KR20210062669A - 스트렙토코쿠스 뉴모니아에의 정제된 협막 다당류 - Google Patents

스트렙토코쿠스 뉴모니아에의 정제된 협막 다당류 Download PDF

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KR20210062669A
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라잔 스리라만
라메쉬 벤카트 마투르
나렌더 데브 만테나
마히마 다틀라
비라판두 산가레디
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바이오로지칼 이 리미티드
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Abstract

본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에의 협막 다당류에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2, 15A, 15C 및 35B의 크기 조정되고 정제된 협막 다당류 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

스트렙토코쿠스 뉴모니아에의 정제된 협막 다당류
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 9월 23일에 출원된 인도 특허 출원 번호 201841031653 및 201841031654에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)의 정제된 협막 다당류에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2, 15A, 15C 및 35B의 정제되고 크기 조정된 협막 다당류 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다.
스트렙토코쿠스 뉴모니아에는 패혈증, 수막염, 중이염 및 엽성 폐렴과 같은 동물 및 인간의 침습적 감염에서 주요 원인제인 그람 양성 박테리아이다. 감염 과정의 일부로, 폐렴구균(Pneumococcus)은 렉틴-유사 방식으로 진핵생물 탄수화물에 결합함으로써 상부 및 하부 호흡기의 비-염증 인간 상피 세포에 쉽게 결합한다.
폐렴구균은 혈청형 특이성을 부여하는 화학적으로 연결된 다당류로 협막 안에 에워싸인다. 폐렴구균에 대해 90개 초과의 공지된 혈청형이 있으며, 협막은 박테리아의 내부 표면을 보체로부터 보호할 뿐만 아니라 그 자체로 면역원성이 약하기 때문에 폐렴구균의 주요 독력 결정인자이다. 항-다당류 항체 수준은 침습적 폐렴구균 질환에 대한 방어를 예측하는 것으로 간주되어 왔다. 백신으로서 폐렴구균 다당류 외피는 면역계가 발달했거나 손상되지 않은 개체에서 스트렙토코쿠스 뉴모니아에에 대한 합리적인 정도의 면역을 부여할 수 있지만, 적절한 캐리어 단백질에 접합된 협막 다당류는, 또한 폐렴구균 감염 위험이 가장 높은, 영아 및 노인에서 면역 반응을 허용한다.
폐렴구균 백신은 폐렴구균 다당류 백신 및 폐렴구균 접합체 백신을 포함한다. 상용화된 폐렴구균 다당류 백신의 방어 효능은 백신접종 시 유도되는 항체의 농도와 다소 관련이 있다는 것이 일반적으로 인정된다. 현재의 백신은 다가 폐렴구균 다당류 백신(2개 이상의 혈청형으로부터의 폐렴구균 다당류를 포함) 및 폐렴구균 접합체 백신을 포함한다.
Pneumovax®23은 다가 폐렴구균 다당류 백신이며, 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F 및 33F를 포함한 23종의 폐렴구균 혈청형으로부터의 비접합된 협막 다당류를 함유한다. 허가받은 Pneumovax®23은 성인, 특히 노인 및 고위험군에서 폐렴구균 질환 예방에 가치가 있음이 입증되었다. 그러나, 영아 및 어린 아이는 이들 비접합된 폐렴구균 다당류 백신에 잘 반응하지 않는다.
Prevnar®-7은 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신이며, 7종의 가장 자주 단리되는 다당류 혈청형(예컨대, CRM197에 접합된 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F)을 포함한다. 2000년 미국에서 Prevnar®-7 사용이 시작된 이후로 어린이에서 침습적 폐렴구균 질환(IPD)이 현저하게 감소되었다. 전 세계 특정 지역에서 Prevnar®-7의 혈청형 적용범위의 한계로 인해 CRM197에 접합된 13종의 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F를 함유하는 13가 접합체 백신 Prevenar-13®이 개발되고 승인되었다.
Synflorix®는 단백질 D(PD)에 접합된 10종의 다당류 혈청형 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 23F, 파상풍 톡소이드(TT)에 접합된 혈청형 18C 및 디프테리아 톡소이드(DT)에 접합된 혈청형 19F를 포함하는 폐렴구균 접합체 백신이다. 각각의 혈청형 다당류는 제어된 pH 하에서 1-시아노-4-디메틸아미노-피리디늄 테트라플루오로보레이트(CDAP)를 사용하여 커플링된다.
미국 특허 번호 9,492,559B2는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15B로부터의 당접합체, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 22F로부터의 당접합체, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 33F로부터의 당접합체, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 12F로부터의 당접합체, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 10A로부터의 당접합체, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 11A로부터의 당접합체 및 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 8로부터의 당접합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 개시한다. WO 2019/050813A1은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 16F로부터의 정제된 협막 다당류, 및 이의 다당류 단백질 접합체를 개시한다.
WO 2019/050814A1은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 23A 및 23B로부터의 정제된 협막 다당류 및 이의 다당류-단백질 접합체를 개시한다.
WO 2019/050815A1은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 24F로부터의 정제된 협막 다당류 및 이의 다당류-단백질 접합체를 개시한다.
WO 2019/050816A1은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 31로부터의 정제된 협막 다당류 및 이의 다당류-단백질 접합체를 개시한다.
이들 백신에도 불구하고, 단순하고 효율적인 방식으로 정제되고 크기 조정된 다당류를 갖는 추가적인 다가 폐렴구균 접합체 백신의 개발이 필요하다. 따라서, 본 발명의 발명자들은 간단하고 효율적인 방식으로 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2, 15A, 15C 및 35B의 협막 다당류를 정제하고 크기 조정하였다.
본 발명은 약 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2의 정제되고 크기 조정된 협막 다당류에 관한 것이다.
본 발명은 또한 약 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15A의 정제되고 크기 조정된 협막 다당류에 관한 것이다.
본 발명은 또한 약 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15C의 정제되고 크기 조정된 협막 다당류에 관한 것이다.
본 발명은 또한 약 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 35B의 정제되고 크기 조정된 협막 다당류에 관한 것이다.
도 1A: 50℃에서 D2O에서 혈청형 2의 협막 다당류의 400 MHz 1차원(1D) 1H NMR 스펙트럼.
도 1B: 혈청형 2의 확인에 사용된 1차원(1D) 1H NMR 정체(identity) 영역.
도 2A: 50℃에서 D2O에서 혈청형 15A의 협막 다당류의 400 MHz 1차원(1D) 1H NMR 스펙트럼.
도 2B: 혈청형 15A의 확인에 사용된 1차원(1D) 1H NMR 정체 영역.
도 3A: 50℃에서 D2O에서 혈청형 15C의 협막 다당류의 400 MHz 1차원(1D) 1H NMR 스펙트럼.
도 3B: 혈청형 15C의 확인에 사용된 1차원(1D) 1H NMR 정체 영역.
도 4A: 50℃에서 D2O에서 혈청형 35B의 협막 다당류의 400 MHz 1차원(1D) 1H NMR 스펙트럼.
도 4B: 35B의 혈청형 확인에 사용된 1차원(1D) 1H NMR 정체 영역.
도 5A: 혈청형 2-CRM197의 접합 반응 속도론을 보여주는 SEC-HPLC 크로마토그램.
도 5B: 혈청형 2-PsaA의 접합 반응 속도론을 보여주는 SEC-HPLC 크로마토그램.
도 6A: (A) 혈청형 15A-CRM197의 접합 반응 속도론을 보여주는 SEC-HPLC 크로마토그램.
도 6B: 혈청형 15A-PsaA의 접합 반응 속도론을 보여주는 SEC-HPLC 크로마토그램.
도 7A: (A) 혈청형 15C-CRM197의 접합 반응 속도론을 보여주는 SEC-HPLC 크로마토그램.
도 7B: 혈청형 15C-PsaA의 접합 반응 속도론을 보여주는 SEC-HPLC 크로마토그램.
도 8A: (A) 혈청형 35B-CRM197의 접합 반응 속도론을 보여주는 SEC-HPLC 크로마토그램.
도 8B: 혈청형 35B-PsaA의 접합 반응 속도론을 보여주는 SEC-HPLC 크로마토그램.
도 9: PCV 제제로 면역화된 토끼에서의 혈청 항체 역가.
정의
본 발명 전체에 걸쳐, 단수 용어는 문맥 상 달리 명확하게 나타내지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 마찬가지로, 단어 "또는"는 2개 이상의 항목과 관련하여 다른 항목과 배타적인 단일 항목만을 의미하도록 명시적으로 제한되지 않는 한, 이러한 목록에서 "또는"을 사용하는 것은 (a) 목록의 단일 항목, (b) 목록의 모든 항목, 또는 (c) 목록에 있는 항목의 임의의 조합을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 또한, 용어 "포함하는" 등은 본 발명 전체에 걸쳐서 더 많은 수의 동일한 특징(들) 및/또는 하나 이상의 추가의 유형의 특징이 배제되지 않도록 적어도 언급된 특징(들)을 포함하는 것을 의미하기 위해 사용된다. 또한, 다양한 특정 특징, 방법 또는 특성이 하나 이상의 실시양태에서 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다.
본 발명은 본원에 개시된 정확한 형태로 본 기술을 제한하거나 완전하게 하려는 것이 아니다. 본원에서는 예시의 목적으로 특정 실시양태가 개시되어 있지만, 관련 기술 분야의 통상의 기술을 가진 자라면 인식할 수 있는 바와 같이 본 기술을 벗어나지 않고 다양한 균등한 변형이 가능하다. 일부 경우에서, 본 기술의 실시양태의 설명을 불필요하게 모호하게 하는 것을 피하기 위해 널리 공지된 구조 및 기능은 상세하게 제시 및/또는 설명되지 않았다. 방법의 단계가 본원에서 특정 순서로 제시될 수 있지만, 대안적인 실시양태에서 단계는 다른 적절한 순서를 가질 수 있다. 마찬가지로, 특정 실시양태의 맥락에서 개시된 본 기술의 특정 실시양태는 다른 실시양태에서 조합되거나 제거될 수 있다. 또한, 특정 실시양태와 관련된 이점이 그들 실시양태의 맥락에서 개시되었을 수 있지만, 다른 실시양태도 이러한 이점을 나타낼 수 있으며, 모든 실시양태가 본 기술의 범위 내에 속하기 위해 본원에 개시된 이러한 이점 또는 다른 이점을 반드시 나타낼 필요는 없다. 따라서, 본 개시 및 관련 기술은 본원에 명시적으로 제시 및/또는 설명되지 않은 다른 실시양태를 포괄할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 방법이 속하는 기술 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이의 각각의 개입 값 및 그 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급되거나 개입된 값이 방법 및 조성물에 포괄되는 것으로 이해된다. 이들 더 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있으며, 또한 언급된 범위에서 임의의 특별히 제외된 제한에 따라 방법 및 조성물에 포괄된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우 포함된 한계 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위도 방법, 조성물 및 조합에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "협막 다당류"는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2, 15A, 15C 및 35B의 세포벽 외부에 있지만 인접한 다당류의 층을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "캐리어 단백질"은 전형적으로 면역계에 의한 항원의 검출을 향상시키거나 용이하게 하기 위한 목적으로, 다당류가 커플링되거나 부착되거나 접합되는 임의의 단백질을 지칭한다. 캐리어 단백질의 예는 CRM197, PsaA 및 파상풍 톡소이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "접합체" 또는 "접합된"은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 협막 다당류가 캐리어 단백질에 공유적으로 결합됨을 의미하기 위해 사용된다.
