. Se os conjugados de polissacarídeo-proteína nos produtos de fármaco forem degradantes ou despolimerizantes, uma diminuição no peso molecular seria aparente e se a agregação da formulação de fármaco ocorrer, um aumento no peso molecular poderia ocorrer. Essa medição fornece caracterização adicional na qualidade do fármaco de vacina ou conjugados de polissacarídeo-proteína como uma função de concentração de PS-20. Conforme mostrado na Figura 24, as formulação de fármaco PCV21 que compreendem todas as substâncias de fármaco que foram, cada uma, preparadas com o uso de aminação redutiva em um solvente aprótico (por exemplo, DMSO) foram estável contra a despolimerização ou degradação química dos carboidratos e estável contra a agregação da proteína na formulação de fármaco devido ao tratamento térmico entre 0,05% e 0,15% de PS-20. Coletivamente, isso indica que um fármaco PCV21 é estável através de temperatura elevada e tensões físicas quando formulado com o uso de PS-20 de 0,025% e 0,2% ou níveis superiores.

EXEMPLO 46 Proteção de PCV21 do Desafio em Camundongos

[0726] Os camundongos Swiss Webster fêmeas jovens (6 a 8 semanas, n=10/grupo) foram imunizados intraperitonealmente (IP) com 0,1 a 0,5 mL de uma vacina conjugada pneumocócica 21-valente (PCV21) nos dias 0, 14 e 28. A vacina pneumocócica de PCV21 foi dosada em 4, 2, 0,4, 0,08 ou 0,016 μg de PnPs (3, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 19A, 20A, 22F, 23A, 23B, 24F, 31, 33F e 35B, cada um sendo conjugado em CRM197) por imunização. Os camundongos foram observados pelo menos diariamente pela equipe de cuidado animal treinada para quaisquer sinais de doença ou angústia. Considera- se que as formulações de vacina em camundongos sejam seguras e bem toleradas, já que nenhum evento adverso relacionado à vacina foi observado. No dia 52, os camundongos foram desafiados intratraquealmente com sorotipo 24F de Streptococcus pneumoniae. As culturas de fase exponencial de S. pneumoniae foram centrifugadas, lavadas e suspensas em PBS estéril. Os camundongos foram anestesiados com isoflurano antes do desafio. 105 cfu de S. pneumoniae em 0,1 mL de PBS foram colocados na garganta dos camundongos suspenso na vertical por seus incisivos. A aspiração das bactérias foi induzida ao puxar a língua para fora e cobrir as narinas. Os camundongos foram pesados diariamente e sofreram eutanásia se a perda de peso exceder 20% de peso inicial. O sangue foi coletado em 24 horas, 48 horas e 72 horas para avaliar quanto à bacteremia. Os camundongos foram observados duas vezes ao dia pela equipe de cuidado animal treinada para quaisquer sinais de doença ou angústia. Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade estrita com as recomendações no Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo experimental de camundongo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Uso e Cuidado Animal da Merck & Co., Inc.

[0727] Os soros de camundongo foram avaliados quanto à imunogenicidade de IgG com o uso de um ensaio de eletroquimioluminescência multiplexada (ECL). Esse ensaio foi desenvolvido para uso com soro de camundongo com base no ensaio humano descrito por Marchese et al., Clin Vaccine Immunol. (2009) 16(3):387 a 96, com o uso de tecnologia desenvolvida por MesoScale Discovery (uma divisão de MesoScale Diagnostics, LLC, Gaithersburg, MD) que utiliza uma marca SULFO-TAG™ que emite luz após o estímulo eletroquímico. O IgG anti-camundongo marcado com SULFO-TAG™foi usado como o anticorpo secundário para testar amostras de soro de camundongo. O anticorpo funcional foi determinado através de ensaios de opsonofagocitose multiplexada (MOPA) com base nos protocolos anteriormente descritos em www.vacina.uab.edu e no software Opsotiter® 3 de propriedade e licenciado pela University de Alabama (UAB) Research Foundation (Vide Caro- Aguilar I. et al., Vaccine (2017) 35(6):865 a 72 e Burton R.L. e Nahm M.H. Clin. Vaccine Immunol. (2006) 13(9):1004 a 9).

