KR20200005458A - 다가 폐렴구균 다당체-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물, 및 이를 포함하는 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다가 폐렴구균 다당체-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물, 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 일 측면에 따른 다가 면역원성 조성물은, 생리학적으로 허용되는 비히클, 및 15개의 상이한 다당체-운반 단백질 접합체를 포함하고, 상기 각각의 다당체-단백질 접합체는 운반 단백질에 접합된 상이한 혈청형의 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 협막 다당체(capsular polysaccharide)를 포함하며, 상기 협막 다당체가 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 11A, 14, 18C, 19A, 19F, 22F 및 23F 로부터 제조되는 것이다.

Description

다가 폐렴구균 다당체-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물, 및 이를 포함하는 약학 조성물 {Immunogenic composition comprising multivalent pneumococcal polysaccharide-protein conjugate, and phamatiutical composition comprising the same}

본 발명은 다가 폐렴구균 다당체-단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물, 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)는 폐렴의 주요한 원인균이다. 통계청에 의하면 2010년 폐렴으로 인한 사망률은 10만 명당 14.9 명으로 10대 사망원인의 하나이며, 2000년 대비 82.9% 증가한 것으로 나타났다. 또한, 2012년 WHO에 따르면 2008년도에 전세계적으로 HIV 음성인 5세 이하 어린이 476,000명이 스트렙토코커스 뉴모니애에 의한 감염으로 사망했으며, 5세 이하 어린이 전체 사망자 중 5%가 이 균에 의한 질환으로 사망하였다.

폐렴구균에 의한 질환을 예방하기 위해 1977년 Dr. Robert Austrian에 의해 14가 다당류 백신이 개발되었고, 이후 23가 다당체 백신으로 발전하였다. 다가 폐렴구균 다당체 백신은 노인 및 고위험 환자에서 폐렴구균 질환을 예방하는데 있어서 유용한 것으로 입증되었다. 그러나, 유아 및 소아는 대부분의 폐렴구균 다당체에 대해 면역 반응이 잘 일어나지 않는데 이는 T-cell 비의존적 면역반응 현상 때문이다. 7가 폐렴구균 접합체 백신(프레브나(Prevnar)®)은 가장 발생 빈도가 높은 7개 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F 유래의 협막 다당체(capsular polysaccharide)를 포함한다. 2000년 미국에서 최초로 승인된 이후 유아 및 소아에서 침습성 질환 및 중이염에 대해 면역원성이 높고 효과적인 것으로 입증되었다. 이 백신은 현재 전세계 약 80여 개 국가에서 승인되어 있다. 프레브나는 미국, 유럽 및 전세계의 다른 지역에서 침습성 폐렴구균 질환의 대략 80 내지 90%, 60 내지 80%, 및 40 내지 80%를 각각 감당한다. 프레브나의 도입 이후에 수년간 축적된 감시(surveillance) 데이터에서는 예상된 바와 같이, 미국에서 프레브나에 포함된 혈청형에 의한 침습성 폐렴구균 질환이 명확히 감소하였다. 하지만, 일부 지역에서는 혈청형 적용 범위에 한계가 있었으며, 프레브나에 포함되지 않은 혈청형, 특히 19A로 인한 침습성 폐렴구균 질환은 증가하였다.

2010년 2월 Advisory Committee on Immunization Practices(ACIP)는 새로 허가받은 13가 폐렴 구균 접합 백신(PCV-13)의 사용 권고를 발표하였다. PCV-13은 프레브나에 포함된 7개 혈청형(4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F) 외에 6개의 추가 혈청형(1, 3, 5, 6A, 7F, 19A)들이 함유된 폐렴구균 접합체 백신이다. 미국 Active Bacterial Core surveillance(ABCs) 조사에 의하면, 5세 이하 어린이의 발병 혈청형으로 알려진 IPD 건 중에서 총 64 %가 PCV13에 포함되어 있으며, 5세 이하 어린이에서 발병한 4600 IPD 건 중에 PCV7에 의한 경우가 70건인데 반해 PCV13의 경우는 2900 건으로 과반수 이상을 차지하고 있다.

한편, 현재 시판되고 있는 PCV (Pneumococcal conjugate vaccine)는 폐렴구균 (혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F 등)으로 인하여 생기는 침습성 질환을 예방하는 백신으로 사용되고 있다. 폐렴구균 백신은 디프테리아 톡소이드(diphtheria toxoid)의 비독성 변형체인 CRM₁₉₇을 운반단백질로 사용하며, 각 혈청형별 다당체와의 화학결합은 환원성아민화(reductive amination) 및 다당체의 수산화기 활성화를 통해 다당체와 운반단백질의 공유결합을 유도한다. 다당체에 운반단백질 결합을 통한 면역원성 증진을 유도하기 위한 화학결합 방법 중 환원성 아민화를 이용한 화학결합은 절차가 다소 복잡하기 때문에 다당체의 항원결정기(epitope)에 변화를 줄 수 있다. 변화된 항원결정기를 가지는 다당체 백신은 면역반응에 있어 차이를 나타내며, 이는 백신의 면역원성에 영향을 준다.