본 명세서에 사용된 용어 "다당류"는 글리코시드 결합에 의해 함께 결합된 당쇄로 구성된 복합 탄수화물을 지칭한다. 다당류는 적어도 10, 20, 30, 40 또는 50개 또는 그 초과의 당류를 함유할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "크기 조정된(sized)" 또는 "크기 조정(sizing)"은 다양한 방법에 의해 천연 다당류의 크기를 감소시키는 것을 지칭한다. 방법은 균질화와 같은 기계적 방법을 포함할 수 있다. 천연 다당류의 크기를 감소시키거나 "크기 조정"하는 것은 (1) 천연 다당류와 비교하여 더 균임함을 제공하고, (2) 접합체에서 다당류 대 단백질의 비율을 제어할 수 있고, (3) 크기 조정된 다당류는 조성물에 대해 더 큰 안정성을 제공할 수 있는 다양한 이점을 제공한다. 본 발명의 목적을 위해, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2, 15A, 15C 및 35B의 천연 협막 다당류는 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량(Mw)으로 크기 조정되었다.
본원에서 사용되는 바와 같이 다당류에 대한 용어 "분자량" 또는 "분자 크기" 또는 "평균 분자 크기" 또는 "평균 분자량"은 MALLS(다중-각 레이저 광 산란)로 측정된 다당류의 중량 평균 분자량(Mw)을 지칭한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2, 15A, 15C 및 35B의 정제되고 크기 조정된 협막 다당류 및 이들의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 다당류는 발효기 내에서 최적화된 영양소로 스트렙토코쿠스 뉴모니아에를 배양하고, 나트륨 데옥시콜레이트(DOC) 또는 임의의 통상적인 용해제를 첨가하여 발효 말기에 세포를 용해시켜 제조된다. 수거된 용해물 브로스(broth)는 단백질, 핵산, 세포벽 성분 등과 같은 불순물을 제거하기 위해 다운스트림 정제를 거친다.
발효 후, DOC 세포 용해물을 배치 또는 연속 원심분리기에서 원심분리하고 세포 파편을 제거한다. 무세포 브로스의 pH를 산성으로 조정하고 온도를 올린 후 원심분리한다. 원심분리 후, 상청액을 심층 필터를 통과시키고, 농축시키고, 한외 필터(UF) 막을 사용하여 정용여과한다. 추가의 불순물을 세제(들)를 첨가한 다음 원심분리하여 다당류 조제물(보유물)로부터 제거한다. 이어서, 세제 처리된 상청액을 숯 필터 또는 활성탄 컬럼을 통과시킨 후 여과된 다당류를 SiO2 입자에 노출시키고 원심분리한다. 상청액을 심층 필터를 통과시키고, 심층 여과액을 탄소 필터에 이어 0.22 내지 0.6 μm 필터를 통과시킨다. 여과액을 농축시키고 UF 막에서 정용여과하고 0.5 내지 2% NaCl 용액으로 또는 물 또는 버퍼에서 정용여과하여 실질적으로 순수한 형태로 수득된 다당류를 수득한다.
정제된 다당류는 높은 pH에서 화학적으로 또는 고압 균질화기를 사용하여 기계적으로 크기 조정된다. 크기 조정된 다당류 조제물은 UF 막에 5 내지 25 mg/mL로 농축된다. 보유물은 0.22 μm 필터를 통과하고 -20℃ 미만으로 동결된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 50 내지 1000 kDa. 바람직하게는, 100-1000 kDa, 200-800 kDa, 250-600 kDa, 또는 300-400 kDa, 70-150 kDa, 또는 75-125 kDa의 평균 분자량(Mw)을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2, 15A, 15C 및 35B의 정제되고 크기 조정된 협막 다당류를 제공한다.
일부 실시양태에서, 접합 전 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2, 15A, 15C 및 35B의 정제된 협막 다당류는 50 kDa 내지 1,000 kDa의 평균 분자량을 갖는다. 다른 이러한 실시양태에서, 다당류는 50 kDa 내지 750 kDa; 50 kDa 내지 500 kDa; 100 kDa 내지 1,000 kDa; 100 kDa 내지 750 kDa; 100 kDa 내지 500 kDa의 평균 분자량을 갖는다.
본 발명의 협막 다당류의 크기는 정제 절차 후에 다양한 크기 조정 기술을 이용하여 원하는 크기로 감소된다. 본 발명자들은 본 발명에 따라 제조된 캐리어 단백질과 접합된 혈청형 2, 15A, 15C 및 35B로부터의 정제된 협막 다당류가 높은 면역원성을 갖는 것을 발견하였다.
한 실시양태에서, 본 발명의 협막 다당류는 약 80 kDa, 100 kDa, 200 kDa, 300 kDa, 400 kDa, 500 kDa, 700 kDa 또는 1000 kDa의 평균 분자량을 갖는 혈청형 2로부터의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 다당류를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 협막 다당류는 약 80 kDa, 100 kDa, 200 kDa, 300 kDa, 400 kDa, 500 kDa, 700 kDa 또는 1000 kDa의 평균 분자량을 갖는 혈청형 15A로부터의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 다당류를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 협막 다당류는 약 80 kDa, 100 kDa, 200 kDa, 300 kDa, 400 kDa, 500 kDa, 700 kDa 또는 1000 kDa의 평균 분자량을 갖는 혈청형 15C로부터의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 다당류를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 협막 다당류는 약 80 kDa, 100 kDa, 200 kDa, 300 kDa, 400 kDa, 500 kDa, 700 kDa 또는 1000 kDa의 평균 분자량을 갖는 혈청형 35B로부터의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 다당류를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 개시내용은 5 내지 18%, 바람직하게는 5 내지 10% 범위의 글리세롤 함량을 포함하는 크기 조정된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15A 협막 다당류를 제공한다.
추가의 측면에서, 본 개시내용은 5 내지 18%, 바람직하게는 5 내지 10% 범위의 글리세롤 함량을 포함하는 크기 조정된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15C 협막 다당류를 제공한다.
추가의 측면에서, 본 개시내용은 2 내지 10%, 바람직하게는 2 내지 8% 범위의 아세테이트 함량을 포함하는 크기 조정된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 35B 협막 다당류를 제공한다.
추가의 측면에서, 본 개시내용은 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량을 갖고 5 내지 18% 범위의 글리세롤 함량을 갖는 크기 조정된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15A를 제공한다.
추가의 측면에서, 본 개시내용은 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량을 갖고 5 내지 18% 범위의 글리세롤 함량을 갖는 크기 조정된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15C를 제공한다.
추가의 측면에서, 본 개시내용은 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량을 갖고 2 내지 10% 범위의 아세테이트 함량을 갖는 단리된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 35B를 제공한다.
글리세롤 포스페이트 측쇄의 존재는 다당류를 불화수소산(HF)으로 처리하여 방출시킨 후 펄싱된 전류측정 검출을 갖는 고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC-PAD)를 이용하여 글리세롤을 측정함으로써 결정될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 폐렴구균 접합체 백신을 제공하며, 여기서 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2로부터의 정제된 다당류는 PsaA, CRM197, PspA 또는 파상풍 톡소이드(TT)로부터 선택되는 캐리어 단백질에 접합되고, 조성물은 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 폐렴구균 접합체 백신을 제공하며, 여기서 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15A로부터의 정제된 다당류는 PsaA, CRM197, PspA 또는 파상풍 톡소이드(TT)로부터 선택되는 캐리어 단백질에 접합되고, 조성물은 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 폐렴구균 접합체 백신을 제공하며, 여기서 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15C로부터의 정제된 다당류는 PsaA, CRM197, PspA 또는 파상풍 톡소이드(TT)로부터 선택되는 캐리어 단백질에 접합되고, 조성물은 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 폐렴구균 접합체 백신을 제공하며, 여기서 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 35B로부터의 정제된 다당류는 PsaA, CRM197, PspA 또는 파상풍 톡소이드(TT)로부터 선택되는 캐리어 단백질에 접합되고, 조성물은 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2로부터의 적어도 하나의 당접합체, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15A로부터의 적어도 하나의 당접합체, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15C로부터의 적어도 하나의 당접합체 및 35B로부터의 적어도 하나의 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 PsaA, CRM197, PspA, 파상풍 톡소이드(TT) 또는 CRM197과 PsaA의 조합 또는 CRM197과 파상풍 톡소이드의 조합 또는 PsaA와 파상풍 톡소이드의 조합 또는 CRM197과 PsaA와 파상풍 톡소이드의 조합으로부터 선택되는 캐리어 단백질에 접합된, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 14, 15B, 16F, 18C, 19A, 19F, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 31, 33F로부터의 당접합체를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 면역원성 조성물은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 25가 또는 그 초가의 폐렴구균 접합체 조성물이다.
또 다른 측면에서, 면역원성 조성물은 다가이고, 8종의 폐렴구균 다당류 접합체(8가), 9종의 폐렴구균 다당류 접합체(9가), 10종의 폐렴구균 다당류 접합체(10가), 11종의 폐렴구균 다당류 접합체(11가), 12종의 폐렴구균 다당류 접합체(12가), 13종의 폐렴구균 다당류 접합체(13가), 14종의 폐렴구균 다당류 접합체(14가), 15종의 폐렴구균 다당류 접합체(15가), 16종의 폐렴구균 다당류 접합체(16가), 17종의 폐렴구균 다당류 접합체(16가), 18종의 폐렴구균 다당류 접합체(18가), 19종의 폐렴구균 다당류 접합체(19가), 20종의 폐렴구균 다당류 접합체(20가), 21종의 폐렴구균 다당류 접합체(21가), 22종의 폐렴구균 다당류 접합체(22가), 23종의 폐렴구균 다당류 접합체(23가), 24종의 폐렴구균 다당류 접합체(24가), 25종의 폐렴구균 다당류 접합체(25가), 26종의 폐렴구균 다당류 접합체(26가)를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 캐리어 단백질에 접합된 약 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2, 15A, 15C 및 35B의 정제된 협막 다당류를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 한 측면에서, 면역원성 조성물은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 다당류를 포함하고, 다당류 혈청형은 최대 x2, x3, x4, x5, x6, x7, x8, x9 또는 x10의 비율로 크기 조정된다. 용어 "최대 x2의 비율로 크기 조정된"은 당류가 당류의 크기를 감소시키지만 천연 다당류 크기의 절반을 초과하는 크기를 유지하도록 의도된 과정을 거치는 것을 의미한다.
크기 조정 기술 과정을 거치지 않은 다당류는 천연 다당류로 지칭된다. 다당류는 정상적인 정제 절차 동안 또는 접합 동안 분해에 의해 크기가 약간 감소될 수 있으며, 이는 여전히 천연 다당류로 지칭될 수 있다.