[0728] A imunização com PCV21 gerou título de anticorpo em camundongos Swiss Webster para todos os sorotipos na vacina (dados não mostrados). O PCV21 foi também imunogênico em camundongos Balb/c e CD1 (dados não mostrados). Os camundongos Swiss Webster imunizados com PCV21 foram protegidos também do desafio com sorotipo 24F de S. pneumoniae (Figura 25). O teste log-rank Mantel Cox indica que todos os grupos imunizados com PCV21 foram protegidos significativamente do desafio quando em comparação ao grupo naive (P<0,05). De modo similar, os grupos de camundongos imunizados com PCV21 tiveram pouca ou nenhuma bacteremia, o que foi siginificativamente menos quando em comparação ao grupo naive (dados não mostrados).

EXEMPLO 47 Imunogenicidade de PCV e Anticorpo Funcional em Coelhos

[0729] Os coelhos brancos Nova Zelândia adultos (NZWR, n=5/grupo) foram imunizados intramuscularmente (IM) com 0,1 mL de PCV no dia 0 e no dia 14 (lados alternados). O PCV foi dosado em 0,4 μg de PnPs por sorotipo por imunização com 25 μg [Al] na forma de adjuvante de Fosfato de Alumínio (APA). No caso de PCV31, a concentração de dosagem de sorotipo 6B foi dobrada para 0,8 μg de PnPs por imunização. O PCV21 (conforme descrito no EXEMPLO 38 ) incluiu polissacarídeos purificados dos sorotipos 3, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 19A, 20A, 22F, 23A, 23B, 24F, 31, 33F e 35B, cada um sendo conjugado em CRM197. Cada conjugado de polissacarídeo-proteína foi preparado sem adjuvante ou formulado com 250 μg [Al]/mL na forma de Fosfato de Alumínio ou APA para avaliar o efeito de adjuvante (PCV21/APA). Os PCVs de latência inferior foram formulados também (conforme descrito no EXEMPLO 38) para incluir 8 STs novos (PCV8: 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, cada um sendo conjugado em CRM197, sem adjuvante), o 16 STs não incluídos em qulaquer PCV licenciado (PCV16 : 6C, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 20, 23A, 23B, 24F, 31 e 35B, cada um sendo conjugado em CRM197, sem adjuvante) ou PCV31 (1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 33F e 35B, cada um sendo conjugado em CRM197, formulado com 250 μg [Al]/mL na forma de Fosfato de Alumínio) para avaliar a supressão de carreadora à medida que a valência de vacina aumentou (PCV31/APA). Cada vacina usou conjugados de polissacarídeo- proteína formulados em 4 μg/mL (p/v) de polissacarídeo pneumocócico (PnPs), exceto o 6B que foi formulado em 8 μg/mL (p/v) de polissacarídeo pneumocócico (PnPs) no PCV31 ou PCV31/APA. A concentração final de polissacarídeo pneumocócico (PnPs) em cada vacina foi 128 μg/mL de PnPs no PCV31, 84 μg/mL de PnPs no PCV21, 64 μg/mL no PCV16 e 32 μg/mL no PCV8.

[0730] Os soros foram coletados antes do início do estudo (pré-imunização) e nos dias 14 (PD1) e 28 (PD2). Os NZWRs foram observados pelo menos diariamente pela equipe de cuidado animal treinada para quaisquer sinais de doença ou angústia. Considera-se que as formulações de vacina em NZWRs sejam seguras e bem toleradas, já que nenhum evento adverso relacionado à vacina foi observado. Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade estrita com as recomendações no Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo experimental de NZWR foi aprovado pelos Comitês Institucionais de Uso e Cuidado Animal tanto da Merck & Co., Inc quanto da Covance (Denver, PA).

[0731] Os soros de coelho foram avaliados quanto à imunogenicidade de IgG com o uso de um ensaio de eletroquimioluminescência multiplexada (ECL).Esse ensaio foi desenvolvido para uso com soro de coelho com base no ensaio humano descrito por Marchese et al., Clin Vaccine Immunol. (2009) 16(3):387 a 96, com o uso de tecnologia desenvolvida por MesoScale Discovery (uma divisão de MesoScale Diagnostics, LLC, Gaithersburg, MD) que utiliza uma marca SULFO-TAG™ que emite luz após o estímulo eletroquímico. O IgG anticoelho marcado com SULFO-TAG™foi usado como o anticorpo secundário para testar amostras de soro de coelho. O anticorpo funcional foi determinado através de ensaios de opsonofagocitose multiplexada (MOPA) com base nos protocolos anteriormente descritos em www.vacina.uab.edu e no software Opsotiter® 3 de propriedade e licenciado pela University de Alabama (UAB) Research Foundation (Vide Caro- Aguilar I. et al., Vaccine (2017) 35(6):865 a 72 e Burton R.L. e Nahm M.H. Clin. Vaccine Immunol. (2006) 13(9):1004 a 9).

