KR20230130153A - 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하는 조성물 및 그의 사용 방법 - Google Patents

스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하는 조성물 및 그의 사용 방법 Download PDF

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치트라난다 아베이구나와르다나
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Abstract

본 발명은 1종 초과의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하는 다가 면역원성 조성물이며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 본원에 정의된 바와 같은 것인 다가 면역원성 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 폴리사카라이드 단백질 접합체 중 적어도 하나는 비양성자성 용매를 포함하는 접합 반응에 의해 형성된다. 추가 실시양태에서, 각각의 폴리사카라이드 단백질 접합체는 비양성자성 용매를 포함하는 접합 반응에 의해 형성된다. 또한, 인간 환자에게 본 발명의 다가 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 인간 환자에서 보호성 면역 반응을 유도하는 방법이 제공된다. 다가 면역원성 조성물은 에스. 뉴모니아에 감염 및 에스. 뉴모니아에에 의해 유발되는 질환에 대한 보호를 제공하는데 유용하다. 본 발명의 조성물은 또한 폐렴구균성 질환의 예방을 위해 지시된 다가 백신으로 백신접종된 환자에 대한 보완적 보호를 제공하는 치료 요법의 일부로서 유용하다.

Description

스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하는 조성물 및 그의 사용 방법{COMPOSITIONS COMPRISING STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE POLYSACCHARIDE-PROTEIN CONJUGATES AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원에 대한 상호 참조
해당 없음
발명의 분야
본 발명은 별개의 폴리사카라이드-단백질 접합체를 갖는 다가 면역원성 조성물을 제공한다. 각각의 접합체는 담체 단백질, 바람직하게는 CRM197에 접합된 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae)의 상이한 혈청형으로부터 제조된 피막 폴리사카라이드로 이루어진다. 면역원성 조성물은 폐렴구균성 질환에 대한 넓은 적용범위를 제공한다.
스트렙토코쿠스 뉴모니아에는 그람-양성 박테리아이고, 영아 및 소아에서 침습성 박테리아 질환 (예컨대 폐렴, 박테리아혈증, 수막염 및 중이염)의 가장 흔한 원인이다. 폐렴구균은 혈청형 특이성을 부여하는 화학적으로 연결된 폴리사카라이드로 피막화되어 있다. 폐렴구균의 90종 초과의 공지된 혈청형이 존재하고, 피막이 보체로부터 박테리아의 내부 표면을 보호할 뿐만 아니라 그 자체가 불량하게 면역원성이기 때문에 피막은 폐렴구균에 대한 주요 병독성 결정인자이다. 폴리사카라이드는 T-세포 독립적 항원이고, 대부분의 경우에 T-세포와 상호작용하기 위해 MHC 분자 상에서 프로세싱되거나 제시될 수 없다. 그러나, 이들은 B 세포 상의 표면 수용체의 가교를 수반하는 대안적 메카니즘을 통해 면역계를 자극할 수 있다.
수년 동안 허가된 다가 폐렴구균 폴리사카라이드 백신은 성인, 특히 고령자 및 고위험자에서 폐렴구균성 질환을 예방하는데 가치있는 것으로 입증되었다. 그러나, 영아 및 소아는 미접합 폐렴구균 폴리사카라이드에 불량하게 반응한다. 그 당시 소아 및 영아에서 침습성 폐렴구균성 질환을 유발하는 7종의 가장 빈번하게 단리된 혈청형 (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F)을 함유하는 폐렴구균 접합체 백신인 프레브나르(Prevnar)®가 미국에서 2000년 2월에 처음 허가되었다. 미국에서 프레브나르®의 보편적인 사용 후에, 프레브나르®에 존재하는 혈청형으로 인한 아동에서의 침습성 폐렴구균성 질환은 유의하게 감소되었다. 문헌 [Centers for Disease Control and Prevention, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005, 54(36):893-7]을 참조한다. 그러나, 세계의 특정 지역에서는 프레브나르®에 의한 혈청형 적용범위에 한계가 있고, 미국에서는 특정 신생 혈청형 (예를 들어, 19A 등)에 관한 일부 증거가 있다. 문헌 [O'Brien et al., 2004, Am J Epidemiol 159:634-44; Whitney et al., 2003, N Engl J Med 348:1737-46; Kyaw et al., 2006, N Engl J Med 354:1455-63; Hicks et al., 2007, J Infect Dis 196:1346-54; Traore et al., 2009, Clin Infect Dis 48:S181-S189]을 참조한다.
미국 특허 출원 공개 번호 US 2006/0228380은 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F를 포함한 13가 폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체 백신을 기재한다. 중국 특허 출원 공개 번호 CN 101590224 A는 혈청형 1, 2, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9N, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F를 포함한 14가 폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체 백신을 기재한다.
다른 PCV는 PCV-15에 함유된 혈청형 중 7, 10, 11 또는 13을 포함하지만 (미국 공개 번호 2011/0195086), 일부 혈청형에 대해 면역 간섭이 관찰되었다 (예를 들어 GSK의 PCV-11에서 혈청형 3에 대해 보다 낮은 보호 및 화이자(Pfizer)의 PCV-13 (프레브나르® 13)에서 혈청형 6B에 대해 보다 낮은 반응률). 문헌 [Prymula et al., 2006, Lancet 367:740-48 및 Kieninger et al., Safety and Immunologic Non-inferiority of 13-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Compared to 7-valent Pneumococcal Conjugate Vaccine Given as a 4-Dose Series in Healthy Infants and Toddlers, presented at the 48th Annual ICAAC/ISDA 46th Annual Meeting, Washington DC, October 25-28, 2008]을 참조한다.
현재 다가 폐렴구균 백신은 백신에 존재하는 이러한 혈청형과 연관된 폐렴구균성 질환의 발생률을 감소시키는데 효과적이었다. 그러나, 현재 이용가능한 백신에 존재하지 않는 혈청형을 발현하는 폐렴구균의 유병률이 증가하고 있다. 따라서, 상이한 세트의 폐렴구균 혈청형에 대한 보호를 제공하고 현재 이용가능한 백신에 존재하지 않는 폐렴구균 혈청형에 대한 보완적 보호를 제공할 수 있는 추가의 폐렴구균 백신 조성물에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하는 다가 면역원성 조성물이며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 본원에 정의된 바와 같은 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형 세트를 포함한다:
a) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B;
b) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20; 및
c) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20.
본 발명의 추가의 특정한 실시양태에서, 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형 세트를 포함한다:
a) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B;
b) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A; 및
c) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A.
본 발명의 추가의 특정한 실시양태에서, 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형 세트를 포함한다:
a) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B;
b) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20B; 및
c) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20B.
일부 실시양태에서, a), b) 또는 c)에 열거된 에스. 뉴모니아에의 혈청형 세트는 혈청형 6C, 혈청형 6A, 또는 혈청형 6A 및 6B를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리사카라이드 단백질 접합체 중 적어도 하나는 비양성자성 용매, 예를 들어 디메틸술폭시드 (DMSO)를 포함하는 접합 반응에 의해 형성된다. 구체적 실시양태에서, 각각의 폴리사카라이드 단백질 접합체는 비양성자성 용매를 포함하는 접합 반응에 의해 형성된다. 본원에 제시된 바와 같이, 폴리사카라이드-단백질 접합체의 환원성 아미노화 동안 용매로서의 DMSO의 사용은 수성 조건 하에 제조된 동일한 접합체에 비해 상기 혈청형에 대한 예상외로 우수한 안정성 및 증진된 면역원성을 가져온다.
또한, 인간 환자에게 본 발명의 다가 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 인간 환자에서 보호성 면역 반응을 유도하는 방법이 제공된다. 본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 환자는 이전에 다가 폐렴구균 백신으로 치료되었다.
본 발명의 다가 면역원성 조성물은 상이한 보완적 폐렴구균 백신을 사용한 치료 요법의 일부로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 임의의 순서로, 인간 환자에게 본 발명의 다가 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 환자에게 다가 폐렴구균 백신을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 인간 환자에서 보호성 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 다가 폐렴구균 백신은 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체로 구성되고, 여기서 접합체는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 다가 폐렴구균 백신은 미접합 피막 폴리사카라이드로 구성된다.
또한, 비양성자성 용매 중에서의 접합 반응을 이용하여 혈청형 8 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제조하는 방법이며, 여기서 접합 반응은 시아노보로히드라이드를 사용하지는 않는 것인 방법이 제공된다.
본 발명은 또한 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하는 다가 면역원성 조성물이며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 선택 혈청형은 다른 선택 혈청형에 대한 교차-반응성을 제공하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
도 1은 50℃에서 산화중수소 (D2O) 중에서 에스. 뉴모니아 혈청형 6C로부터의 피막 폴리사카라이드의 600 MHz 1차원 1H NMR 스펙트럼을 도시한다. 내부 표준 (DMSO 및 DSS-d6) 및 잔류수 (HOD)로부터 발생하는 신호가 표시되어 있다. *로 표시된 부차 신호는 에스. 뉴모니아 세포벽 잔기, 예컨대 C-폴리사카라이드 및/또는 펩티드글리칸으로 인한 것이다.
도 2는 50℃에서 산화중수소 (D2O) 중에서 에스. 뉴모니아 혈청형 15A로부터의 피막 폴리사카라이드의 600 MHz 1차원 1H NMR 스펙트럼을 도시한다. 내부 표준 (DMSO 및 DSS-d6) 및 잔류수 (HOD)로부터 발생하는 신호가 표시되어 있다. *로 표시된 부차 신호는 에스. 뉴모니아 세포벽 잔기, 예컨대 C-폴리사카라이드 및/또는 펩티드글리칸으로 인한 것이다.
도 3은 50℃에서 산화중수소 (D2O) 중에서 에스. 뉴모니아 혈청형 탈-O-아세틸화된 15B로부터의 피막 폴리사카라이드의 600 MHz 1차원 1H NMR 스펙트럼을 도시한다. 내부 표준 (DMSO 및 DSS-d6) 및 잔류수 (HOD)로부터 발생하는 신호가 표시되어 있다. *로 표시된 부차 신호는 에스. 뉴모니아 세포벽 잔기, 예컨대 C-폴리사카라이드 및/또는 펩티드글리칸으로 인한 것이다.
도 4는 50℃에서 산화중수소 (D2O) 중에서 에스. 뉴모니아 혈청형 35B로부터의 피막 폴리사카라이드의 600 MHz 1차원 1H NMR 스펙트럼을 도시한다. 내부 표준 (DMSO 및 DSS-d6) 및 잔류수 (HOD)로부터 발생하는 신호가 표시되어 있다. *로 표시된 부차 신호는 에스. 뉴모니아 세포벽 잔기, 예컨대 C-폴리사카라이드 및/또는 펩티드글리칸으로 인한 것이다.
도 5는 에스. 뉴모니아 혈청형 6C의 혈청형 확인에 유용한 1H NMR 동일성 영역을 도시한다. 각각의 모노사카라이드 잔기로부터의 반복 단위의 각각의 아노머 양성자의 신호 위치가 표시되어 있다.
도 6은 에스. 뉴모니아 혈청형 15A의 혈청형 확인에 유용한 1H NMR 동일성 영역을 도시한다. 각각의 모노사카라이드 잔기로부터의 반복 단위의 각각의 아노머 양성자의 신호 위치가 표시되어 있다.
도 7은 에스. 뉴모니아 혈청형 탈-O-아세틸화된 15B의 혈청형 확인에 유용한 1H NMR 동일성 영역을 도시한다. 각각의 모노사카라이드 잔기로부터의 각각의 아노머 양성자의 신호 위치가 표시되어 있다.
도 8은 에스. 뉴모니아 혈청형 35B의 혈청형 확인에 유용한 1H NMR 동일성 영역을 도시한다. 각각의 모노사카라이드 잔기로부터의 반복 단위의 각각의 아노머 양성자의 신호 위치가 표시되어 있다.
도 9a-9c는 에스. 뉴모니아 혈청형 15B로부터의 천연 피막 폴리사카라이드 (도 9a), 에스. 뉴모니아 혈청형 15B로부터의 탈-O-아세틸화된 피막 폴리사카라이드 (도 9b) 및 에스. 뉴모니아 혈청형 15C로부터의 피막 폴리사카라이드 (도 9c)의 600 MHz 1차원 1H NMR 스펙트럼를 도시한다. 50℃에서 산화중수소 (D2O) 중에서 스펙트럼을 획득하였다. 내부 표준물 (DMSO 및 DSS-d6) 및 잔류수 (HOD)로부터 발생하는 신호가 표시되어 있다. *로 표시된 신호는 에스. 뉴모니아 세포벽 잔기, 예컨대 C-폴리사카라이드 및/또는 펩티드글리칸으로 인한 것이다.
도 10a-10c는 에스. 뉴모니아 혈청형 15B로부터의 천연 피막 폴리사카라이드 (도 10a), 에스. 뉴모니아 혈청형 15B로부터의 탈-O-아세틸화된 피막 폴리사카라이드 (도 10b) 및 에스. 뉴모니아 혈청형 15C로부터의 피막 폴리사카라이드 (도 10c)의 600 MHz 1차원 1H NMR 스펙트럼의 아노머 영역을 보여준다. 도 10d-10f는 에스. 뉴모니아 혈청형 15B로부터의 천연 피막 폴리사카라이드 (도 10d), 에스. 뉴모니아 혈청형 15B로부터의 탈-O-아세틸화된 피막 폴리사카라이드 (도 10e) 및 에스. 뉴모니아 혈청형 15C로부터의 피막 폴리사카라이드 (도 10f)의 O-아세틸 및 N-아세틸 메틸 신호가 존재하는 스펙트럼의 영역을 보여준다.
도 11은 HPSEC-UV/MALS/RI를 사용하여 PCV16 (0.128 mg/mL) 또는 PCV21 (0.084 mg/mL 또는 0.169 mg/mL) 약물 제품의 폴리사카라이드 농도에 대한 시간 및 온도 (4℃에서 12주까지-마름모형, 25℃에서 4주까지-정사각형, 37℃에서 4주까지-삼각형)의 영향을 보여준다 (실시예 39 참조).
도 12는 사전-충전된 시린지에 분배된 PCV16 (0.128 mg/mL) 또는 PCV21 (0.084 mg/mL 또는 0.169 mg/mL) 약물 제품의 폴리사카라이드 농도에 대한 수평 회전 교반 및 온도 (4℃, 25℃ 또는 37℃에서 1주)의 영향을 보여준다 (실시예 39 참조).
도 13은 HPSEC-UV/MALS/RI를 사용하여 PCV16 (0.128 mg/mL) 또는 PCV21 (0.084 mg/mL 또는 0.169 mg/mL) 약물 제품의 평균 분자량 (Mw 및 Mn)에 대한 시간 경과에 따른 PS 농도 및 온도 (4℃, 25℃ 또는 37℃에서 4주까지)의 영향을 보여준다.
도 14a 및 14b는 280 nm에서의 여기 파장에 의한 고유 단백질 형광 분광분석법을 사용하여 a) 양성자성 용매 (모두 수성 접합을 사용하여 제제화된 PCV15) 또는 b) 비양성자성 용매 (0.064 mg/mL PnPs로 모두 DMSO 접합을 사용하여 제제화된 PCV16) 중에서 접합된 약물 물질로 제조된 폐렴구균 접합체 백신 (PCV15 또는 PCV16)의 안정성에 대한 시간 및 온도 (4℃ 또는 37℃에서 1주까지)의 영향을 보여준다 (실시예 40).
도 15는 CRM197에 접합되고 알루미늄 포스페이트 아주반트 (APA)와 함께 제제화된 에스. 뉴모니아에 1가 혈청형으로 면역화된 토끼에 대한 ELISA IgG 항체 희석 역가 (투여 2 후)를 보여준다. 기호는 개별 역가를 나타내고, 오차 막대는 기하 평균 역가 (GMT)의 95% 신뢰 구간 (CI)을 나타낸다.
도 16은 CRM197에 접합되고 알루미늄 포스페이트 아주반트 (APA)와 함께 제제화된 에스. 뉴모니아에 1가 혈청형으로 면역화된 토끼에 대한 혈청형 특이적 OPA 희석 역가 (투여 2 후)를 제공한다. 기호는 개별 역가를 나타내고, 오차 막대는 기하 평균 역가 (GMT)의 95% 신뢰 구간 (CI)을 나타낸다.
도 17은 에스. 뉴모니아에 혈청형 15 1가 접합체로 면역화된 토끼에 대한 ELISA IgG 항체 희석 역가 (투여 2 후)를 제공한다. X-축은 토끼를 면역화시키는데 사용된 백신을 나타낸다. 파선은 코팅 항원으로서 개별 폐렴구균 폴리사카라이드를 사용하는 3종의 개별 ELISA 검정을 구분한다. 기호는 개별 역가를 나타내고, 오차 막대는 기하 평균 역가 (GMT)의 95% 신뢰 구간 (CI)을 나타낸다.
도 18은 에스. 뉴모니아에 혈청형 15 1가 접합체로 면역화된 토끼에 대한 혈청형 특이적 OPA 희석 역가 (면역전, 투여 1 후 (PD1, 풀링) 및 투여 2 후 (PD2))를 보여준다. X-축은 토끼를 면역화시키는데 사용된 백신을 나타낸다. 파선은 개별 에스. 뉴모니아에 박테리아 균주를 사용하는 3종의 OPA 검정을 구분한다. 기호는 개별 역가를 나타내고, 오차 막대는 기하 평균 역가 (GMT)의 95% 신뢰 구간 (CI)을 나타낸다.
도 19a는 4, 2, 1, 0.4, 0.08 또는 0.016 μg/용량의 PCV21을 사용한 백신접종 후 NZWR (군당 5마리)에서의 PD1 항체 반응의 비교를 제공한다. 기호는 PD1 기하 평균 역가 (GMT) 비 (2 μg/용량 군 vs. 다른 용량 군)를 나타내고, 오차 막대는 95% 신뢰 구간 (CI)을 나타낸다. 도 19b는 도 19a에서 하위 95% 신뢰 경계가 1.0 초과인 경우 담회색으로 음영처리된 GMT 비 및 상위 95% 신뢰 경계가 1.0 미만인 경우 진회색으로 음영처리된 GMT 비에 상응하는 PCV21 용량 비교 PD1 GMT 비 (95% CI)를 제공한다. 교차 보호를 평가하기 위해 혈청형 15B 데이터가 포함된다.
도 20a는 4, 2, 1, 0.4, 0.08 또는 0.016 μg/용량의 PCV21을 사용한 백신접종 후 NZWR (군당 5마리)에서의 PD2 항체 반응의 비교를 제공한다. 기호는 PD2 GMT 비 (2 μg/용량 군 vs. 다른 용량 군)를 나타내고, 오차 막대는 95% CI를 나타낸다. 도 20b는 도 20a에서 하위 95% 신뢰 경계가 1.0 초과인 경우 담회색으로 음영처리된 GMT 비에 상응하는 PCV21 용량 비교 PD2 GMT 비 (95% 신뢰 구간)를 제공한다. 교차 보호를 평가하기 위해 혈청형 15B 데이터가 포함된다.
도 21a는 PCV21 (2μg/PnPs)로 면역화된 토끼에 대한 혈청형 특이적 PD1 OPA 희석 역가를 보여준다. 기호는 개별 역가를 나타내고, 오차 막대는 기하 평균 역가 (GMT)의 95% 신뢰 구간 (CI)을 나타낸다. * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001. 도 21b는 PCV21 (2μg/PnPs)로 면역화된 토끼에 대한 혈청형 특이적 PD2 OPA 희석 역가를 보여준다. 기호는 개별 역가를 나타내고, 오차 막대는 기하 평균 역가 (GMT)의 95% 신뢰 구간 (CI)을 나타낸다, **** p<0.0001. 교차 보호를 평가하기 위해 혈청형 15B 데이터가 포함된다.
도 22a-c는 280 nm에서의 여기 파장에 의한 고유 단백질 형광 분광분석법을 사용하여, 모두 수성 용매 또는 DMSO 용매 중에서 접합된 약물 물질로 제조된 3종의 폐렴구균 접합체 백신 (PCV1, PCV7 및 PCV14)의 안정성에 대한 시간 및 온도 (즉 4℃에서 7일, 37℃에서 1일 또는 37℃에서 7일)의 영향을 보여준다. 도 22d는 280 nm에서의 여기 파장에 의한 고유 단백질 형광 분광분석법을 사용하여, 모두 DMSO 용매 중에서 접합된 약물 물질로 제조된 21가 폐렴구균 접합체 백신 (0.084 mg/mL PnPs의 PCV21)의 안정성에 대한 시간 및 온도 (즉 4℃ 또는 37℃에서 7일)의 영향을 보여준다.
도 23은 0.084 mg/mL PnPs로 PS-20 (0%, 0.025%, 0.05%, 0.1%, 0.15% 또는 0.2%; 모두 w/v PS-20)과 함께 제제화된 6종의 PCV21 폐렴구균 접합체 백신 약물 제품의 나노입자 추적 분석 (NTA)에 의한 분석시 입자 크기 분포에 대한 온도 (4℃ 또는 37℃에서 7일) 및 4℃에서의 교반의 영향을 보여준다.
도 24는 HPSEC/UV/MALS/RI 검정에 의해 분석시 3종의 PCV21 약물 제품 평균 분자량에 대한 온도 (4℃ 및 37℃) 및 교반의 영향을 보여준다. 3종의 PCV21 폐렴구균 접합체 백신 약물 제품을 0.084 mg/mL PnPs로 상이한 농도의 PS-20 (0.05%, 0.1% 및 0.15% w/v)과 함께 제제화하였다.
도 25는 PCV21 면역화된 마우스가 에스. 뉴모니아에 24F 기관내 챌린지로부터 보호된다는 것을 보여준다.
도 26a-b는 아주반트가 첨가되지 않은 PCV21 또는 APA와 함께 제제화된 PCV21에 의해 면역화된 토끼에 대한 ECL에 의해 결정시 면역전 (풀링됨), PD1 (풀링됨) 및 PD2 IgG 항체 희석 역가를 보여준다. 오차 막대는 기하 평균 역가 (GMT)의 95% 신뢰 구간 (CI)을 나타낸다. 교차 보호를 평가하기 위해 혈청형 15B 데이터가 포함된다.
도 27a-c는 아주반트가 첨가되지 않은 PCV8, 아주반트가 첨가되지 않은 PCV16 및 APA를 갖는 PCV31에 의해 면역화된 토끼에 대한 ECL에 의해 결정시 면역전 (풀링됨), PD1 (풀링됨) 및 PD2 IgG 항체 희석 역가를 보여준다. 오차 막대는 기하 평균 역가 (GMT)의 95% 신뢰 구간 (CI)을 나타낸다. 교차 보호를 평가하기 위해 혈청형 15B 데이터가 포함된다.
도 28은 APA를 갖거나 또는 갖지 않는 PCV21에 의한 백신접종 후 NZWR (군당 5마리)에서의 PD2 ECL 항체 반응의 비교를 보여준다. 기호는 PD2 GMT 비를 나타내며, 오차 막대는 95% CI를 나타낸다. 교차 보호를 평가하기 위해 혈청형 15B 데이터가 포함된다.
도 29는 PCV21, PCV8 또는 PCV16에 의한 백신접종 후 공통 혈청형 및 교차 보호된 혈청형 15B에 대한 NZWR (군당 5마리)에서의 PD2 ECL 항체 반응의 비교를 보여준다. 기호는 PD2 ECL GMT 비를 나타내며, 오차 막대는 95% CI를 나타낸다.
도 30은 PCV21/APA 또는 PCV31/APA에 의한 백신접종 후 공통 혈청형 및 교차 보호된 혈청형 15B에 대한 NZWR (군당 5마리)에서의 PD2 ECL 항체 반응의 비교를 보여준다. 기호는 PD2 ECL GMT 비를 나타내며, 오차 막대는 95% CI를 나타낸다.