한편, 항생제 내성 및 다재내성을 나타내는 일부 혈청형에 의해 혈청형 교체(serotype replacement)가 나타났다. 또한, 혈청형 분포의 지역간 편차로 인해 프레브나 적용범위가 지역에 따라 달라지는 한계가 제기되었다. 따라서, 기존의 폐렴구균 접합체 백신으로부터 혈청형을 추가하여 적용범위를 더 넓혀야 할 필요성이 있는 실정이었다.

대한민국 공개특허공보 제2003-0024714호

본 발명은 우수한 혈청 IgG 역가를 유도할 수 있고, 영유아, 소아, 및 성인의 폐렴구균에 의한 질환을 예방하는데 유용하게 사용될 수 있는 다가 면역원성 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면에 따른 다가 면역원성 조성물은, 생리학적으로 허용되는 비히클, 및 15개의 상이한 다당체-운반 단백질 접합체를 포함하고, 상기 각각의 다당체-단백질 접합체는 운반 단백질에 접합된 상이한 혈청형의 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 협막 다당체(capsular polysaccharide)를 포함하며, 상기 협막 다당체가 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 11A, 14, 18C, 19A, 19F, 22F 및 23F 로부터 제조되는 것이다.

그리고, 상기 다당체-운반 단백질 접합체는 하기 화학식 1로 표시되는 에틸렌글리콜 디하이드라자이드 또는 이의 유도체로 접합될 수 있다.

[화학식 1]

또한, 상기 운반 단백질이 CRM₁₉₇일 수 있다.

그리고, 상기 다가 면역원성 조성물은 애쥬번트(adjuvant)를 더 포함할 수 있다.

또한, 상기 애쥬번트는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트, 및 알루미늄 하이록사이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 다가 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 협막 다당체(capsular polysaccharide) 접합체에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약학 조성물이 제공된다.

그리고, 상기 다가 면역원성 조성물이 2 내지 5 ㎍의 각 당류; 30 내지 60㎍의 CRM₁₉₇ 운반 단백질; 0.1 내지 0.3mg의 알루미늄 애쥬번트; 및 부형제로 염화나트륨을 함유하도록 제제화된 단일 0.5 mL 용량일 수 있다.

본 발명에 따른 다가 면역원성 조성물은 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 11A, 14, 18C, 19A, 19F, 22F 및 23F 폐렴구균 혈청형 유래의 협막 다당체를 포함함으로써, 우수한 혈청 IgG 역가와 기능적 항체 활성을 유도할 수 있다.

그리고, 본 발명에 따른 다가 면역원성 조성물은 추가된 혈청형인 11A와 22F로 인해 나머지 13가 혈청형의 면역원성 저하가 나타나지 않을 뿐 아니라, 영유아, 소아, 및 성인의 폐렴구균에 의한 질환을 예방하는데 유용하게 사용될 수 있고, 특히 영아 기본접종에 적합한 백신에 사용될 수 있다.

도 1은, 시험예 1에 따른 Rabbit 실험에 대한 면역원성 ELISA 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는, 시험예 1에 따른 Rabbit 실험에 대한 면역원성 OPA 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 발명은, 생리학적으로 허용되는 비히클, 및 15개의 상이한 다당체-운반 단백질 접합체를 포함하고, 상기 각각의 다당체-단백질 접합체는 운반 단백질에 접합된 상이한 혈청형의 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 협막 다당체(capsular polysaccharide)를 포함하며, 상기 협막 다당체가 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 11A, 14, 18C, 19A, 19F, 22F 및 23F 로부터 제조되는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 측면에 따르면 다가 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 협막 다당체(capsular polysaccharide) 접합체에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약학 조성물이 제공된다.

이하 발명의 구체적인 구현예에 따른 다가 면역원성 조성물에 관하여 보다 상세하게 설명하기로 한다.

항생제 내성 및 다재내성을 나타내는 일부 혈청형에 의해 혈청형 교체(serotype replacement)가 나타났다. 또한, 혈청형 분포의 지역간 편차로 인해 프레브나 적용범위가 지역에 따라 달라지는 한계가 제기되었다. 따라서, 기존의 폐렴구균 접합체 백신으로부터 혈청형 제거 없이 오히려 혈청형을 추가하여 적용범위를 더 넓혀야 할 필요성이 있었다.

본 발명자들은 혈청형 11A 및 22F를 포함한 15개 폐렴구균 혈청형 유래의 협막 다당체를 포함함으로써, 우수한 혈청 IgG 역가와 기능적 항체 활성을 유도할 수 있고, 추가된 혈청형인 11A와 22F로 인해 나머지 13가 혈청형의 면역원성 저하가 나타나지 않을 뿐 아니라, 영유아, 소아, 및 성인의 폐렴구균에 의한 질환을 예방하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 영아 기본접종에 적합한 백신에 사용될 수 있다는 점을 실험을 통해 발견하여 본 발명을 완성하였다.

협막 다당체는 당업자에게 공지된 표준 기술에 의해서 제조될 수 있고, 협막 다당체는 점도를 감소시키기 위해서 또는 활성화된 협막 다당체의 용해도를 증가시키기 위해서 크기를 줄일 수 있다.

본 발명에서, 협막 다당체는 스트렙토코커스 뉴모니애의 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 11A, 14, 18C, 19A, 19F, 22F 및 23F 로부터 제조될 수 있다.