[0732] Os soros de coelho foram testados como um conjunto quanto à pré- imunização e PD1, e individualmente quanto à PD2 nos ensaios eletroquimioluminescentes multiplexados para determinar títulos de anticorpos. Os PCVs geraram títulos de anticorpo em coelhos para todos os sorotipos após imunizações com a vacina (dados não mostrados). O polissacarídeo de sorotipo 15B não foi incluído no PCV16, PCV21 ou PCV31. Entretanto, os títulos de anticorpo para o sorotipo 15B foram observados após a imunização com ambos os PCV16, PCV21 e PCV31.

[0733] O PCV21 sem adjuvante teve imunogenicidade comparável ou significativamente superior (sorotipos 3, 7F, 10A, 19A, 23A e 23B) quando em comparação ao PCV21 com APA (Figura 26A-B e Figura 28), não sugerindo nenhum benefício adicional em coelhos com APA incluído na vacina.

[0734] A supressão epitópica induzida por carreador se refere à interferência na resposta de anticorpo a um antígeno (como polissacarídeo capsular) acoplado à mesma proteína carreadora (como CRM197). Considera-se que a interferência surja a partir da competição por um número limitado de células T auxiliares primárias específicas de carreadora. Como um resultado, pode haver uma diminuição na resposta ao polissacarídeo capsular. A Pfizer observou uma diminuição na imunogenicidade de vacina dos sorotipos compartilhados como a valência de vacina aumentada de uma vacina 7-valente para 13-valente [Comparison of IgG antibody GMC of Prevnar (7 valent) versus Prevnar13, (tabela 9, página 29 de monografia de PCV13)]. Portanto, procura-se investigar a imunogenicidade de PCVs valentes inferiores quando em comparação ao PCV21 (Figura 27A a C). O PCV8 (8 sorotipos novos) teve imunogenicidade comparável em relação ao PCV21 para os 8 sorotipos compartilhados (Figura 29). O PCV16 (PCV21 menos 5 sorotipos sobrepostos do PCV15) teve imunogenicidade comparável em relação ao PCV21 para 15 dos 16 sorotipos compartilhados (Figura 29). O sorotipo 31 teve imunogenicidade superior no PCV16 (Figura 29). No geral, não houve tendências importantes de supressão de carreadora com PCV21 em NZWR. O PCV31/APA teve imunogenicidade comparável em relação ao PCV21/APA para o 12 dos 21 sorotipos compartilhados. 10 sorotipos (6C, 7F, 9N, 12F, 15A, 15B (não no PCV21), 15C, 17F, 19A e 23A) tiveram imunogenicidade superior no PCV31, se situaram na faixa entre 2,9 vezes e 11 vezes (Figura 30). No geral, não houve tendências importantes de supressão de carreadora com PCV31 em NZWR.

[0735] Constatou-se que os PCVs são imunogênicos em coelhos e geraram anticorpos funcionais que exterminaram cepas bacterianas do tipo vacina. Os soros de coelho foram testados nos ensaios de opsonofagocitose multiplexados (MOPA) para determinar títulos de anticorpo funcional. O PCV21 teve títulos comparáveis ou superiores aos títulos de PD2 OPA quando em comparação ao PCV21/APA, PCV8 e PCV16 (Figura 31). Os dados transformados em log foram analisados por uma ANOVA de uma via com teste de Dunnett para determinar significância. O PCV21 teve títulos significativamente superiores aos títulos de OPA para o sorotipo 16F quando em comparação ao PCV8 e para os sorotipos 12F, 23A e 19A quando em comparação ao PCV21/APA. O PCV31 teve títulos superiores aos títulos de OPA para o sorotipo 23A quando em comparação ao PCV21.