협막 다당류는 미세유동화, Emulsiflex™, 고압 균질화, 초음파처리 또는 가울린(Gaulin) 균질화와 같은 고압 기술과 같은 당업계에 공지된 다양한 기계적 수단에 의해 크기가 감소될 수 있다.
고압 균질화는 충분히 작은 치수의 유동로를 통해 공정 스트림을 펌핑하여 높은 전단 속도를 달성한다. 더 큰 적용된 균질화 압력을 사용하면 전단 속도가 증가하고 균질화기를 통해 공급 스트림을 재순환하여 노출시간을 증가시킬 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 캐리어 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2로부터의 협막 다당류를 포함하는 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 조성물을 제공하며, 다당류-단백질 접합체는 500 kDa 내지 약 10000 kDa 범위의 평균 분자량을 갖고 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 캐리어 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15A로부터의 협막 다당류를 포함하는 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 조성물을 제공하며, 다당류-단백질 접합체는 500 kDa 내지 약 10000 kDa 범위의 평균 분자량을 갖고 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 캐리어 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15C로부터의 협막 다당류를 포함하는 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 조성물을 제공하며, 다당류-단백질 접합체는 500 kDa 내지 약 10000 kDa 범위의 평균 분자량을 갖고 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 캐리어 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 35B로부터의 협막 다당류를 포함하는 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 조성물을 제공하며, 다당류-단백질 접합체는 500 kDa 내지 약 10000 kDa 범위의 평균 분자량을 갖고 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 갖는다.
본 발명의 다당류 단백질 접합체는 500 kDa 내지 약 5000 kDa; 1,000 kDa 내지 약 10,000 kDa; 약 1,500 kDa 내지 약 15,000 kDa; 약 2,000 kDa 내지 약 20,000 kDa; 약 2,500 kDa 내지 약 25,000 kDa; 또는 약 3,000 kDa 내지 약 30,000 kDa 범위의 평균 분자량을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 정제된 폐렴구균 다당류 및 캐리어 단백질을 포함하고, 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 퍼센트 비율을 갖는, 폐렴구균 접합체 백신 조성물을 제공한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 PsaA, CRM197, PspA, 파상풍 톡소이드(TT), 또는 CRM197와 PsaA의 조합 또는 CRM197과 파상풍 톡소이드의 조합 또는 PsaA와 파상풍 톡소이드의 조합 또는 CRM197과 PsaA와 파상풍 톡소이드의 조합으로부터 선택되는 캐리어 단백질에 접합된, 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2, 15A, 15C 및 35B로부터의 정제된 다당류를 포함하는 폐렴구균 접합체 백신 조성물을 제공하며, 조성물은 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 퍼센트 비율을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 각각 캐리어 단백질에 개별적으로 접합된 하나 이상의 정제된 협막 폐렴구균 다당류 혈청형을 포함하는 폐렴구균 접합체 백신 조성물을 제공하며, 각각의 다당류-단백질 접합체는 약 1,500 kDa 내지 약 15,000 kDa의 평균 분자량을 갖는다.
다른 실시양태에서, 정제된 폐렴구균 다당류는 하나 이상의 캐리어 단백질에 접합하기 전에 (예컨대, 화학적으로) 활성화될 수 있다. 각각의 활성화된 폐렴구균 다당류는 각각 개별적으로 캐리어 단백질에 접합되어 다당류-단백질 접합체(예컨대, 당접합체)를 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 정제된 폐렴구균 다당류는 화학적으로 활성화되고 이어서 미국 특허 번호 4,365,170, 4,673,574 및 4,902,506에 기재된 것과 같은 공지된 기술에 따라 캐리어 단백질에 접합될 수 있다. 예컨대, 폐렴구균 다당류는 탄수화물의 하나 이상의 인접 히드록실기의 무작위적 산화 절단 및 하나 이상의 반응성 알데히드기의 형성에 의해 퍼요오데이트(예컨대, 과요오드산나트륨, 과요오드산칼륨 또는 과요오드산)과 같은 산화제를 사용하여 말단 히드록실기를 알데하이드로 산화시킴으로써 활성화될 수 있다.
본 발명의 정제된 폐렴구균 다당류는 또한 CDAP(1-시아노-4-디메틸아미노-피리디늄 테트라플루오로보레이트)에 의해 활성화되고 이어서 PsaA, CRM197, PspA 또는 이들의 조합과 같은 하나 이상의 캐리어 단백질에 접합될 수 있다. 다른 실시양태에서, 시아네이트 에스테르를 형성하기 위해 CDAP로 활성화된 폐렴구균 다당류는 하나 이상의 캐리어 단백질에 직접적으로 접합되거나 스페이서(예컨대, 링커)를 사용하여 접합될 수 있다. 스페이서는 캐리어 단백질 상의 아미노기에 커플링할 수 있다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 시스타민 또는 시스테아민일 수 있으며, 이는 캐리어 단백질을 티오에테르 연결을 통해 말레이미드 활성화된 캐리어 단백질(예컨대, GMBS 사용) 또는 할로아세틸화된 캐리어 단백질(예컨대, 요오도아세트이미드, 에틸 요오도아세트이미드 HCl, SIAB, SIA, SBAP, 및/또는 N-숙신이미딜 브로모아세테이트 사용)에 커플링할 수 있는 티올화된 다당류를 생성한다. 다른 실시양태에서, 시아네이트 에스테르는 헥산 디아민 또는 이디프산 디히드라지드(ADH)를 사용하여 커플링되고, 아미노 유도체화된 당류는 카보디이미드(예컨대, EDAC 또는 EDC) 화학을 이용하여 단백질 캐리어 상의 카르복실기를 통해 캐리어 단백질에 접합된다. 이러한 접합체는 문헌(PCT 공개 번호 WO 93/15760, PCT 공개 번호 WO 95/08348, PCT 공개 번호 WO 96/29094, 및 Chu et al., 1983, Infect. Immunity 40:245-256)에 기재된다.
본 발명의 다당류-단백질 접합체 및 백신 조성물과 함께 이용하기 위한 다른 적합한 활성화 및/또는 커플링 기술은 카보디이미드, 히드라지드, 활성 에스테르, 노르보란, p-니트로벤조산, N-히드록시숙신이미드, S-NHS, EDC, TSTU, 및 PCT 공개 번호 WO 98/42721에 기재된 다른 방법의 이용을 포함한다. 예컨대, 접합은 당류의 유리 히드록실기의 CDI와의 반응(Bethell et al., 1979, J. Biol. Chem. 254:2572-4; Hearn et al., 1981, J. Chromatogr. 218:509-18)에 이어 단백질과의 커플링에 의해 카르바메이트 연결을 형성함으로써 형성될 수 있는 카르보닐 링커를 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아노머 말단은 1차 히드록실기로 환원되고, 1차 히드록실기를 임의적으로 보호/탈보호하고, 1차 히드록실기의 CDI와의 반응으로 CDI 카르바메이트 중간체를 형성하고, CDI 카르바메이트 중간체를 단백질 상의 아미노기와 커플링할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 다당류-단백질 접합체 및 백신 조성물과 함께 이용하기 위한 또 다른 적합한 활성화 및/또는 커플링 기술은 하기 방법을 포함한다: 크기 조정된 폐렴구균 다당류(예컨대, 약 10 mg/mL농도의 크기 조정된 다당류 약 6 mL) 및 CDAP(예컨대, 아세토니트릴 중 약 100 mg/mL (w/v))는 유리 바이알에서 약 1 대 약 1의 비율로 (예컨대, 약 1분 동안 교반함으로써) 혼합될 수 있다. 다당류 용액의 pH는 필요에 따라 조정될 수 있다(예컨대, 약 0.2 M 트리에틸아민으로 약 9.25로 조정되고 실온에서 3분 동안 교반됨). 또한, PsaA(예컨대, 약 15 mg/mL의 농도를 갖는 용액 약 4 mL)를 (예컨대, 약 1 대 약 1(Ps:캐리어 단백질)의 비율로) 활성화된 폐렴구균 다당류에 서서히 첨가할 수 있다. 반응물의 pH를 (예컨대, 0.2 M 트리메틸아민을 사용하여 약 9.05로) 조정하고 반응을 (예컨대, 실온에서 5시간 동안 교반함으로써) 계속할 수 있다. 반응 혼합물은 (예컨대, 과잉 농도의 글리신을 첨가함으로써) 퀀칭될 수 있다.
일부 실시양태에서, 반응 혼합물은 막(예컨대, 100 K MWCO 막)을 사용하여 정용여과될 수 있고 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 정용여과 및 정제된 분획은 SEC-MALLS 및 안트론(anthrone) 방법을 이용하여 분석될 수 있다. 접합체를 함유하는 분석된 분획은 풀링되고 (예컨대, 0.2 μm 필터를 사용하여) 멸균 여과될 수 있다.