도 31a-d는 PCV로 면역화된 토끼에 대한 혈청형 특이적 면역전 (풀링됨) (a, b) 및 PD2 (c, d) OPA 희석 역가를 보여준다. 오차 막대는 GMT의 95% CI를 나타낸다. PCV21을 통계적 비교에 대한 벤치마크로서 사용하였다, * p<0.05. 도 a 및 c는 평가된 모든 PCV에서의 8종의 공통 혈청형 (6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B) 및 PCV16, PCV21 및 PCV31에서의 추가의 8종의 공통 혈청형 (8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20B)에 대한 데이터를 보여준다. 도 b 및 d는 도 a 및 c에 포함되지 않은 추가의 16종의 혈청형에 대한 데이터를 보여준다. 이들 중 5종은 또한 PCV21 및 PCV31에서의 공통 혈청형이고 (3, 7F, 19A, 22F, 33F), 10종의 혈청형은 PCV31에만 독점적으로 함유된다 (1, 4, 5, 6A, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F). 교차 보호를 평가하기 위해 혈청형 15B 데이터가 포함된다.
도 32는 PCV21로 면역화된 성체 레서스 마카크 (n=8)에 대한 ECL에 의해 결정시 면역전, PD1, PD2 및 PD3 IgG 항체 희석 역가를 보여준다. 오차 막대는 GMT의 95% CI를 나타낸다. 교차 보호를 평가하기 위해 혈청형 15B 데이터가 포함된다.
도 33은 PCV21 면역화된 성체 레서스 마카크 (n=8)의 면역전, PD1 (풀링) 및 PD3 OPA 희석 역가를 보여준다. 오차 막대는 GMT의 95% CI를 나타낸다. 교차 보호를 평가하기 위해 혈청형 15B 데이터가 포함된다.
도 34는 PCV21로 면역화된 성체 레서스 마카크에 대한, PCV21 백신에 함유되지 않은 4종의 혈청형에 대한 면역전 및 PD3 (제70일) OPA 역가를 보여준다.
도 35는 APA를 갖거나 또는 갖지 않는 PCV21에 의한 백신접종 후 성체 레서스 마카크 (군당 5마리)에서의 PD1 ECL 항체 반응의 비교를 보여준다. 기호는 PD1 ECL GMT 비 (PCV21 vs. PCV21/APA)를 나타내며, 오차 막대는 95% CI를 나타낸다. 교차 보호를 평가하기 위해 혈청형 15B 데이터가 포함된다.
도 36은 PCV15 또는 프레브나르13과 비교하여 PCV21에 의한 백신접종 후 성체 레서스 마카크 (군당 2-5마리)에서의 혈청형 3, 7F, 19A, 22F 및 33F에 대한 PD1 IgG 항체 반응을 보여준다. 기호는 PD1 ECL GMT 비를 나타내며, 오차 막대는 95% CI를 나타낸다.
도 37은 6A-CRM197 (a) 또는 6B-CRM197 (b) 1가 약물 제품으로 면역화된 토끼에 대한 6A, 6B 및 6C ((면역전 및 PD1, 풀링됨) 및 PD2)에 대한 ELISA IgG 항체 희석 역가를 보여준다. 막대는 기하 평균 역가 (GMT)를 나타내고, 오차 막대는 GMT의 95% 신뢰 구간 (CI)을 나타낸다.
도 38은 6A-CRM197 (a) 또는 6B-CRM197 (b) 1가 약물 제품으로 면역화된 토끼에 대한 6A, 6B 및 6C ((면역전 및 PD1 풀링됨) 및 PD2)에 대한 혈청형 특이적 OPA 희석 역가를 보여준다. 막대는 기하 평균 역가 (GMT)를 나타내고, 오차 막대는 GMT의 95% 신뢰 구간 (CI)을 나타낸다.
도 39는 20A-CRM197/APA (a) 또는 PCV21 (b)로 면역화된 토끼에 대한 20A 및 20B (면역전 (풀링됨), PD1 및 PD2)에 대한 혈청형 특이적 OPA 희석 역가를 보여준다. 막대는 기하 평균 역가 (GMT)를 나타내고, 오차 막대는 GMT의 95% 신뢰 구간 (CI)을 나타낸다.
본 발명은 폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체를 포함하는 다가 면역원성 조성물을 제공하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 본원에 정의된 바와 같다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 (a) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B; (b) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20; 및 (c) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20으로 이루어진 군으로부터 선택된 폐렴구균 혈청형 세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역원성 조성물은 (a) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B; (b) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20B; 및 (c) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20B로 이루어진 군으로부터 선택된 폐렴구균 혈청형 세트를 포함한다. 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 (a) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B; (b) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A; 및 (c) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A로 이루어진 군으로부터 선택된 폐렴구균 혈청형 세트를 포함한다. 추가 실시양태에서, 면역원성 조성물은 (i) 혈청형 6A; (ii) 혈청형 6A 및 6B; 또는 (iii) 혈청형 6C를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 본 발명은 다수의 폐렴구균 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 혈청형 3, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 19A, 20A, 22F, 23A, 23B, 24F, 31, 33F 및 35B를 포함한다. 상기 조성물은 토끼에서 면역원성인 것으로 밝혀졌고, 시험된 모든 용량에서 백신-유형 박테리아 균주를 사멸시키는 기능적 항체를 생성하였다 (실시예 43). 또 다른 특정한 실시양태에서, 본 발명은 다수의 폐렴구균 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 혈청형 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20, 6A, 15A, 15C, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B를 포함한다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 본 발명은 다수의 폐렴구균 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 혈청형 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20B, 6A, 15A, 15C, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B를 포함한다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 본 발명은 다수의 폐렴구균 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 혈청형 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 15A, 15C, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B를 포함한다.
본 발명의 다가 면역원성 조성물은 백신-유형 에스. 뉴모니아에 혈청형에 대해 환자를 면역화시키는데 유용하고, 상이한 보완적 폐렴구균 백신(들)을 사용한 치료 요법의 일부로서 유용하다. 따라서, 본 발명은 임의의 순서로, 인간 환자에게 본 발명의 다가 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 환자에게 다가 폐렴구균 백신을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 인간 환자에서 보호성 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 다가 면역원성 조성물은 상이한 다가 폐렴구균 백신으로 이전에 면역화된 환자에게 투여된다.
본 발명의 실시양태에서, 적어도 1종의 폐렴구균 혈청형으로부터의 접합체는 비양성자성 용매, 예컨대 DMSO 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 제조된다. 추가 실시양태에서, 다가 면역원성 조성물은 비양성자성 용매 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 각각 제조된 폐렴구균 접합체를 포함한다. 비양성자성 용매 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 각각 제조된 약물 물질을 포함하는 PCV1, PCV7, PCV14, PCV16 및 PCV21 (하기 정의된 바와 같음) 약물 제품이 약물 제품 제제화시 탄수화물의 탈중합 또는 화학적 분해에 대해 안정하고 단백질의 응집에 대해 안정한 것으로 본원에 제시된다 (실시예 40 및 실시예 45 참조). DMSO 용매의 사용은 담체 단백질의 표면 상의 리신 잔기의 직접적 소비를 통해 단백질에 대한 폴리사카라이드의 공유 회합을 증진시킨다. 증가된 공유 회합은 DMSO 중에서 접합된 폴리사카라이드 항원을 포함하는 다가 면역원성 조성물의 폴리사카라이드 단백질 접합체의 안정성을 증가시키는 직접적 이익을 갖는다.
I. 정의 및 약어
본 명세서 및 첨부된 청구범위 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 하기 약어가 적용된다:
APA 알루미늄 포스페이트 아주반트
APC 항원 제시 세포
CI 신뢰 구간
DMSO 디메틸술폭시드
DS 폴리사카라이드-단백질 약물 물질
GMC 기하 평균 농도
GMT 기하 평균 역가
HPSEC 고성능 크기 배제 크로마토그래피
IM 근육내 또는 근육내로
LOS 리포-올리고사카라이드
LPS 리포폴리사카라이드
MALS 다중-각도 광 산란
MBC 1가 벌크 접합체
MOPA 멀티플렉스화 옵소닌식세포 검정
MW 분자량
NMWCO 공칭 분자량 컷오프
NZWR 뉴질랜드 화이트 토끼
OPA 옵소닌식세포작용 검정
PCV 폐렴구균 접합체 백신
PD1 투여 1 후
PD2 투여 2 후
PnPs 폐렴구균 폴리사카라이드
Ps 폴리사카라이드
PS-20 폴리소르베이트-20
RI 굴절률
UV 자외선
w/v 부피당 중량
본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있도록 하기 위해, 특정 기술 과학 용어가 하기에 구체적으로 정의된다. 본 명세서의 다른 곳에서 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 다른 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야에서의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는, 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 복수 지시대상을 포함한다.
"또는"에 대한 언급은, 문맥이 달리 나타낸 가능성 중 하나를 지시하지 않는 한, 어느 하나 또는 둘 다의 가능성을 나타낸다. 일부 경우에, "및/또는"은 어느 하나 또는 둘 다의 가능성을 강조하는데 사용되었다.
용어 "수성 용매" 또는 "수성 조건"은 접합, 예컨대 환원성 아미노화와 함께 사용되는 경우에 접합 반응을 위한 용매로서 물의 사용을 지칭한다. 물은 유기 용매가 존재하지 않는다는 것을 제외하고는 완충제 및 다른 성분을 함유할 수 있다.
용어 "비양성자성 용매", "DMSO 용매" 또는 "DMSO 조건"은 접합, 예컨대 환원성 아미노화와 함께 사용되는 경우에 접합 반응을 위한 용매로서 비양성자성 용매, 또는 비양성자성 용매들의 조합, (또는 적용가능한 경우 DMSO)의 사용을 지칭한다. 비양성자성 용매는, 예를 들어 1%, 2%, 5%, 10% 또는 20% 이하로 일부 물이 존재할 수 있다.
용어 "포함하다"는 본 발명의 면역원성 조성물과 함께 사용되는 경우에 임의의 다른 성분, 예컨대 아주반트 및 부형제의 포함, 또는 구체적으로 열거되지 않은 1종 이상의 폴리사카라이드-단백질 접합체의 첨가를 지칭한다. 용어 "이루어진"은 다가 폴리사카라이드-단백질 접합체 혼합물과 함께 사용되는 경우에 상기 특정한 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 갖고 상이한 혈청형으로부터의 다른 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체는 갖지 않는 혼합물을 지칭한다. "본질적으로 이루어지다" 및 변형어, 예컨대 "본질적으로 이루어진다" 또는 "본질적으로 이루어진"은 임의의 언급된 요소 또는 요소의 군의 포함, 및 명시된 투여 요법, 방법 또는 조성물의 기초 또는 신규 특성을 실질적으로 변화시키지 않는, 언급된 요소 이외에 유사한 또는 상이한 성질을 갖는 다른 요소의 임의적인 포함을 나타낸다.
본 발명의 조성물의 "유효량"은 후속 챌린지 동안 미생물, 예를 들어 에스. 뉴모니아에의 감염성의 가능성 또는 중증도를 유의하게 감소시키는 항체를 도출하는데 요구되는 용량을 지칭한다.
본원에 사용된 어구 "폐렴구균성 질환의 예방을 위해 지시된"은 백신 또는 면역원성 조성물이 1개 이상의 규제 기관, 예컨대 미국 식품 의약품국에 의해, 에스. 뉴모니아에의 임의의 혈청형에 의해 유발되는 1종 이상의 질환, 예컨대, 비제한적으로, 일반적으로 폐렴구균성 질환, 폐렴구균성 폐렴, 폐렴구균성 수막염, 폐렴구균성 박테리아혈증, 에스. 뉴모니아에에 의해 유발되는 침습성 질환, 및 에스. 뉴모니아에에 의해 유발되는 중이염의 예방을 위해 승인된다는 것을 의미한다.
"다가 폐렴구균 백신"은 에스. 뉴모니아에의 1종 초과의 혈청형에 의해 유발되는 질환 또는 병리학적 상태에 대한 능동 면역을 제공하는 1종 초과의 활성제 (예를 들어, 폐렴구균 피막 폴리사카라이드 또는 폐렴구균 폴리사카라이드 단백질 접합체)를 포함하는 제약 제제이다.
용어 "폴리사카라이드"는 "사카라이드", "올리고사카라이드", "폴리사카라이드", "리포사카라이드", "리포-올리고사카라이드 (LOS)", "리포폴리사카라이드 (LPS)", "글리코실레이트", "당접합체" 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 면역학적 및 박테리아 백신 분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 항원성 사카라이드 요소 (또는 항원성 단위)를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 "PCV1"은 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 3인 (실시예 38 및 45에 예시된 바와 같음), 1종의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하는 1가 폐렴구균 접합체 백신을 지칭한다. 구체적 실시양태에서, 담체 단백질은 CRM197이다.
본원에 사용된 "PCV7"은 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 각각 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 3, 8, 9N, 11A, 19A, 15A 및 10A인, 7종의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하는 7가 폐렴구균 접합체 백신을 지칭한다. 구체적 실시양태에서, 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체 중 1종 이상의 담체 단백질은 CRM197이다. 추가 실시양태에서, 각각의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체의 담체 단백질은 CRM197이다.
본원에 사용된 "PCV8"은 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 각각 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B인, 8종의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하는 8가 폐렴구균 접합체 백신을 지칭한다. 구체적 실시양태에서, 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체 중 1종 이상의 담체 단백질은 CRM197이다. 추가 실시양태에서, 각각의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체의 담체 단백질은 CRM197이다.
본원에 사용된 "PCV14"는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 각각 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 3, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 16F, 17F, 19A, 20, 22F 및 33F인, 14종의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하는 14가 폐렴구균 접합체 백신을 지칭한다. 구체적 실시양태에서, 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체 중 1종 이상의 담체 단백질은 CRM197이다. 추가 실시양태에서, 각각의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체의 담체 단백질은 CRM197이다.
본원에 사용된 "PCV15"는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 각각 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F인, 15종의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하는 15가 폐렴구균 접합체 백신을 지칭한다. 구체적 실시양태에서, 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체 중 1종 이상의 담체 단백질은 CRM197이다. 추가 실시양태에서, 각각의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체의 담체 단백질은 CRM197이다.
본원에 사용된 "PCV16"은 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 각각 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 6C, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 16F, 17F, 20A, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B, 및 하기 혈청군 15 혈청형: 15B, 15C 또는 탈-O-아세틸화된-15B 중 적어도 1종인, 16종의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하는 16가 폐렴구균 접합체 백신을 지칭한다. 특정한 실시양태에서, 혈청군 15 혈청형은 혈청형 15C 또는 탈-O-아세틸화된 15B이다. 본원에 제시된 바와 같이 (하기 실시예 3 참조), 탈-O-아세틸화된 혈청형 15B 폐렴구균 폴리사카라이드는 혈청형 15C 폐렴구균 폴리사카라이드와 동등하고 동일한 NMR 스펙트럼을 갖는다. 구체적 실시양태에서, 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체 중 1종 이상의 담체 단백질은 CRM197이다. 추가 실시양태에서, 각각의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체의 담체 단백질은 CRM197이다.
본원에 사용된 "PCV21"은 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 각각 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 3, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 16F, 17F, 19A, 20A, 22F, 23A, 23B, 24F, 31, 33F 및 35B, 및 하기 혈청군 15 혈청형: 15B, 15C 또는 탈-O-아세틸화된-15B 중 적어도 1종인, 21종의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하는 21가 폐렴구균 접합체 백신을 지칭한다. 특정한 실시양태에서, 혈청군 15 혈청형은 혈청형 15C 또는 탈-O-아세틸화된 15B이다. 구체적 실시양태에서, 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체 중 1종 이상의 담체 단백질은 CRM197이다. 추가 실시양태에서, 각각의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체의 담체 단백질은 CRM197이다.
에스. 뉴모니아에 혈청형 20A 및 20B는 2012년에 유전자 분석을 통해 혈청군 20 내에서 확인되었다 (Calix, J.J. et al., J. Biol. Chem. (2012) 287(33): 27885-27894). 문헌 [Calix J.J., et al.]에 의해 논의된 바와 같이, 통상적인 혈청형결정 방법 및 상업적으로 입수가능한 항체는 이전에 이들 2종의 혈청형을 구별할 수 없었고, 혈청형 20A 및 20B에 대한 혈청형결정 노력에 관한 정보는 현재 제한적이다. 추가로, 혈청군 20에 의해 유발되는 확인된 질환 내에서 20A 또는 20B의 질환 유병률은 잘 이해되지 않는다. 이에 따라, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 에스. 뉴모니아에 백신 조성물에 이들 2종의 혈청형 (20A 및/또는 20B) 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함시키도록 선택할 수 있다. 하나의 혈청형 20 폴리사카라이드 항원을 함유하는 에스. 뉴모니아에 백신은 또 다른 것을 교차 보호할 수 있다는 것이 또한 가능하다 (예를 들어, 에스. 뉴모니아에 혈청형 20A의 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하고 혈청형 20B의 것은 포함하지 않는 백신이 에스. 뉴모니아에 혈청형 20B에 의한 감염에 대해 교차 보호할 수 있음). 따라서, 본원에 사용된 "혈청형 20"은 혈청형 20A 및/또는 혈청형 20B의 폴리사카라이드 단백질 접합체를 함유하는 조성물을 지칭할 수 있다.
"CpG-함유 뉴클레오티드", " CpG-함유 올리고뉴클레오티드", " CpG 올리고뉴클레오티드" 및 유사 용어는 비메틸화 CpG 모이어티를 함유하는 6-50개 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 분자를 지칭한다. 예를 들어, 문헌 [Wang et al., 2003, Vaccine 21:4297]을 참조한다. CpG-함유 올리고뉴클레오티드는 임의의 합성 뉴클레오시드간 연결, 변형된 염기 및/또는 변형된 당을 사용하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 정의된 바와 같은 "아주반트"는 본 발명의 면역원성 조성물의 면역원성을 증진시키는 역할을 하는 물질이다. 면역 아주반트는 단독으로 투여시 약하게 면역원성인 항원, 예를 들어 항체 역가 또는 세포-매개 면역 반응을 유도하지 않거나 약하게 유도하는 항원에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있고/거나, 항원에 대한 항체 역가를 증가시킬 수 있고/거나, 개체에서 면역 반응을 달성하는데 효과적인 항원의 용량을 낮출 수 있다. 따라서, 아주반트는 종종 면역 반응을 부스팅하기 위해 제공되고, 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
"환자" (대안적으로 본원에서 "대상체"로 지칭됨)는 에스. 뉴모니아에에 의해 감염될 수 있는 포유동물을 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, 환자는 인간이다. 환자는 예방적으로 또는 치료적으로 치료될 수 있다. 예방적 치료는 폐렴구균 감염 또는 그의 영향, 예를 들어 폐렴구균성 폐렴의 가능성 또는 중증도를 감소시키기에 충분한 보호성 면역을 제공한다. 치료적 치료는 에스. 뉴모니아에 감염 또는 그의 임상 영향의 중증도를 감소시키거나 재발을 예방하기 위해 수행될 수 있다. 예방적 치료는 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 다가 면역원성 조성물을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물은 일반 집단 또는 폐렴구균 감염의 위험이 증가된 사람, 예를 들어 고령자, 또는 고령자와 함께 살거나 고령자를 관리하는 자에게 투여될 수 있다.
"치료를 필요로 하는" 자는 에스. 뉴모니아에에 이전에 노출되었거나 그에 의해 감염된 자, 에스. 뉴모니아에에 대해 이전에 백신접종된 자, 뿐만 아니라 감염되기 쉬운 자 또는 감염 가능성의 감소가 요망되는 임의의 사람, 예를 들어 면역손상된 사람, 고령자, 소아, 성인 또는 건강한 개체를 포함한다.
"안정한" 다가 면역원성 조성물은 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 12개월 및/또는 24개월 동안 냉장 온도 (예를 들어, 2-8℃ 또는 4℃)에서 유의한 변화가 관찰되지 않는 조성물이다. 추가적으로, "안정한" 조성물은 1개월, 3개월, 6개월, 12개월 및/또는 24개월을 포함한 기간 동안 25℃ 및 37℃를 포함한 온도에서 목적하는 특색을 나타내는 것을 포함한다. 안정성에 대한 전형적인 허용가능한 기준은 하기와 같다: (a) 조성물 내의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체의 수 평균 분자량 (Mn), (b) 조성물 내의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체의 중량 평균 분자량 (Mw), (c) 조성물 내의 총 폴리사카라이드 농도, (d) 특정한 여기 파장, 예를 들어 280 나노미터에서 고유 단백질 형광 분광분석법을 사용하여 측정된 조성물의 방출 최대치, 및 (e) 특정한 여기 파장에서 고유 단백질 형광 분광분석법을 사용하여 측정된 조성물의 형광 강도 중 1가지 이상에 있어서 약 5%, 약 10%, 약 15% 또는 약 20% 이하의 가변성. 용어 "안정한"은 또한 다가 면역원성 조성물 내의 특정한 폐렴구균 접합체를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 사용에 있어서, 용어는 특정한 온도에서 시간에 걸쳐 목적하는 특성을 나타내는 접합체를 지칭하고, 이러한 특성은 언급된 시간 및 온도에 걸쳐 약 5%, 약 10%, 약 15% 또는 약 20% 이하로 변한다.
II. 다가 면역원성 조성물
본 발명은 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명의 다가 면역원성 조성물의 다양한 측면 및 실시양태가 하기 기재된다.
한 실시양태 (실시양태 E1)에서, 본 발명은 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 각각 포함하는 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 하기를 포함하거나, 하기로 이루어지거나 또는 하기로 본질적으로 이루어진 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다:
(1) 15A,
(2) 16F,
(3) (a) 23A 및 23B, (b) 23A 및 23F, (c) 23B 및 23F, (d) 23A, (e) 23B, 및 (f) 23F로부터 선택된 1종 이상의 혈청군 23 혈청형,
(4) 24F,
(5) 31, 및
(6) 35B.
실시양태 E1의 하위실시양태에서, 1종 이상의 혈청군 23 혈청형은 23A 및 23B이다 (즉, 다른 혈청군 23 혈청형은 존재하지 않음). 실시양태 E1의 추가 하위실시양태에서, 1종 이상의 혈청군 23 혈청형은 23A 및 23F이다. 실시양태 E1의 또 다른 하위실시양태에서, 1종 이상의 혈청군 23 혈청형은 23B 및 23F이다. 실시양태 E1의 또 다른 하위실시양태에서, 23A는 유일한 혈청군 23 혈청형이다. 실시양태 E1의 추가 하위실시양태에서, 23B는 유일한 혈청군 23 혈청형이다. 실시양태 E1의 추가 하위실시양태에서, 23F는 유일한 혈청군 23 혈청형이다.
제2 실시양태 (실시양태 E2)에서, 본 발명은 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 실시양태 E1 또는 실시양태 E1의 임의의 하위실시양태에 제시된 혈청형을 포함하고, 혈청형: (1) 6C, (2) 6A, 또는 (3) 6A 및 6B를 추가로 포함하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
실시양태 E2의 하위실시양태에서, 조성물은 혈청형 6C를 포함한다. 실시양태 E2의 추가 하위실시양태에서, 조성물은 혈청형 6A 및 6B를 포함하고, 혈청형 6C는 포함하지 않는다. 실시양태 E2의 또 다른 하위실시양태에서, 조성물은 혈청형 6A를 포함한다.
제3 실시양태 (실시양태 E3)에서, 본 발명은 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 실시양태 E1 또는 실시양태 E1의 임의의 하위실시양태, 또는 실시양태 E2 또는 실시양태 E2의 임의의 하위실시양태에 제시된 혈청형을 포함하고, 하기 혈청형을 추가로 포함하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다:
(1) 8,
(2) 9N,
(3) 11A
(4) 12F,
(5) 15B 또는 15C,
(6) 17F, 및
(7) 20A 및/또는 20B.