EXEMPLO 48 Imunogenicidade de PCV21 em Macacos Rhesus adultos

[0736] O PCV21 foi avaliado também em modelos imunigênicos de macaco Rhesus adulto. Os macacos Rhesus foram imunizados intramuscularmente com PCV21 nos dias 0, 28 e 56. O PCV21 foi dosado em 1 μg de PnPs em um volume de 0,25 mL (3, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 19A, 20A, 22F, 23A, 23B, 24F, 31, 33F e 35B, cada um sendo conjugado em CRM197) por imunização. Os soros foram coletados antes do início do estudo (pré-imunização, dia 0) e nos dias 14 (PD1), 28, 42 (PD2), 56, 70 (PD3) e 84.

[0737] Os soros de Rhesus foram avaliados quanto à imunogenicidade de IgG com o uso de um ensaio eletroquimioluminescente multiplexado (ECL). Esse ensaio foi desenvolvido para uso com soro de Rhesus com base no ensaio humano descrito por Marchese et al. e Skinner et al. (Marchese R.D. et al., Clin. Vaccine Immunol. (2009) 16(3):387a 96 e Skinner, J.M. et al., Vaccine (2011) 29(48):8870-8876) com o uso de tecnologia desenvolvida por MesoScale Discovery (uma divisão de MesoScale Diagnostics, LLC, Gaithersburg, MD) que utiliza uma marca SULFO-TAG™ que emite luz após o estímulo eletroquímico. O IgG anti-humano marcado com SULFO-TAG™foi usado como o anticorpo secundário para testar amostras de soro de Rhesus. O anticorpo funcional foi determinado através de ensaios de opsonofagocitose multiplexada (MOPA) com base nos protocolos anteriormente descritos em www.vacina.uab.edu e no software Opsotiter® 3 de propriedade e licenciado pela University de Alabama (UAB) Research Foundation (Vide Caro-Aguilar I. et al., Vaccine (2017) 35(6):865 a 72 e Burton R.L. e Nahm M.H. Clin. Vaccine Immunol. (2006) 13(9):1004 a 9).

[0738] Constatou-se que o PCV21 é imunogênico em macacos adultos e gerou anticorpos funcionais que exterminaram cepas bacterianas do tipo vacina em todos os pontos de tempo testados (Figura 32 e 33). Observa-se também que o PCV21 que contém conjugados de polissacarídeo 15A-CRM197 e 15C-CRM197 fornece também reatividade cruzada para 15B conforme evidenciado no ECL. O PCV21 foi imunogênico com uma dose de vacina nos macacos (Figura 32). A maior parte dos sorotipos atingiu seu título máximo em PD1 com excepção dos STs 6C, 12F e 24F, que se beneficiaram das imunizações adicionais. Os macacos Rhesus adultos tiveram títulos de anticorpo pré-existentes quando em comparação a estudos de PCV anteriores em macacos Rhesus bebê. Os títulos de anticorpo pré-existente foram mais aparentes ao testar as amostras de soros em MOPA, o que dificultou a determinação do título de opsonofagocitose. Todos os pontos de tempo de estudo foram testados em MOPA como amostras agrupadas ou individuais, mas para uma visualização mais fácil, apenas a pré-imunização, PD1 e PD3 são mostrados (Figura 33), pois não há muita diferença nos títulos de OPA entre PD1 e PD3.

[0739] Os soros de macaco Rhesus adulto imunizado com Rhesus foram avaliados para proteção cruzado com outras bactérias de S. pneumoniae (Figura 34). Os soros de macaco imunizado com PCV21 tiveram proteção cruzada com os sorotipos 6A, 6B e 23F, mas não com o sorotipo 19F. A proteção cruzada com 6A e 6B é provável devido à imunização com conjugado de polissacarídeo 6C- CRM197 como parte de um PCV21 multivalente. Similarmente, a imunização com conjugados de polissacarídeo 23A-CRM197 e 23B-CRM197 como parte de um PCV multivalente resultou em proteção cruzada para sorotipo 23F. A imunização com PCV21 incluindo o conjugado de polissacarídeo 19A-CRM197 não forneceu proteção cruzada para 19F.