폐렴구균 다당류를 하나 이상의 캐리어 단백질에 접합시킨 후, 다당류-단백질 접합체는 다양한 기술에 의해 정제(예컨대, 다당류-단백질 접합체의 양에 대해 농축)될 수 있다. 이들 기술은 농축/정용여과 작업, 침전/용출, 컬럼 크로마토그래피, 및 심층 여과를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 접합체를 정제한 후, 접합체를 화합하여 본 발명의 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 조성물을 제제화할 수 있으며, 이는 백신으로 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 캐리어 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에의 혈청형으로부터의 다당류를 포함하는 17가 폐렴구균 접합체 백신 조성물을 제공하며, 혈청형은 2, 15A, 15C 및 35B 및 추가 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F를 포함한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 캐리어 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에의 혈청형으로부터의 다당류를 포함하는 17가 폐렴구균 접합체 백신 조성물을 제공하며, 혈청형은 2, 15A, 15C 및 35B 및 추가 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F를 포함하고, 캐리어 단백질은 PsaA, CRM197, PspA, 파상풍 톡소이드(TT)로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 2, 15A, 15C 및 35B로부터 선택되는 적어도 3종의 폐렴구균 혈청형 및 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 14, 18C, 19A, 19F, 20A, 20B, 22F, 23F, 24F, 33F를 포함하는 추가 혈청형을 포함하는 24가 폐렴구균 접합체 백신 조성물을 제공하며, 24종의 혈청형은 캐리어 단백질에 접합되고, 캐리어 단백질은 PsaA, CRM197, PspA, 파상풍 톡소이드(TT) 또는 CRM197와 PsaA의 조합 또는 CRM197과 파상풍 톡소이드의 조합 또는 PsaA와 파상풍 톡소이드의 조합 또는 CRM197과 PsaA와 파상풍 톡소이드의 조합으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 2, 15A, 15C 및 35B로부터 선택되는 적어도 2종의 폐렴구균 혈청형 및 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 33F를 포함하는 추가 혈청형으로부터의 다당류를 포함하는 24가 폐렴구균 접합체 백신 조성물을 제공하며, 24종의 혈청형은 PsaA, CRM197, PspA, 파상풍 톡소이드(TT) 또는 CRM197와 PsaA의 조합 또는 CRM197과 파상풍 톡소이드의 조합 또는 PsaA와 파상풍 톡소이드의 조합 또는 CRM197과 PsaA와 파상풍 톡소이드의 조합으로부터 선택되는 캐리어 단백질에 접합된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 2, 15A, 15C 및 35B로부터 선택되는 적어도 2종의 폐렴구균 혈청형 및 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 18C, 19A, 19F, 20A, 20B, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 33F로부터 선택되는 하나 이상의 추가 혈청형으로부터의 다당류를 포함하는 다가 폐렴구균 접합체 백신 조성물을 제공하며, 혈청형은 PsaA, CRM197, PspA, 파상풍 톡소이드(TT) 또는 CRM197와 PsaA의 조합 또는 CRM197과 파상풍 톡소이드의 조합 또는 PsaA와 파상풍 톡소이드의 조합 또는 CRM197과 PsaA와 파상풍 톡소이드의 조합으로부터 선택되는 캐리어 단백질에 접합된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 폐렴구균 백신 조성물의 다당류-단백질 접합체를 제조하는 방법을 제공하며, 방법은 다당류-단백질 접합체를 애주번트, 부형제 및 버퍼를 포함하는 폐렴구균 백신 조성물로 제제화하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 폐렴구균 백신 조성물의 다당류-단백질 접합체를 제조하는 방법을 제공하며, 애주번트는 인산알루미늄이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 균주에 의해 유발되는 감염(증)의 예방을 위해 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 폐렴구균 백신 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 침습적 폐렴구균 질환(IPD)과 같은 스트렙토코쿠스 뉴모니아에에 의해 매개되는 질환을 갖는다. 한 실시양태에서, 대상체는 인간, 예컨대 영아(약 1세 미만), 유아(약 12개월 내지 약 24개월), 어린 아이(약 2세 내지 약 5세), 나이든 아이(약 5세 내지 약 13세), 청소년(약 13세 내지 약 18세), 성인(약 18세 내지 약 65세), 또는 노인(약 65세 초과)이다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 폐렴구균 접합체 백신 조성물의 면역학적 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 협막 다당류 접합체에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 폐렴구균 접합체 백신 조성물을 대상체에게 전신, 피하, 및/또는 점막 투여하는 단계를 포함하여, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 협막 다당류 접합체에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 백신 조성물의 용량에서 각각의 접합체의 양은 유의한 부작용 없이 면역보호 반응과 같은 면역보호 반응을 유도하기에 충분한 양이다. 각각의 접합체의 양은 폐렴구균 혈청형에 따라 달라질 수 있지만, 백신 조성물의 각각의 용량은 약 1.5 μg 내지 약 5 μg의 캐리어 단백질을 포함하는 각각의 캐리어 단백질에 접합된 약 0.1 μg 내지 약 50 μg의 각각의 폐렴구균 다당류, 약 0.1 μg 내지 약 10 μg, 또는 약 1 μg 내지 약 5 μg의 각각의 폐렴구균 다당류를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 1.5 μg 내지 약 5 μg의 캐리어 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2로부터의 협막 다당류 0.1 μg 내지 약 10 μg을 포함하는 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 조성물을 제공하며, 다당류-단백질 접합체는 500 kDa 내지 약 15000 kDa의 평균 분자량을 갖고 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 1.5 μg 내지 약 5 μg의 캐리어 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15A로부터의 협막 다당류 0.1 μg 내지 약 10 μg을 포함하는 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 조성물을 제공하며, 다당류-단백질 접합체는 500 kDa 내지 약 15000 kDa의 평균 분자량을 갖고 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 1.5 μg 내지 약 5 μg의 캐리어 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15C로부터의 협막 다당류 0.1 μg 내지 약 10 μg을 포함하는 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 조성물을 제공하며, 다당류-단백질 접합체는 500 kDa 내지 약 15000 kDa의 평균 분자량을 갖고 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 1.5 μg 내지 약 5 μg의 캐리어 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 32B로부터의 협막 다당류 0.1 μg 내지 약 10 μg을 포함하는 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 조성물을 제공하며, 다당류-단백질 접합체는 500 kDa 내지 약 15000 kDa의 평균 분자량을 갖고 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 1.5 μg 내지 약 5 μg의 CRM197 캐리어 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2로부터의 협막 다당류 0.5 μg 내지 약 5 μg을 포함하는 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 조성물을 제공하며, 다당류-단백질 접합체는 500 kDa 내지 약 15000 kDa의 평균 분자량을 갖고 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 1.5 μg 내지 약 5 μg의 CRM197 캐리어 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15A로부터의 협막 다당류 0.5 μg 내지 약 5 μg을 포함하는 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 조성물을 제공하며, 다당류-단백질 접합체는 500 kDa 내지 약 15000 kDa의 평균 분자량을 갖고 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 1.5 μg 내지 약 5 μg의 CRM197 캐리어 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15C로부터의 협막 다당류 0.5 μg 내지 약 5 μg을 포함하는 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 조성물을 제공하며, 다당류-단백질 접합체는 500 kDa 내지 약 15000 kDa의 평균 분자량을 갖고 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 1.5 μg 내지 약 5 μg의 PsaA 캐리어 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2로부터의 협막 다당류 0.5 μg 내지 약 5 μg을 포함하는 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 조성물을 제공하며, 다당류-단백질 접합체는 500 kDa 내지 약 15000 kDa의 평균 분자량을 갖고 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 1.5 μg 내지 약 5 μg의 PsaA 캐리어 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15A로부터의 협막 다당류 0.5 μg 내지 약 5 μg을 포함하는 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 조성물을 제공하며, 다당류-단백질 접합체는 500 kDa 내지 약 15000 kDa의 평균 분자량을 갖고 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 1.5 μg 내지 약 5 μg의 PsaA 캐리어 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15C로부터의 협막 다당류 0.5 μg 내지 약 5 μg을 포함하는 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 조성물을 제공하며, 다당류-단백질 접합체는 500 kDa 내지 약 15000 kDa의 평균 분자량을 갖고 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 갖는다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 1.5 μg 내지 약 5 μg의 PsaA 캐리어 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 35B로부터의 협막 다당류 0.5 μg 내지 약 5 μg을 포함하는 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 조성물을 제공하며, 다당류-단백질 접합체는 500 kDa 내지 약 15000 kDa의 평균 분자량을 갖고 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 갖는다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 PsaA, CRM197, PspA, 파상풍 톡소이드(TT)로부터 선택되는 캐리어 단백질에 접합된 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2, 15A, 15C 및 35B로부터의 적어도 2종의 다당류를 포함하는 다가 접합체 백신 조성물을 제공하며, 조성물은 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 퍼센트 비율을 포함하고, PsaA, CRM197, PspA, 파상풍 톡소이드(TT) 또는 캐리어 단백질의 조합으로부터 선택되는 캐리어 단백질에 접합된, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에　혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 14, 16F, 18C, 19A, 19F, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 31, 33F로부터의 추가의 다당류 단백질 접합체를 포함한다.
본 발명의 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 조성물은 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예컨대, 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 비히클, 예컨대 물 또는 식염수와 함께 제제화될 수 있다. 또한, 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 조성물은 버퍼, 보존제 또는 안정화제, 폴리소르베이트, 알루미늄 화합물과 같은 애주번트, 예컨대 수산화알루미늄, 인산알루미늄 또는 히드록시인산알루미늄, 및 또는 동결건조 부형제 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 조성물에 상기 화합물 중 어느 하나를 포함하는 것은 이를 필요로 하는 대상체에 대한 투여 방식 및 경로의 함수로서 선택될 수 있고 추가로 표준 약학 관행에 기초할 수 있다.
본 발명의 폐렴구균 다당류-단백질 접합체 백신 조성물은 대상체에게 투여 될 때, 표준 ELISA 검정에 의해 측정되는 바와 같이 스트렙토코쿠스 뉴모니아에의 혈청형 2, 15A, 15C 및 35B에 결합할 수 있는 항체의 형성을 유도한다. ELISA는 WHO 제안 프로토콜에 따라 수행되었다. 간단히, MaxisorpTM ELISA 플레이트를 주어진 혈청형의 PnCPS로 코팅하였다(1 μg/50 μL/웰, PBS 사용; 멸균 내독소 없음, 0.02% 아지드화나트륨 포함). 플레이트를 가습을 위해 젖은 종이 타월이 담긴 상자에 넣고, 37℃±2℃에서 5시간 동안 인큐베이션한 다음, 플레이트를 사용할 때까지 5℃±3℃에서 저장하였다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공되며 단지 예시를 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1:
a. 폐렴구균 협막 다당류 혈청형 2, 15A, 15C 및 35B의 제조
(혈청형 2, 15A, 15C 및 35B에 대한) 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 균주의 세포 은행은 미국 질병 통제 및 예방 센터(Center for Disease Control and Prevention)에서 입수하였다.
프리-시드 제조:
0.4 μL의 배양(스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2) 단리물을 60 mL의 완전한 뮬러 힌톤(Mueller Hinton: MH) 배지에 접종하였다. 접종된 플라스크를 35±1℃, 5±0.5% CO2에서 2 내지 8시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 수집하고 600 nm에서 광학 밀도를 점검하였다. 원하는 OD가 0.8±0.2에 도달하면 샘플을 수집하고 pH 및 그람 염색을 점검하였다.
시드 제조:
프리-시드 배양물의 현미경검사(그람 염색)로 순도를 확인한 후, 40 mL의 프리-시드 배양물을 760 mL의 MH 배지를 함유하는 1 리터 플라스크에 접종하였다. 접종된 시드를 35±1℃, 5±0.5% CO2에서 3 내지 11시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 수집하고 600 nm에서 광학 밀도(OD)를 점검하였다. 원하는 OD가 4±2에 도달하면 그람 염색, pH를 위해 샘플을 수집하였다. 혈액 한천 플레이트에 플레이팅하여 순도를 확인하였다.
발효/배양:
750 mL의 시드를 15 리터의 MH 배지에 접종하고 30 내지 50%의 글루코스를 분당 3 내지 5 mL의 속도로 600nm에서의 OD가 6±2에 도달할 때까지 35±1℃에서 분당 100 내지 140 회전( rpm) 하에 pH 7.1±0.3에서 보충하였다.
불활성화:
소듐 데옥시콜레이트(DOC)의 13% 스톡 용액을 배양 브로스의 불활성화를 위해 발효기 브로스에 첨가하고 10±2시간 동안 인큐베이션하였다.