제4 실시양태 (실시양태 E4)에서, 본 발명은 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 임의의 실시양태 E1-E3 또는 그의 임의의 하위실시양태에 제시된 혈청형을 포함하고, 혈청형: 10A 또는 39를 추가로 포함하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
제5 실시양태 (실시양태 E5)에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에 혈청형은 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
제6 실시양태 (실시양태 E6)에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에 혈청형은 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
제7 실시양태 (실시양태 E7)에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에 혈청형은 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
제8 실시양태 (실시양태 E8)에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에 혈청형은 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
제9 실시양태 (실시양태 E9)에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에 혈청형은 임의의 실시양태 E1-E8 (또는 그의 임의의 하위실시양태)에 제시된 혈청형을 포함하고, 혈청형: 3, 7F 및 19A를 추가로 포함하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
제10 실시양태 (실시양태 E10)에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에 혈청형은 임의의 실시양태 E1-E9 (또는 그의 임의의 하위실시양태)에 제시된 혈청형을 포함하고, 혈청형 22F를 추가로 포함하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
제11 실시양태 (실시양태 E11)에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에 혈청형은 임의의 실시양태 E1-E10 (또는 그의 임의의 하위실시양태)에 제시된 혈청형을 포함하고, 혈청형 33F를 추가로 포함하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
제12 실시양태 (실시양태 E12)에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에 혈청형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 에스. 뉴모니아에 혈청형 세트를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다:
(1) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(2) 15A, 16F, 23F, 23B, 24F, 31 및 35B,
(3) 15A, 16F, 23A, 23F, 24F, 31 및 35B,
(4) 15A, 16F, 23A, 24F, 31 및 35B,
(5) 15A, 16F, 23B, 24F, 31 및 35B,
(6) 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(7) 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(8) 6C, 15A, 16F, 23F, 23B, 24F, 31 및 35B,
(9) 6C, 15A, 16F, 23A, 23F, 24F, 31 및 35B,
(10) 6C, 15A, 16F, 23A, 24F, 31 및 35B,
(11) 6C, 15A, 16F, 23B, 24F, 31 및 35B,
(12) 6C, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(13) 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(14) 6A, 15A, 16F, 23F, 23B, 24F, 31 및 35B,
(15) 6A, 15A, 16F, 23A, 23F, 24F, 31 및 35B,
(16) 6A, 15A, 16F, 23A, 24F, 31 및 35B,
(17) 6A, 15A, 16F, 23B, 24F, 31 및 35B,
(18) 6A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(19) 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(20) 6A, 6B, 15A, 16F, 23F, 23B, 24F, 31 및 35B,
(21) 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23F, 24F, 31 및 35B,
(22) 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 24F, 31 및 35B,
(23) 6A, 6B, 15A, 16F, 23B, 24F, 31 및 35B, 및
(24) 6A, 6B, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B.
제13 실시양태 (실시양태 E13)에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에 혈청형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 에스. 뉴모니아에 혈청형 세트를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다:
(1) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(2) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(3) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(4) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(5) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(6) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(7) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(8) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(9) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(10) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(11) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(12) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(13) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(14) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(15) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(16) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(17) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(18) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(19) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(20) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(21) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(22) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(23) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(24) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(25) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(26) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(27) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(28) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(29) 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(30) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(31) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B, 및
(32) 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B.
제13 실시양태 (실시양태 E13)는 에스. 뉴모니아에 혈청형 세트, 열 (1) 내지 (32)를 추가로 포함하며, 여기서 각각의 세트 내의 혈청형 20A가 혈청형 20 또는 혈청형 20B로 치환된다.
본 발명의 제14 실시양태에서 (실시양태 E14)에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 다수의 에스 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에 혈청형은 실시양태 E13에 제시된 혈청형 세트, 열 (17) 내지 (32) 중 임의의 것으로부터 선택된 에스. 뉴모니아에 혈청형 세트를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 본질적으로 이로 이루어지고, 혈청형 23A 및/또는 23B를 추가로 포함하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
제15 실시양태 (실시양태 E15)에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에 혈청형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 에스. 뉴모니아에 혈청형 세트를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 이로 본질적으로 이루어진 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다:
(1) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(2) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(3) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(4) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(5) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(6) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(7) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(8) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(9) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(10) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(11) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(12) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(13) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(14) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(15) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(16) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
(17) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(18) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(19) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(20) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6C, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(21) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(22) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(23) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(24) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(25) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(26) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(27) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(28) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(29) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(30) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(31) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 6B, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(32) 3, 7F, 19A, 22F, 33F,8, 9N, 39, 11A, 12F, 15B, 17F, 20A, 6A, 15A, 16F, 23F, 24F, 31 및 35B,
(33) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20B,
(34) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24B, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A,
(35) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24B, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20B,
(36) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20B,
(37) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24B, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A,
(38) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24B, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20B,
(39) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20,
(40) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24B, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20,
(41) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24B, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20,
(42) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20,
(43) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24B, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20, 및
(44) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24B, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20.
본 발명의 제16 실시양태에서 (실시양태 E16)에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 다수의 에스 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에 혈청형은 실시양태 E15에 제시된 혈청형 세트, 열 (17) 내지 (32) 중 임의의 것으로부터 선택된 에스. 뉴모니아에 혈청형 세트를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 본질적으로 이로 이루어지고, 혈청형 23A 및/또는 23B를 추가로 포함하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
제17 실시양태 (실시양태 E17)에서, 본 발명은 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형 세트를 포함하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다:
i. 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B,
ii. 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A, 및
iii. 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A.
실시양태 E17의 하위실시양태에서, 면역원성 조성물은 어떠한 추가의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체도 포함하지 않는다.
제18 실시양태 (실시양태 E18)에서, 본 발명은 에스. 뉴모니아에 혈청형 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하는 다가 면역원성 조성물을 제공한다. 실시양태 E18의 하위실시양태에서, 면역원성 조성물은 어떠한 추가의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체도 포함하지 않는다.
제19 실시양태 (실시양태 E19)에서, 본 발명은 에스. 뉴모니아에 혈청형 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하는 다가 면역원성 조성물을 제공한다. 실시양태 E19의 하위실시양태에서, 면역원성 조성물은 어떠한 추가의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체도 포함하지 않는다.
제20 실시양태 (실시양태 E20)에서, 본 발명은 에스. 뉴모니아에 혈청형 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하는 다가 면역원성 조성물을 제공한다. 실시양태 E20의 하위실시양태에서, 면역원성 조성물은 어떠한 추가의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체도 포함하지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 에스. 뉴모니아에 혈청형 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하는 다가 면역원성 조성물을 제공한다. 이러한 실시양태의 하위실시양태 (즉, 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A)에서, 면역원성 조성물은 어떠한 추가의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체도 포함하지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 에스. 뉴모니아에 혈청형 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하는 다가 면역원성 조성물을 제공한다. 이러한 실시양태의 하위실시양태 (즉, 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20)에서, 면역원성 조성물은 어떠한 추가의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체도 포함하지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 에스. 뉴모니아에 혈청형 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20B로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하는 다가 면역원성 조성물을 제공한다. 이러한 실시양태의 하위실시양태 (즉, 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20B)에서, 면역원성 조성물은 어떠한 추가의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체도 포함하지 않는다.
본원에 제시된 바와 같이 (하기 실시예 3 참조), 탈-O-아세틸화된 혈청형 15B 폐렴구균 폴리사카라이드는 혈청형 15C 폐렴구균 폴리사카라이드와 동등하고 동일한 NMR 스펙트럼을 갖는다. 본원에 기재되고 개시된 바와 같은 탈-O-아세틸화된 혈청형 15B 폐렴구균 폴리사카라이드는 혈청형 15C 폐렴구균 폴리사카라이드와 동등하고, 둘 다 반복 단위당 O-아세틸 함량이 0-5% 범위 또는 0-4% 범위 또는 0-3% 범위 또는 0-2% 범위 또는 0-1% 범위 또는 0-0.5% 범위 또는 0-0.1% 범위이거나 O-아세틸 함량을 갖지 않을 수 있다. 문헌 [Spencer B.L., et al.]에 의한 보고에서, 15C는 약간 O-아세틸화될 수 있다 (Spencer, B.L. et al., Clin. Vac. Immuno. (2017) 24(8): 1-13). 따라서, 본원의 다가 면역원성 조성물의 임의의 실시양태에서, 탈-O-아세틸화된 혈청형 15B가 혈청형 15C 대신에 사용될 수 있다. 탈-O-아세틸화 방법은, 예를 들어 문헌 [Rajam et al., Clinical and Vaccine Immunology, 2007, 14(9):1223-1227]에 기재된 바와 같이 관련 기술분야에 공지되어 있다.
실시양태 E1 내지 E20 및 그의 임의의 하위실시양태를 포함한 본 발명의 임의의 다가 면역원성 조성물의 특정 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함한다.
교차-반응성
한 실시양태에서, 본 발명은 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 혈청형 6C를 포함한 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형 6C는 에스. 뉴모니아에의 혈청형 6A 및 6B에 대한 교차-보호를 제공하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 실시양태 E1 내지 E20으로부터 선택된 바와 같은 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 혈청형 6C를 포함한 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형 6C는 에스. 뉴모니아에의 혈청형 6A 및 6B에 대한 교차-보호를 제공하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 혈청형 19A를 포함한 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형 19A는 에스. 뉴모니아에의 혈청형 19F에 대한 교차-보호를 제공하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 실시양태 E1 내지 E20으로부터 선택된 바와 같은 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 혈청형 19A를 포함한 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형 19A는 에스. 뉴모니아에의 혈청형 19F에 대한 교차-보호를 제공하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 혈청형 23A 및/또는 23B를 포함한 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형 23A 및/또는 23B는 에스. 뉴모니아에의 혈청형 23F에 대한 교차-보호를 제공하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 실시양태 E1 내지 E20으로부터 선택된 바와 같은 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 혈청형 23A 및/또는 23B를 포함한 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형 23A 및/또는 23B는 에스. 뉴모니아에의 혈청형 23F에 대한 교차-보호를 제공하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 혈청형 6A를 포함한 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형 6A는 에스. 뉴모니아에의 혈청형 6B 및/또는 6C에 대한 교차-보호를 제공하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 실시양태 E1 내지 E20으로부터 선택된 바와 같은 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 혈청형 6A를 포함한 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형 6A는 에스. 뉴모니아에의 혈청형 6B 및/또는 6C에 대한 교차-보호를 제공하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 혈청형 20A를 포함한 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형 20A는 에스. 뉴모니아에의 혈청형 20B에 대한 교차-보호를 제공하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 실시양태 E1 내지 E20으로부터 선택된 바와 같은 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 혈청형 20A를 포함한 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형 20A는 에스. 뉴모니아에의 혈청형 20B에 대한 교차-보호를 제공하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 혈청형 20B를 포함한 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형 20B는 에스. 뉴모니아에의 혈청형 20A에 대한 교차-보호를 제공하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 실시양태 E1 내지 E20으로부터 선택된 바와 같은 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 혈청형 20B를 포함한 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형 20B는 에스. 뉴모니아에의 혈청형 20A에 대한 교차-보호를 제공하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 혈청형 15C를 포함한 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형 15C는 에스. 뉴모니아에의 혈청형 15B에 대한 교차-보호를 제공하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 실시양태 E1 내지 E20으로부터 선택된 바와 같은 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 혈청형 15C를 포함한 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형 15C는 에스. 뉴모니아에의 혈청형 15B에 대한 교차-보호를 제공하는 것인 다가 면역원성 조성물을 제공한다.
담체 단백질
본 발명의 특정한 실시양태에서, CRM197이 담체 단백질로서 사용된다. CRM197은 하기 아미노산 서열을 갖는 디프테리아 독소의 비-독성 변이체 (즉, 톡소이드)이다:
Figure pat00001
한 실시양태에서, CRM197은 카사미노산 및 효모 추출물-기재 배지에서 성장된 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria) 균주 C7 (β197)의 배양물로부터 단리된다. 또 다른 실시양태에서, CRM197은 미국 5,614,382에 기재된 방법에 따라 재조합적으로 제조된다. 전형적으로, CRM197은 한외여과, 황산암모늄 침전 및 이온-교환 크로마토그래피의 조합을 통해 정제된다. 일부 실시양태에서, CRM197은 페넥스 발현 기술(Pfenex Expression Technology)™ (페넥스 인크.(Pfenex Inc.), 캘리포니아주 샌디에고)을 사용하여 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens)에서 제조된다.
다른 적합한 담체 단백질은 추가의 불활성화된 박테리아 독소, 예컨대 DT (디프테리아 톡소이드) 또는 DT의 단편 B (DTFB), TT (파상풍 톡소이드) 또는 TT의 단편 C, 백일해 톡소이드, 콜레라 톡소이드 (예를 들어, WO 2004/083251에 기재된 바와 같음), 이. 콜라이 LT, 이. 콜라이 ST, 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의 외독소 A를 포함한다. 박테리아 외막 단백질, 예컨대 외막 복합체 c (OMPC), 포린, 트랜스페린 결합 단백질, 폐렴구균 표면 단백질 A (PspA; WO 02/091998 참조), 폐렴구균 어드헤신 단백질 (PsaA), A군 또는 B군 스트렙토코쿠스로부터의 C5a 펩티다제, 또는 헤모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae) 단백질 D, 폐렴구균 뉴모리신 (Kuo et al., 1995, Infect Immun 63; 2706-13), 예를 들어 일부 방식으로 해독된 ply, 예를 들어 dPLY-GMBS (WO 04/081515 참조) 또는 dPLY-포르몰, PhtX, 예를 들어 PhtA, PhtB, PhtD, PhtE 및 Pht 단백질의 융합체, 예를 들어 PhtDE 융합체, PhtBE 융합체 (WO 01/98334 및 WO 03/54007 참조)가 또한 사용될 수 있다. 다른 단백질, 예컨대 오브알부민, 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체 (PPD), PorB (엔. 메닌기티디스(N. meningitidis)로부터의 것), PD (헤모필루스 인플루엔자에 단백질 D; 예를 들어, EP 0 594 610 B 참조), 또는 그의 면역학상 기능적 등가물, 합성 펩티드 (EP0378881 및 EP0427347 참조), 열 쇼크 단백질 (WO 93/17712 및 WO 94/03208 참조), 백일해 단백질 (WO 98/58668 및 EP0471177 참조), 시토카인, 림포카인, 성장 인자 또는 호르몬 (WO 91/01146 참조), 다양한 병원체 유래 항원으로부터의 다중 인간 CD4+ T 세포 에피토프를 포함하는 인공 단백질 (문헌 [Falugi et al., 2001, Eur J Immunol 31:3816-3824] 참조), 예컨대 N19 단백질 (문헌 [Baraldoi et al., 2004, Infect Immun 72:4884-7] 참조), 철 흡수 단백질 (WO 01/72337 참조), 씨. 디피실레(C. difficile)의 독소 A 또는 B (WO 00/61761 참조), 및 플라젤린 (문헌 [Ben-Yedidia et al., 1998, Immunol Lett 64:9] 참조)이 또한 담체 단백질로서 사용될 수 있다.
담체 단백질로서 다른 DT 돌연변이체, 예컨대 CRM176, CRM228, CRM45 (Uchida et al., 1973, J Biol Chem 218:3838-3844); CRM9, CRM45, CRM102, CRM103 및 CRM107 및 문헌 [Nicholls and Youle in Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992]에 기재된 다른 돌연변이; 결실 또는 Glu-148에서 Asp, Gln 또는 Ser로의 돌연변이 및/또는 Ala 158에서 Gly로의 돌연변이 및 미국 4,709,017 또는 미국 4,950,740에 개시된 다른 돌연변이; 적어도 1개 이상의 잔기 Lys 516, Lys 526, Phe 530 및/또는 Lys 534의 돌연변이 및 미국 5,917,017 또는 미국 특허 번호 6,455,673에 개시된 다른 돌연변이; 또는 미국 5,843,711에 개시된 단편이 사용될 수 있다. 이러한 DT 돌연변이체는 또한 에피티프 영역을 함유하는 B 단편을 포함하는 DTFB 변이체를 제조하는데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 담체 단백질은 외막 단백질 복합체 (OMPC), 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드, 단백질 D 및 CRM197로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 다가 면역원성 조성물 내의 폴리사카라이드 단백질 접합체 중 1종 이상에 대해 제2 담체가 사용될 수 있다. 제2 담체 단백질은 바람직하게는 비-독성 및 비-반응원성이고 충분한 양 및 순도로 수득가능한 단백질이다. 제2 담체 단백질은 또한 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드와 접합되거나 연결되어 항원의 면역원성을 증진시킨다. 담체 단백질은 표준 접합 절차를 받을 수 있어야 한다. 한 실시양태에서, 제1 담체 단백질에 접합되지 않은 각각의 피막 폴리사카라이드는 동일한 제2 담체 단백질에 접합된다 (예를 들어, 각각의 피막 폴리사카라이드 분자는 단일 담체 단백질에 접합됨). 또 다른 실시양태에서, 제1 담체 단백질에 접합되지 않은 피막 폴리사카라이드는 2종 이상의 담체 단백질에 접합된다 (각각의 피막 폴리사카라이드 분자는 단일 담체 단백질에 접합됨). 이러한 실시양태에서, 동일한 혈청형의 각각의 피막 폴리사카라이드는 전형적으로 동일한 담체 단백질에 접합된다.
임의의 실시양태 E1-E20 및 그의 임의의 하위실시양태를 포함한 본 발명의 실시양태에서, 폴리사카라이드 혈청형 중 1종 이상 (적용가능한 경우, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21종 포함)이 CRM197에 접합된다. 임의의 실시양태 E1-E20 및 그의 임의의 하위실시양태를 포함한 본 발명의 추가 실시양태에서, 각각의 폴리사카라이드 혈청형은 CRM197에 접합된다.
본 발명의 폴리사카라이드-단백질 접합체의 제제화는 관련 기술분야에 인식된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 개별 폐렴구균 접합체를 생리학상 허용되는 비히클과 함께 제제화하여 조성물을 제조할 수 있다. 이러한 비히클의 예는 물, 완충 염수, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 덱스트로스 용액을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
바람직한 실시양태에서, 백신 조성물은 염화나트륨을 갖는 L-히스티딘 완충제 중에서 제제화된다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 다가 면역원성 조성물은 담체 단백질 및 아주반트에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하며, 여기서 에스. 뉴모니아에 혈청형은 본원에 기재된 바와 같은 것인, 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함한다. 조성물의 유효성을 증진시키기 위한 적합한 아주반트는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
(1) 알루미늄 염 (명반), 예컨대 알루미늄 히드록시드, 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 술페이트 등;
(2) 수중유 에멀젼 제제 (다른 특정 면역자극제, 예컨대 무라밀 펩티드 (하기 정의됨) 또는 박테리아 세포벽 성분이 있거나 없음), 예컨대, 예를 들어, (a) 미세유동화기, 예컨대 모델 110Y 미세유동화기 (마이크로플루이딕스(Microfluidics), 매사추세츠주 뉴턴)를 사용하여 서브마이크로미터 입자로 제제화된, 5% 스쿠알렌, 0.5% 트윈 80 및 0.5% 스팬 85를 함유 (임의로 다양한 양의 MTP-PE 함유)하는 MF59 (국제 특허 출원 공개 번호 WO 90/14837), (b) 서브마이크로미터 에멀젼으로 미세유동화되거나 보다 큰 입자 크기 에멀젼을 생성하기 위해 볼텍싱된, 10% 스쿠알렌, 0.4% 트윈 80, 5% 플루로닉-차단된 중합체 L121 및 thr-MDP를 함유하는 SAF, (c) 2% 스쿠알렌, 0.2% 트윈 80, 및 미국 특허 번호 4,912,094에 기재된 3-O-탈아실화 모노포스포리피드 A (MPL™), 트레할로스 디미콜레이트 (TDM) 및 세포벽 골격 (CWS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 박테리아 세포벽 성분, 바람직하게는 MPL+CWS (디톡스(Detox)™)를 함유하는 리비(Ribi)™ 아주반트 시스템 (RAS) (코릭사(Corixa), 몬타나주 해밀턴); 및 (d) 몬타니드 ISA;
(3) 사포닌 아주반트, 예컨대 퀼 A 또는 스티물론(STIMULON)™ QS-21 (안티제닉스(Antigenics), 매사추세츠주 프레이밍햄) (예를 들어, 미국 특허 번호 5,057,540 참조), 또는 그로부터 생성된 입자, 예컨대 ISCOM (콜레스테롤, 사포닌, 인지질 및 양친매성 단백질의 조합에 의해 형성된 면역자극 복합체) 및 이스코매트릭스(Iscomatrix)® (ISCOM과 본질적으로 동일한 구조를 갖지만 단백질이 없는 것)가 사용될 수 있음;
(4) 박테리아 리포폴리사카라이드, 합성 지질 A 유사체, 예컨대 아미노알킬 글루코사민 포스페이트 화합물 (AGP), 또는 그의 유도체 또는 유사체, 이는 코릭사로부터 입수가능하고 미국 특허 번호 6,113,918에 기재됨; 하나의 이러한 AGP는 2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]에틸 2-데옥시-4-O-포스포노-3-O-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일]-2-[(R)-3-테트라데카노일옥시테트라데카노일아미노]-b-D-글루코피라노시드이며, 이는 또한 529로 공지되어 있고 (이전에 RC529로서 공지됨), 수성 형태 또는 안정한 에멀젼으로서 제제화됨;
(5) 합성 폴리뉴클레오티드, 예컨대 CpG 모티프(들)를 함유하는 올리고뉴클레오티드 (미국 특허 번호 6,207,646);
(6) 시토카인, 예컨대 인터류킨 (예를 들어, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 등), 인터페론 (예를 들어, 감마 인터페론), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 대식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF), 종양 괴사 인자 (TNF), 공동자극 분자 B7-1 및 B7-2 등; 및
(7) 보체, 예컨대 보체 성분의 삼량체 C3d.
또 다른 실시양태에서, 아주반트는 상기 아주반트 중 2, 3종 또는 그 초과의 혼합물, 예를 들어 SBAS2 (3-탈아실화 모노포스포릴 지질 A 및 QS21을 또한 함유하는 수중유 에멀젼)이다.
무라밀 펩티드는 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 (thr-MDP), N-아세틸-노르무라밀-L-알라닌-2-(1'-2' 디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 (MTP-PE) 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 아주반트는 알루미늄 염이다. 알루미늄 염 아주반트는 명반-침전된 백신 또는 명반-흡착된 백신일 수 있다. 알루미늄-염 아주반트는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Harlow, E. and D. Lane (1988; Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory) and Nicklas, W. (1992; Aluminum salts. Research in Immunology 143:489-493)]에 기재되어 있다. 알루미늄 염은 수화 알루미나, 알루미나 수화물, 알루미나 3수화물 (ATH), 알루미늄 수화물, 알루미늄 3수화물, 알히드로겔, 슈퍼포스, 암포겔, 알루미늄 (III) 히드록시드, 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트, 알루미늄 포스페이트 아주반트 (APA), 무정형 알루미나, 3수화 알루미나 또는 트리히드록시알루미늄을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
APA는 알루미늄 히드록시포스페이트의 수성 현탁액이다. APA는 염화알루미늄 및 인산나트륨을 1:1 부피 비로 블렌딩하여 알루미늄 히드록시포스페이트를 침전시킴으로써 제조된다. 블렌딩 공정 후에, 물질은 고-전단 혼합기로 크기-감소되어 단분산 입자 크기 분포를 달성한다. 이어서 생성물은 생리학적 염수에 대해 투석여과되고, 증기 멸균된다.