이 폐렴구균 접합체들은 별개의 과정에 의해서 제조되고 단일 투여 제형으로 제제화된다. 예를 들어 각 폐렴구균 다당체 혈청형을 대두-기제 배지에서 증식시키고, 이어서 개개의 다당체를 원심분리, 침전, 한외여과를 통해서 정제한다.

운반 단백질은 바람직하게는 무독성이고 비반응원성이며, 충분한 양 및 순도로 수득할 수 있는 단백질이다. 상기 운반 단백질은 표준 접합 방법에 적절해야 한다. 본 발명에 따른 다가 면역원성 조성물에 있어서, 상기 운반 단백질은 CRM₁₉₇일 수 있다. CRM₁₉₇은 카사미노산 및 효모 추출물-기제 배지에서 증식시킨 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria) 균주의 배양물로부터 분리된 디프테리아 독소의 무독성 변이체(톡소이드)이다. CRM₁₉₇은 한외여과, 암모늄 설페이트 침전 및 이온 교환 크로마토그래피를 통해서 정제된다.

다른 디프테리아 톡소이드도 또한 운반 단백질로서 사용될 수 있다. 다른 적당한 운반 단백질에는, 파상풍 톡소이드, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드(WO 2004/083251), 이.콜라이(E. coli) LT, 이.콜라이 ST, 및 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래의 외독소 A와 같은 불활성화된 세균 독소가 포함된다.

세균 외막 단백질, 예를 들면, 외막복합체 c (OMPC), 포린, 트랜스페린 결합 단백질, 뉴모리신, 폐렴구균 표면 단백질 A(PspA), 폐렴구균 어드헤신(adhesin) 단백질(PsaA), 그룹 A 또는 그룹 B 연쇄구균 유래의 C5a 펩티다제, 또는 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 단백질 D도 또한 사용될 수 있다. 오브알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 소 혈청 알부민(BSA) 또는 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체(PPD)와 같은 다른 단백질도 또한 운반 단백질로서 사용될 수 있다. CRM₁₇₃, CRM₂₂₈, CRM₄₅와 같은 디프테리아 독소의 변이체도 운반 단백질로 사용할 수 있다.

운반 단백질과 반응할 수 있는 당류를 제조하기 위하여, 정제된 다당체는 화학적으로 활성화시킨다. 일단 활성화되면, 각 협막 다당체를 운반 단백질에 하나씩 접합시켜서 당접합체(glycoconjugate)를 형성한다. 일 구현예에서, 각 협막 다당체를 동일한 운반 단백질에 접합시킨다. 다당체의 화학적 활성화 및 이어지는 운반체 단백질에의 접합은 공지의 방법에 의해 수행될 수 있다.

한편, 본 발명의 일 구현예에 따르면 하이드라자이드 링커에 에틸렌글리콜 그룹을 합성하여 친수성의 접합체를 제조할 수 있다. 즉, 상기 다당체-운반 단백질 접합체는 하기 화학식 1로 표시되는 에틸렌글리콜 디하이드라자이드 및 이의 유도체로 접합되는 것을 특징으로 하는, 면역원성 조성물을 제공할 수 있다.

[화학식 1]

이 때, 상기 화학식 1에 있어서, n은 바람직하게는 1 내지 10일 수 있으며, 보다 바람직하게는, 1 내지 5일 수 있고, 가장 바람직하게는, 1 내지 3일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기와 같은 다당체-단백질 접합체로 백신을 제작할 경우, 제작된 백신의 높은 수용액상의 안정성을 보존할 수 있고, 이로 인해 폐렴구균 백신 효능을 향상시킬 수 있다.

각 혈청형 다당체와 CRM₁₉₇ 단백질을 접합시키기 위해 기본적으로 CDAP (Cyanodiaminopyridinium tetrafluoroborate)와 EDAC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminno propyl)-carbodimide)를 activator로 사용할 수 있다. 각 혈청형 다당체는 CDAP (cyanylation 법)으로 활성화시켜 링커 분자 ADH(adipic dihydrazide) 를 접합할 수 있고, 링커분자가 접합된 활성화된 다당체와 CRM₁₉₇ 단백질은 EDAC (carbodiimide법)으로 활성화하여 접합할 수 있다.

얻어진 다당체-단백질 접합체는 다양한 방법에 의해 정제할 수 있다. 이들 방법의 예는 농축/투석여과 공정, 칼럼 크로마토그래피 및 다층 여과를 포함한다. 정제된 다당체-단백질 접합체들은 각각을 혼합하여 본 발명의 면역원성 조성물로 제제화하고, 이를 백신으로서 사용할 수 있다. 당업계에서 공지된 방법을 사용하여 본 발명의 면역원성 조성물의 제제화를 수행할 수 있다. 예를 들면, 15개의 개개의 폐렴구균 접합체를 생리학적으로 허용되는 비히클과 함께 제형화하여 조성물을 제조할 수 있다.