EXEMPLO 49 Imunogenicidade de PCV21 em Macacos Rhesus adultos - Avaliação de adjuvante e de Supressão de Carreadora

[0740] Um outro estudo com macaco incluiu a avaliação de PCV21 com e sem APA e a comparação de imunogenicidade de sorotipo compartilhado para avaliar a supressão de portadora. Os macacos Rhesus adultos (n=5/grupo) foram imunizados intramuscularmente com vacinas em uma meia dose humana no dia 0 do estudo. O PCV21 foi dosado em 1 μg de PnPs em um 0,25 mL de volume (3, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 19A, 20, 22F, 23A, 23B, 24F, 31, 33F e 35B, cada um sendo conjugado em CRM197) por imunização. Um grupo incluiu PCV21 com adjuvante com 62,5 μg [Al] na forma de Fosfato de Alumínio. Um outro grupo incluiu PCV15 dosado em 1 μg de PnPs em um 0,25 mL de volume (1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F e 33F, cada um sendo conjugado em CRM197 com 6B dosado em 2 μg) por imunização e com adjuvante com 62,5 μg [Al] na forma de Fosfato de Alumínio. Um outro grupo incluiu Prevnar13® (PCV13) dosado em 1,1 μg de PnPs em um 0,25 mL de volume (1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F, cada um sendo conjugado em CRM197 com 6B dosado em 2,2 μg) por imunização. Os soros foram coletados antes do início do estudo (pré-imunização, dia 0) e no dia 28.

[0741] Constatou-se que o PCV21 é imunogênico em macacos e geraram anticorpos funcionais que exterminaram cepas bacterianas do tipo vacina. O PCV21 sem adjuvante teve imunogenicidade comparável ou significativamente superior (sorotipos 15A e 15B) quando em comparação ao PCV21 com APA (Figura 35). O PCV21 não inclui sorotipo 15B.

[0742] Os macacos imunizados com PCV21 foram comparados aos macacos imunizados com PCV15 e Prevnar13. O PCV21 e o PCV15 têm 5 sorotipos compartilhados (3, 7F, 19A, 22F, 33F); não houve nenhuma diferença na imunogenicidade desses 5 sorotipos entre os macacos imunizados com PCV21 ou PCV15 (Figura 36). O PCV21 e o Prevnar13 têm 3 sorotipos compartilhados (3, 7F, 19A); não houve nenhuma diferença na imunogenicidade para os sorotipos 7F e 19A. Os macacos imunizados com Prevnar13 tiveram títulos de anticorpo inferiores para o sorotipo 3 em comparação ao PCV21 (Figura 36). Essa constatação é consistente com os dados clínicos humanos de PCV15, mostrando o sorotipo 3 sendo mais imunogênico na vacina de PCV15 da Merck. Esses resultados considerados em conjunto sugerem que a supressão de carreadora não foi observada em macacos Rhesus adultos imunizados com PCV21 quando em comparação ao Prevnar13 ou PCV15.

EXEMPLO 50 Reatividade Cruzada de sorotipos 6A, 6B e 6C - Estudo Monovalente

[0743] O fármaco monovalente foi preparado com o uso de conjugado de polissacarídeo pneumocócico 6A-CRM197 ou conjugado de polissacarídeo pneumocócico 6B-CRM197 e foi formulado em 20 mM de histidina com pH 5,8 e 150 mM de cloreto de sódio e 0,1% p/v de polissorbato-20 (PS-20) em uma concentração-alvo de polissacarídeo total de 4,0 μg/mL de qualquer sorotipo. Os conjugados foram preparados através de conjugação individual da proteína CRM197 com polissacarídeo pneumocócico (PnPs) de tipos (-6A ou -6B). O volume exigido de conjugados concentrados necessários para obter a concentração-alvo de sorotipos individuais foram calculados com base no volume de lote e na concentração de concentrações de polissacarídeo concentrados individual. Os conjugados individuais foram adicionados a uma solução de histidina, cloreto de sódio e PS-20 para criar um conjugado 2X misturado. O vaso de formulação contendo o conjugado 2X misturado foram foi misturado com o uso de uma barra de agitação magnética, e o estéril filtrado em um outro vaso. Então, o estéril filtrado 2X misturado foi diluído com solução salina para alcançar as concentrações de polissacarídeo total e adjuvante alvo desejadas. Então, as formulações foram preenchidas em frascos e armazenadas a 2 a 8 °C.