특정 실시양태에서, 상업적으로 입수가능한 Al(OH)3 (예를 들어, 뉴욕주 웨스트베리 소재 덴마크/아큐레이트 케미칼 앤 사이언티픽 캄파니(Denmark/Accurate Chemical and Scientific Co.)의 알히드로겔 또는 슈퍼포스)이 단백질을 50 - 200 μg 단백질/mg 알루미늄 히드록시드의 비로 흡착시키는데 사용된다. 단백질의 흡착은, 또 다른 실시양태에서, 단백질의 pI (등전 pH) 및 배지의 pH에 좌우된다. 보다 낮은 pI를 갖는 단백질은 보다 높은 pI를 갖는 단백질보다 양으로 하전된 알루미늄 이온에 더 강하게 흡착한다. 알루미늄 염은 2-3주의 기간에 걸쳐 서서히 방출되고/거나, 대식세포의 비특이적 활성화 및 보체 활성화에 관여하고/거나, 선천성 면역 메카니즘을 자극하는 (가능하게는 요산의 자극을 통해) 항원의 데포를 확립할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Lambrecht et al., 2009, Curr Opin Immunol 21:23]을 참조한다.
1가 벌크 수성 접합체는 전형적으로 함께 블렌딩되고, 8 μg/mL를 표적으로 희석될 혈청형 6B를 제외한 모든 혈청형에 대해 4 μg/mL를 표적으로 희석된다. 희석되면, 배치가 멸균 여과될 것이고, 250 μg/mL의 최종 알루미늄 농도를 표적으로 동일 부피의 알루미늄 포스페이트 아주반트가 무균으로 첨가된다. 아주반트 첨가된, 제제화된 배치는 단일-사용, 0.5 mL/용량 바이알 내로 충전될 것이다.
특정 실시양태에서, 아주반트는 CpG-함유 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 CpG-함유 올리고뉴클레오티드, 특히 CpG-함유 올리고데옥시뉴클레오티드 (CpG ODN)이다. 또 다른 실시양태에서, 아주반트는 ODN 1826이며, 이는 콜리 파마슈티칼 그룹(Coley Pharmaceutical Group)으로부터 획득될 수 있다.
CpG 올리고뉴클레오티드의 사용 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Sur et al., 1999, J Immunol. 162:6284-93; Verthelyi, 2006, Methods Mol Med. 127:139-58; 및 Yasuda et al., 2006, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 23:89-110]에 기재되어 있다.
대안적 실시양태에서, 면역원성 조성물은 본원에, 예를 들어 임의의 실시양태 E1-E20 또는 그의 임의의 하위실시양태에 기재된 바와 같은 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하고, 아주반트를 포함하지 않는다.
제제
본 발명의 조성물은 단일 용량 바이알, 다중-용량 바이알 또는 사전-충전된 유리 또는 플라스틱 시린지로서 제제화될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 경구로 투여되고, 따라서 경구 투여에 적합한 형태로, 즉, 고체 또는 액체 제제로서 제제화된다. 고체 경구 제제는 정제, 캡슐, 환제, 과립, 펠릿 등을 포함한다. 액체 경구 제제는 용액, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 오일 등을 포함한다.
액체 제제에 대한 제약상 허용되는 담체는 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 오일이다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 주사가능한 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트이다. 수성 담체는 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액, 예를 들어 염수 및 완충 매질을 포함한다. 오일의 예는 동물, 식물 또는 합성 기원의 것, 예를 들어 땅콩 오일, 대두 오일, 올리브 오일, 해바라기 오일, 어류-간 오일, 또 다른 해양 오일, 또는 우유 또는 난으로부터의 지질이다.
제약 조성물은 등장성, 저장성 또는 고장성일 수 있다. 그러나, 주입 또는 주사용 제약 조성물이 투여될 때 이는 본질적으로 등장성인 것이 종종 바람직하다. 따라서, 저장을 위해 제약 조성물은 바람직하게는 등장성 또는 고장성일 수 있다. 제약 조성물이 저장을 위해 고장성인 경우에, 이는 투여 전에 등장성 용액이 되도록 희석될 수 있다.
등장화제는 이온성 등장화제, 예컨대 염 또는 비-이온성 등장화제, 예컨대 탄수화물일 수 있다. 이온성 등장화제의 예는 NaCl, CaCl2, KCl 및 MgCl2를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 비-이온성 등장화제의 예는 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
적어도 1종의 제약상 허용되는 첨가제는 완충제인 것이 또한 바람직하다. 일부 목적을 위해, 예를 들어, 제약 조성물이 주입 또는 주사를 위해 의도되는 경우에, 조성물은 용액을 4 내지 10, 예컨대 5 내지 9, 예를 들어 6 내지 8 범위의 pH로 완충시킬 수 있는 완충제를 포함하는 것이 종종 바람직하다.
완충제는, 예를 들어 트리스, 아세테이트, 글루타메이트, 락테이트, 말레에이트, 타르트레이트, 포스페이트, 시트레이트, 카르보네이트, 글리시네이트, 히스티딘, 글리신, 숙시네이트 및 트리에탄올아민 완충제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
완충제는, 특히 제약 제제가 비경구 용도를 위한 것인 경우에, 비경구 용도를 위한 USP 상용성 완충제로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 완충제는 일염기성 산, 예컨대 아세트산, 벤조산, 글루콘산, 글리세르산 및 락트산; 이염기성 산, 예컨대 아코니트산, 아디프산, 아스코르브산, 탄산, 글루탐산, 말산, 숙신산 및 타르타르산, 다염기성 산, 예컨대 시트르산 및 인산; 및 염기, 예컨대 암모니아, 디에탄올아민, 글리신, 트리에탄올아민 및 트리스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
비경구 비히클 (피하, 정맥내, 동맥내 또는 근육내 주사용)은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거 및 고정 오일을 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제, 예컨대 링거 덱스트로스를 기재로 하는 것 등을 포함한다. 예는 계면활성제 및 다른 제약상 허용되는 아주반트를 첨가하거나 첨가하지 않은 멸균 액체, 예컨대 물 및 오일이다. 일반적으로, 물, 염수, 수성 덱스트로스 및 관련 당 용액, 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리소르베이트 80 (PS-80), 폴리소르베이트 20 (PS-20) 및 폴록사머 188 (P188)이 특히 주사가능한 용액을 위한 바람직한 액체 담체이다. 오일의 예는 동물, 식물 또는 합성 기원의 것, 예를 들어 땅콩 오일, 대두 오일, 올리브 오일, 해바라기 오일, 어류-간 오일, 또 다른 해양 오일, 또는 우유 또는 난으로부터의 지질이다.
본 발명의 제제는 또한 계면활성제를 함유할 수 있다. 바람직한 계면활성제는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 (통상적으로 트윈으로 지칭됨), 특히 PS-20 및 PS-80; 에틸렌 옥시드 (EO), 프로필렌 옥시드 (PO) 및/또는 부틸렌 옥시드 (BO)의 공중합체, 다우팍스(DOWFAX)™ 상표명으로 판매됨, 예컨대 선형 EO/PO 블록 공중합체; 반복 에톡시 (옥시-1,2-에탄디일) 기의 수가 다양할 수 있는 옥톡시놀, 옥톡시놀-9 (트리톤 X-100 또는 t-옥틸페녹시폴리에탄올)가 특히 관심대상임; (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올 (이게팔(IGEPAL) CA-630/NP-40); 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린 (레시틴); 노닐페놀 에톡실레이트, 예컨대 테르기톨(Tergitol)™ NP 시리즈; 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알콜로부터 유도된 폴리옥시에틸렌 지방 에테르 (브리즈(Brij) 계면활성제로 공지됨), 예컨대 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르 (브리즈 30); 및 소르비탄 에스테르 (통상적으로 스팬(SPAN)으로 공지됨), 예컨대 소르비탄 트리올레에이트 (스팬 85) 및 소르비탄 모노라우레이트. 에멀젼에 포함시키기에 바람직한 계면활성제는 PS-80이다.
계면활성제의 혼합물, 즉 PS-80/스팬 85 혼합물이 사용될 수 있다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 (PS-80) 및 옥톡시놀, 예컨대 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (트리톤 X-100)의 조합물이 또한 적합하다. 또 다른 유용한 조합물은 라우레트 9 플러스 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및/또는 옥톡시놀을 포함한다.
계면활성제의 바람직한 양 (중량%)은 다음과 같다: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 (예컨대 PS-80) 0.01 내지 1%, 특히 약 0.1%; 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올 (예컨대 트리톤 X-100, 또는 트리톤 시리즈의 다른 세제) 0.001 내지 0.1%, 특히 0.005 내지 0.02%; 폴리옥시에틸렌 에테르 (예컨대 라우레트 9) 0.1 내지 20%, 바람직하게는 0.1 내지 10%, 특히 0.1 내지 1% 또는 약 0.5%.
특정 실시양태에서, 조성물은 pH 5.8에서의 히스티딘 (20mM), 염수 (150mM) 및 0.2% PS-20 또는 0.04% PS-80과 250 μg/mL의 APA (알루미늄 포스페이트 아주반트)로 본질적으로 이루어진다. PS-20은 모의 제조 동안 및 1차 포장을 사용하는 수송에서 응집을 제어하는 제제화에 있어서 PS-20 또는 PS-80의 존재 하에 0.005% 내지 0.3% (w/v) 범위일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, PS-20은 0.025% 내지 0.8% (w/v) 범위일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, PS-20은 0.05% 내지 0.8% (w/v) 범위일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, PS-20은 0.05% 내지 0.2% (w/v) 범위일 수 있다. 공정은 24종 이하의 혈청형의 블렌드를 히스티딘, 염수 및 PS-20 또는 PS-80 중에서 합한 다음, 이러한 블렌딩된 물질을 항미생물 보존제와 함께 또는 항미생물 보존제 없이 APA 및 염수와 합하는 것으로 이루어진다.
특정한 실시양태에서, 다가 면역원성 조성물은 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 폴리사카라이드 단백질 접합체 내의 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 본원에 제시된 임의의 혈청형 세트를 포함하고, 20-80 mM 히스티딘 pH 5.8 및 150 mM NaCl을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 면역원성 조성물은 0.2% 내지 0.8% w/v 폴리소르베이트 20을 추가로 포함한다.
계면활성제의 선택은 상이한 약물 제품 및 약물 물질에 대해 최적화될 필요가 있을 수 있다. 15종 이상의 혈청형을 갖는 다가 백신의 경우, PS-20 및 P188이 바람직하다. 접합체를 제조하기 위해 사용되는 화학의 선택은 또한 제제의 안정화에 중요한 역할을 할 수 있다. 특히, 다가 조성물 내의 상이한 폴리사카라이드 단백질 접합체를 제조하는데 사용된 접합 반응이 수성 용매 및 DMSO 용매 둘 다를 포함하는 경우에, 특정한 계면활성제 시스템이 안정성에 유의한 차이를 제공한다. 폴리소르베이트 20 단독 또는 폴리올과 조합된 폴록사머 188에서 폴리사카라이드 단백질 접합체의 개선된 안정성이 관찰되었다.
특정 세제가 생물치료제를 보호하는 방법의 정확한 메카니즘은 잘 이해되지 않고, 선험적으로 예측될 수 없다. 가능한 안정화 메카니즘은 우선적 수화, 우선적 배제, 생물치료제와 표면 사이의 공기/액체 계면 경쟁, 표면 장력, 및/또는 응집을 위한 시드로서의 역할을 하는 소수성 패치를 차폐하기 위한 세제와 생물치료제의 직접적 회합을 포함한다.
폴록사머가 또한 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다. 폴록사머는 폴리옥시에틸렌 (폴리(에틸렌 옥시드))의 2개 친수성 쇄가 플랭킹되어 있는 폴리옥시프로필렌 (폴리(프로필렌 옥시드))의 중앙 소수성 쇄로 구성된 비이온성 삼블록 공중합체이다. 폴록사머는 또한 상표명 플루로닉(Pluronic)®으로 공지되어 있다. 중합체 블록의 길이는 맞춤화될 수 있기 때문에, 약간 상이한 특성을 갖는 많은 상이한 폴록사머가 존재한다. 일반 용어 "폴록사머"의 경우, 이들 공중합체는 통상적으로 문자 "P" (폴록사머에 대한 것)에 이어서 3개의 숫자로 명명되고, 처음 2개의 숫자 x 100은 폴리옥시프로필렌 코어의 대략적인 분자 질량을 제공하고, 마지막 숫자 x 10은 폴리옥시에틸렌 함량 백분율을 제공한다 (예를 들어, P407 = 4,000 g/mol의 폴리옥시프로필렌 분자 질량 및 70% 폴리옥시에틸렌 함량을 갖는 폴록사머). 플루로닉® 상표명의 경우, 이들 공중합체의 부호화는 실온에서 그의 물리적 형태를 규정하기 위한 문자 (L = 액체, P = 페이스트, F = 박편 (고체))로 시작한 후, 2 또는 3개의 숫자가 이어진다. 수치 지정에서 첫번째 숫자 (3자리-숫자 수에서는 2개의 숫자)에 300을 곱한 것은, 소수성물질의 대략적인 분자량을 나타내고; 마지막 숫자 x 10은 폴리옥시에틸렌 함량 백분율을 제공한다 (예를 들어, L61 = 1,800 g/mol의 폴리옥시프로필렌 분자 질량 및 10% 폴리옥시에틸렌 함량을 갖는 플루로닉®). 미국 특허 번호 3740421을 참조한다.
폴록사머의 예는 다음 화학식을 갖는다: HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH, 여기서 a 및 b 블록은 하기 값을 갖는다:
Figure pat00002
본원에 사용된 분자량 단위는 달톤 (Da) 또는 g/mol이다.
바람직하게는, 폴록사머는 일반적으로 1100 내지 17,400 Da, 7,500 내지 15,000 Da, 또는 7,500 내지 10,000 Da 범위의 분자량을 갖는다. 폴록사머는 폴록사머 188 또는 폴록사머 407로부터 선택될 수 있다. 제제 중 폴록사머의 최종 농도는 0.001% 내지 5% 중량/부피 또는 0.025% 내지 1% 중량/부피이다. 특정 측면에서, 폴리올은 프로필렌 글리콜이고, 1% 내지 20% 중량/부피의 최종 농도로 존재한다. 특정 측면에서, 폴리올은 폴리에틸렌 글리콜 400이고, 1% 내지 20% 중량/부피의 최종 농도로 존재한다.
본 발명의 제제에 적합한 폴리올은 중합체 폴리올, 특히 폴리에테르 디올, 예컨대, 비제한적으로, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르이다. 프로필렌 글리콜은 ~425 내지 ~2700의 단량체 분자량 범위에서 이용가능하다. 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르는 또한 PEG200, PEG300, PEG400, PEG1000, PEG MME 550, PEG MME 600, PEG MME 2000, PEG MME 3350 및 PEG MME 4000을 포함하나 이에 제한되지는 않는 ~200 내지 ~35000 범위의 분자량 범위에서 이용가능하다. 바람직한 폴리에틸렌 글리콜은 폴리에틸렌 글리콜 400이다. 본 발명의 제제 중 폴리올의 최종 농도는 1% 내지 20% 중량/부피 또는 6% 내지 20% 중량/부피일 수 있다.
제제는 또한 pH-완충 염수 용액을 함유한다. 완충제는, 예를 들어 트리스, 아세테이트, 글루타메이트, 락테이트, 말레에이트, 타르트레이트, 포스페이트, 시트레이트, 카르보네이트, 글리시네이트, 히스티딘, 글리신, 숙시네이트, HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판술폰산), MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산) 및 트리에탄올아민 완충제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 완충제는 용액을 4 내지 10, 5.2 내지 7.5, 또는 5.8 내지 7.0 범위의 pH로 완충시킬 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 완충제는 포스페이트, 숙시네이트, 히스티딘, MES, MOPS, HEPES, 아세테이트 또는 시트레이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 완충제는 추가로, 예를 들어, 특히 제약 제제가 비경구 용도를 위한 것인 경우에, 비경구 용도를 위한 USP 상용성 완충제로부터 선택될 수 있다. 완충제의 농도는 1 mM 내지 100 mM 범위일 것이다. 완충제의 농도는 10 mM 내지 80 mM 범위일 것이다. 완충제의 농도는 1 mM 내지 50 mM 또는 5 mM 내지 50 mM 범위일 것이다. 특정 측면에서, 완충제는 5 mM 내지 50 mM의 최종 농도의 히스티딘, 또는 1 mM 내지 10 mM의 최종 농도의 숙시네이트이다. 특정 측면에서, 히스티딘은 20 mM ± 2 mM의 최종 농도로 존재한다.
염수 용액 (즉, NaCl을 함유하는 용액)이 바람직하지만, 제제에 적합한 다른 염은 CaCl2, KCl 및 MgCl2 및 그의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 수크로스, 트레할로스, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤을 포함하나 이에 제한되지 않는 비-이온성 등장화제가 염 대신에 사용될 수 있다. 적합한 염 범위는 25 mM 내지 500 mM 또는 40 mM 내지 170 mM을 포함하나 이에 제한되는 않는다. 한 측면에서, 염수는 임의로 20 mM 내지 170 mM의 농도로 존재하는 NaCl이다.
바람직한 실시양태에서, 제제는 염화나트륨을 갖는 L-히스티딘 완충제를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 제어 방출 시스템으로 전달된다. 예를 들어, 작용제는 정맥내 주입, 경피 패치, 리포솜 또는 다른 투여 방식을 사용하여 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 중합체 물질이, 예를 들어 마이크로스피어에 또는 이식물에 사용된다.
각각의 백신 용량 중 접합체의 양은 유의한 유해 효과 없이 면역보호 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 이러한 양은 폐렴구균 혈청형에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 폴리사카라이드-기재의 접합체의 경우, 각각의 용량은 각각의 폴리사카라이드 0.08 내지 100 μg을 포함할 것이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 각각의 폴리사카라이드 접합체의 용량은 0.08 내지 10 μg을 포함할 것이다. 추가 실시양태에서, 용량은 1 내지 5 μg, 0.4 내지 4 μg, 0.4 내지 3 μg, 0.4 내지 2 μg, 또는 0.4 내지 1 μg이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 폴리사카라이드 접합체의 용량은 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 또는 750 ng, 또는 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.75, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7.5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 μg이다.
본 발명의 조성물의 일부 실시양태에서, 모든 폴리사카라이드 접합체는 조성물 내에 동일한 양으로 존재한다. 추가 실시양태에서, 폴리사카라이드 접합체는 조성물 내에 상이한 양으로 존재한다 (즉, 적어도 1종의 폴리사카라이드 접합체는 조성물의 1종 이상의 다른 폴리사카라이드 접합체와 상이한 양으로 존재함).
특정한 백신에 대한 성분의 최적량은 대상체에서의 적절한 면역 반응의 관찰을 수반하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 또 다른 실시양태에서, 인간 백신접종을 위한 투여량은 동물 연구로부터 인간 데이터로의 외삽에 의해 결정된다. 또 다른 실시양태에서, 투여량은 경험적으로 결정된다.
한 실시양태에서, 알루미늄 염의 용량은 10, 15, 20, 25, 30, 50, 70, 100, 125, 150, 200, 300, 500 또는 700 μg, 또는 1, 1.2, 1.5, 2, 3, 5 mg 또는 그 초과이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 기재된 알루미늄 염의 용량은 재조합 단백질 μg당이다.
본 발명의 조성물은 또한 에스. 뉴모니아에로부터의 1종 이상의 단백질을 포함할 수 있다. 포함시키기에 적합한 에스. 뉴모니아에 단백질의 예는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 02/083855 및 WO 02/053761에서 확인된 것들을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 1종 이상의 방법에 의해, 예컨대 비경구로, 경점막으로, 경피로, 근육내로, 정맥내로, 피부내로, 비강내로, 피하로, 복강내로 대상체에게 투여될 수 있고, 그에 따라 제제화될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 액체 제제의 표피 주사, 근육내 주사, 정맥내, 동맥내, 피하 주사, 또는 호흡기내 점막 주사를 통해 투여된다. 주사용 액체 제제는 용액 등을 포함한다.
III. 제조 방법
스트렙토코쿠스 뉴모니아에로부터의 피막 폴리사카라이드는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 표준 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 폴리사카라이드는 박테리아로부터 단리될 수 있고, 공지된 방법 (예를 들어, 유럽 특허 번호 EP497524 및 EP497525 참조); 및 바람직하게는 균질화기를 사용하여 수행되는 미세유동화에 의해 또는 화학적 가수분해에 의해 어느 정도 크기조정될 수 있다. 한 실시양태에서, 각각의 폐렴구균 폴리사카라이드 혈청형은 대두-기재 배지에서 성장된다. 이어서 개별 폴리사카라이드가 원심분리, 침전 및 한외여과를 포함한 표준 단계를 통해 정제된다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2008/0286838 및 미국 특허 번호 5,847,112를 참조한다. 폴리사카라이드는 폴리사카라이드 샘플 내의 점도를 감소시키고/거나 접합된 생성물의 여과성을 개선시키기 위해 기계적 또는 화학적 크기조정과 같은 기술을 사용하여 크기조정될 수 있다. 화학적 가수분해는 아세트산을 사용하여 수행될 수 있다. 기계적 크기조정은 고압 균질화 전단을 사용하여 수행될 수 있다.
정제된 폴리사카라이드는 사카라이드가 담체 단백질과 반응할 수 있게 되도록 화학적으로 활성화될 수 있다. 정제된 폴리사카라이드는 링커에 연결될 수 있다. 활성화되거나 링커에 연결되면, 각각의 피막 폴리사카라이드는 담체 단백질에 개별적으로 접합되어 당접합체를 형성한다. 폴리사카라이드 접합체는 공지된 커플링 기술에 의해 제조될 수 있다.
폴리사카라이드는 링커에 커플링되어 폴리사카라이드-링커 중간체를 형성할 수 있으며, 여기서 링커의 유리 말단은 에스테르 기이다. 따라서, 링커는 적어도 1개의 말단이 에스테르 기인 것이다. 다른 말단은 폴리사카라이드와 반응하여 폴리사카라이드-링커 중간체를 형성할 수 있도록 선택된다.
폴리사카라이드는 폴리사카라이드 내의 1급 아민 기를 사용하여 링커에 커플링될 수 있다. 이 경우에, 링커는 전형적으로 두 말단에 에스테르 기를 갖는다. 이는 에스테르 기 중 하나를 폴리사카라이드 내의 1급 아민 기와 친핵성 아실 치환에 의해 반응시킴으로써 커플링이 일어나게 한다. 반응은 폴리사카라이드가 아미드 연결을 통해 링커에 커플링된 폴리사카라이드-링커 중간체를 생성한다. 따라서, 링커는 폴리사카라이드 내의 1급 아민 기와 반응하기 위한 제1 에스테르 기 및 담체 분자 내의 1급 아민 기와 반응하기 위한 제2 에스테르 기를 제공하는 이관능성 링커이다. 전형적인 링커는 아디프산 N-히드록시숙신이미드 디에스테르 (SIDEA)이다.
커플링은 또한 간접적으로, 즉 링커에 커플링하기 전에 폴리사카라이드를 유도체화하기 위해 사용되는 추가의 링커를 사용하여 수행될 수 있다.
폴리사카라이드는 폴리사카라이드의 환원 말단에서 카르보닐 기를 사용하여 추가의 링커에 커플링된다. 이러한 커플링은 2개의 단계: (a1) 카르보닐 기를 추가의 링커와 반응시키는 단계; 및 (a2) 추가의 링커의 유리 말단을 링커와 반응시키는 단계를 포함한다. 이들 실시양태에서, 추가의 링커는 전형적으로 두 말단에 1급 아민 기를 갖고, 이에 의해 1급 아민 기 중 하나를 폴리사카라이드 내의 카르보닐 기와 환원성 아미노화에 의해 반응시킴으로써 단계 (a1)이 일어나도록 한다. 폴리사카라이드 내의 카르보닐 기와 반응성인 1급 아민 기가 사용된다. 히드라지드 또는 히드록실아미노 기가 적합하다. 동일한 1급 아민 기가 전형적으로 추가의 링커의 두 말단에 존재한다. 반응은 폴리사카라이드-추가의 링커 중간체를 생성하며, 여기서 폴리사카라이드는 C-N 연결을 통해 추가의 링커에 커플링된다.