이러한 비히클의 예에는, 물, 완충 식염수, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 덱스트로스 용액이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구현예에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 하나 이상의 애주번트를 포함한다. 본원에서 정의되는 "애주번트"는 본 발명의 면역원성 조성물의 면역원성을 증가시키는데 사용되는 물질이다. 따라서, 애주번트는 종종 면역 반응을 부스터하기 위하여 제공되고 당업자에게 잘 알려져 있다. 조성물의 유효성을 증가시키기에 적당한 애주번트는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트 및 알루미늄 하이록사이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

특정 구현예에서, 알루미늄 염이 애주번트로서 사용된다. 알루미늄 염 애주번트는 알루미늄-침전 백신(alumprecipitated vaccine)이거나 알루미늄-흡착 백신(alum-adsorbed vaccine)일 수 있다. 알루미늄 염에는 수화된 알루미나, 알루미나 수화물, 알루미나 3수화물(ATH), 알루미늄 수화물, 알루미늄 3수화물, 알하이드로겔, Superfos, 암포젤, 수산화알루미늄(Ⅲ), 알루미늄 히드록시포스페이트 설페이트(Aluminum Phosphate Adjuvant(APA)), 무정형 알루미나 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. APA는 알루미늄 히드록시포스페이트의 현탁액이다. 염화알루미늄과 인산나트륨을 1:1의 비율로 혼합하면 알루미늄 히드록시포스페이트 설페이트가 침전된다. High shear mixer를 이용하여 침전물의 크기가 2~8㎛이 되도록 한 다음 생리식염수로 투석하고 멸균하여 제조한다. 일 구현예에서, 상업적으로 이용가능한 Al(OH)3(예를 들어 알하이드로겔 또는 Superfos)를 사용하여 단백질을 흡착한다. 수산화알루미늄 1 mg당 50~200g의 단백질이 흡착될 수 있으며 이 비율은 단백질의 pI와 용매의 pH에 의존적이다. 낮은 pI의 단백질은 높은 pI를 가진 단백질에 비해 강하게 결합한다. 알루미늄 염은 2~3주간 서서히 항원을 방출하는 항원 저장소를 형성하여 비특이적으로 대식세포, 보체, 선천성 면역 메커니즘을 활성화시킨다.

본 발명은 상기 다가 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애 협막 다당체 접합체에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약학 조성물(예를 들어, 백신 제제)을 제공한다.

본 발명에 따른 백신 제제는, 전신 또는 점막 경로로 투여함으로써, 폐렴구균에 감염되기 쉬운 사람을 보호 또는 치료하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 정의되는 "유효량"이란 스트렙토코커스 뉴모니애에 감염될 확률 또는 감염의 심각성을 상당히 감소시킬 수 있을 정도의 항체를 유발하는데 필요한 투여량을 말한다. 투여에는 근육내, 복강내, 피내 또는 피하 경로를 통한 주사; 또는 구강/소화관, 기도관 또는 비뇨생식관으로의 점막 투여가 포함될 수 있다. 일 구현예에서, 폐렴 또는 중이염의 치료를 위하여 비내 투여가 사용되며, 이는 폐렴구균의 비인두 보균을 보다 효과적으로 예방하여, 초기 단계에서 감염을 약화시킬 수 있기 때문이다. 각 백신 용량에서 상기 접합체의 양은, 상당한 부작용 없이 면역보호 반응을 유도하는 양으로 선택된다. 이러한 양은 폐렴구균의 혈청형에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 각 용량은 0.1 내지 100 ㎍, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎍, 더욱 바람직하게는 1 내지 5㎍의 다당체를 포함할 것이다.

특정 백신에 대한 성분의 최적량은 피험자에서 적당한 면역 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해서 확인될 수 있다. 예를 들어 동물실험 결과를 외삽하여 사람을 대상으로 한 백신접종 용량을 결정할 수 있다. 또한 경험적으로 용량을 결정할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 백신 조성물은 각각 CRM₁₉₇에 접합된 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 11A, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 및 23F의 폐렴구균 협막 다당체의 멸균 액체 제형이다.

각 0.5mL 용량에, 2 내지 5 ㎍의 각 다당체; 30 내지 60㎍ CRM₁₉₇ 운반체 단백질; 0.1 내지 0.3mg의 알루미늄 애쥬번트; 및 부형제로서 염화나트륨을 함유하도록 제제화될 수 있다.

상기 액체는 보존제 없이 단일 용량 주사기 또는 유리 바이알 속에 충전될 수 있다. 진탕하고 나면, 즉시 근육 내 투여할 수 있는 균질한 백색 현탁액의 백신이 된다.

본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 단회 접종으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 백신 조성물은 적당한 간격으로 2회, 3회, 4회 또는 그 이상 투여될 수 있으며, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 간격으로, 혹은 이것의 어떠한 조합에 따라 투여될 수 있다. 면역접종 계획은 프레브나에 대해 명시된 것을 따를 수 있다. 예를 들면, 스트렙토코커스 뉴모니애에 의해서 발생하는 침습성 질환에 대해 유아 및 갓난아이를 대상으로 한 정기접종 계획은 생후 2, 4, 6 및 12 내지 15개월이다. 따라서, 당해 양태에서, 조성물을 생후 2, 4, 6 및 12 내지 15개월에 4회 접종한다.

본 발명의 조성물은 또한 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 하나 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 포함시키기에 적당한 스트렙토코커스 뉴모니애 단백질의 예에는 WO 02/053761에 기술된 단백질뿐만 아니라, WO 02/083855에서 동정된 단백질도 포함된다.