원심분리:
DOC 처리된 배양물을 수거하고 20℃에서 14000 상대적 원심력(RCF)으로 원심분리하였다. 원심분리 후, 상청액을 수집하고 정제 단계를 위해 처리하였다.
b. 폐렴구균 협막 다당류 혈청형 2의 정제
스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2 DOC 세포 용해물을 배치 원심분리기에서 원심분리하고 세포 파편을 제거하였다. 이어서, 무세포 브로스의 pH를 5.0으로 조정하고, 4시간 동안 인큐베이션한 후, 14000 g에서 45분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상청액을 심층 필터를 통과시켰다. 이어서, 여과액을 4.2x로 농축시키고 30-300 kDa UF 막을 사용하여 정용여과하였다(4-15 Dia 부피). 세제(CTAB 1%)를 첨가하여 다당류 조제물(보유물)로부터 추가의 불순물을 제거하고, 30 내지 90분 동안 6℃에서 인큐베이션한 다음, 9000 내지 14500 g에서 15-60분 동안 원심분리하였다. 이어서, CTAB 처리된 상청액을 활성탄 컬럼을 통과시켰다(30-300 g/L 폴리 조제물). 탄소 여과된 다당류 조제물을 SiO2(이산화규소) 입자(3-10%, 염 포함)에 노출시키고, 2 내지 40℃에서 15-120분 동안 인큐베이션한 다음, 9000 내지 14500 g에서 15-60분 동안 원심분리하였다. 상청액을 2 내지 50 μm 심층 필터를 통과시키고 심층 여과액을 탄소 필터에 이어 0.22 내지 0.6 μm 필터를 통과시켰다. 이어서, 여과액(0.22 내지 0.6 μm)을 농축시키고, 30-300 kDa UF 막에 정용여과하고, 0.5 내지 2% NaCl 용액으로 또는 물 또는 버퍼에서 염 없이 정용여과하여 실질적으로 순수한 형태의 협막 다당류 혈청형 2를 수득하였다.
혈청형 15A 및 15C로부터의 폐렴구균 협막 다당류의 정제는 혈청형 2에 대해 상술된 유사한 절차로 제조되었다.
c. 폐렴구균 협막 다당류 혈청형 35B의 정제
스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 35B, DOC 세포 용해물을 배치 원심분리기에서 원심분리하고 세포 파편을 제거하였다. 이어서, 무세포 브로스의 pH를 5.0으로 조정하고, 4시간 동안 인큐베이션한 후, 14000 g에서 45분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상청액을 심층 필터를 통과시켰다. 이어서, 여과액을 7.5x로 농축시키고 30-300 kDa UF 막을 사용하여 정용여과하였다(4-15 Dia 부피). 세제(CTAB 1%)를 첨가하여 다당류 조제물(보유물)로부터 추가의 불순물을 제거하고, 30 내지 90분 동안 6℃에서 인큐베이션한 다음, 9000 내지 14500 g에서 15-60분 동안 원심분리하였다. 이어서, CTAB 처리된 상청액을 활성탄 컬럼을 통과시켰다(30-300 g/L 폴리 조제물). 탄소 여과된 다당류 조제물을 SiO2(이산화규소) 입자(3-10%, 염 포함)에 노출시키고 2 내지 40℃에서 15-120분 동안 인큐베이션한 다음, 9000 내지 14500 g에서 15-60분 동안 원심분리하였다. 상청액을 2 내지 50 μm 심층 필터를 통과시키고 심층 여과액을 탄소 필터에 이어 0.22 내지 0.6 μm 필터를 통과시켰다. 이어서, 여과액(0.22 내지 0.6 μm)을 농축시키고, 30-300 kDa UF 막에 정용여과하고, 0.5 내지 2% NaCl 용액으로 또는 물 또는 버퍼에서 염 없이 정용여과하여 실질적으로 순수한 형태의 협막 다당류 혈청형 35B를 수득하였다.
d. 정제된 폐렴구균 협막 다당류 혈청형 2의 크기 조정
상기에서 수득된 정제된 폐렴구균 협막 다당류 혈청형 2를 1000 bar에서 고압 균질화기를 사용하여 1 내지 20회 사이클 동안 기계적으로 크기 조정하였다. 크기 조정된 다당류 조제물을 30 kDa 한외 필터(UF) 막에서 15 mg/mL로 다시 농축시켰다. 보유물을 0.22 μm 필터를 통과시키고 -20℃ 미만으로 동결시켰다.
혈청형 35B로부터의 폐렴구균 협막 다당류의 크기 조정은 혈청형 2에 대해 상술된 유사한 절차를 이용하여 수행되었다.
e. 정제된 폐렴구균 협막 다당류 혈청형 15A의 크기 조정
정제된 폐렴구균 협막 다당류 혈청형 15A를 1500 bar에서 고압 균질화기를 사용하여 1 내지 20회 사이클 동안 기계적으로 크기 조정하였다. 크기 조정된 다당류 폐렴구균 혈청형 15A 조제물을 30 kDa 한외 필터(UF) 막에서 15 mg/mL로 다시 농축시켰다. 보유물을 0.22 μm 필터를 통과시키고 -20℃ 미만으로 동결시켰다.
f. 정제된 폐렴구균 협막 다당류 혈청형 15C의 크기 조정
정제된 폐렴구균 협막 다당류 혈청형 15C를 1200 bar에서 고압 균질화기를 사용하여 1 내지 20회 사이클 동안 기계적으로 크기 조정하였다. 크기 조정된 다당류 폐렴구균 혈청형 15C 조제물을 30 kDa 한외 필터(UF) 막에서 15 mg/mL로 다시 농축시켰다. 보유물을 0.22 μm 필터를 통과시키고 -20℃ 미만으로 동결시켰다.
폐렴구균 협막 다당류 혈청형 2, 15A 및 15C의 NMR 구조 분석.
혈청형 2, 15A 및 15C에 대한 다당류 정체의 확인은 NMR 분석에 의해 수행되었다. 분석은 문헌(Abeygunawardana et.al., Development and Validation of an NMR based Identity Assay for polysaccharides, Analytical Biochemistry, 279, 226-240 (2000))에 따른 공개된 방법론을 기반으로 하여 수행되었다. 도 1-3의 NMR 데이터를 기반으로 하여, NMR 스펙트럼의 아노머 영역은 다당류 정체성을 확인하고 피크는 각각의 다당류 혈청형 2, 15A 및 15C에 함유된 슈가에 대해 확인된다.
폐렴구균 협막 다당류 혈청형 35B의 NMR 구조 분석.
혈청형 35B에 대한 다당류 정체의 확인은 NMR 분석에 의해 수행되었다. 분석은 문헌(Abeygunawardana et.al., Development and Validation of an NMR based Identity Assay for polysaccharides, Analytical Biochemistry, 279, 226-240 (2000))에 따른 공개된 방법론을 기반으로 하여 수행되었다. 도 4의 NMR 데이터를 기반. 혈청형 35B의 1H NMR 스펙트럼 피크 할당은 문헌(L. M. Beynon., J. C. Richards., M. B. Perry., P. J. Kniskern, Characterization of the capsular antigen of Streptococcus pneumoniae serotype 35B, Canadian Journal of Chemistry, 73(1): 41-48 (1995))에 따른 공개된 데이터에 따라 수행되었다.
전술된 바와 같이 제조된 폐렴구균 혈청형 2, 15A, 15C 및 35B로부터의 정제되고 크기 조정된 다당류의 핵심적인 특징은 아래 표 1에 언급된다.
Figure pct00001
실시예 2: 캐리어 단백질의 제조
a. CRM 197 의 제조
CRM197은 미국 특허 번호 5,614,382에 기재된 방법에 따른 재조합 방법으로 제조될 수 있다. 대안적으로, CRM197은 문헌에 공지된 방법에 따라 또는 PCT 공개 WO 2016/079755, WO 2017/081700 및 WO 2018/193475에 개시된 방법에 따라 재조합적으로 제조된다. CRM197은 당업계에 널리 공지된 방법인 한외여과, 황산암모늄 침전, 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
b. PsaA의 제조
PsaA 유전자는 그의 소수성 리더 펩티드 서열 없이 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 4로부터 PCR 증폭되었다. 유전자 서열을 검증하고 더 높은 발현을 위해 사내에서 구축된 벡터(PBE66)를 사용하여 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli)에 클로닝하였다.
PsaA 유전자를 코딩하는 글리세롤 스톡 배양물을 150 mL 원뿔형 플라스크에서 1 mL의 글리세롤 스톡을 함유하는 20 mL LB 배지에서 회복시켰다. 배양물을 3.5 OD의 최종 OD 600nm까지 200 rpm 하에 37℃에서 약 6시간 동안 인큐베이션하였다. 회복된 배양물을 5 L 원뿔형 플라스크의 1 L 시드 배양물로 전달하였다. 배양물을 37℃에서 약 10시간 동안 200 rpm 하에서 3의 최종 OD 600nm까지 성장시켰다. 시드 배양물을 하기 배지 성분을 함유하는 20 L 발효기에 무균적으로 전달하였다: 하이펩톤(HyPeptone) 6 g/L, 효모 추출물 12/L, 오르토인산수소이칼륨 13.5 g/L , 이염기성 인산암모늄 4 g/L, 시트르산 1.7 g/L, MgSO4.7H2O 1.2 g/L, 글루코스 4 g/L, 타민 HCL 10 m g/L 및 1 mL/L 미량 원소(예컨대, 100 mL 조성을 위한 미량 원소 FeCl3 2.7 g, ZnCl2 0.2g, CoCl2.6H2O 0.2g, Na2 MoO4.2H2O 0.2 g, CuSO4 5H2O 0.1 g, 붕산 0.05 g, CaCl2 2H2O 0.1g, 농축, HCL 10 mL). 초기 발효는 OD600nm 0.2 OD로 시작되었다. pH를 20% 오르토-인산 및 12.5% 수산화암모늄으로 발효 내내 7±0.2로 유지하였다. 글루코스 수준이 0.5 g/L 미만으로 떨어질 때 공급 배치(feed batch)를 3-4 g/L/hr의 일정한 속도로 시작하였으며, DO%를 산소 농축과 함께 발효 내내 >20%로 유지하였다. 세포를 발효기에서 성장시키고 세포 펠렛을 원심분리로 수거하였다. 세포 파괴 장치(Panda)를 사용하여 세포를 용해시켰다. 용해물을 10000 g에서 원심분리하고, 정화된 상청액을 정제하였다.
PsaA 정제는 문헌(Larentis et.al, 2011 (Protein expression and Purification 78 (2011) 38))에 기재된 절차와 유사하게 수행되었다. 정제는 더 높은 순도의 PsaA를 달성하기 위해 DEAE 후 혼합 모드 크로마토그래피(세라믹 히드록시아파타이트 타입-II)를 사용하여 더욱 최적화되었다.
음이온 교환 크로마토그래피: 30 mL의 DEAE 세파로스(GE) 수지를 XK16/20 컬럼에 충전하였다. 수지를 5 컬럼 부피의 멸균 증류수로 세척한 다음 10 컬럼 부피의 20 mM 트리스, 1 mM EDTA, pH 8.0(평형 버퍼)으로 세척하였다. 30 mL의 상청액을 평형 버퍼를 사용하여 100 mL로 희석하고 컬럼에 로딩하고 통과액을 수집하였다. 컬럼을 5 부피의 평형 버퍼로 세척하였다. PsaA를 12 부피의 (0-100% B)의 선형 구배로 용출시켰다(버퍼 A는 20 mM 트리스, 1 mM EDTA pH 8.0을 함유; 버퍼 B-20 mM 트리스, 1 mM EDTA, 250 mM NaCl pH 8.0). 이어서, 컬럼을 20 mM 트리스, 1 mM EDTA, 1 M NaCl pH8.0으로 세척하였다.