폴리사카라이드는 폴리사카라이드 내의 상이한 기, 특히 카르복실 기를 사용하여 추가의 링커에 커플링될 수 있다. 이러한 커플링은 2개의 단계: (a1) 기를 추가의 링커와 반응시키는 단계; 및 (a2) 추가의 링커의 유리 말단을 링커와 반응시키는 단계를 포함한다. 이 경우에, 추가의 링커는 전형적으로 두 말단에 1급 아민 기를 갖고, 이에 의해 1급 아민 기 중 하나를 폴리사카라이드 내의 카르복실 기와 EDAC 활성화에 의해 반응시킴으로써 단계 (a1)이 일어나도록 한다. 폴리사카라이드 내의 EDAC-활성화된 카르복실 기와 반응성인 1급 아민 기가 사용된다. 히드라지드 기가 적합하다. 동일한 1급 아민 기가 전형적으로 추가의 링커의 두 말단에 존재한다. 반응은 폴리사카라이드-추가의 링커 중간체를 생성하며, 여기서 폴리사카라이드는 아미드 연결을 통해 추가의 링커에 커플링된다.
한 실시양태에서, 폴리사카라이드의 화학적 활성화 및 후속 환원성 아미노화에 의한 담체 단백질에의 접합은 미국 특허 번호 4,365,170, 4,673,574 및 4,902,506, 미국 특허 출원 공개 번호 2006/0228380, 2007/184072, 2007/0231340 및 2007/0184071, 및 WO2006/110381, WO2008/079653 및 WO2008/143709에 기재된 수단에 의해 달성될 수 있다. 화학은 말단 히드록실 기를 알데히드로 산화시키는 임의의 산화제, 예컨대 퍼아이오데이트 (소듐 퍼아이오데이트, 포타슘 퍼아이오데이트 또는 퍼아이오딘산 포함)와 반응시켜, 폐렴구균 폴리사카라이드를 활성화시키는 것을 포함할 수 있다. 반응은 탄수화물의 이웃자리 히드록실 기의 무작위 산화적 절단과 반응성 알데히드 기의 형성을 유도한다.
담체 단백질에 대한 커플링은 단백질의 리실 기에 대한 직접적 아미노화를 통한 환원성 아미노화에 의한 것이다. 예를 들어, 접합은 활성화된 폴리사카라이드 및 담체 단백질의 혼합물을 니켈의 존재 하에 환원제, 예컨대 소듐 시아노보로히드라이드와 반응시킴으로써 수행될 수 있다. 접합 반응은 수용액 하에 또는 DMSO의 존재 하에 일어날 수 있다. 예를 들어, US2015/0231270, US2011/0195086 및 EP 0471 177 B1을 참조한다. 이어서 미반응 알데히드는 강한 환원제, 예컨대 소듐 보로히드라이드의 첨가에 의해 캡핑된다.
환원성 아미노화는 2 단계, (1) 폴리사카라이드를 산화시켜 반응성 알데히드를 형성하는 단계, (2) 활성화된 폴리사카라이드와 담체 단백질 사이에 형성된 이민 (쉬프 염기)을 환원시켜 안정한 아민 접합체 결합을 형성하는 단계를 포함한다. 산화 전에, 폴리사카라이드는 임의로 크기 감소된다. 기계적 방법 (예를 들어 균질화) 또는 화학적 가수분해가 사용될 수 있다. 화학적 가수분해는 아세트산을 사용하여 수행될 수 있다. 산화 단계는 퍼아이오데이트와의 반응을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적상, 용어 "퍼아이오데이트"는 퍼아이오데이트 및 퍼아이오딘산을 둘 다 포함하고; 용어는 또한 메타퍼아이오데이트 (IO4 -) 및 오르토퍼아이오데이트 (IO6 -)를 둘 다 포함하며 퍼아이오데이트의 다양한 염 (예를 들어, 소듐 퍼아이오데이트 및 포타슘 퍼아이오데이트)을 포함한다. 한 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 메타퍼아이오데이트의 존재 하에, 바람직하게는 소듐 퍼아이오데이트 (NaIO4)의 존재 하에 산화된다. 또 다른 실시양태에서, 피막 폴리사카라이드는 오르토퍼아이오데이트의 존재 하에, 바람직하게는 퍼아이오딘산의 존재 하에 산화된다.
한 실시양태에서, 산화제는 1급 히드록실을 선택적으로 산화시키기 위한 산화제의 존재 하에 안정한 니트록실 또는 니트록시드 라디칼 화합물, 예컨대 피페리딘-N-옥시 또는 피롤리딘-N-옥시 화합물이다 (예를 들어, WO 2014/097099에 기재된 바와 같음). 상기 반응에서, 실제 산화제는 촉매 사이클에서 N-옥소암모늄 염이다. 한 측면에서, 상기 안정한 니트록실 또는 니트록시드 라디칼 화합물은 피페리딘-N-옥시 또는 피롤리딘-N-옥시 화합물이다. 한 측면에서, 상기 안정한 니트록실 또는 니트록시드 라디칼 화합물은 TEMPO (2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시) 또는 PROXYL (2,2,5,5-테트라메틸-1-피롤리디닐옥시) 모이어티를 보유한다. 한 측면에서, 상기 안정한 니트록실 라디칼 화합물은 TEMPO 또는 그의 유도체이다. 한 측면에서, 상기 산화제는 N-할로 모이어티를 보유하는 분자이다. 한 측면에서, 상기 산화제는 N-클로로숙신이미드, N-브로모숙신이미드, N-아이오도숙신이미드, 디클로로이소시아누르산, 1,3,5-트리클로로-1,3,5-트리아지난-2,4,6-트리온, 디브로모이소시아누르산, 1,3,5-트리브로모-1,3,5-트리아지난-2,4,6-트리온, 디아이오도이소시아누르산 및 1,3,5-트리아이오도-1,3,5-트리아지난-2,4,6-트리온으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는 상기 산화제는 N-클로로숙신이미드이다.
특정 측면에서, 산화제는 공산화제로서의 2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시 (TEMPO) 자유 라디칼 및 N-클로로숙신이미드 (NCS)이다 (WO2014/097099에 기재된 바와 같음). 따라서, 한 측면에서, 에스. 뉴모니아에로부터의 당접합체는 a) 수성 용매 중에서 사카라이드를 2,2,6,6-테트라메틸-1-피페리디닐옥시 (TEMPO) 및 N-클로로숙신이미드 (NCS)와 반응시켜 활성화된 사카라이드를 생성하는 단계; 및 b) 활성화된 사카라이드를 1개 이상의 아민 기를 포함하는 담체 단백질과 반응시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득가능하다 (상기 방법은 이하에서 "TEMPO/NCS-환원성 아미노화"로 지정됨).
임의로, 산화 반응물은 켄칭제의 첨가에 의해 켄칭된다. 켄칭제는 이웃자리 디올, 1-,2-아미노알콜, 아미노산, 글루타티온, 술파이트, 비술페이트, 디티오나이트, 메타비술파이트, 티오술페이트, 포스파이트, 하이포포스파이트 또는 아인산 (예컨대 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로판-1-,2-디올, 부탄-1,2-디올 또는 부탄-2,3-디올, 아스코르브산)으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 비양성자성 용매 중에서의 접합 반응을 이용하여 혈청형 8 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 접합 반응은 시아노보로히드라이드를 사용하지 않는다. 추가 실시양태에서, 접합 반응은 쉬프 염기 환원 또는 환원성 아미노화이다. 추가 실시양태에서, 단백질은 파상풍 톡소이드, 디프테리아 톡소이드 또는 CRM197이다. 추가 실시양태에서, 단백질은 CRM197이다. 추가 실시양태에서, 접합 반응은 환원성 아미노화이다. 추가 실시양태에서, 환원성 아미노화는 디메틸술폭시드 (DMSO) 중에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 접합 전의 산화된 폴리사카라이드는 30 kDa 내지 1,000 kDa의 분자량을 갖는다. 분자량은 다중각도 광 산란 검출기 (MALS) 및 굴절률 검출기 (RI)와 조합된 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 계산될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리사카라이드는 50 kDa 내지 300 kDa의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 폴리사카라이드는 50 kDa 내지 1,000 kDa의 분자량을 갖는다. 추가의 실시양태에서, 폴리사카라이드는 70 kDa 내지 900 kDa의 분자량을 갖는다. 다른 실시양태에서, 폴리사카라이드는 100 kDa 내지 800 kDa의 분자량을 갖는다. 다른 실시양태에서, 폴리사카라이드는 200 kDa 내지 600 kDa의 분자량을 갖는다. 추가 실시양태에서, 폴리사카라이드는 100 kDa 내지 1,000 kDa; 100 kDa 내지 900 kDa; 100 kDa 내지 800 kDa; 100 kDa 내지 700 kDa; 100 kDa 내지 600 kDa; 100 kDa 내지 500 kDa; 100 kDa 내지 400 kDa; 100 kDa 내지 300 kDa; 150 kDa 내지 1,000 kDa; 150 kDa 내지 900 kDa; 150 kDa 내지 800 kDa; 150 kDa 내지 700 kDa; 150 kDa 내지 600 kDa; 150 kDa 내지 500 kDa; 150 kDa 내지 400 kDa; 150 kDa 내지 300 kDa; 200 kDa 내지 1,000 kDa; 200 kDa 내지 900 kDa; 200 kDa 내지 800 kDa; 200 kDa 내지 700 kDa; 200 kDa 내지 600 kDa; 200 kDa 내지 500 kDa; 200 kDa 내지 400 kDa; 200 kDa 내지 300; 250 kDa 내지 1,000 kDa; 250 kDa 내지 900 kDa; 250 kDa 내지 800 kDa; 250 kDa 내지 700 kDa; 250 kDa 내지 600 kDa; 250 kDa 내지 500 kDa; 250 kDa 내지 400 kDa; 250 kDa 내지 350 kDa; 300 kDa 내지 1 ,000 kDa; 300 kDa 내지 900 kDa; 300 kDa 내지 800 kDa; 300 kDa 내지 700 kDa; 300 kDa 내지 600 kDa; 300 kDa 내지 500 kDa; 300 kDa 내지 400 kDa; 400 kDa 내지 1,000 kDa; 400 kDa 내지 900 kDa; 400 kDa 내지 800 kDa; 400 kDa 내지 700 kDa; 400 kDa 내지 600 kDa; 500 kDa 내지 600 kDa의 분자량을 갖는다.
접합 공정의 제2 단계는 환원제를 사용하여 활성화된 폴리사카라이드와 담체 단백질 사이의 이민 (쉬프 염기) 결합을 환원시켜 안정한 접합체 결합을 형성하는 것이다 (소위 환원성 아미노화). 적합한 환원제는 시아노보로히드라이드 (예컨대 소듐 시아노보로히드라이드 또는 소듐 보로히드라이드)를 포함한다. 한 실시양태에서, 환원제는 소듐 시아노보로히드라이드이다.
특정 실시양태에서, 환원성 아미노화 반응은 비양성자성 용매 (또는 비양성자성 용매의 혼합물) 중에서 수행된다. 한 실시양태에서, 환원 반응은 DMSO 또는 DMF (디메틸포름아미드) 용매 중에서 수행된다. DMSO 또는 DMF 용매는 동결건조된 경우의 활성화된 폴리사카라이드 및 담체 단백질을 재구성하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 비양성자성 용매는 DMSO이다.
환원 반응의 종료시에, 접합체에 미반응 알데히드 기가 남아있을 수 있으며, 이는 적합한 캡핑제를 사용하여 캡핑될 수 있다. 한 실시양태에서, 이러한 캡핑제는 소듐 보로히드라이드 (NaBH4)이다. 적합한 대안물은 브뢴스테드 또는 루이스 산의 존재 하에 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 또는 소듐 또는 아연 보로히드라이드, 아민 보란, 예컨대 피리딘 보란, 2-피콜린 보란, 2,6-디보란-메탄올, 디메틸아민-보란, t-BuMe'PrN-BH3, 벤질아민-BH3 또는 5-에틸-2-메틸피리딘 보란 (PEMB) 또는 보로히드라이드 교환 수지를 포함한다. 접합 (환원 반응 및 임의로 캡핑) 후에, 당접합체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 기술에 의해 정제될 수 있다 (폴리사카라이드-단백질 접합체의 양이 풍부해짐). 이들 기술은 투석, 농축/투석여과 작업, 접선 흐름 여과, 침전/용리, 칼럼 크로마토그래피 (이온 교환 크로마토그래피, 다중모드 이온 교환 크로마토그래피, DEAE 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피), 및 심층 여과를 포함한다. 한 실시양태에서, 당접합체는 투석여과 또는 이온 교환 크로마토그래피 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제된다.
비양성자성 용매 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 제조된 당접합체가 일반적으로 다가 폐렴구균 접합체 백신에 사용된다. 따라서, 모든 혈청형이 비양성자성 용매 중에서 제조되지는 않은 다가 조성물에 대한 특정 실시양태에서, 남아있는 혈청형에 대한 환원 반응은 수성 용매 (예를 들어, PBS (포스페이트 완충 염수), MES (2-(N-모르폴리노)에탄술폰산), HEPES, (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), 비스-트리스, ADA (N-(2-아세트아미도)이미노디아세트산), PIPES (피페라진-N,N'-비스(2-에탄술폰산)), MOPSO (3-모르폴리노-2-히드록시프로판술폰산), BES (N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산), MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판술폰산), DIPSO (3-비스(2-히드록시에틸)아미노-2-히드록시프로판-1-술폰산), MOBS (4-(N-모르폴리노)부탄술폰산), HEPPSO (N-(2-히드록시에틸)피페라진-N-(2-히드록시프로판술폰산)), POPSO (피페라진-1,4-비스(2-히드록시-3-프로판술폰산)), TEA (트리에탄올아민), EPPS (4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-프로판술폰산), 비신 (pH 6.0 내지 8.5, 7.0 내지 8.0, 또는 7.0 내지 7.5)로부터 선택됨) 중에서 수행된다.
비양성자성 용매 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 제조될 수 있는 에스. 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드-단백질 접합체는 혈청형: 3, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 19A, 20A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 31, 33F, 35B 및 39를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 비양성자성 용매 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 제조될 수 있는 에스. 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드-단백질 접합체는 혈청형: 3, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 19A, 20, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 31, 33F, 35B 및 39를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 비양성자성 용매 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 제조될 수 있는 에스. 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드-단백질 접합체는 혈청형: 3, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 19A, 20B, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 31, 33F, 35B 및 39를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리사카라이드는 올리고사카라이드의 형태로 사용될 수 있다. 이들은 편리하게는 정제된 폴리사카라이드의 단편화에 의해 (예를 들어 가수분해에 의해) 형성되고, 이후 통상적으로 목적하는 크기의 단편의 정제가 이어질 것이다.
특정 실시양태에서, 혈청형 3, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 19A, 20A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 31, 33F, 35B 및 39 중 1종 이상의 폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체는 비양성자성 용매 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 제조된다. 특정 실시양태에서, 혈청형 3, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 19A, 20, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 31, 33F, 35B 및 39 중 1종 이상의 폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체는 비양성자성 용매 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 제조된다. 특정 실시양태에서, 혈청형 3, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 19A, 20B, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 31, 33F, 35B 및 39 중 1종 이상의 폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체는 비양성자성 용매 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 제조된다. 특정 실시양태에서, 다가 면역원성 조성물 내의 각각의 혈청형은 비양성자성 용매 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 제조된다. 특정 실시양태에서, 다가 조성물 내의 1종 이상의 혈청형의 폴리사카라이드는 비양성자성 용매 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 접합되고, 1종 이상의 혈청형의 폴리사카라이드는 수성 용매 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 접합된다. 특정 실시양태에서, 다가 조성물 내의 2종 이상의 혈청형의 폴리사카라이드는 비양성자성 용매 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 접합된다. 다른 실시양태에서, 다가 조성물 내의 3종 이상, 4종 이상, 5종 이상, 6종 이상, 7종 이상, 8종 이상, 9종 이상, 10종 이상, 11종 이상, 12종 이상, 13종 이상, 14종 이상, 15종 이상, 16종 이상, 17종 이상, 18종 이상, 19종 이상, 20종 이상 또는 21종 이상의 혈청형의 폴리사카라이드는 비양성자성 용매 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 접합된다. 특정 실시양태에서, 다가 조성물 내의 1종 이상의 혈청형으로부터의 폴리사카라이드는 비양성자성 용매 중에 또는 수성 용매 중에 존재할 수 있는 다른 화학을 사용하여 접합된다.
따라서, 본 발명은 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 각각 포함하는 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하는 다가 면역원성 조성물에 관한 것이며, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 본원에 (즉, 섹션 II, "다가 면역원성 조성물"에) 기재된 바와 같고, 여기서 폴리사카라이드 단백질 접합체 중 1종 이상으로부터의 폴리사카라이드를 담체 단백질에 접합시키는 접합 반응은 비양성자성 용매 중에서 이루어진다. 특정 실시양태에서, 다가 조성물 내의 적어도 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100%의 혈청형이 비양성자성 용매 중에서 제조된다. 나머지 혈청형은 대안적 화학을 사용하여 및/또는 수성 용매 중에서 제조된다.
폴리사카라이드-단백질 접합체의 환원성 아미노화 동안 용매로서 DMSO를 사용하는 것은 수성 조건 하에 제조된 동일한 접합체에 비해 상기 혈청형에 대한 예상외로 우수한 안정성 및 증진된 면역원성을 가져오는 것으로 결정되었다 (미국 출원 일련 번호 62/463,216 및 62/555,444 참조). 본원에 제시된 바와 같이 (실시예 40 참조), 비양성자성 용매 (예를 들어 DMSO) 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 제조된 본 발명의 폐렴구균 접합체를 함유하는 약물 제품 제제는 접합 공정에서 환원성 아미노화 동안 양성자성 (즉 수성) 용매를 사용하여 제조된 약물 물질을 이용하는 백신과 비교하여 우수한 물리적 및 화학적 안정성을 가져왔다. 따라서, 일부 실시양태에서, 다가 조성물 내의 모든 폐렴구균 폴리사카라이드 접합체는 비양성자성 용매 중에서 제조된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 조성물 내의 총 폴리사카라이드 농도는 약 0.02 내지 약 0.175 mg/mL이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 조성물 내의 총 폴리사카라이드 농도는 약 0.03 내지 약 0.175 mg/mL이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 조성물 내의 총 폴리사카라이드 농도는 약 0.04 내지 약 0.175 mg/mL이다. 다른 실시양태에서, 조성물 내의 총 폴리사카라이드 농도는 약 0.065 내지 약 0.085 mg/mL, 약 0.070 내지 약 0.080 mg/mL, 약 0.065 내지 약 0.080 mg/mL, 약 0.070 내지 약 0.085 mg/mL, 약 0.110 내지 약 0.128 mg/mL, 약 0.110 내지 약 0.175 mg/mL, 약 0.10 내지 약 0.175 mg/mL, 약 0.110 내지 약 0.170 mg/mL, 약 0.115 내지 약 0.15 mg/mL, 약 0.110 내지 약 0.15 mg/mL, 약 0.110 내지 약 0.125 mg/mL, 약 0.150 내지 약 0.170 mg/mL, 약 0.150 내지 약 0.165 mg/mL, 약 0.140 내지 약 0.170 mg/mL, 약 0.130 내지 약 0.170 mg/mL, 약 0.150 내지 약 0.175 mg/mL, 약 0.070 내지 약 0.170 mg/mL, 약 0.065 내지 약 0.175 mg/mL, 또는 약 0.065 내지 약 0.180 mg/mL이다.
다가 면역원성 조성물 내의 폴리사카라이드-단백질 접합체 중 1종 이상 또는 모두가 비양성자성 용매 중에서 제조되는 본 발명의 실시양태에서, 조성물 내의 총 폴리사카라이드 농도는 37℃에서 4주 이상, 25℃에서 4주 이상 및 4℃에서 12주 이상 동안 안정하다.
다가 면역원성 조성물 내의 폴리사카라이드-단백질 접합체 중 1종 이상 또는 모두가 비양성자성 용매 중에서 제조되는 본 발명의 특정 실시양태에서, 조성물 내의 모든 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체의 중량 평균 분자량 (Mw) (조성물 내의 모든 접합체의 평균)은 약 3,500 내지 약 4,700 kDa, 약 3,500 내지 약 4,600 kDa, 약 3,500 내지 약 4,500 kDa, 약 3,500 내지 약 4,400 kDa, 약 3,500 내지 약 4,300 kDa, 약 3,500 내지 약 4,200 kDa, 약 3,600 내지 약 4,700 kDa, 약 3,600 내지 약 4,600 kDa, 약 3,600 내지 약 4,500 kDa, 약 3,600 내지 약 4,400 kDa, 약 3,600 내지 약 4,300 kDa, 약 3,600 내지 약 4,200 kDa, 약 3,700 내지 약 4,700 kDa, 약 3,700 내지 약 4,600 kDa, 약 3,700 내지 약 4,500 kDa, 약 3,700 내지 약 4,400 kDa, 약 3,700 내지 약 4,300 kDa, 약 3,700 내지 약 4,200 kDa, 약 3,800 내지 약 4,700 kDa, 약 3,800 내지 약 4,600 kDa, 약 3,800 내지 약 4,500 kDa, 약 3,800 내지 약 4,400 kDa, 약 3,800 내지 약 4,300 kDa, 약 3,800 내지 약 4,200 kDa, 약 3,900 내지 약 4,700 kDa, 약 3,900 내지 약 4,600 kDa, 약 3,900 내지 약 4,500 kDa, 약 3,900 내지 약 4,400 kDa, 약 3,900 내지 약 4,300 kDa, 또는 약 3,900 내지 약 4,200 kDa이다.
다가 면역원성 조성물 내의 폴리사카라이드-단백질 접합체가 비양성자성 용매 중에서 제조되는 본 발명의 특정 실시양태에서, 조성물 내의 각각의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체의 Mw (단일 혈청형에 대한 것)는 약 1,000 내지 약 10,000 kDa, 약 1,500 내지 약 5,500 kDa, 약 1,500 내지 약 5,600 kDa, 약 1,500 내지 약 5,700 kDa, 약 1,500 내지 약 5,800 kDa, 약 1,500 내지 약 5,900 kDa, 약 1,500 내지 약 6,000 kDa, 약 1,000 내지 약 5,500 kDa, 약 1,000 내지 약 5,000 kDa, 약 1,000 내지 약 4,000 kDa, 약 1,000 내지 약 4,500 kDa, 약 1,000 내지 약 4,000 kDa, 또는 약 1,000 내지 약 3,500 kDa이다. 다른 실시양태에서, 조성물 내의 단일 혈청형으로부터의 접합체의 Mw는 약 1,000 kDa, 약 1,100 kDa, 약 1,200 kDa, 약 1,300 kDa, 약 1,400 kDa, 약 1,500 kDa, 약 1,600 kDa, 약 1,700 kDa, 약 1,800 kDa, 약 1,900 kDa, 약 2,000 kDa, 약 2,100 kDa, 약 2,200 kDa, 약 2,300 kDa, 약 2,400 kDa, 약 2,500 kDa, 약 2,600 kDa, 약 2,700 kDa, 약 2,800 kDa, 약 2,900 kDa, 약 3,000 kDa, 약 3,100 kDa, 약 3,200 kDa, 약 3,300 kDa, 약 3,400 kDa, 약 3,500 kDa, 약 3,600 kDa, 약 3,700 kDa, 약 3,800 kDa, 약 3,900 kDa, 약 4,000 kDa, 약 4,100 kDa, 약 4,200 kDa, 약 4,300 kDa, 약 4,400 kDa, 약 4,500 kDa, 약 4,600 kDa, 약 4,700 kDa, 약 4,800 kDa, 약 4,900 kDa, 약 5,000 kDa, 약 5,100 kDa, 약 5,200 kDa, 약 5,300 kDa, 약 5,400 kDa, 또는 약 5,500 kDa이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 다가 면역원성 조성물 내의 폴리사카라이드-단백질 접합체는 비양성자성 용매 중에서 제조된다. 비양성자성 용매 중에서 담체 단백질에 접합된 보다 높은 백분율의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드를 함유하는 조성물 (양성자성 용매 중에서 제조된 것과 대조적으로)이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, 비양성자성 용매 중에서 제조된 에스. 뉴모니아에 혈청형 특이적 접합체의 백분율 (비양성자성 용매 중에서 제조된 폴리사카라이드 혈청형의 수를 폴리사카라이드 혈청형의 총수로 나누어 계산된 것이며, 여기서 총수는 비양성자성 용매 또는 양성자성 용매 중에서 제조된 것을 포함함)은 50% 초과 또는 60% 초과 또는 70% 초과 또는 80% 초과 또는 90% 초과 또는 100%일 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 조성물 내의 혈청형 3 폴리사카라이드-단백질 접합체는 비양성자성 용매 중에서 제조되고, 상기 접합체의 Mw는 약 1,000 내지 약 5,000 kDa, 또는 약 1,000 내지 약 4,000 kDa, 또는 약 1,000 내지 약 3,000 kDa, 또는 약 1,000 내지 약 2,500 kDa, 또는 약 1,000 내지 약 2,000 kDa이다.