본 발명의 조성물은 당업자에게 공지된 하나 이상의 투여경로, 비경구, 경피 또는 점막, 비내, 근육내, 복강내, 피내, 정맥 또는 피하 경로 등으로 피험자에게 투여될 수 있으며, 그에 따라 제제화할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 액상제제로서 근육내, 복강내, 표피, 정맥, 동맥 또는 피하 경로를 통한 주사; 또는 호흡기 점막 주사로 투여할 수 있다. 주사용 액상 제제는 용액 또는 그와 같은 종류를 포함한다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예 1 : 스트렙토코커스 뉴모니애 유래 협막 다당체의 제조

스트렙토코커스 뉴모니애 배양과 다당체 정제는 당사에서 개발한 공정개발 방법에 의해 수행하였다.

(1) 세포은행 제작 및 배양

스트렙토코스 뉴모니애 각 혈청형은 수탁기관[Culture Collection University of Goteborg(CCUG)]로부터 입수하였다. 입수한 스트렙토코스 뉴모니애의 특성분석 방법 및 기준은 CDC의 Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis Caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Hemophilus influenzae, Chapter 8: Identification and Characterization of Streptococcus pneumoniae를 참고하였다.

그람양성, lancet-shaped 쌍구균, Catalase 시험 음성, 담즙 용해성 시험 양성, Quellung test 양성 반응을 확인하였다.

세포은행 제작 시 동물성 기원의 성분을 제거하기 위해 모든 배양물을 대두-기제 배지에서 원종균을 여러 세대 배양하였다. 후속 세대의 배양 후 냉동보존제로서 합성 글리세롤을 20%가 되도록 첨가하고 초저온 냉동 보관하였다(-70℃ 이하).

초저온 냉동보관 된 후속 세대 균주 1vial을 해동하여 대두-기제 배지에 접종하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 정치 배양하였다. 목표 흡광도 OD_600nm: 0.6~1.2에 도달하면 본 배양 발효기에 접종하여 37℃, pH 7.0~7.2, 60~90rpm, glucose 1.5~2.0% 가 유지되도록 조절하였다.

(2) 다당체 정제

배양이 완료되면 인산을 이용하여 pH 5.0 이하로 떨어트려 불순물 침전을 유도하고 0.1% DOC를 밤새(12 시간 이상) 처리하여 불활화 시켰다. 불활화 된 배양물을 원심분리하고 여과하여 세균 잔해를 제거하였다. 농축 및 버퍼교환 1, CTAB 침전, 1차 침전(CTAB 추출), 2차 침전(불순물 침전), 3차 침전(다당체 침전), 농축 및 버퍼교환 2, HA 컬럼 공정, 농축 및 버퍼교환 3, 0.2 um 여과의 과정을 진행하여 불순물을 제거하고 협막 다당체를 정제하였다.

실시예 2 : 스트렙토코커스 뉴모니애 유래 협막 다당체-CRM ₁₉₇ 의 접합체 제조

상이한 15종 혈청형의 다당체를 기계적인 방법을 통해 목표 분자량 범위로 크기를 조절하였다. 목표 분자량의 다당체는 화학적으로 활성화하고 한외/정용여과를 통해 미반응물을 제거하였다. 활성화된 다당체는 CRM₁₉₇와 EDAC에 의해 amide bond를 형성하면서 접합되고 한외/정용여과를 이용하여 정제한 후 최종적으로 0.2μm 제균필터로 여과하였다.

공정 변수, 공정 중 검사 및 자세한 공정 내용을 하기에 기재하였다.

(1) 다당체 목표 분자량 조절 (분자량 감소)

최종 농도 범위가 5.0 내지 10.0 mg/mL이 되도록 각각의 혈청형 다당체 용액을 준비하였다. 물리적 방법을 이용하여 혈청형 1, 4, 5, 7F, 11A, 14, 19A, 19F, 22F, 23F는 목표 분자량 조절을 생략하거나, 5000 내지 15000psi 압력에서 1 내지 3회 목표 분자량 조절 공정을 수행하였다.

혈청형 6A, 6B, 9V, 18C는 동일한 방법으로 15000 내지 25000psi 압력에서 1 내지 3회 목표 분자량 조절 공정을 수행하였다.

혈청형 3은 동일한 방법으로 25000 내지 30000psi 압력에서 1 내지 3회 목표 분자량 조절 공정을 수행하였다.

각각 혈청형의 다당체 분자량과 점도 공정 적용 정도를 판단하였고, SEC-MALS (공정 중 검사)를 이용하여 목표 분자량 범위에 도달함을 확인하였다.

하기 표 1은 혈청형별 저분자화 기기 조건 및 목표 분자량 범위를 나타낸 것이다.

혈청형	Microfluidizer		목표 분자량 (Mw, kDa)
	Pressure (psi)	Cycle
1	5000 ~ 15000	1 ~ 3	150 ~ 650
3	25000 ~ 35000	1 ~ 3	200 ~ 950
4	5000 ~ 15000	1 ~ 3	150 ~ 650
5	5000 ~ 15000	1 ~ 3	150 ~ 650
6A	15000 ~ 25000	1 ~ 3	150 ~ 450
6B	15000 ~ 25000	1 ~ 3	150 ~ 450
7F	5000 ~ 15000	1 ~ 3	150 ~ 650
9V	15000 ~ 25000	1 ~ 3	150 ~ 450
11A	5000 ~ 15000	1 ~ 3	150 ~ 450
14	5000 ~ 15000	1 ~ 3	150 ~ 650
18C	15000 ~ 25000	1 ~ 3	150 ~ 650
19A	5000 ~ 15000	1 ~ 3	50 ~ 400
19F	5000 ~ 15000	1 ~ 3	150 ~ 450
22F	5000 ~ 15000	1 ~ 3	150 ~ 450
23F	5000 ~ 15000	1 ~ 3	150 ~ 450