혼합 모드 크로마토그래피 : 25 mL의 세라믹 히드록시아파타이트 타입-II(CHT-II)를 컬럼에 충전하였다. 수지를 멸균 증류수로 세척한 다음 10 부피의 20 mM 트리스 pH 6.8로 세척하였다. SDS PAGE에서 PsaA의 약 37 KD의 양호한 농도의 선명한 주요 가시 밴드를 나타내는 DEAE 수지로부터의 용출 분획을 풀링하고 CHT-II 수지에 로딩하였다. 통과액을 수집하고 컬럼을 5 컬럼 부피의 평형 버퍼로 세척하였다. 단백질을 (15% B, 20% B, 50% B 및 100% B)의 5 컬럼 부피 단계 구배로 용출시켰다. 버퍼 A는 20 mM 트리스 pH 6.8을 함유하고, 버퍼 B는 250 mM 포스페이트 버퍼 pH 6.8을 함유한다.
PsaA의 예상 크기에서 선명한 밴드를 나타내는 모든 용출 분획을 풀링하고 10 kDa MWCO 카세트로 농축시키고 20 mM 포스페이트 버퍼 pH 7.5에 대해 정용여과하였다. 순도를 평가하기 위해 정제된 단백질을 SDS-PAGE 겔에 로딩하였다.
실시예 3: 폐렴구균 협막 다당류 혈청형 2, 15A, 15C 및 35B의 접합
a. 폐렴구균 협막 다당류 혈청형 2의 CRM 197 과의 접합
1000 mg(200.0 mL의 5.0 mg/mL 농도)의 기계적으로 크기가 감소된 다당류 혈청형 2 및 5.0 mL의 CDAP(아세토니트릴 중 100 mg/mL (w/v))를 유리병에서 1.0:0.5(PS:CDAP)의 비율로 혼합하고 1분 동안 교반하였다. 12.0 mL의 0.2 M 트리에틸아민을 사용하여 다당류 용액의 pH를 9.0으로 조정하고 실온(RT)에서 1분 동안 교반하였다. 1000 mg의 CRM(66.7 mL의 15.0 mg/mL 농도)을 1.0:1.0(PnPs:CRM)의 비율로 활성화된 다당류에 서서히 첨가하였다.
반응물의 pH를 2.8 mL의 0.2 M 트리에틸아민으로 9.0으로 조정하고, 실온에서 3-5시간 동안 교반하면서 반응을 계속한 다음, 과잉 농도의 글리신(100 mM)을 첨가하여 반응을 퀀칭시켰다. 반응물의 접합 속도론(도 5A)은 반응의 매시간마다 SEC-HPLC를 사용하여 모니터링되었다.
반응 혼합물을 정용여과하고 100 kDa MWCO TFF 막을 사용하여 농축시켰다. 농축물을 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 분획을 SEC-MALLS, 안트론 방법으로 분석하고, 접합체를 함유하는 분획을 풀링하고, 0.2pm 필터로 멸균 여과하였다. 수득된 접합체의 평균 분자량은 8168 kDa였다.
b. 폐렴구균 협막 다당류 혈청형 2의 PsaA와의 접합
1000 mg(200.0 mL의 5.0 mg/mL 농도)의 기계적으로 크기가 감소된 다당류 혈청형 2 및 5.0 mL의 CDAP(아세토니트릴 중 100 mg/mL (w/v))를 유리병에서 1.0:0.5(PS:CDAP)의 비율로 혼합하고 1분 동안 교반하였다. 16.0 mL의 0.2 M 트리에틸아민을 사용하여 다당류 용액의 pH를 9.0으로 조정하고 실온(RT)에서 1분 동안 교반하였다. 800 mg의 PsaA(53.33 mL의 15.0 mg/mL 농도)을 1.0:0.8(PnPs:PsaA)의 비율로 활성화된 다당류에 서서히 첨가하였다.
반응물의 pH를 3.5 mL의 0.2 M 트리에틸아민으로 9.0으로 조정하고, 실온에서 3-5시간 동안 교반하면서 반응을 계속한 다음, 과잉 농도의 글리신(100 mM)을 첨가하여 반응을 퀀칭시켰다. 반응물의 접합 속도론(도 5B)은 반응의 매시간마다 SEC-HPLC를 사용하여 모니터링되었다.
반응 혼합물을 정용여과하고 100 kDa MWCO TFF 막을 사용하여 농축시켰다. 농축물을 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 분획을 SEC-MALLS, 안트론 방법으로 분석하고, 접합체를 함유하는 분획을 풀링하고, 0.2pm 필터로 멸균 여과하였다. 수득된 접합체의 평균 분자량은 6295 kDa였다.
c. 폐렴구균 협막 다당류 혈청형 15A의 CRM 197 과의 접합
1000 mg(66.7 mL의 15.0 mg/mL 농도)의 기계적으로 크기가 감소된 다당류 혈청형 15A 및 10.0 mL의 CDAP(아세토니트릴 중 100 mg/mL (w/v))를 유리병에서 1.0:1.0(PS:CDAP)의 비율로 혼합하고 1분 동안 교반하였다. 18.0 mL의 0.2 M 트리에틸아민을 사용하여 다당류 용액의 pH를 9.0으로 조정하고 실온(RT)에서 1분 동안 교반하였다. 1000 mg의 CRM197(53.3 mL의 15.0 mg/mL 농도)을 1.0:0.8(PnPs:CRM)의 비율로 활성화된 다당류에 서서히 첨가하였다.
반응물의 pH를 1.0 mL의 0.2 M 트리에틸아민으로 9.0으로 조정하고, 실온에서 3-5시간 동안 교반하면서 반응을 계속한 다음, 과잉 농도의 글리신(100 mM)을 첨가하여 반응을 퀀칭시켰다. 반응물의 접합 속도론(도 6A)은 반응의 매시간마다 SEC-HPLC를 사용하여 모니터링되었다.
반응 혼합물을 정용여과하고 100 kDa MWCO TFF 막을 사용하여 농축시켰다. 농축물을 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 분획을 SEC-MALLS, 안트론 방법으로 분석하고, 접합체를 함유하는 분획을 풀링하고, 0.2pm 필터로 멸균 여과하였다. 수득된 접합체의 평균 분자량은 4272 kDa였다.
d. 폐렴구균 협막 다당류 혈청형 15A의 PsaA와의 접합
1000 mg(71.4 mL의 14.0 mg/mL 농도)의 기계적으로 크기가 감소된 다당류 혈청형 15A 및 10.0 mL의 CDAP(아세토니트릴 중 100 mg/mL (w/v))를 유리병에서 1.0:1.0(PS:CDAP)의 비율로 혼합하고 1분 동안 교반하였다. 20.5 mL의 0.2 M 트리에틸아민을 사용하여 다당류 용액의 pH를 9.0으로 조정하고 실온(RT)에서 1분 동안 교반하였다. 1000 mg의 PsaA(66.6 mL의 15.0 mg/mL 농도)을 1.0:1.0(PnPs:PsaA)의 비율로 활성화된 다당류에 서서히 첨가하였다.
반응물의 pH를 0.9 mL의 0.2 M 트리에틸아민으로 9.0으로 조정하고, 실온에서 3-5시간 동안 교반하면서 반응을 계속한 다음, 과잉 농도의 글리신(100 mM)을 첨가하여 반응을 퀀칭시켰다. 반응물의 접합 속도론(도 6B)은 반응의 매시간마다 SEC-HPLC를 사용하여 모니터링되었다.
반응 혼합물을 정용여과하고 100 kDa MWCO TFF 막을 사용하여 농축시켰다. 농축물을 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 분획을 SEC-MALLS, 안트론 방법으로 분석하고, 접합체를 함유하는 분획을 풀링하고, 0.2pm 필터로 멸균 여과하였다. 수득된 접합체의 평균 분자량은 9776 kDa였다.
e. 폐렴구균 협막 다당류 혈청형 15C의 CRM 197 과의 접합
1000 mg(100.0 mL의 10.0 mg/mL 농도)의 기계적으로 크기가 감소된 다당류 혈청형 15C 및 15.0 mL의 CDAP(아세토니트릴 중 100 mg/mL (w/v))를 유리병에서 1.0:1.5(PS:CDAP)의 비율로 혼합하고 1분 동안 교반하였다. 24.0 mL의 0.2 M 트리에틸아민을 사용하여 다당류 용액의 pH를 9.0으로 조정하고 실온(RT)에서 1분 동안 교반하였다. 1000 mg의 CRM197(66.6 mL의 15.0 mg/mL 농도)을 1.0:1.0(PnPs:CRM)의 비율로 활성화된 다당류에 서서히 첨가하였다.
반응물의 pH를 2.8 mL의 0.2 M 트리에틸아민으로 9.0으로 조정하고, 실온에서 3-5시간 동안 교반하면서 반응을 계속한 다음, 과잉 농도의 글리신(100 mM)을 첨가하여 반응을 퀀칭시켰다. 반응물의 접합 속도론(도 7A)은 반응의 매시간마다 SEC-HPLC를 사용하여 모니터링되었다.
반응 혼합물을 정용여과하고 100 kDa MWCO TFF 막을 사용하여 농축시켰다. 농축물을 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 분획을 SEC-MALLS, 안트론 방법으로 분석하고, 접합체를 함유하는 분획을 풀링하고, 0.2pm 필터로 멸균 여과하였다. 수득된 접합체의 평균 분자량은 10490 kDa였다.
f. 폐렴구균 협막 다당류 혈청형 15C의 PsaA와의 접합
1000 mg(100.0 mL의 10.0 mg/mL 농도)의 기계적으로 크기가 감소된 다당류 혈청형 15C 및 15.0 mL의 CDAP(아세토니트릴 중 100 mg/mL (w/v))를 유리병에서 1.0:1.5(PS:CDAP)의 비율로 혼합하고 1분 동안 교반하였다. 24.0 mL의 0.2 M 트리에틸아민을 사용하여 다당류 용액의 pH를 9.0으로 조정하고 실온(RT)에서 1분 동안 교반하였다. 1000 mg의 PsaA(66.6 mL의 15.0 mg/mL 농도)을 1.0:1.0(PnPs:PsaA)의 비율로 활성화된 다당류에 서서히 첨가하였다.
반응물의 pH를 2.8 mL의 0.2 M 트리에틸아민으로 9.0으로 조정하고, 실온에서 3-5시간 동안 교반하면서 반응을 계속한 다음, 과잉 농도의 글리신(100 mM)을 첨가하여 반응을 퀀칭시켰다. 반응물의 접합 속도론(도 7B)은 반응의 매시간마다 SEC-HPLC를 사용하여 모니터링되었다.