다가 면역원성 조성물 내의 폴리사카라이드-단백질 접합체 중 1종 이상 또는 모두가 비양성자성 용매 내에서 제조되는 본 발명의 특정 실시양태에서, 조성물 내의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체의 수 평균 분자량 (Mn) (조성물 내의 모든 접합체의 평균)은 약 900 내지 약 3,000 kDa, 약 1,000 내지 약 3,000 kDa, 약 1,000 내지 약 2,500 kDa, 약 1,500 내지 약 2,500 kDa, 약 1,800 내지 약 2,500 kDa, 약 1,900 내지 약 2,500 kDa, 또는 약 2,000 내지 약 2,500 kDa이다.
다가 면역원성 조성물 내의 폴리사카라이드-단백질 접합체 중 1종 이상 또는 모두가 비양성자성 용매 중에서 제조되는 본 발명의 특정 실시양태에서, 조성물 내의 각각의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체의 Mn (단일 혈청형에 대한 것)은 약 700 내지 약 7,000 kDa, 약 1,000 내지 약 6,000 kDa, 약 1,000 내지 약 5,000 kDa, 약 1,000 내지 약 4,000 kDa, 약 1,000 내지 약 3,000 kDa, 약 900 내지 약 5,500 kDa, 약 900 내지 약 5,000 kDa, 약 900 내지 약 4,500 kDa, 약 900 내지 약 4,000 kDa, 약 900 내지 약 3,500 kDa, 또는 약 900 내지 약 3,000 kDa이다.
본 발명의 실시양태에서, 조성물 내의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체의 Mw 및/또는 Mn은 37℃에서 4주 이상, 25℃에서 4주 이상, 및/또는 4℃에서 12주 이상 동안 안정하다.
본 발명의 실시양태에서, 폴리사카라이드 농도, Mw 및/또는 Mn은 HPSEC UV/MALS/RI를 사용하여 결정된다.
다가 면역원성 조성물 내의 폴리사카라이드-단백질 접합체 중 1종 이상 또는 모두가 비양성자성 용매 중에서 제조되는 본 발명의 일부 실시양태에서, 280 나노미터 (nm)에서의 여기 파장에 의한 고유 단백질 형광 분광분석법을 사용하여 측정된 조성물의 방출 최대치는 약 335 nm 내지 약 342 nm이다. 일부 실시양태에서, 방출 최대치는 약 335 nm에서 약 342 nm로 유지되고, 형광 강도는 37℃에서 적어도 1주 동안 안정하다. 일부 실시양태에서, 방출 최대치는 약 335 nm에서 약 342 nm로 유지되고, 형광 강도는 37℃에서 1주 동안 안정하다.
일부 실시양태에서, 다가 조성물 내의 모든 폐렴구균 폴리사카라이드 접합체는 DMSO 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 제조된다. 특정 하위실시양태에서, 모두 DMSO를 사용하여 제조된 폴리사카라이드 접합체를 포함하는 다가 조성물은 아주반트를 포함하지 않는다.
어떠한 이론에 얽매이지는 않지만, DMSO 중에서 제조된 당접합체에 의해 관찰된 증진된 면역원성에 대한 하나의 가능한 메카니즘은 탄수화물 (피막 폴리사카라이드)과 담체 단백질의 표면 상의 리신 잔기 사이의 증가된 수의 연결을 포함하며, 이는 단백질과 폴리사카라이드 사이의 추가의 부착 지점을 생성하여 안정성을 부여하고 펩티드 탄수화물 결합의 화학적 탈중합 또는 파괴를 상쇄시킬 것이다. 예를 들어, 문헌 [Hsieh, Characterization of Saccharide-CRM197 Conjugate Vaccines in Brown F, Corbel M, Griffiths E (eds): Physico-Chemical Procedures for the Characterization of Vaccines. Dev. Biol. Basel, Karger, 2000, vol 103, pp. 93-104]을 참조한다. DMSO 용매 중에서의 접합 동안 생성되는 증가된 폴리사카라이드-단백질 연결의 추가의 이익은 T-세포에 대한 펩티드-탄수화물의 성공적인 제시의 추가의 기회일 수 있다. 탄수화물 항원에 접합된 특정 펩티드 서열의 로딩 또는 그와의 회합 능력 및 감수성의 변경을 유발하는 인간 집단에서의 유전적 가변성으로 인해, 담체 단백질 상의 추가의 부착 지점은 항원 제시 세포 (APC)의 표면에서의 성공적인 항원 제시의 가능성을 증가시켜 다른 T-세포 독립적 항원에 대한 T-세포 의존성 반응을 가능하게 할 것임이 인지될 수 있다. DMSO 용매 중에서의 접합에 의해 관찰된 증진된 면역원성의 또 다른 가능한 메카니즘은 유기 용매 중에서의 CRM197의 변성으로 인한 것일 수 있고, 이는 폴리사카라이드 연결을 위한 추가의 리신을 노출시켜, 상이한 펩티드 에피토프에 대한 T-세포 의존성 반응을 위한 APC의 표면에서의 글리코펩티드 제시의 증가된 가능성을 제공한다. 문헌 [Avci et al., 2011, Nature Medicine 17: 1602-1610]을 참조한다.
접합체 내의 변성된 CRM197을 생성하는 유기 용매 중에서의 접합의 또 다른 이익은 천연 CRM197 에피토프에 대한 항체의 감소된 면역학적 간섭일 수 있다. DMSO 용매 중에서의 접합 동안 생성되는 증가된 폴리사카라이드-단백질 연결의 추가의 이익은 보다 큰 크기의 폴리사카라이드 단백질 접합체가 형성되어 증진된 면역원성을 가져올 수 있다는 것이다. 본 발명의 조성물은 인간 반응을 도출하는데 상당한 이점을 제공하는 것으로 여겨진다.
특정 실시양태에서, 접합 반응은 보다 큰 접합 반응 효율을 위해 및 유리 시아나이드 제거를 보조하는데 니켈이 사용되는 환원성 아미노화에 의해 수행된다. 전이 금속은 시아나이드와 안정한 착물을 형성하는 것으로 공지되어 있고, 소듐 시아노보로히드라이드에 의한 단백질 아미노 기 및 포름알데히드의 환원성 메틸화를 개선시키는 것으로 공지되어 있다 (S Gidley et al., Biochem J. 1982, 203: 331-334; Jentoft et al. Anal Biochem. 1980, 106: 186-190). 니켈의 첨가는, 잔류 억제성 시아나이드와 착물을 형성함으로써, 접합 동안 단백질의 소비를 증가시키고 보다 큰, 잠재적으로 보다 면역원성인 접합체의 형성을 유도한다.
소듐 시아노보로히드라이드 시약 로트에서 출발 시아나이드 수준의 차이는 또한 일관되지 않은 접합 성능을 초래하여, 가변적인 생성물 속성, 예컨대 접합체 크기 및 접합체 Ps-대-CRM197 비를 유발한다. 니켈의 첨가는 시아나이드와의 착물형성에 의해 접합 비일관성을 감소시켜 소듐 시아노보로히드라이드 로트의 차이를 제거하였다.
적합한 대안적 화학은 사카라이드를 1-시아노-4-디메틸아미노 피리디늄 테트라플루오로보레이트 (CDAP)로 활성화시켜 시아네이트 에스테르를 형성하는 것을 포함한다. 따라서, 활성화된 사카라이드는 직접적으로 또는 스페이서 (링커) 기를 통해 담체 단백질 상의 아미노 기에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 스페이서가 시스타민 또는 시스테아민이어서 티올화된 폴리사카라이드를 제공할 수 있으며, 이는 말레이미드-활성화된 담체 단백질 (예를 들어 GMBS를 사용함) 또는 할로아세틸화된 담체 단백질 (예를 들어 아이오도아세트이미드 [예를 들어, 에틸 아이오도아세트이미드 HCl] 또는 N-숙신이미딜 브로모아세테이트 또는 SIAB, 또는 SIA, 또는 SBAP를 사용함)과의 반응 후에 수득된 티오에테르 연결을 통해 담체에 커플링될 수 있다. 바람직하게는, 시아네이트 에스테르 (임의로 CDAP 화학에 의해 제조됨)는 헥산 디아민 또는 아디프산 디히드라지드 (ADH)와 커플링되고, 아미노-유도체화된 사카라이드는 카르보디이미드 (예를 들어 EDAC 또는 EDC) 화학을 사용하여 담체 단백질 상의 카르복실 기를 통해 담체 단백질에 접합된다. 이러한 접합체는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 93/15760, WO 95/08348 및 WO 96/29094; 및 문헌 [Chu et al., 1983, Infect. Immunity 40:245-256]에 기재되어 있다.
다른 적합한 기술은 카르보디이미드, 히드라지드, 활성 에스테르, 노르보란, p-니트로벤조산, N-히드록시숙신이미드, S--NHS, EDC, TSTU를 사용한다. 다수가 국제 특허 출원 공개 번호 WO 98/42721에 기재되어 있다. 접합은 사카라이드의 유리 히드록실 기와 CDI의 반응에 의해 형성될 수 있는 카르보닐 링커를 포함할 수 있고 (문헌 [Bethell et al., 1979, J. Biol. Chem. 254:2572-4; Hearn et al., 1981, J. Chromatogr. 218:509-18] 참조), 이는 이어서 단백질과 반응하여 카르바메이트 연결을 형성할 수 있다. 이는 아노머 말단의 1급 히드록실 기로의 환원, 1급 히드록실 기의 임의적인 보호/탈보호, 1급 히드록실 기와 CDI와의 반응으로 CDI 카르바메이트 중간체 형성 및 CDI 카르바메이트 중간체와 단백질 상의 아미노 기와의 커플링을 포함할 수 있다.
피막 폴리사카라이드의 담체 단백질에 대한 접합 후, 폴리사카라이드-단백질 접합체는 1종 이상의 다양한 기술에 의해 정제된다 (폴리사카라이드-단백질 접합체의 양이 풍부해짐). 이들 기술의 예는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 농축/투석여과 작업, 한외여과, 침전/용리, 칼럼 크로마토그래피 및 심층 여과를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,146,902를 참조한다.
개별 당접합체가 정제된 후에, 이들은 배합되어 본 발명의 면역원성 조성물로 제제화된다. 이들 폐렴구균 접합체는 개별 공정에 의해 제조되고, 단일 투여 제제로 벌크 제제화된다.
본 발명의 당접합체를 특징화하기 위한 대안적 방법은 사카라이드에 접합되는 담체 단백질 (예를 들어, CRM197) 내의 리신 잔기의 수에 의하며, 이는 접합된 리신의 범위 (접합 정도)로 특징화될 수 있다. 폴리사카라이드에의 공유 연결로 인한 담체 단백질의 리신 변형에 대한 증거는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 상용 방법을 사용하는 아미노산 분석에 의해 얻어질 수 있다. 접합은 접합체 물질을 생성하는데 사용되는 담체 단백질 출발 물질과 비교하여 회수된 리신 잔기 수의 감소를 일으킨다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 당접합체의 접합 정도는 2 내지 15, 2 내지 13, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 3 내지 15, 3 내지 13, 3 내지 10, 3 내지 8, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 5 내지 15, 5 내지 10, 8 내지 15, 8 내지 12, 10 내지 15 또는 10 내지 12이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 당접합체의 접합 정도는 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14 또는 약 15이다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 당접합체의 접합 정도는 4 내지 7이다. 일부 이러한 실시양태에서, 담체 단백질은 CRM197이다.
본 발명의 조성물의 당접합체는 또한 사카라이드 대 담체 단백질 (Ps:Pr)의 비 (중량/중량)로 특징화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물 내의 당접합체의 담체 단백질에 대한 폴리사카라이드의 비 (w/w)는 0.5 내지 3.0 (예를 들어, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.1 , 약 1.2, 약 1.3, 약 1.4, 약 1.5, 약 1.6, 약 1.7, 약 1.8, 약 1.9, 약 2.0, 약 2.1 , 약 2.2, 약 2.3, 약 2.4, 약 2.5, 약 2.6, 약 2.7, 약 2.8, 약 2.9 또는 약 3.0)이다. 다른 실시양태에서, 담체 단백질에 대한 사카라이드 비 (w/w)는 0.5 내지 2.5, 0.5 내지 1.5, 0.8 내지 2.5, 0.5 내지 1.0, 1.0 내지 1.5, 1.0 내지 2.0, 0.8 내지 2.4, 0.8 내지 2.3, 0.8 내지 2.2, 0.8 내지 2.1, 0.8 내지 2.0, 0.8 내지 1.9, 0.8 내지 1.8, 0.8 내지 1.7, 0.8 내지 1.6, 0.8 내지 1.5, 0.8 내지 1.4, 0.8 내지 1.3, 0.9 내지 2.4, 0.9 내지 2.3, 0.9 내지 2.2, 0.9 내지 2.1, 0.9 내지 2.0, 0.9 내지 1.9, 0.9 내지 1.8, 0.9 내지 1.7, 0.9 내지 1.6, 0.9 내지 1.5, 0.9 내지 1.4, 0.9 내지 1.3, 0.9 내지 1.2, 1.0 내지 2.4, 1.0 내지 2.3, 1.0 내지 2.2, 1.0 내지 2.1, 1.0 내지 2.0, 1.0 내지 1.9, 1.0 내지 1.8, 1.0 내지 1.7, 1.0 내지 1.6, 1.0 내지 1.5, 1.0 내지 1.4, 1.0 내지 1.3 또는 1.0 내지 1.2이다. 추가 실시양태에서, 담체 단백질에 대한 사카라이드 비 (w/w)는 0.8 내지 1.2이다. 일부 이러한 실시양태에서, 담체 단백질은 CRM197이다. 본 발명의 당접합체 및 면역원성 조성물은 담체 단백질에 공유 접합되지 않지만 그럼에도 불구하고 당접합체 조성물에 존재하는 유리 사카라이드를 함유할 수 있다. 유리 사카라이드는 당접합체와 비-공유적으로 회합될 수 있다 (즉, 당접합체에 비-공유적으로 결합되거나, 그에 흡착되거나, 또는 그 내에 또는 그에 의해 포획될 수 있음).
구체적 실시양태에서, 혈청형 15A 접합체의 담체 단백질에 대한 사카라이드 비 (w/w)는 약 1.0 내지 약 2.0, 약 1.25 내지 약 1.75 또는 약 1.3 내지 약 1.7이다. 다른 실시양태에서, 혈청형 15A의 담체 단백질에 대한 사카라이드 비 (w/w)는 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7 또는 1.8이다.
구체적 실시양태에서, 혈청형 15C 접합체의 담체 단백질에 대한 사카라이드 비 (w/w)는 약 1.0 내지 약 2.0, 약 1.25 내지 약 1.75 또는 약 1.3 내지 약 1.7이다. 다른 실시양태에서, 혈청형 15C의 담체 단백질에 대한 사카라이드 비 (w/w)는 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7 또는 1.8이다.
구체적 실시양태에서, 혈청형 33F 접합체의 담체 단백질에 대한 사카라이드 비 (w/w)는 약 1.0 내지 약 2.0, 약 1.25 내지 약 1.75 또는 약 1.3 내지 약 1.7이다. 다른 실시양태에서, 혈청형 33F의 담체 단백질에 대한 사카라이드 비 (w/w)는 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7 또는 1.8이다.
구체적 실시양태에서, 혈청형 35B 접합체의 담체 단백질에 대한 사카라이드 비 (w/w)는 약 1.25 내지 약 2.25, 약 1.25 내지 약 2.0 또는 약 1.3 내지 약 1.8이다. 다른 실시양태에서, 혈청형 33B의 담체 단백질에 대한 사카라이드 비 (w/w)는 약 1.2, 1.3, 1.3, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 또는 2.0이다.
구체적 실시양태에서, 혈청형 24F 접합체의 담체 단백질에 대한 사카라이드 비 (w/w)는 약 0.5 내지 약 1.5, 약 0.75 내지 약 1.25 또는 약 0.8 내지 약 1.0이다. 다른 실시양태에서, 혈청형 24F의 담체 단백질에 대한 사카라이드 비 (w/w)는 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0이다.
바람직한 실시양태에서, 당접합체는 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 약 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20% 또는 15% 미만의 유리 폴리사카라이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 당접합체는 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 약 25% 미만의 유리 폴리사카라이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 당접합체는 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 약 20% 미만의 유리 폴리사카라이드를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 당접합체는 폴리사카라이드의 총량과 비교하여 약 15% 미만의 유리 폴리사카라이드를 포함한다.
IV. 사용 방법
본 발명의 실시양태는 또한 (i) 하기에 사용하기 위한, (ii) 하기를 위한 의약 또는 조성물로서 사용하기 위한, 또는 (iii) 하기를 위한 의약의 제조에서 사용하기 위한 본원에 기재된 다가 면역원성 조성물 중 1종 이상을 포함한다: (a) 요법 (예를 들어, 인간 신체의 요법); (b) 의약; (c) 스트렙토코쿠스 뉴모니아에에 의한 감염의 억제; (d) 에스. 뉴모니아에 대한 면역 반응 또는 보호성 면역 반응의 유도; (e) 에스. 뉴모니아에에 의한 감염의 예방; (f) 에스. 뉴모니아에 감염의 재발의 예방; (g) 에스. 뉴모니아에 감염과 연관된 병리학적 증상의 진행, 발병 또는 그의 중증도의 감소, 예를 들어 연관된 합병증, 예컨대 뇌 손상, 청각 상실 및 발작의 예방, (h) 에스. 뉴모니아에 감염의 가능성의 감소 또는 (i) 폐렴구균성 질환(들), 예를 들어, 비제한적으로, 폐렴구균성 폐렴, 폐렴구균성 박테리아혈증, 폐렴구균성 수막염, 중이염 및 부비동염의 치료, 예방 또는 그의 발병, 중증도 또는 진행의 지연. 이들 용도에서, 본 발명의 다가 폐렴구균 폴리사카라이드-접합체 조성물은 임의로 1종 이상의 아주반트와 조합되어 또는 아주반트 없이 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 다가 면역원성 폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체 조성물 중 1종 이상을 투여하는 것을 포함하는, 에스. 뉴모니아에 감염 또는 폐렴구균성 질환의 예방적 치료 (즉, 그에 대한 보호) 방법을 제공한다.
본 발명의 조성물 및 제제는 전신 또는 점막 경로를 통해 본 발명의 조성물을 투여함으로써, 감염, 예를 들어 폐렴구균 감염에 걸리기 쉬운 인간을 보호하거나 치료하기 위해 사용될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 환자에게 면역학적 유효량의 본 발명의 다가 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 에스. 뉴모니아에에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 인간에게 면역학적 유효량의 본 발명의 다가 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 폐렴구균 감염에 대해 인간을 백신접종하는 방법을 제공한다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 인간 환자에게 본 발명의 다가 면역원성 조성물 (즉 본원에 기재된 임의의 다가 면역원성 조성물, 예컨대 상기 "다가 면역원성 조성물"이라는 표제의 섹션 II에 기재된 다가 면역원성 조성물)을 투여하는 것을 포함하는, (1) 인간 환자에서 면역 반응을 유도하거나, (2) 인간 환자에서 보호성 면역 반응을 유도하거나, (3) 에스. 뉴모니아에에 의한 감염에 대해 인간 환자를 백신접종하거나, 또는 (4) 인간 환자에서 에스. 뉴모니아에 감염의 가능성을 감소시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 18세 이상의 성인에서의 폐렴구균성 폐렴 및 침습성 질환의 예방 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 24종의 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 균주 (3, 6A, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 19A, 20A, 20B, 22F, 23A, 23B, 24F, 31, 33F 및 35B)에 의해 유발되는 폐렴구균성 폐렴 및 침습성 질환의 예방 방법을 제공한다.
상기 방법의 한 실시양태에서, 조성물은 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 혈청형 세트: 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A를 포함한다. 상기 방법의 한 실시양태에서, 조성물은 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 혈청형 세트: 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20을 포함한다. 상기 방법의 한 실시양태에서, 조성물은 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 혈청형 세트: 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20B를 포함한다. 상기 방법의 또 다른 실시양태에서, 조성물은 혈청형 6A 또는 6C의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 추가로 포함한다.
혈청형 6A를 포함하는 폐렴구균 접합체 백신은 혈청형 6C에 대한 일부 교차-보호를 제공할 수 있는 것으로 밝혀졌다 (Cooper et al., Vaccine 29 (2011) 7207- 7211). 따라서, 상기 방법의 일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 혈청형 6C를 포함하지 않지만 대신 혈청형 6A 또는 혈청형 6A 및 6B를 포함하는 다가 면역원성 조성물의 용도를 제공한다. 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 혈청형 6A, 6B 및 6C의 폐렴구균 접합체를 포함한다. 상기 방법의 특정한 실시양태에서, 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형 세트를 포함한다:
I-a) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A;
I-b) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A;
I-c) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A; 및
I-d) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A.
상기 (I-a 내지 I-d)의 혈청형 세트의 특정한 실시양태에서, 혈청형 20A가 혈청형 20 또는 20B로 치환될 수 있다.
상기 방법의 추가 실시양태에서, 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형 세트를 포함한다:
II-a) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B;
II-b) 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B;
II-c) 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B;
II-d) 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B;
II-e) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A;
II-f) 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A;
II-g) 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A; 및
II-h) 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A.
상기 혈청형 세트 (II-e 내지 IIh)의 특정한 실시양태에서, 혈청형 20A가 혈청형 20 또는 20B로 치환될 수 있다.
상기 방법의 추가 실시양태에서, 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 실시양태 I-a), II-a) 또는 II-e) 중 임의의 것에 제시된 바와 같은 혈청형 세트를 포함하고, 혈청형 6A, 6B 및 6C를 추가로 포함한다.
혈청형 10A를 포함하는 폐렴구균 접합체 백신이 혈청형 39에 대한 일부 교차-보호를 제공할 수 있는 것으로 또한 밝혀졌다 (WO 2017/085586 참조). 따라서, 상기 방법의 일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 혈청형 10A를 포함하지 않지만 대신 혈청형 39를 포함하는 다가 면역원성 조성물의 용도를 제공한다. 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 혈청형 10A 및 39의 폐렴구균 접합체를 포함한다. 상기 방법의 특정한 실시양태에서, 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형 세트를 포함한다:
III-a) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A;
III-b) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A;
III-c) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A;
III-d) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A;
III-e) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A;
III-f) 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A;
III-g) 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A; 및
III-h) 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 39, 11A, 12F, 15C, 17F 및 20A.