(2) 다당체 활성화

각 혈청형 다당체를 5.0 mg/mL 농도로 주사용수를 이용하여 희석하고 1-Cyano-4-dimethylaminopyridinium (50 mg/mL CDAP in Acetonitrile) 용액을 다당체 동일 무게비로 첨가하고 19 내지 25℃에서 1 내지 2분 동안 혼합하였다. Tri-ethylene amine (0.21 M TEA in WFI) 용액을 제조하여 CDAP와 동일 부피비로 첨가하고 19 내지 25℃에서 3 내지 4분 동안 혼합하였다. Adipic acid dihydrazide (0.5 M ADH in 0.5 M Sodium bicarbonate) 용액을 제조하여 CDAP와 동일 부피비로 첨가하고 19 내지 25℃에서 5 내지 8분 동안 혼합하였다. 완전히 혼합하면서, 모든 혈청형에 대해 4 내지 10℃에서 14 내지 16시간 동안 활성화반응을 진행시켰다.

(3) 활성화된 다당체의 완충용액 교환 및 농축

활성화반응이 완료된 혼합용액을 10 내지 30kDa MWCO 한외여과 필터에 주사용수로 공정액의 20 내지 40 배수 이상으로 활성화된 다당체의 완충용액 교환 및 농축을 실시한다. 투과액을 폐기하고 잔류액을 0.45㎛ 필터를 통해서 여과시켰다. 여과된 공정액에 대해 TNBSA를 이용하여 ADH (%)함량을 측정하고, RP-HPLC를 이용하여 잔류 DMAP량을 확인하였다 (공정 중 검사).

(4) CRM₁₉₇의 완충용액 교환 및 농축

접합반응에 사용되는 운반 단백질 CRM₁₉₇을 10 내지 30 kDa MWCO 한외여과 필터를 사용하여 완충용액인 0.1M MES (2-Morpholinoethanesulfonic acid monohydrate) Buffer (pH 6.0±0.2)로 CRM₁₉₇ 공정액의 10 내지 20 배수 이상으로 버퍼교환 및 농축을 실시하였다. 투과액을 폐기하고 잔류액을 0.45㎛ 필터를 통해서 여과시켰다.

0.1M MES Buffer 상태의 CRM₁₉₇은 0.1M MES Buffer를 사용하여 1.5 내지 4.0 mg/mL 농도가 되도록 희석하였다.

(5) 접합반응

활성화된 다당체를 2.5 내지 5.0 mg/mL 농도로 주사용수로 희석하였다. 접합반응을 개시하기 위해서 활성화된 다당체에 1M MES Buffer를 첨가하여 0.1M MES Buffer 상태의 활성화된 다당체를 제조하였다. 동일 무게비의 0.1M MES Buffer 상태의 CRM₁₉₇ 운반 단백질과 혼합하고, 활성화된 다당체와 전달 단백질이 각각 최종 혼합 용액에서 0.8 내지 2.0 mg/mL 농도가 되도록 0.1M MES Buffer를 첨가하였다.

활성화 다당체에 CRM₁₉₇을 첨가한 후 19 내지 25℃에서 3 내지 5분 동안 혼합하였다. 1-ethyl-3-(-3dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) coupling reagent 1 내지 5M 용액 (in 0.1M MES Buffer)을 제조하여 최종 EDAC 농도가 0.05 내지 0.25 M 이 되도록 첨가하였다. 혼합 후 19 내지 25℃에서 3 내지 5분 동안 혼합하였다. 2 내지 8℃에서 14 내지 16시간 동안 접합반응을 진행시켰다.

(6) 접합체 완충용액 교환

접합반응 완료된 혼합용액을 100kDa MWCO 한외여과 필터에 1X PBS (Sodium phosphate) Buffer (pH 7.2±0.5) 공정액의 20 내지 40 배수 이상으로 접합체의 완충용액 교환 및 농축을 실시하였다. 한외 여과가 완료된 공정액에 대해 SEC-HPLC를 통해 유리 단백 잔류 여부를 확인하였다(공정 중 검사).

최종 접합체는 1X PBS Buffer로 200 내지 600 ㎍/mL 농도가 되도록 희석하였고, 0.22㎛ 필터를 통해서 여과시켰다. 최종 접합체 원액은 2 내지 8 ℃에 냉장 보관하였다.

접합된 다당체와 단백질 (다당-단백) 함량은 anthrone assay (안트론) 분석법과 lowry assay 법을 통해 각각 분석하였다. 단백질과 미결합한 유리 다당은 DOC(Deoxycholic acid)로 다당-단백 접합체를 침전시킨 후 상등액 층의 유리 다당을 얻어 anthrone assay (안트론)을 통해 분석한 후 전체 당 대비 유리 다당의 비율(%)로 계산하였다.

15종 접합체 원액 시료를 분석한 결과, 혈청형별 유리 다당 함량 및 다당/단백 접합비를 나타낸 하기 표 2에서 볼 수 있듯이, 유리다당 비율은 모두 40% 이하, 다당체/CRM197 접합비율은 0.3~2.0 범위에 분포됨을 알 수 있었다.