반응 혼합물을 정용여과하고 100 kDa MWCO TFF 막을 사용하여 농축시켰다. 농축물을 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 분획을 SEC-MALLS, 안트론 방법으로 분석하고, 접합체를 함유하는 분획을 풀링하고, 0.2pm 필터로 멸균 여과하였다. 수득된 접합체의 평균 분자량은 8719 kDa였다.
g. 폐렴구균 협막 다당류 혈청형 35B의 CRM 197 과의 접합
1000 mg(100.0 mL의 10.0 mg/mL 농도)의 기계적으로 크기가 감소된 다당류 혈청형 35B 및 5.0 mL의 CDAP(아세토니트릴 중 100 mg/mL (w/v))를 유리병에서 1.0:0.5(PS:CDAP)의 비율로 혼합하고 1분 동안 교반하였다. 5.0 mL의 0.2 M 트리에틸아민을 사용하여 다당류 용액의 pH를 9.0으로 조정하고 실온(RT)에서 1분 동안 교반하였다. 1000 mg의 CRM197(66.7 mL의 15.0 mg/mL 농도)을 1.0:1.0(PnPs:CRM)의 비율로 활성화된 다당류에 서서히 첨가하였다.
반응물의 pH를 1.6 mL의 0.2 M 트리에틸아민으로 9.0으로 조정하고, 실온에서 3-5시간 동안 교반하면서 반응을 계속한 다음, 과잉 농도의 글리신(100 mM)을 첨가하여 반응을 퀀칭시켰다. 반응물의 접합 속도론(도 8A)은 반응의 매시간마다 SEC-HPLC를 사용하여 모니터링되었다.
반응 혼합물을 정용여과하고 100 kDa MWCO TFF 막을 사용하여 농축시켰다. 농축물을 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 분획을 SEC-MALLS, 안트론 방법으로 분석하고, 접합체를 함유하는 분획을 풀링하고, 0.2pm 필터로 멸균 여과하였다. 수득된 접합체의 평균 분자량은 8572 kDa였다.
h. 폐렴구균 협막 다당류 혈청형 35B의 PsaA와의 접합
1000 mg(142.8 mL의 7.0 mg/mL 농도)의 기계적으로 크기가 감소된 다당류 혈청형 35B 및 6.0 mL의 CDAP(아세토니트릴 중 100 mg/mL (w/v))를 유리병에서 1.0:0.6(PS:CDAP)의 비율로 혼합하고 1분 동안 교반하였다. 7.0 mL의 0.2 M 트리에틸아민을 사용하여 다당류 용액의 pH를 9.0으로 조정하고 실온(RT)에서 1분 동안 교반하였다. 1000 mg의 PsaA(66.6 mL의 15.0 mg/mL 농도)을 1.0:1.0(PnPs:PsaA)의 비율로 활성화된 다당류에 서서히 첨가하였다.
반응물의 pH를 2.2 mL의 0.2 M 트리에틸아민으로 9.0으로 조정하고, 실온에서 3-5시간 동안 교반하면서 반응을 계속한 다음, 과잉 농도의 글리신(100 mM)을 첨가하여 반응을 퀀칭시켰다. 반응물의 접합 속도론(도 8B)은 반응의 매시간마다 SEC-HPLC를 사용하여 모니터링되었다.
반응 혼합물을 정용여과하고 100 kDa MWCO TFF 막을 사용하여 농축시켰다. 농축물을 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다. 분획을 SEC-MALLS, 안트론 방법으로 분석하고, 접합체를 함유하는 분획을 풀링하고, 0.2pm 필터로 멸균 여과하였다. 수득된 접합체의 평균 분자량은 6944 kDa였다.
실시예 4: 폐렴구균 협막 다당류-단백질 접합체 백신의 제제화
다가 접합체 백신을 실시예 3에서 제조된 ~8-10 μg의 CRM197 단백질에 접합된 혈청형 2, 15A, 15C 및 35B로부터의 각각의 폐렴구균 다당류 2.2 μg을 함유하는 0.5 mL 용량으로 제제화하였다. 모든 접합체를 0.5 mL의 용량당 0.5 mg Al3+에 상응하는 인산알루미늄 겔에 흡착시켰다. 0.9% W/V 식염수를 제제를 위한 희석제 및 비히클로서 사용하고, 최종 제제의 pH를 1 N 염산을 사용하여 pH 6으로 조정하였다. pH 조정 후 효과적인 흡착을 위해, 제제를 일정한 교반 하에 2시간 동안 혼합하였다. 2시간의 블렌딩 후, 제제화된 블렌드를 바이알당 0.58 mL 충전 부피로 3 mL 멸균 비-실리콘화 바이알에 무균 충전하고, 멸균 13 mM 고무 마개로 닫고, 13 mM 멸균 핑크색 플립 오프(flip off) 알루미늄 밀봉재로 밀봉한 다음, 충전된 바이알의 광학 검사 및 라벨링을 수행하였다. 로트로부터, 일부 바이알을 무작위로 선택하고, 외관, pH, 삼투질농도, 총 폴리 및 단백질 함량(μg/SHD), 흡착%, 알루미늄 함량(mg/SHD)을 분석하였다.
실시예 5: 폐렴구균 협막 다당류-단백질 접합체 백신의 제제화
다가 접합체 백신을 실시예 3에서 제조된 ~8-10 μg의 PsaA 캐리어 단백질에 접합된 혈청형 2, 15A, 15C, 및 35B로부터의 각각의 폐렴구균 다당류 2.2 μg을 함유하는 0.5 mL 용량으로 제제화하였다. 모든 접합체를 알루미늄에 흡착시켰다. 모든 접합체를 0.5 mL의 용량당 0.5 mg Al3+에 상응하는 인산알루미늄 겔에 흡착시켰다. 0.9% W/V 식염수를 제제를 위한 희석제 및 비히클로서 사용하고, 최종 제제의 pH를 1 N 염산을 사용하여 pH 6으로 조정하였다. pH 조정 후 효과적인 흡착을 위해, 제제를 일정한 교반 하에 2시간 동안 혼합하였다. 2시간의 블렌딩 후, 제제화된 블렌드를 바이알당 0.58 mL 충전 부피로 3 mL 멸균 비-실리콘화 바이알에 무균 충전하고, 멸균 13 mM 고무 마개로 닫고, 13 mM 멸균 핑크색 플립 오프 알루미늄 밀봉재로 밀봉한 다음, 충전된 바이알의 광학 검사 및 라벨링을 수행하였다. 로트로부터, 일부 바이알을 무작위로 선택하고, 외관, pH, 삼투질농도, 총 폴리 및 단백질 함량(μg/SHD), 흡착%, 알루미늄 함량(mg/SHD)을 분석하였다.
실시예 5: 폐렴구균 협막 다당류-단백질 접합체 백신의 제제화
24가 접합된 백신을 25 내지 40 μg CRM197에 접합된 혈청형 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F로부터의 각각의 폐렴구균 다당류 2.2 μg(예외적으로 6B는 4.4 μg) 및 25 내지 40 μg의 PsaA에 접합된 혈청형 3, 6A, 8, 10A, 11A, 12F, 15A, 23A, 23B, 24F 및 35B로부터의 각각의 폐렴구균 다당류 2.2 μg을 함유하는 0.5 mL 용량으로 제제화하였다. 모든 접합체를 0.5 mL의 용량당 0.5 mg Al3+에 상응하는 인산알루미늄 겔에 흡착시켰다. 0.9% W/V 식염수를 제제를 위한 희석제 및 비히클로서 사용하고, 최종 제제의 pH를 1 N 염산을 사용하여 pH 6으로 조정하였다. pH 조정 후 효과적인 흡착을 위해, 제제를 일정한 교반 하에 2시간 동안 혼합하였다. 2시간의 블렌딩 후, 제제화된 블렌드를 바이알당 0.58 mL 충전 부피로 3 mL 멸균 비-실리콘화 바이알에 무균 충전하고, 멸균 13 mM 고무 마개로 닫고, 13 mM 멸균 핑크색 플립 오프 알루미늄 밀봉재로 밀봉한 다음, 충전된 바이알의 광학 검사 및 라벨링을 수행하였다. 로트로부터 무작위로 선택된 일부 바이알을 보내 외관, pH, 삼투질농도, 총 폴리 및 단백질 함량(μg/SHD), 흡착%, 알루미늄 함량(mg/SHD)을 분석하였다.
실시예 6: 0.5 mL 용량으로 토끼의 면역화
A) 면역화 및 ELISA
각각 1.5 내지 2kg의 건강한 토끼들을 사육하고 격리 시설에서 사육하였다. 토끼를 실시예 4 및 5에 기재된 바와 같이 단일 0.5 mL 용량의 다가 PCV로 면역화시켰다. 7마리 토끼로 이루어진 각각의 그룹을 제1일, 제15일 및 제29일에 제제로 면역화시켰다. 혈액 샘플을 제0일(면역 전), 제15일(시험 출혈) 및 제36일(최종 출혈)에 수집하였다. 제0일(PD1) 및 제40일(PD3)에 수집된 토끼 혈청을 ELISA를 이용하여 혈청형 특이적 면역 반응에 대해 분석하였다. ELISA를 WHO 제안 프로토콜에 따라 수행하였다. ELISA를 WHO 제안 프로토콜에 따라 수행하였다. 간단히 말해서, Maxisorp™ ELISA 플레이트를 주어진 혈청형의 PnCPS로 코팅하였다. ELISA를 WHO 제안 프로토콜에 따라 수행하였다. 간단히 말하면, Maxisorp™ ELISA 플레이트를 주어진 혈청형의 PnCPS로 코팅하였다(1 μg/50 μL/웰, PBS 사용; 멸균 내독소 없음, 0.02% 아지드화나트륨 포함). 플레이트를 가습을 위해 젖은 종이 타월이 담긴 상자에 넣고, 37℃±2℃에서 5시간 동안 인큐베이션한 다음, 플레이트를 사용할 때까지 5℃±3℃에서 저장하였다.
시험 혈청을 CWPS mLtiTM에 사전 흡착시켜 세포벽 다당류로부터 발생하는 배경 반응성을 제거하였다. 이 2 μL의 시험 및 양성 대조군 혈청을 998 μL의 사전 흡착 용액(PBST 중의 999 μL의 10% SuperBlockTM 중의 1 mL-1 μL CWPS MultiTM)을 사용하여 희석하여 1:500의 최종 희석을 수득하였다. 희석된 샘플을 실온(25℃±5℃)에서 1시간 동안 지속적으로 흔들면서 인큐베이션하였다. 결합되지 않은 PnCPS는 플레이트를 튕겨(flicking) 제거하고 웰 내의 유리 부위는 200 μL의 차단제(PBS 중의 20% SuperBlockTM)를 첨가하여 차단하였다. 플레이트를 흔들지 않고 실온(25℃±5℃)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
B) 시험 샘플 및 대조군 첨가
50 μL 희석제(PBST 중의 10% SuperBlockTM)를 A1 내지 A12를 제외한 모든 웰에 첨가하였다. 이 100 μL/웰의 사전 흡착된 시험 혈청 샘플을 A1 내지 A10에 첨가한 후, 대조군 혈청 샘플을 A11 및 A12에 첨가하였다. 시험 샘플의 2배 연속 희석은 50 μL를 1차에서 2차로 전달하는 방식으로, 즉 A1-A10에서 H1-H10으로 전달함으로써 수행하였다. 마찬가지로, A11 및 12에서 E11 및 E12로의 대조군 샘플(007SP)의 연속 희석을 수행하였다. 희석이 없는 F11 및 F12에서 H11 및 H12는 블랭크로 설정하였다. 플레이트를 흔들지 않고 실온(25℃±5℃)에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 단계 후 내용물을 버리고 플레이트를 PBST(~250 μL/웰)로 수동으로 또는 플레이트 와셔로 3회 세척하였다.