상기 혈청형 세트 (II-a 내지 III-h)의 특정한 실시양태에서, 혈청형 20A가 혈청형 20 또는 20B로 치환될 수 있다.
상기 방법의 추가 실시양태에서, 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 실시양태 III-a) 내지 III-h) 중 임의의 것에 제시된 바와 같은 혈청형 세트를 포함하고, 혈청형 10A를 추가로 포함한다.
또한, 담체 단백질에 공유 연결된 에스. 뉴모니아에 혈청형 15B 피막 폴리사카라이드를 포함하는 면역원성 접합체는 혈청형 15C 및/또는 혈청형 15A에 대한 일부 교차-보호를 제공할 수 있는 것으로 밝혀졌다 (WO 2015/110942 참조). 따라서, 상기 방법의 일부 실시양태에서, 본 발명은 또한 혈청형 15C (또는 탈-O-아세틸화된 15B)를 포함하지 않지만 대신 혈청형 15B (즉 혈청형 15B 폴리사카라이드는 탈-O-아세틸화되지 않음)를 포함하는 다가 면역원성 조성물의 용도를 제공한다. 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물은 혈청형 15B 및 15C (또는 탈-O-아세틸화된 15B)의 폐렴구균 접합체를 포함한다. 상기 방법의 특정한 실시양태에서, 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 혈청형 세트를 포함한다:
IV-a) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F 및 20A;
IV-b) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F 및 20A;
IV-c) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F 및 20A;
IV-d) 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F 및 20A;
IV-e) 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F 및 20A;
IV-f) 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F 및 20A;
IV-g) 6A, 6B, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F 및 20A; 및
IV-h) 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F 및 20A.
상기 혈청형 세트 (IVa 내지 IVh)의 특정한 실시양태에서, 혈청형 20A가 혈청형 20 또는 20B로 치환될 수 있다.
상기 방법의 추가 실시양태에서, 에스. 뉴모니아에의 혈청형은 실시양태 IV-a) 내지 IV-h) 중 임의의 것에 제시된 바와 같은 혈청형 세트를 포함하고, 혈청형 15C (및/또는 탈-O-아세틸화된 15B)를 추가로 포함한다.
본 발명의 조성물은 이전에 다가 폐렴구균 백신을 받은 환자에서 에스. 뉴모니아에에 대한 보완적 보호를 제공하는 방법에 유용하다. 이러한 용도에서, 본 발명의 조성물은 환자가 이전에 백신접종되지 않은 특정한 에스. 뉴모니아에 혈청형에 대한 보호를 제공할 수 있거나, 환자가 이전에 백신접종된 에스. 뉴모니아에 혈청형에 대한 추가의 보호를 제공할 수 있거나, 또는 환자가 이전에 백신접종되지 않은 에스. 뉴모니아에 혈청형 및 환자가 이전에 백신접종된 에스. 뉴모니아에 혈청형 둘 다에 대한 보호를 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명은 환자에게 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하는 다가 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 폴리사카라이드 단백질 접합체는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 환자는 이전에 에스. 뉴모니아에에 대해 백신접종된 것인, 환자에서 에스. 뉴모니아에에 대한 면역 반응을 유도하거나, 백신접종하거나 또는 보호성 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 측면의 실시양태에서, 다가 면역원성 조성물은 본원에 기재된 임의의 다가 면역원성 조성물일 수 있다. 본 발명의 방법의 특정한 실시양태에서, 다가 면역원성 조성물은 이전에 다가 폐렴구균 백신으로 치료된 환자에게 투여된다. 다가 면역원성 백신은 에스. 뉴모니아에의 1종 초과의 혈청형에 의해 유발되는 폐렴구균성 질환의 예방을 위해 지시된 임의의 백신일 수 있다.
상기 방법의 구체적 실시양태에서, 환자는 이전에 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 에스. 뉴모니아에 혈청형에 의해 유발되는 폐렴구균성 질환의 예방을 위해 지시된 다가 폐렴구균 백신으로 치료되었다.
a) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F;
b) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 6A, 7F 및 19A;
c) 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F;
d) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 6A, 7F, 19A, 22F 및 33F;
e) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 7F, 19A, 22F, 33F, 2, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F 및 20; 및
f) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 6A, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 10A, 11A, 12F 및 15B.
상기 방법의 구체적 실시양태에서, 다가 폐렴구균 백신은 에스. 뉴모니아에 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 7F, 19A, 22F, 33F, 2, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F 및 20A의 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 상기 방법의 구체적 실시양태에서, 다가 폐렴구균 백신은 에스. 뉴모니아에 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 7F, 19A, 22F, 33F, 2, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F 및 20의 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 상기 방법의 구체적 실시양태에서, 다가 폐렴구균 백신은 에스. 뉴모니아에 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 7F, 19A, 22F, 33F, 2, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F 및 20B의 피막 폴리사카라이드를 포함한다.
상기 방법의 구체적 실시양태에서, 다가 폐렴구균 백신은 다수의 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 폴리사카라이드 단백질 접합체는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 다가 폐렴구균 백신은 담체 단백질에 접합되지 않은 다수의 에스. 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드를 포함한다.
상기 방법의 추가의 실시양태에서, 환자는 이전에 프레브나르® 13 (폐렴구균 13가 접합체 백신 [디프테리아 CRM197 단백질], 화이자, 인크., 미국 펜실베니아주 필라델피아)으로 치료되었다.
상기 방법의 추가 실시양태에서, 환자는 이전에 뉴모박스(PNEUMOVAX)® 23 (다가 폐렴구균 백신, 머크 앤 캄파니, 인크.(Merck & Co., Inc.), 미국 뉴저지주 케닐워스)으로 치료되었다.
상기 방법의 추가 실시양태에서, 환자는 이전에 신플로릭스(SYNFLORIX)™ (폐렴구균 폴리사카라이드 접합체 백신 (흡착형), 글락소스미스클라인 바이올로지칼스 에스.에이.(GlaxoSmithKline Biologicals s.a.), 벨기에 릭셍사흐)로 치료되었다.
상기 방법의 실시양태에서, 본 발명의 다가 면역원성 조성물은 의료 전문의, 예를 들어 의사에 의해 제공된 치료 요법에 따라, 환자가 다가 폐렴구균 백신을 받은 후 임의의 시점에 환자에게 투여된다. 특정한 실시양태에서, 본 발명의 다가 면역원성 조성물은 환자가 다가 폐렴구균 백신을 받은지 1개월 내지 5년 후에, 대안적으로 환자가 다가 폐렴구균 백신을 받은지 1개월 내지 1년, 1개월 내지 2년, 1개월 내지 3년, 1개월 내지 4년, 1개월 내지 6개월, 2개월 내지 6개월, 2개월 내지 1년, 1년 내지 5년, 6개월 내지 5년, 6개월 내지 4년, 6개월 내지 3년, 6개월 내지 2년, 6개월 내지 1년, 1년 내지 4년, 1년 내지 3년 또는 1년 내지 2년 후에 환자에게 투여된다. 추가 실시양태에서, 다가 면역원성 조성물은 환자가 다가 폐렴구균 백신을 받은지 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 약 1년, 약 1.25년, 약 1.5년, 약 1.75년, 약 2년, 약 2.25년, 약 2.5년, 약 2.75년, 약 3년, 약 3.25년, 약 3.5년, 약 3.75년, 약 4년, 약 4.25년, 약 4.5년, 약 4.75년 또는 약 5년 후에 환자에게 투여된다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 임의의 순서로, 인간 환자에게 본 발명의 다가 면역원성 조성물을 투여하는 단계 및 다가 폐렴구균 백신을 투여하는 단계를 포함하는, (1) 인간 환자에서 면역 반응을 유도하거나, (2) 인간 환자에서 보호성 면역 반응을 유도하거나, (3) 에스. 뉴모니아에에 의한 감염에 대해 인간 환자를 백신접종하거나, 또는 (4) 인간 환자에서 에스. 뉴모니아에 감염의 가능성을 감소시키는 방법을 제공한다. 다가 폐렴구균 백신은 에스. 뉴모니아에의 1종 초과의 혈청형에 의해 유발되는 폐렴구균성 질환의 예방을 위해 지시된 임의의 백신일 수 있다.
상기 방법의 구체적 실시양태에서, 환자는 본 발명의 다가 면역원성 조성물 및 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 에스. 뉴모니아에 혈청형에 의해 유발되는 폐렴구균성 질환의 예방을 위해 지시된 다가 폐렴구균 백신으로 치료된다:
a) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F;
b) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 6A, 7F 및 19A;
c) 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F 및 23F;
d) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 6A, 7F, 19A, 22F 및 33F;
e) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 7F, 19A, 22F, 33F, 2, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F 및 20; 및
f) 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 6A, 7F, 19A, 22F, 33F, 8, 10A, 11A, 12F 및 15B.
상기 방법의 구체적 실시양태에서, 다가 폐렴구균 백신은 에스. 뉴모니아에 혈청형 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 3, 5, 7F, 19A, 22F, 33F, 2, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F 및 20A의 피막 폴리사카라이드를 포함한다.
상기 방법의 구체적 실시양태에서, 다가 폐렴구균 백신은 다수의 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 폴리사카라이드 단백질 접합체는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 폴리사카라이드를 포함한다. 다른 실시양태에서, 다가 폐렴구균 백신은 담체 단백질에 접합되지 않은 다수의 에스. 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드를 포함한다.
상기 방법의 추가의 실시양태에서, 환자는 임의의 순서로, 본 발명의 다가 면역원성 조성물로 치료되고, 프레브나르® 13 (폐렴구균 13가 접합체 백신 [디프테리아 CRM197 단백질], 화이자, 인크., 미국 펜실베니아주 필라델피아)으로 치료된다. 한 실시양태에서, 환자에게 첫번째로 프레브나르® 13을 투여하고, 환자에게 두번째로 본 발명의 다가 면역원성 조성물을 투여한다. 대안적 실시양태에서, 환자에게 첫번째로 본 발명의 다가 면역원성 조성물을 투여하고, 두번째로 프레브나르® 13을 투여한다.
상기 방법의 추가 실시양태에서, 환자는 임의의 순서로, 본 발명의 다가 면역원성 조성물로 치료되고, 뉴모박스® 23 (다가 폐렴구균 백신, 머크 앤 캄파니, 인크., 미국 뉴저지주 케닐워스)으로 치료된다. 한 실시양태에서, 환자에게 첫번째로 뉴모박스® 23을 투여하고, 환자에게 두번째로 본 발명의 다가 면역원성 조성물을 투여한다. 대안적 실시양태에서, 환자에게 첫번째로 본 발명의 다가 면역원성 조성물을 투여하고, 두번째로 뉴모박스® 23을 투여한다.
상기 방법의 추가 실시양태에서, 환자는 임의의 순서로, 본 발명의 다가 면역원성 조성물로 치료되고, 신플로릭스™ (폐렴구균 폴리사카라이드 접합체 백신 (흡착형), 글락소스미스클라인 바이올로지칼스 에스.에이., 벨기에 릭셍사흐)로 치료된다. 한 실시양태에서, 환자에게 첫번째로 신플로릭스™를 투여하고, 환자에게 두번째로 본 발명의 다가 면역원성 조성물을 투여한다. 대안적 실시양태에서, 환자에게 첫번째로 본 발명의 다가 면역원성 조성물을 투여하고, 두번째로 신플로릭스™를 투여한다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 다가 면역원성 조성물 및 다가 폐렴구균 백신은 공동으로 투여된다. 본원에 사용된 "공동 투여"는 2종의 조성물을 동시에 투여하는 것에 제한되는 것이 아니라, 임의의 순서로 하나를 다른 것 직후에 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다가 면역원성 조성물 및 다가 폐렴구균 백신은 근육내 또는 피하 투여를 통해 개별 해부학적 부위, 예를 들어 다른 두 팔에 투여된다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 본 발명의 다가 면역원성 조성물의 투여와 다가 폐렴구균 백신의 투여 사이의 시간의 양은 약 4주 내지 약 1년이다. 대안적 실시양태에서, 시간의 양은 약 1개월 내지 약 5년이다.
한 실시양태에서, 환자에게 첫번째로 본 발명의 다가 폐렴구균 백신을 투여하고, 환자에게 두번째로 본 발명의 다가 면역원성 조성물을 투여한다. 대안적 실시양태에서, 환자에게 첫번째로 본 발명의 다가 면역원성 조성물을 투여하고, 두번째로 본 발명의 다가 폐렴구균 백신을 투여한다.
하기 단계를 포함하는, 환자에서 에스. 뉴모니아에에 대한 면역 반응을 유도하거나, 백신접종하거나 또는 보호성 면역 반응을 유도하는 방법이 또한 제공된다:
(1) 환자에게 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하는 다가 면역원성 조성물을 투여하는 단계이며, 여기서 각각의 폴리사카라이드 단백질 접합체는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 것인 단계,
(2) 미리 결정된 양의 시간이 경과하기를 기다리는 단계, 및
(3) 환자에게 다가 폐렴구균 백신을 투여하는 단계.
이러한 방법에서, 다가 면역원성 조성물은 본원에 제시된 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체의 임의의 조합을 포함할 수 있고, 다가 폐렴구균 백신은 에스. 뉴모니아에의 1종 초과의 혈청형에 의해 유발되는 질환의 예방을 위해 지시된 임의의 백신일 수 있다.
하기 단계를 포함하는, 환자에서 에스. 뉴모니아에에 대한 면역 반응을 유도하거나, 백신접종하거나 또는 보호성 면역 반응을 유도하는 방법이 또한 본 발명에 의해 제공된다:
(1) 환자에게 다가 폐렴구균 백신을 투여하는 단계,
(2) 미리 결정된 양의 시간이 경과하기를 기다리는 단계, 및
(3) 환자에게 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하는 다가 면역원성 조성물을 투여하는 단계이며, 여기서 각각의 폴리사카라이드 단백질 접합체는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함하는 것인 단계.
이러한 방법에서, 다가 면역원성 조성물은 본원에 제시된 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체의 임의의 조합을 포함할 수 있고, 다가 폐렴구균 백신은 에스. 뉴모니아에의 1종 초과의 혈청형에 의해 유발되는 질환의 예방을 위해 지시된 임의의 백신일 수 있다.
상기 방법의 일부 실시양태에서, 다가 폐렴구균 백신은 다수의 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 단백질 접합체를 포함하며, 여기서 폴리사카라이드 단백질 접합체는 담체 단백질에 접합된 에스. 뉴모니아에 혈청형으로부터의 피막 폴리사카라이드를 포함한다. 대안적 실시양태에서, 다가 폐렴구균 백신은 담체 단백질에 접합되지 않은 에스. 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드를 포함한다.
본 발명의 방법의 임의의 실시양태 (즉 본원에 기재된 임의의 방법)에서, 방법은 환자에게 본 발명의 다가 면역원성 조성물의 1회 이상의 추가의 용량을 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 방법에서, 환자는 상기와 같이 본 발명의 다가 면역원성 조성물의 제1 용량을 받기 전에 다가 폐렴구균 백신을 이미 받았거나, 또는 본 발명의 다가 면역원성 조성물을 받기 전에 에스. 뉴모니아에에 대해 백신접종되어 있지 않을 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 에스. 뉴모니아에에 의해 유발되는 폐렴구균성 질환의 예방을 위해 지시된 다가 폐렴구균 백신을 받은 환자는 본 발명의 다가 면역원성 조성물의 2회 이상의 용량이 투여된다. 대안적 실시양태에서, 폐렴구균성 질환의 예방을 위해 지시된 임의의 백신으로 이전에 치료되지 않은 환자는 본 발명의 다가 면역원성 조성물의 2회 이상의 용량이 투여된다.
상기 방법의 실시양태에서, 2회 이상의 용량은 본 발명의 동일한 다가 면역원성 조성물의 용량이다. 대안적 실시양태에서, 2회 이상의 용량은 본 발명의 상이한 다가 면역원성 조성물의 용량이다.
이들 방법 중 임의의 것의 구체적 실시양태에서, 환자는 본 발명의 다가 면역원성 조성물의 2, 3 또는 4회 용량이 투여된다. 특정한 실시양태에서, 환자는 면역손상된 환자이고 (예를 들어, 줄기 세포 이식 후 면역억제 요법을 받음), 용량의 횟수는 3회이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 다가 면역원성 조성물의 각각의 용량의 투여 사이의 시간의 양은 약 4주 내지 약 1년이다. 대안적 실시양태에서, 본 발명의 다가 면역원성 조성물의 각각의 용량의 투여 사이의 시간의 양은 약 1개월 내지 약 5년이다.
본 발명의 임의의 방법의 실시양태에서, 본 발명의 조성물(들)로 치료될 환자는 인간이다. 특정 실시양태에서, 인간 환자는 유아 (대략 12 내지 24개월) 또는 소아 (대략 2 내지 5세)이다. 본 발명의 조성물은 또한 아동, 청소년 및 성인 (예를 들어, 18세 내지 45세, 18세 내지 50세, 18세 내지 55세, 18세 내지 60세 또는 18세 내지 65세)에서 사용하기에 적합하다. 본 발명의 임의의 방법의 다른 실시양태에서, 환자는 약 2세 내지 약 18세이다. 본 발명의 임의의 방법의 추가 실시양태에서, 환자는 18세 이상이다.
본 발명의 방법의 추가 실시양태에서, 인간 환자는 고령자이다. 본 발명의 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 환자는 50세 이상이다. 본 발명의 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 환자는 55세 이상이다. 본 발명의 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 환자는 60세 이상이다. 본 발명의 임의의 방법의 추가 실시양태에서, 환자는 65세 이상이다. 본 발명의 임의의 방법의 추가의 실시양태에서, 환자는 70세 이상이다.
본 발명의 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 본 발명의 면역원성 조성물로 치료될 환자는 면역손상된 환자이다.
본 발명의 임의의 방법의 일부 실시양태에서, 다가 면역원성 조성물은 인플루엔자에 대한 백신과 병용으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 인플루엔자 백신은 고령자, 예를 들어 65세 이상의 사람에 대해 지시된 고용량 독감 백신인 "고령자 독감 백신"이다.
본 발명은 환자에게 면역학적 유효량의 본원에 기재된 임의의 다가 면역원성 폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 폐렴구균 감염에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 특정한 백신 (즉 다가 면역원성 조성물)에 대한 성분들의 최적량은 대상체에서의 적절한 면역 반응의 관찰을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 예를 들어, 또 다른 실시양태에서, 인간 백신접종을 위한 투여량은 동물 연구로부터 인간 데이터로의 외삽에 의해 결정된다. 또 다른 실시양태에서, 투여량은 실험적으로 결정된다.
본 발명의 방법은 침습성 감염 (수막염, 폐렴 및 박테리아혈증) 및 비침습성 감염 (급성 중이염 및 부비동염)을 둘 다 포함한, 미생물, 예를 들어 에스. 뉴모니아에 의해 유발되는 1차 임상 증후군의 예방 및/또는 감소를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여는 근육내, 복강내, 피내 또는 피하 경로를 통한 주사; 또는 구강/소화기, 호흡기도 또는 비뇨생식관에 대한 점막 투여를 통한 것 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 비강내 투여는 폐렴 또는 중이염의 치료를 위해 사용된다 (폐렴구균의 비인두 담지가 보다 효과적으로 예방될 수 있어, 그의 가장 초기 단계에서 감염을 약화시킬 수 있으므로). 구체적 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 근육내 또는 피하 투여를 통해 환자에게 투여된다.
본원에 언급된 모든 공보는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 방법론 및 물질을 기재 및 개시하기 위한 목적으로 참조로 포함된다.
첨부된 도면을 참조하여 본원에 본 발명의 다양한 실시양태를 기재하였지만, 본 발명이 그러한 정확한 실시양태에 제한되지 않는다는 것, 및 그 안에서 다양한 변화 및 변형이 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같은 본 발명의 범주 또는 취지를 벗어나지 않으면서 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이루어질 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하지만 제한하지 않는다.
실시예 1
에스. 뉴모니아에 피막 폴리사카라이드의 제조
폐렴구균의 배양 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Chase, 1967, Methods of Immunology and Immunochemistry 1:52]을 참조한다. 폐렴구균 피막 폴리사카라이드의 제조 방법이 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 유럽 특허 번호 EP 0 497 524 B1을 참조한다. 하기 기재된 공정은 일반적으로 유럽 특허 번호 EP 0 497 524 B1에 기재된 방법을 따르고, 일반적으로 모든 폐렴구균 혈청형에 적용가능하다.
혈청형 6C, 23B 및 31에 대한 폐렴구균 균주의 단리물을 질병 관리 예방 센터 (조지아주 아틀란타)로부터 입수하였다. 혈청형 3, 8, 10A, 11A, 12F, 15B, 22F 및 33F에 대한 균주를 펜실베니아 대학교 (로버트 오스트리안 박사)로부터 입수하였다. 혈청형 17F 및 19A에 대한 균주를 FDA 생물의약품 사무국 (존 로빈스 박사)으로부터 입수하였다. 혈청형 7F를 뉴욕 주립 대학교, 다운스테이트 메디칼 센터 (제랄드 쉬프만 박사)로부터 입수하였다. 상기 열거되지 않은 폐렴구균 혈청형의 단리물은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (버지니아주 마나사스)으로부터 입수하였다. 필요한 경우, 하위유형은 특이적 항혈청을 사용하는 팽화 반응에 기초하여 구별하였다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,847,112를 참조한다. 대두 펩톤, 효모 추출물 및 글루코스를 함유하고 헤민을 함유하지 않는 동물-성분 무함유 배지로 이루어진 한천 플레이트 상에 연속으로 2 단계로 플레이팅함으로써 수득된 단리물을 추가로 클론 단리하였다. 혈청형 7F의 경우, 사용된 한천 플레이트는 또한 헤민을 함유하였다. 대두 펩톤, 효모 추출물, HEPES, 염화나트륨, 중탄산나트륨, 인산칼륨, 글루코스 및 글리세롤을 함유하는 동물-성분 무함유 배지를 사용한 액체 배양물 중에서 각각의 혈청형에 대한 클론 단리물을 추가로 확장시켜 프리-마스터 세포 은행을 제조하였다.
폐렴구균 폴리사카라이드의 각각의 혈청형의 생산은 세포 확장 및 배치 생산 발효에 이어서 화학적 불활성화 후 하류 정제로 이루어졌다. 대두 펩톤 또는 대두 펩톤 한외여과물, 효모 추출물 또는 효모 추출물 한외여과물, HEPES, 염화나트륨, 중탄산나트륨, 인산칼륨 및 글루코스를 함유하는 사전-멸균된 동물-성분 무함유 성장 배지를 함유한 진탕 플라스크 또는 배양 용기를 사용하여 각각의 혈청형으로부터의 해동된 세포 은행 바이알을 확장시켰다. 세포 확장 배양물을 온도 및 교반 제어 하에 기체 교환을 최소화하도록 밀봉된 진탕 플라스크 또는 용기에서 성장시켰다. 혈청형 3, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 19A, 20, 22F 및 33F의 경우, 해동된 세포 은행 바이알을 동일한 배지를 함유하는 발효기를 사용하여 확장시켰다. 이들 혈청형의 세포 확장 동안, 온도, pH, 압력 및 교반을 제어하였다. 살포를 사용하지 않았으므로 기류 오버레이를 또한 제어하였다. 600 nm에서의 광학 밀도에 의해 측정시 명시된 배양 밀도를 달성한 후, 대두 펩톤 또는 대두 펩톤 한외여과물, 효모 추출물 또는 효모 추출물 한외여과물, 염화나트륨, 인산칼륨 및 글루코스를 함유하는 사전-멸균된 동물-성분 무함유 성장 배지를 함유한 생산 발효기로 세포 확장 배양물의 일부분을 옮겼다. 온도, pH, 압력 및 교반을 제어하였다. 살포를 사용하지 않았으므로 기류 오버레이를 또한 제어하였다.