혈청형	유리 다당 함량 (%)	다당/단백 접합 비
1	10 ~ 30 %	0.5 ~ 1.2
3	15 ~ 40 %	0.5 ~ 1.2
4	10 ~ 30 %	0.5 ~ 1.2
5	15 ~ 40 %	0.7 ~ 1.5
6A	10 ~ 30 %	0.5 ~ 1.2
6B	10 ~ 30 %	0.5 ~ 1.2
7F	15 ~ 40 %	0.5 ~ 1.2
9V	10 ~ 30 %	0.8 ~ 1.5
11A	10 ~ 30 %	0.5 ~ 1.2
14	15 ~ 40 %	0.8 ~ 1.5
18C	15 ~ 40 %	0.3 ~ 1.0
19A	15 ~ 40 %	0.5 ~ 1.2
19F	15 ~ 40 %	0.5 ~ 1.2
22F	10 ~ 30 %	0.5 ~ 1.2
23F	10 ~ 30 %	0.5 ~ 1.2

실시예 3 : 다가 폐렴구균 접합체 백신의 제제화

각 백신에 포함된 접합체의 용량은 부작용이 없고 면역반응을 유도하는 양으로 선택하였다. 이러한 양은 폐렴구균의 혈청형에 따라 달라질 수 있다. 동물실험 결과를 바탕으로 사람을 대상으로 한 백신 접종 용량을 결정할 수 있다.

벌크 당류 농도를 기준으로 하여 최종 벌크 농축액의 필요량을 계산하였다. 15종의 각 다당체를 농축액으로 혼합 한 후 알루미늄 포스페이트를 서서히 혼합하였다. 제제화된 벌크 제품을 2내지 8℃에서 보관하였다. 얻어진 백신 조성물은 총 0.5mL 중에 2.2ug의 각 다당체, 6B의 경우 4.4ug, CRM₁₉₇ 운반 단백질은 30~60ug, 0.125mg의 알루미늄 포스페이트 애주번트를 함유하였다.

시험예 1 : 다가 폐렴구균 접합체의 면역원성 평가

동물실험에는 Rabbit(New Zealand White)을 사용하였으며, 음성대조군으로 PBS, 양성대조군으로 Prevnar13®(R48621)을 사용하였다. 애주번트로 알루미늄 포스페이트를 사용하였으며 Prevnar13과 동일한 양으로 첨가하여 제작하였다.

Rabbit의 항원 주입량은 사람과 동일하기 500uL씩 사용하였고, 각 항원의 실제 사용된 다당체 양은 하기 표 3과 같았다.

Group	혈청형 및 항원량
양성대조군	1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F 각 2.2ug, 6B 4.4ug (13가 복합)
시험군	1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F, 11A, 22F 각 2.2ug, 6B 4.4ug (15가 복합)
단일군	1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 23F, 11A, 22F 각 2.2ug, 6B 4.4ug (각각 단일)

항원 주입 일정은 1차 주입 후 2주, 4주에 각각 boosting을 하고 항원 주입 전에 채혈을 하여 0, 2, 4, 6, 8 주의 혈청시료를 확보하였다.

1-1. 혈청형 특이적 IgG 농도 측정

항체 생성률을 indirect ELISA 방법으로 측정하였고, ATCC에서 판매하는 다당체 15종을standard로 하여 100ng/well의 농도로 각각 코팅하였으며, 6 weeks의 각 혈청은 Pneumococcal Cell Wall Polysaccharide(CWPS Multi)가 10ug/mL로 첨가된 희석 버퍼를 이용하여 1/200x에서 단계 희석하여 1/204800x까지 희석하여 측정하였다. 450nm에서 측정된 흡광도 값을 4차 방정식으로 도식하여 흡광도가 “1”이 되는 값의 희석 배수를 계산하여 ELISA unit으로 하였다.

양성대조군인 Prevnar 13과 15가 시험군을 비교하면, 전반적으로 시험군의 면역원성이 우수한 것으로 나타났고, 또한 새로 추가한 혈청인 11A와 22F의 면역원성도 잘 유도됨을 확인하였다 (하기 ELISA 항체 가를 나타낸 표4, 및 Rabbit 실험에 대한 면역원성 ELISA 결과를 나타낸 그래프인 도 1).

단일 혈청형으로만 주입한 단일군을 양성대조군 및 시험군과 비교하면, 양성대조군에 비해 모든 혈청형이 우수하였고, 시험군에 비해 혈청형 14, 23F를 제외하고 동등이상으로 나타났다.

13가 양성대조군과 15가 시험군이 단일군에 비해 비교적 낮게 나타난 것은 단지 여러 다당체들의 복합적인 면역작용에 의해 면역원성이 저하된 것으로 판단된다.

13가 양성대조군보다 전반적으로 높은 면역원성을 나타내는 15가 시험군의 면역원성 결과와 시험군에서 단일군보다 오히려 높은 면역원성을 나타내는 혈청형 14와 23F의 결과를 종합해 볼 때, 추가된 혈청형인 11A와 22F로 인한 나머지 13가 혈청형의 면역원성 저하가 나타나지 않는다는 점을 알 수 있었다 (도 1).