C) 1차 항체 첨가
50 μL/웰의 재조합 단백질 A/G 퍼옥시다제(PBST 중의 10% SuperBlockTM을 사용하여 1:20000으로 희석됨)를 모든 웰에 첨가하고 플레이트를 흔들지 않고 실온(25℃±5℃)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 후, 플레이트를 PBST(250 μL/웰)로 수동으로 또는 플레이트 와셔로 3회 세척하였다.
D) 전개 및 판독
50μg/웰의 TMB 기질을 첨가하고 흔들지 않고 실온(25℃±5℃)에서 15분 동안 인큐베이션함으로써 발색 반응을 전개시켰다. 50 μL/웰의 1.25 M 황산을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 450nm에서 OD를 측정하였다.
E) 역가 추정
면역화된 동물의 항체 역가는 희석 배율의 역으로 지정되었다. (대략 0.2) 면역 전 역가의 2배로서의 OD450nm를 나타내는 가장 높은 희석이 역가로 보고되었다. 각각의 혈청형에 대한 혈청 항체의 역가를 플로팅하고 상이한 처리 그룹과 비교하였다.
F) 토끼에서의 면역 반응
토끼를 실시예 5에 기재된 제제로 면역화시켰다. 연구 설계는 각각 7마리의 토끼의 2개의 그룹으로 이루어졌다. 동물을 제제화된 백신의 3회 투여로 면역화시켰다.
면역화된 토끼로부터의 혈청을 지정된 간격으로 수집하였다. 혈청형 특이 IgG 역가 수준은 인간 혈청에서 혈청 항체 역가를 평가하기 위해 WHO 권장 ELISA로부터 채택된 ELISA에서 추정되었다. 항체 역가는 컷오프 한계를 초과하는 OD450nm 값을 제공하는 혈청의 최대 희석으로 추정되었다. 백신접종 전의 동물의 IgG 역가 값을 사용하여 혈청 IgG 역가에서 기하 평균 배수 증가(GMFR)를 계산하였다. 상기된 24가 PCV 제제를 투여한 후, 동물은 백신의 접합체의 다당류의 각각의 혈청형에 대한 항체를 갖는 것으로 밝혀졌고, 따라서 이들 백신은 면역원성이다.
(도 9)에 나타난 바와 같이, 역가는 컷오프 값(2 × 면역 전 혈청에서 관찰된 OD450nm; 약 0.1의 OD 값) 초과의 ELISA OD450nm를 생성하는 최대 혈청 희석으로 추정된다. 각각의 혈청형에 대한 기하 평균 배수 증가(GMFR)를 플로팅하였다. 3회 투여의 면역화 후(3회 투여 후) 수득된 혈청을 사용하여 면역원성을 평가하였다. 검은색 막대는 CRM197에 접합된 폐렴구균 다당류를 나타내며, 열린 흰색 막대는 PsaA에 접합된 폐렴구균 다당류를 나타낸다.
전술된 바로부터, 본 발명의 특정 실시양태가 예시의 목적으로 본원에 설명되었지만, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.

Claims (25)

  1. 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량(Mw)을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae) 혈청형 2, 15A, 15C 또는 35B의 정제되고 크기 조정된 협막 다당류.
  2. 제1항에 있어서, 50 kDa 내지 750 kDa; 50 kDa 내지 500 kDa; 100 kDa 내지 1,000 kDa; 100 kDa 내지 750 kDa; 100 kDa 내지 500 kDa의 평균 분자량(Mw)을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2, 15A, 15C 또는 35B의 정제된 협막 다당류.
  3. 제1항에 있어서, 5-18% 범위 내의 글리세롤 함량을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15A 또는 15C의 정제된 협막 다당류.
  4. 제3항에 있어서, 5 내지 10%의 글리세롤 함량을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15A의 정제된 협막 다당류.
  5. 제3항에 있어서, 5 내지 10%의 글리세롤 함량을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15C의 정제된 협막 다당류.
  6. 제1항에 있어서, 2-10%, 바람직하게는 2-8% 범위 내의 아세테이트 함량을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 35B의 정제된 협막 다당류.
  7. a. 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2, 15A, 15C 또는 35B를 적합한 배양 배지에서 배양하는 단계;
    b. 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 배양 브로스를 불활성화시키는 단계;
    c. 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 배양 브로스를 원심분리시키는 단계;
    d. 배양 브로스로부터 스트렙토코쿠스 뉴모니아에의 협막 다당류를 정제하는 단계; 및
    e. 스트렙토코쿠스 뉴모니아에의 정제된 협막 다당류를 고압 균질화하여 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량(Mw)을 갖는 크기 조정된 협막 다당류를 수득하는 단계
    를 포함하는, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형의 정제되고 크기 조정된 협막 다당류를 제조하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 균질화가 500 내지 2000 bar 범위의 압력에서 수행되는 것인 방법.
  9. 제7항의 방법에 의해 수득된 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량(Mw)을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2, 15A, 15C 또는 35B의 정제된 협막 다당류.
  10. 캐리어 단백질에 접합된 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량을 갖는 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 2, 15A, 15C 또는 35B로부터의 적어도 하나의 정제되고 크기 조정된 협막 다당류를 포함하는 폐렴구균 접합체 백신으로서, 조성물이 약 0.5 내지 약 2.0의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 포함하는 것인 폐렴구균 접합체 백신.
  11. 제10항에 있어서, 캐리어 단백질이 PsaA, CRM197, PspA, 파상풍 톡소이드(TT) 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 접합체 백신.
  12. 제10항에 있어서, PsaA, CRM197, PspA 또는 파상풍 톡소이드(TT)에 접합된 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량을 갖는 혈청형 2로부터의 다당류를 포함하고, 조성물이 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 포함하는 것인 폐렴구균 접합체 백신.
  13. 제10항에 있어서, PsaA, CRM197, PspA 또는 파상풍 톡소이드(TT)로부터 선택되는 캐리어 단백질에 접합된 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량을 갖는 혈청형 15A로부터의 다당류를 포함하고, 조성물이 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 포함하는 것인 폐렴구균 접합체 백신.
  14. 제10항에 있어서, PsaA, CRM197, PspA 또는 파상풍 톡소이드(TT)로부터 선택되는 캐리어 단백질에 접합된 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량을 갖는 혈청형 15C로부터의 다당류를 포함하고, 조성물이 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 포함하는 것인 폐렴구균 접합체 백신.
  15. 제10항에 있어서, PsaA, CRM197, PspA 또는 파상풍 톡소이드(TT)로부터 선택되는 캐리어 단백질에 접합된 50 내지 1000 kDa의 평균 분자량을 갖는 혈청형 35B로부터의 다당류를 포함하고, 조성물이 약 0.5 내지 약 2.0, 바람직하게는 0.7 내지 1.2의 단백질 대 다당류(단백질/PS)의 (w/w) 퍼센트 비율을 포함하는 것인 폐렴구균 접합체 백신.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 접합체가 500 kDa 내지 5000 kDa; 1,000 kDa 내지 10,000 kDa; 1,500 kDa 내지 15,000 kDa; 2,000 kDa 내지 20,000 kDa; 2,500 kDa 내지 25,000 kDa; 또는 3,000 kDa 내지 30,000 kDa 범위의 평균 분자량을 갖는 것인 폐렴구균 접합체 백신.
  17. 스트렙토코쿠스 뉴모니아에　혈청형 2, 15A, 15C 또는 35B로부터의 적어도 하나의 당접합체를 포함하는 면역원성 조성물로서, 당접합체의 다당류가 제1항의 정제된 협막 다당류인 면역원성 조성물.
  18. 제17항에 있어서, PsaA, CRM197, PspA, 파상풍 톡소이드(TT) 또는 캐리어 단백질의 조합으로부터 선택되는 캐리어 단백질에 접합된, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에　혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 14, 15B, 16F, 18C, 19A, 19F, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 31, 33F로부터의 당접합체를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 조성물이 다가 면역원성 조성물이고, 8가, 9가, 10가, 11가, 12가, 13가, 14가, 15가, 16가, 17가, 18가, 19가, 20가, 22가, 24가, 25가 또는 그 초과의 가의 폐렴구균 접합체 조성물인 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 조성물이 2, 15A, 15C 및 35B로부터 선택되는 적어도 3종의 폐렴구균 혈청형 및 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 14, 18C, 19A, 19F, 20A, 20B, 22F, 23F, 24F, 33F를 포함하는 추가 혈청형으로부터의 다당류를 포함하는 24가 폐렴구균 접합체 조성물이고, 혈청형이 캐리어 단백질에 접합되고, 캐리어 단백질이 PsaA, CRM197, PspA, 파상풍 톡소이드(TT)로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 조성물이 2, 15A, 15C 및 35B로부터 선택되는 적어도 2종의 폐렴구균 혈청형 및 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 33F를 포함하는 추가 혈청형으로부터의 다당류를 포함하는 24가 폐렴구균 접합체이고, 혈청형이 PsaA, CRM197, PspA, 파상풍 톡소이드(TT)로부터 선택되는 캐리어 단백질에 접합되는 것인 면역원성 조성물.
  22. 제19항에 있어서, 조성물이 2, 15A, 15C 및 35B로부터 선택되는 적어도 2종의 폐렴구균 혈청형 및 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 18C, 19A, 19F, 20A, 20B, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 33F로부터 선택되는 하나 이상의 추가 혈청형으로부터의 다당류를 포함하는 다가 폐렴구균 접합체 백신 조성물이고, 혈청형이 PsaA, CRM197, PspA, 파상풍 톡소이드(TT)로부터 선택되는 캐리어 단백질에 접합되는 것인 면역원성 조성물.
  23. 제19항에 있어서, 조성물이 캐리어 단백질에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에의 혈청형으로부터의 다당류를 포함하는 17가 폐렴구균 접합체 백신 조성물이고, 혈청형이 2, 15A, 15C 및 35B 및 추가 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F를 포함하고, 캐리어 단백질이 PsaA, CRM197, PspA, 파상풍 톡소이드(TT)로부터 선택되는 것인 면역원성 조성물.
  24. 제1항에 있어서, 다당류가 백신 또는 면역원성 조성물의 제조에 유용한 것인 정제된 협막 다당류.
  25. 제10항 내지 제16항 및 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 백신 또는 면역원성 조성물이 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 감염에 대한 예방에 유용한 것인 백신 또는 면역원성 조성물.
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