[0744] Os coelhos foram imunizados com 6A-CRM197 ou 6B-CRM197 para avaliar a reatividade cruzada no sorogrupo 6. Os coelhos brancos Nova Zelândia adultos (NZWR, n=3/grupo) foram imunizados de modo intramuscular (IM) com 0,25 mL da respectiva vacina de conjugado monovalente no dia 0 e no dia 14 (lados alternados). A vacina conjugada pneumocócica monovalente formulada em 20 mM de L-Histidina com pH 5,8, NaCl a 150 mM e 0,1% (p/v) PS-20 com um processo de formulação descrito no Exemplo 38 foi dosada em 1 μg de PnPs (6A ou 6B, cada um sendo conjugado em CRM197). Os soros foram coletados antes do início do estudo (pré-imune) e nos dias 14 (pós-dose 1, PD1) e 28 (pós-dose 2, PD2). Os NZWRs foram observados pelo menos diariamente pela equipe de cuidado animal treinada para quaisquer sinais de doença ou angústia. Considera- se que as formulações de vacina em NZWRs sejam seguras e bem toleradas, já que nenhum evento adverso relacionado à vacina foi observado. Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade estrita com as recomendações no Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo experimental de NZWR foi aprovado pelos Comitês Institucionais de Uso e Cuidado Animal tanto da Merck & Co., Inc quanto da Covance (Denver, PA).

[0745] Os soros de NZWR foram testados em ensaios de ELISA para avaliar a imunogenicidade de IgG com o uso de uma respectiva concentração de revestimento de PnPs de 2 μg/ml. O anticorpo funcional foi determinado através de ensaios de opsonofagocitose (OPA) com base nos protocolos anteriormente descritos em www.vacina.uab.edu e no software Opsotiter® 3 de propriedade de e licenciado pela UAB Research Foundation (Vide, Caro-Aguilar I. et al., vacina (2017) 35(6):865 a 72 e Burton R.L. e Nahm M.H. Clin. Vaccine Immunol. (2006) 13(9):1004 a 9).

[0746] Constatou-se que tanto o 6A-CRM197 quanto o 6B-CRM197 são imunogênicos em coelhos (Figura 37) e geram anticorpo funcional que exterminou a respectiva cepa bacteriana (Figura 38). Além disso, os coelhos imunizados com vacina conjugada pneumocócicas monovalentes do sorogrupo 6 tiveram títulos equivalentes de PD2 IgG e OPA à cepa de polissacarídeo homólogo e heterólogo e bacteriana respectivamente. Os coelhos imunizados com 6A-CRM197 ou 6B-CRM197, todos tiveram reatividade cruzado com cada polissacarídeo pneumocócico (PnPs 6A, PnPs 6B e PnPs 6C) (Figura 37). Ao usar dados de IgG transformados em log pós-dose 2 (PD2) analisados por uma-ANOVA de uma via, não houve diferença significativa nos títulos de IgG no sorogrupo 6. Além disso, os coelhos imunizados com 6A-CRM197 ou 6B-CRM197, todos tiveram reatividade cruzada com cada cepa bacteriana de S. pneumoniae (6A, 6B e 6C), pois todos os soros de coelho hiperimune tiveram anticorpo funcional para cada cepa avaliada e exterminaram as bactérias (Figura 38). Similarmente, ao usar dados de OPA transformados em log pós-dose 2 (PD2) analisados por uma ANOVA de uma via, não houve diferença significativa nos títulos de OPA no sorogrupo 6.

EXEMPLO 51 Reatividade Cruzada de sorotipos 20A e 20B - Estudo Monovalente

[0747] O fármaco foi preparado com o uso de conjugado de polissacarídeo pneumocócico 20A-CRM197 e foi formulado em 20 mM de histidina com pH 5,8 e 150 mM de cloreto de sódio e 0,2% p/v de polissorbato-20 (PS-20) a 4,0 μg/ml. A formulação foi preparada com 250,0 μg [Al]/mL na forma de Fosfato de Alumínio como o adjuvante (20A-CRM197/APA). O conjugado foi preparado através de conjugação individual da proteína CRM197 com polissacarídeo pneumocócico (PnPs) do tipo 20. O volume de conjugado concentrado necessário para obter a concentração-alvo de sorotipo individual foi calculado com base no volume de lote e na concentração de concentração de polissacarídeo concentrado individual. O único conjugado foi adicionado a uma solução de histidina, cloreto de sódio e PS-20 para produzir um conjugado 4X misturado a 16,0 μg/ml. O recipiente de formulação contendo o conjugado misturado foi misturado com o uso de uma barra de agitação magnética e o estéril foi filtrado em um outro recipiente. Então, o estéril filtrado 4X misturado foi adicionado em outro recipiente contendo adjuvante de Fosfato de Alumínio para alcançar as concentrações de polissacarídeo total, excipiente e adjuvante alvo desejadas. Então, as formulações foram preenchidas em frascos de vidro e armazenadas a 2 a 8 °C.