Serotype		ELISA unit
		양성대조군(13가)		시험군(15가)	단일군(Mono)
13 common serotypes	1	3051	8800	18174
	3	2310	5326	4920
	4	3500	5359	25000
	5	1968	4519	13490
	6A	3090	4777	18412
	6B	3000	9350	9000
	7F	19300	6744	76151
	9V	4196	6033	25825
	14	1538	7321	2582
	18C	6825	8205	30000
	19A	2324	9756	7767
	19F	889	9110	7586
	23F	489	7896	968
2 additional serotypes	11A	3	5928	4854
	22F	3	10536	5517

1-2. 기능적 면역원성 확인시험(OPA)

OPA assay로 혈청의 기능성 항체 가를 평가하였다. HL-60 cell을 분화시켜 0.8% DMF에서 72시간 배양하였다. 각 개별 혈청을 opsonization buffer(Ca²⁺와 Mg²⁺가 포함된 Hanks’ balanced salt solution[HBSS], 0.1% gelatin, 10% inactivated FBS)에 1:7의 비율로 희석하여 사용하였다. -80℃에 보관된 각 혈청형의 폐렴구균을 녹여서 혈청과 혼합 후 30분간 상온에서 700rpm으로 교반하며 섞어주었다.

분화된 HL-60 cell과 각 폐렴구균의 비율을 400:1로 하고 Baby rabbit complement를 12.5%로 섞어주었다. 37℃, 5% CO₂ 조건에서 shaking platform 700 rpm으로 45분간 반응한 후 1.5% THY agar plate에 접종하였다. 접종한 plate를 완전히 건조시킨 뒤, triphenyl tetrazolium chloride dye(TTC, 1mg/mL)가 포함된 0.75% THY agar를 부어주었다. 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. NICE software를 사용하여 폐렴구균의 colony를 계산하고 opsonic index는 Opsotiter3 프로그램을 사용하여 측정하였다.

Serotype		Pre- vaccination	Post vaccination			Fold-Rise*
			PBS	대조군	시험군	PBS	대조군	시험군
13 common serotypes	1	16	16	173	175	1	11	11
	3	16	16	86	130	1	5.4	8.1
	4	16	16	923	1653	1	58	103
	5	16	16	169	695	1	11	43
	6A	16	16	6689	2358	1	418	147
	6B	16	16	671	635	1	42	40
	7F	16	16	1436	341	1	90	21
	9V	16	16	574	240	1	36	15
	14	16	16	808	763	1	51	48
	18C	16	16	1028	614	1	64	38
	19A	16	16	2188	975	1	137	61
	19F	16	16	196	433	1	12	27
	23F	16	16	1200	1168	1	75	73
2 additional serotypes	11A	16	16	56	352	1	3.5	22
	22F	16	16	16	414	1	1	26

(Note: *Fold-Rise were between post vaccination and pre-vaccination)

상기 표 5(토끼에서 백신 투여 전, 후의 OPA Index 및 Fold-Rise) 및 도 2에서 나타난 바와 같이, 양성 대조군인 Prevnar 13과 시험군의 OPA titer를 비교하면 대부분의 혈청형이 Prevnar 13과 유사하였다. 또한, 새로 추가한 혈청인 11A와 22F의 면역원성도 잘 유도됨을 확인하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 다가 면역원성 조성물은 혈청형 11A 및 22F를 포함한 15개 폐렴구균 혈청형 유래의 협막 다당체를 포함함으로써, 우수한 혈청 IgG 역가와 기능적 항체 활성을 유도할 수 있다는 점을 알 수 있었고, 본 발명에 따른 다가 면역원성 조성물은 영유아, 소아, 및 성인의 폐렴구균에 의한 질환을 예방하는데 유용하게 사용될 수 있고, 특히 영아 기본접종에 적합한 백신에 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

1. 생리학적으로 허용되는 비히클, 및 15개의 상이한 다당체-운반 단백질 접합체를 포함하고,
   상기 각각의 다당체-운반단백질 접합체는 운반 단백질에 접합된 상이한 혈청형의 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 유래의 협막 다당체(capsular polysaccharide)를 포함하며,
   상기 협막 다당체가 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 11A, 14, 18C, 19A, 19F, 22F 및 23F로부터 제조되는 것인 다가 면역원성 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 다당체-운반 단백질 접합체는 하기 화학식 1로 표시되는 에틸렌글리콜 디하이드라자이드 또는 이의 유도체로 접합되는 다가 면역원성 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   (n은 1 내지 10의 정수이다)
   
3. 제1항에 있어서, 상기 운반 단백질이 CRM₁₉₇인 다가 면역원성 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 애쥬번트(adjuvant)를 더 포함하는 다가 면역원성 조성물.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 애쥬번트는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 설페이트, 및 알루미늄 하이록사이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 다가 면역원성 조성물.
   
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 다가 면역원성 조성물의 면역학적 유효량을 포함하는, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 협막 다당체(capsular polysaccharide) 접합체에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약학 조성물.
   
7. 제6항에 있어서, 상기 다가 면역원성 조성물이 2 내지 5 ㎍의 각 당류; 30 내지 60㎍의 CRM₁₉₇ 운반 단백질; 0.1 내지 0.3mg의 알루미늄 애쥬번트; 및 부형제로 염화나트륨을 함유하도록 제제화된 단일 0.5 mL 용량인 약학 조성물.

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