[0748] Os coelhos foram imunizados com 20A-CRM197/APA ou PCV21 para avaliar a reatividade cruzada no sorogrupo 20. Os coelhos brancos Nova Zelândia adultos (NZWR, n=3/grupo) foram imunizados de modo intramuscular (IM) com vacina conjugada pneumocócica no dia 0 e no dia 14 (lados alternados). A vacina conjugada pneumocócica monovalente formulada conforme descrito acima foi dosada em 1 μg de PnPs em 0,25 mL (conjugado ST20A em CRM197 e 62,5 μg [Al] na forma de Fosfato de Alumínio foi usado como adjuvante), uma vacina conjugada pneumocócica multivalente PCV21 (84 μg/mL de PnPs) formulada em 20 mM de L-Histidina, NaCl a 150 mM com pH 5,8 e 0,2% (p/v) de PS-20 com um processo de formulação descrito no Exemplo 38 foi dosada em 0,4 μg de PnPs em 0,1 mL (sorotipos 3, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 19A, 20, 22F, 23A, 23B, 24F, 31, 33F e 35B, cada um sendo conjugado em CRM197). Os soros foram coletados antes do início do estudo (pré-imune) e nos dias 14 (pós- dose 1, PD1) e 28 (pós-dose 2, PD2). Os NZWRs foram observados pelo menos diariamente pela equipe de cuidado animal treinada para quaisquer sinais de doença ou angústia. Considera-se que as formulações de vacina em NZWRs sejam seguras e bem toleradas, já que nenhum evento adverso relacionado à vacina foi observado. Todos os experimentos com animais foram realizados em conformidade estrita com as recomendações no Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde. O protocolo experimental de NZWR foi aprovado pelos Comitês Institucionais de Uso e Cuidado Animal tanto da Merck & Co., Inc quanto da Covance (Denver, PA).

[0749] Os soros de NZWR foram testados em ensaios de opsonofagocitose (OPA) para avaliar o anticorpo funcional com base nos protocolos anteriormente descritos em www.vacina.uab.edu e no software Opsotiter® 3 de propriedade e licenciado pela UAB Research Foundation (Vide, Caro-Aguilar I. et al., Vaccine (2017) 35(6):865 a 72 e Burton R.L. e Nahm M.H. Clin. Vaccine Immunol. (2006) 13(9):1004 a 9).

[0750] Os coelhos imunizados tanto com vacinas 20A-CRM197/APA monovalentes quanto com vacinas PCV21 multivalentes geradas anticorpo funcional que exterminaram ambos os sorotipos 20A e 20B de S. pneumoniae (Figura 39). Isso sugere que os sorotipos 20A e 20B compartilham similaridade estrutural resultando na reatividade cruzada no sorogrupo.

Claims (4)

1. Composição imunogênica multivalente, caracterizada pelo fato de que compreende conjugados de proteína carreadora e polissacarídeo de S. pneumoniae, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo particular de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae consistem em 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B O- desacetilado, 17F e 20, e a proteína carreadora é CRM197.

2. Composição imunogênica multivalente de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polissacarídeo O-desacetilado 15B tem um teor de O-Acetil por unidade de repetição inferior a 5%.

3. Composição imunogênica multivalente, caracterizada pelo fato de que compreende conjugados de proteína carreadora e polissacarídeo de S. pneumoniae, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo particular de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae consistem em 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F e 20, e a proteína carreadora é CRM197.

4. Composição imunogênica multivalente, caracterizada pelo fato de que compreende conjugados de proteína carreadora e polissacarídeo de S. pneumoniae, em que cada um dos conjugados compreende um polissacarídeo de um sorotipo particular de S. pneumoniae conjugado a uma proteína carreadora, em que os sorotipos de S. pneumoniae consistem em 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F e 20, e a proteína carreadora é CRM197.

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