글루코스가 거의 고갈되었을 때, 화학적 불활성화제인 페놀을 첨가하여 배치 발효를 종결시켰다. 순수한 페놀을 0.8 - 1.2%의 최종 농도로 첨가하여 세포를 불활성화시키고 세포벽으로부터 피막 폴리사카라이드를 유리시켰다. 1차 불활성화는 온도 및 교반이 계속 제어되는 발효기 내에서 명시된 시간 동안 일어난다. 1차 불활성화 후, 배치를 또 다른 용기로 옮기고, 여기서 완전한 불활성화를 위해 제어된 온도 및 교반 하에 추가의 명시된 시간 동안 유지시켰다. 이를 미생물 플레이팅 기술에 의해 또는 페놀 농도 및 명시된 시간의 검증에 의해 확인하였다. 이어서 불활성화된 브로쓰를 정제하였다.
실시예 2
폐렴구균 폴리사카라이드의 정제
폐렴구균 폴리사카라이드의 정제 공정은 여러 원심분리, 심층 여과, 농축/투석여과 작업 및 침전 단계로 이루어졌다. 달리 명시되지 않는 한 모든 절차를 실온에서 수행하였다.
에스. 뉴모니아에의 발효기 배양물로부터 불활성화된 브로쓰를 양이온성 중합체 (예컨대 BPA-1000, 트레톨라이트(TRETOLITE)® (베이커 휴즈 인크.(Baker Hughes Inc.), 텍사스주 휴스톤), 스펙트럼 8160, 폴리(에틸렌이민) 및 밀리포어 pDADMAC)로 응집시켰다. 양이온성 중합체는 불순물 단백질, 핵산 및 세포 파편에 결합하였다. 응집 단계 및 노화 기간 후, 원심분리 및 다중 심층 여과 단계를 통해 응집된 고체를 제거하였다. 정화된 브로쓰를 농축시키고, 100 kDa 내지 500 kDa MWCO (분자량 컷오프) 필터를 사용하여 투석여과하였다. 트리스, MgCl2 완충제 및 인산나트륨 완충제를 사용하여 투석여과를 수행하였다. 투석여과는 잔류 핵산 및 단백질을 제거하였다.
폴리사카라이드를 아세트산나트륨 및 페놀 중에서 변성 알콜 및/또는 이소프로판올로 재침전시킴으로써 추가 불순물 제거를 수행하였다. 페놀 침전 단계 동안, 인산나트륨 염수 완충제 및 페놀 (액화 페놀 또는 고체 페놀) 중 아세트산나트륨을 투석여과된 보유물에 충전하였다. 이어서 폴리사카라이드의 알콜 분획화를 2 단계로 수행하였다. 제1 단계에서, 낮은 퍼센트 알콜을 제제에 첨가하여 세포 파편 및 다른 원치않는 불순물을 침전시켰으며, 조 폴리사카라이드는 용액 중에 남아있었다. 원심분리에 이어서 심층 여과 단계를 통해 불순물을 제거하였다. 이어서 추가의 이소프로판올 또는 변성 알콜을 배치에 첨가하여 용액으로부터 폴리사카라이드를 회수하였다. 침전된 폴리사카라이드 펠릿을 원심분리에 의해 회수하고, 연화처리하고, 분말로 건조시키고, -70℃에서 동결 저장하였다.
실시예 3
NMR 시험에 의한 특정 폐렴구균 혈청형의 구조 동일성 분석
0.01% 디메틸 술폭시드 (DMSO) 및 0.01% 2,2-디메틸-2-실라펜탄-5-술포네이트-d6 나트륨 염 (DSS-d6)을 함유하는 산화중수소 (D2O) 중에 폴리사카라이드 분말을 5mg 분말/mL 용액으로 용해시킴으로써 NMR 분석을 위한 샘플을 제조하였다. DMSO는 정량적 분석에 사용된 내부 표준이고, DSS-d6은 화학적 이동 스케일을 0 ppm으로 설정하는데 사용하였다. 1차원 양성자 NMR 데이터 세트를 50℃에서 획득하고, 이어서 아노머 공명을 함유하는 스펙트럼의 일부분을 마이크로소프트 엑셀 워크북을 사용하여 분석용 ASCII 파일에 x, y 좌표로서 선택적으로 기록하였다. 이어서 Y 좌표 (즉, 스펙트럼 프로파일)를 참조 데이터베이스 내의 피막 박테리아 폴리사카라이드의 스펙트럼 프로파일과 비교하였다. 참조 프로파일을 선택된 각각의 혈청형의 제제에 대해 유사한 방식으로 생성하고, 이후 참조 로트로서 지정하였다. 샘플 및 참조 스펙트럼으로부터의 y-값을 쌍별 비교하여 스펙트럼 사이의 유사성의 척도로서 상관 계수 (ρ x,y)를 생성하였다. 임의의 참조 스펙트럼과의 ρ-값 ≥ 0.95를 폴리사카라이드 구조의 양성 확인으로서 여겼다.
도 1-4는 각각 에스. 뉴모니아 혈청형 6C, 15A, 탈-O-아세틸화된 15B 및 35B로부터의 피막 폴리사카라이드의 600 MHz 1차원 1H NMR 스펙트럼을 제공한다. 에스. 뉴모니아 혈청형 6C, 15A, 탈-O-아세틸화된 15B 및 35B의 혈청형 확인에 사용된 1H NMR 동일성 영역이 각각 도 5-8에 제공된다.
에스. 뉴모니아 혈청형 탈-O-아세틸화된 15B 및 15C로부터의 피막 폴리사카라이드의 구조
뉴질랜드 화이트 토끼에서 PCV21을 사용하여 면역원성 연구를 수행하였다 (하기 실시예 43 참조). 이들 연구에서, 다가 조성물에 혈청형 15C 대신 탈-O-아세틸화된 폴리사카라이드 혈청형 15B를 사용하였다. 탈-O-아세틸화된 15B 폴리사카라이드가 혈청형 15C 폴리사카라이드와 동등한지를 확인하기 위해 NMR 연구를 수행하였다.
피막 폴리사카라이드 혈청형들 사이의 구조적 차이는 NMR 스펙트럼에서 화학적 이동 차이로서 나타난다. 아노머 영역 (대략 4.4 ppm 내지 6.0 ppm)은 폴리사카라이드의 반복 단위에서의 모든 구조적 특색에 민감하다. 입체화학, 모노사카라이드 조성, O-아세틸화 및 글리오시드 연결에서의 차이는 아노머 신호의 화학적 이동에 영향을 주어 각각의 혈청형에 고유한 이러한 스펙트럼 영역을 남긴다. 탈-O-아세틸화된 혈청형 15B 폴리사카라이드의 경우, 완전 1H NMR 스펙트럼은 혈청형 15C 폴리사카라이드의 1H NMR 스펙트럼과 동일하며, 이는 두 폴리사카라이드의 반복 단위가 동일한 모노사카라이드 치환기 및 글리오시드 연결 부위로 이루어져 있다는 것을 나타낸다 (도 9b-9c 및 10b-10c 참조). 또한, 탈-O-아세틸화 단계는 15B 폴리사카라이드에 존재하는 O-아세테이트 기를 제거하였다는 것 및 본질적으로 남아있는 O-아세테이트 기가 관찰되지 않는다는 것이 명백하게 밝혀졌다 (도 10a-10f 참조).
실시예 4
DMSO 접합을 사용하는 다가 연구를 위한 혈청형 3 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, 디메틸술폭시드 (DMSO) 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 380 bar/5회 통과로 제어하였다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.25 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이었다. 산화 반응을 22℃에서 12시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 10% w/v의 수크로스 농도를 갖는 2 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 1.0 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.3을 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 1시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1.6시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과한 다음, 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 1. DMSO 접합으로부터의 다가 연구를 위한 혈청형 3 접합체의 속성
Figure pat00003
실시예 5
DMSO 접합을 사용하는 접합체 1가 연구를 위한 혈청형 6C의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 여과된 용해된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.10 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이었다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 2.2 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.4를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 15시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과한 다음, 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 2. DMSO 접합으로부터의 1가 연구를 위한 혈청형 6C 접합체의 속성
Figure pat00004
실시예 6
DMSO 접합을 사용하는 다가 연구를 위한 혈청형 6C 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 여과된 용해된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.10 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이었다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 1.9 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.4를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 15시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과한 다음, 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 3. DMSO 접합으로부터의 다가 연구를 위한 혈청형 6C 접합체의 속성
Figure pat00005
DMSO 접합을 사용하는 1가 연구를 위한 혈청형 6A 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 200 bar/5회 통과로 제어하였다. 크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.10 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이었다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 1.5 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.4를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 15시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과한 다음, 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 3a. DMSO 접합으로부터의 1가 연구를 위한 혈청형 6A 접합체의 속성
Figure pat00006
실시예 7
DMSO 접합을 사용하는 다가 연구를 위한 혈청형 7F 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 150 bar/7회 통과로 제어하였다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.24 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이었다. 산화 반응을 4℃에서 4시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 2.6 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.5를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 4시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과한 다음, 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 4. DMSO 접합으로부터의 다가 연구를 위한 혈청형 7F 접합체의 속성
Figure pat00007
실시예 8
DMSO 접합을 사용하는 다가 연구를 위한 혈청형 8 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 600 bar/5회 통과로 제어하였다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.18 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이었다. 산화 반응을 22℃에서 4시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 4.0 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.5를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 블렌딩 후, 접합 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다. 소듐 시아노보로히드라이드를 접합 반응에 첨가하지 않았는데, 이는 소듐 시아노보로히드라이드 첨가가 혈청형 8에 대한 접합 반응 동안 비가역적 침전을 초래할 수 있는 것으로 관찰되었기 때문이다. 반응으로부터 소듐 시아노보로히드라이드를 생략하는 것은 접합체 속성에 유의하게 영향을 미치지 않으면서 침전을 피하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과하고 (0.5 마이크로미터 프리필터 사용), 이어서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 5. DMSO 접합으로부터의 다가 연구를 위한 혈청형 8 접합체의 속성
Figure pat00008
실시예 9
DMSO 접합을 사용하는 다가 연구를 위한 혈청형 9N 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 250 bar/5회 통과로 제어하였다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.16 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이었다. 산화 반응을 22℃에서 4시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 3.25 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.5를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 1시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과한 다음, 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 6. DMSO 접합으로부터의 다가 연구를 위한 혈청형 9N 접합체의 속성
Figure pat00009
실시예 10
DMSO 접합을 사용하는 1가 연구를 위한 혈청형 10A 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 200 bar/5회 통과에 이어서 600 bar/5회 통과로 제어하여 표적 분자 질량을 달성하였다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.15 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이었다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 5.0 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 2.0을 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 4시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과하고 (0.5 마이크로미터 프리필터 사용), 이어서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 7. DMSO 접합으로부터의 1가 연구를 위한 혈청형 10A 접합체의 속성
Figure pat00010
실시예 11
DMSO 접합을 사용하는 다가 연구를 위한 혈청형 10A 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 600 bar/5회 통과로 제어하였다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.16 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이었다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 4.0 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.75를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 4시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과하고 (0.5 마이크로미터 프리필터 사용), 이어서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 8. DMSO 접합으로부터의 다가 연구를 위한 혈청형 10A 접합체의 속성
Figure pat00011
실시예 12
DMSO 접합을 사용하는 다가 연구를 위한 혈청형 11A 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를, 아세트산을 200 mM로 첨가하여 산 가수분해하고, 92℃에서 75분 동안 인큐베이션한 다음, 차가운 인산칼륨 pH 7 완충제를 400 mM로 첨가하여 중화시킴으로써 크기-감소시켰다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.13 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이었다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 25 mM 염화나트륨을 함유하는 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 3.5 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.5를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 4시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과하고 (0.5 마이크로미터 프리필터 사용), 이어서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 9. DMSO 접합으로부터의 다가 연구를 위한 혈청형 11A 접합체의 속성
Figure pat00012
실시예 13
DMSO 접합을 사용하는 다가 연구를 위한 혈청형 12F 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를, 아세트산을 200 mM로 첨가하여 산 가수분해하고, 90℃에서 45분 동안 인큐베이션한 다음, 차가운 인산칼륨 pH 7 완충제를 400 mM로 첨가하여 중화시킴으로써 크기-감소시켰다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.26 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이었다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 25 mM 염화나트륨을 함유하는 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 3.0 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.5를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 4시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과한 다음, 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 10. DMSO 접합으로부터의 다가 연구를 위한 혈청형 12F 접합체의 속성
Figure pat00013
실시예 14
DMSO 접합을 사용하는 1가 연구를 위한 혈청형 15A 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 200 bar/5회 통과로 제어하였다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 1.75 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이었다. 산화 반응을 22℃에서 20시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 25 mM 염화나트륨을 함유하는 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 6.0 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 2.0을 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 2.5시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과하고 (0.5 마이크로미터 프리필터 사용), 이어서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 11. DMSO 접합으로부터의 1가 연구를 위한 혈청형 15A 접합체의 속성
Figure pat00014
실시예 15
수성 접합을 사용하는 15A/B/C 교차 보호 연구를 위한 혈청형 15A 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 크기 감소시키고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 이어서 정제된 CRM197을 활성화된 폴리사카라이드에 수성 반응 혼합물 중 염화니켈을 이용하여 접합시키고, 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 폴리사카라이드 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 200 bar/5회 통과로 제어하여 표적 분자 질량을 달성하였다. 이어서 크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.45 mol이었다. 산화 반응을 22℃에서 20시간 동안 진행하였다. 활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하였다. 2-8℃에서 한외여과를 수행하였다. 한외여과된 생성물을 22℃ 및 pH 5로 조정함으로써 추가 활성화를 달성하였다. 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 2.0 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이 충전된 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 활성화를 수행하였다. 산화 반응을 22℃에서 20시간 동안 진행하였다. 제2 활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
산화된 폴리사카라이드 용액을 물 및 1.5 M 인산칼륨 pH 6.0과 혼합하였다. 선택된 완충제 pH는 접합 반응 동안 활성화된 폴리사카라이드의 안정성을 개선시키는 것이었다. 이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 0.2-마이크로미터 여과하고, 완충된 폴리사카라이드 용액과 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 0.6으로 합하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 폴리사카라이드 및 포스페이트 농도는 각각 9.75 g/L 및 100 mM이었다. 생성된 접합체의 크기를 제어하도록 폴리사카라이드 농도를 선택하였다. 100 mM 염화니켈 용액을 사용하여 염화니켈을 대략 2 mM로 첨가하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 첨가하였다. 폴리사카라이드 및 단백질의 소비를 최대화하기 위해 접합을 10℃에서 148시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
접합 반응 후, 배치를 대략 3.0 g/L의 폴리사카라이드 농도로 희석하고, 2-8℃로 냉각시키고, 1.2-마이크로미터 여과하였다. 배치를 100 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2-8℃에서 100 mM 인산칼륨, pH 7.0에 대해 투석여과하였다. 이어서 보유물에 회수된 배치를 대략 2.0 g 폴리사카라이드/L로 희석하고, 1.2 M 중탄산나트륨, pH 9.4의 첨가에 의해 pH-조정하였다. 소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하였다. 1.5 M 인산칼륨, pH 6.0을 나중에 첨가하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM L-히스티딘에 대해 투석여과하였다. 폴리소르베이트 20을 보유물 배치에 0.05% (w/v)의 농도로 첨가하고, 이어서 배치를 0.2 마이크로미터 여과하였다 (0.5 마이크로미터 프리필터 사용).
배치를 0.03% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 완충제 중 추가의 10 mM L-히스티딘에 의해 1.0 g/L의 폴리사카라이드 농도로 조정하였다. 배치를 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 12. 수성 접합으로부터의 15A/B/C 교차 보호 연구를 위한 혈청형 15A 접합체의 속성
Figure pat00015
실시예 16
DMSO 접합을 사용하는 다가 연구를 위한 혈청형 15A 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 200 bar/5회 통과로 제어하였다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 1.75 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이었다. 산화 반응을 22℃에서 20시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 34℃로 사전-가열한 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 용액에 염화나트륨을 50 mM의 농도로 스파이킹하였다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 5.0 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 2.0을 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 34℃에서 2시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과한 다음, 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 13. DMSO 접합으로부터의 다가 연구를 위한 혈청형 15A 접합체의 속성
Figure pat00016
실시예 17
DMSO 접합을 사용하는 15A/B/C 교차 보호 연구를 위한 혈청형 15B 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 300 bar/5회 통과로 제어하였다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.20 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이었다. 산화 반응을 22℃에서 4시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 3.0 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 2.0을 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 5시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과하고 (0.5 마이크로미터 프리필터 사용), 이어서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 14. DMSO 접합으로부터의 15A/B/C 교차 보호 연구를 위한 혈청형 15B 접합체의 속성
Figure pat00017
실시예 18
DMSO 접합을 사용하는 1가 연구 및 15A/B/C 교차 보호 연구를 위한 혈청형 15C 접합체의 제조
스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15B로부터 유래된 폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 온화한 염기 가수분해에 적용하여 O-아세틸 기를 방출시키고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소, 염기 가수분해 및 산화
정제된 혈청형 15B 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 300 bar/5회 통과로 제어하였다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
폴리사카라이드 용액을 60℃로 가열하고, 중탄산나트륨 pH 9 완충제를 최종 농도 50 mM로 첨가하였다. 배치를 60℃에서 13시간 동안 혼합하면서 인큐베이션하여 O-아세틸 기를 방출시켰다. 인산칼륨 pH 6 완충제를 최종 농도 136 mM로 첨가하여 pH를 중화시키고, 용액을 주위 온도로 냉각시켰다. 이어서 용액을 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.20 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이었다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 3.0 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 2.0을 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 4시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과하고 (0.5 마이크로미터 프리필터 사용), 이어서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 15. DMSO 접합으로부터의 1가 연구 및 15A/B/C 교차 보호 연구를 위한 혈청형 15C 접합체의 속성
Figure pat00018
실시예 19
DMSO 접합을 사용하는 다가 연구를 위한 혈청형 15C 접합체의 제조
스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 15B로부터 유래된 폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 온화한 염기 가수분해에 적용하여 O-아세틸 기를 방출시키고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소, 염기 가수분해 및 산화
정제된 혈청형 15B 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 300 bar/5회 통과로 제어하였다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
폴리사카라이드 용액을 60℃로 가열하고, 중탄산나트륨 pH 9 완충제를 최종 농도 50 mM로 첨가하였다. 배치를 60℃에서 13시간 동안 혼합하면서 인큐베이션하여 O-아세틸 기를 방출시켰다. 인산칼륨 pH 6 완충제를 최종 농도 136 mM로 첨가하여 pH를 중화시키고, 용액을 주위 온도로 냉각시켰다. 이어서 용액을 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.20 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이었다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 3.0 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.75를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 8시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과하고 (0.5 마이크로미터 프리필터 사용), 이어서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 16. DMSO 접합으로부터의 다가 연구를 위한 혈청형 15C 접합체의 속성
Figure pat00019
실시예 20
수성 접합을 사용하는 1가 연구를 위한 혈청형 16F 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 크기 감소시키고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 이어서 정제된 CRM197을 활성화된 폴리사카라이드에 수성 반응 혼합물 중 염화니켈을 이용하여 접합시키고, 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 폴리사카라이드 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 200 bar/5회 통과에 이어서 500 bar/5회 통과로 제어하여 표적 분자 질량을 달성하였다. 이어서 크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.15 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이었다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
산화된 폴리사카라이드 용액을 물 및 1.5 M 인산칼륨 pH 7.0과 혼합하였다. 선택된 완충제 pH는 접합 반응 동안 활성화된 폴리사카라이드의 안정성을 개선시키는 것이었다. 이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 0.2-마이크로미터 여과하고, 완충된 폴리사카라이드 용액과 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 0.7로 합하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 폴리사카라이드 및 포스페이트 농도는 각각 7.5 g/L 및 100 mM이었다. 생성된 접합체의 크기를 제어하도록 폴리사카라이드 농도를 선택하였다. 이어서, 용액을 0.2-마이크로미터 여과하였다. 100 mM 염화니켈 용액을 사용하여 염화니켈을 대략 2 mM로 첨가하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 첨가하였다. 폴리사카라이드 및 단백질의 소비를 최대화하기 위해 접합을 22℃에서 122시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
접합 반응 후, 배치를 대략 3.0 g/L의 폴리사카라이드 농도로 희석하고, 2-8℃로 냉각시키고, 1.2-마이크로미터 여과하였다. 배치를 100 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2-8℃에서 100 mM 인산칼륨, pH 7.0에 대해 투석여과하였다. 이어서 보유물에 회수된 배치를 대략 2.0 g 폴리사카라이드/L로 희석하고, 1.2 M 중탄산나트륨, pH 9.4의 첨가에 의해 pH-조정하였다. 소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하였다. 1.5 M 인산칼륨, pH 6.0을 나중에 첨가하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM L-히스티딘에 대해 투석여과하였다. 폴리소르베이트 20을 보유물 배치에 0.05% (w/v)의 농도로 첨가하고, 이어서 배치를 0.2 마이크로미터 여과하였다 (0.5 마이크로미터 프리필터 사용).
배치를 0.03% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 완충제 중 추가의 10 mM L-히스티딘에 의해 1.0 g/L의 폴리사카라이드 농도로 조정하였다. 배치를 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 17. 수성 접합으로부터의 1가 연구를 위한 혈청형 16F 접합체의 속성
Figure pat00020
실시예 21
DMSO 접합을 사용하는 다가 연구를 위한 혈청형 16F 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 1000 bar/5회 통과로 제어하였다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.15 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이었다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 용액에 염화나트륨을 50 mM의 농도로 스파이킹하였다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 2.0 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.5를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kD NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과한 다음, 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 18. DMSO 접합으로부터의 다가 연구를 위한 혈청형 16F 접합체의 속성
Figure pat00021
실시예 22
DMSO 접합을 사용하는 1가 연구를 위한 혈청형 17F 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 200 bar/5회 통과로 제어하였다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.11 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이었다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 용액에 염화나트륨을 50 mM의 농도로 스파이킹하였다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 2.0 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.5를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과한 다음, 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 19. DMSO 접합으로부터의 1가 연구를 위한 혈청형 17F 접합체의 속성
Figure pat00022
실시예 23
DMSO 접합을 사용하는 다가 연구를 위한 혈청형 17F 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 200 bar/5회 통과로 제어하였다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.11 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이었다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 용액에 염화나트륨을 20 mM의 농도로 스파이킹하였다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 2.1 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.5를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과하고 (0.5 마이크로미터 프리필터 사용), 이어서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 20. DMSO 접합으로부터의 다가 연구를 위한 혈청형 17F 접합체의 속성
Figure pat00023
실시예 24
DMSO 접합을 사용하는 다가 연구를 위한 혈청형 19A 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트의 양은 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.26 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)이었다. 산화 반응을 22℃에서 20시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 3.8 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.33을 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 1.5시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과한 다음, 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 21. DMSO 접합으로부터의 다가 연구를 위한 혈청형 19A 접합체의 속성
Figure pat00024
실시예 25
DMSO 접합을 사용하는 1가 연구를 위한 혈청형 20A 접합체의 제조
이전에 혈청형 20A인 것으로 결정된 폴리사카라이드 (Calix et al., Biochemical, Genetic, and Serological Characterization of Two Capsule Subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 Strains, J. Biol. Chem. 287(33): 27885-27894, (2012))를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 200 bar/5회 통과로 제어하였다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 소듐 메타퍼아이오데이트를 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.11 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)로 첨가하였다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 2.0 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.5를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 6시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kD NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과하고 (0.5 마이크로미터 프리필터 사용), 이어서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 22. DMSO 접합으로부터의 1가 연구를 위한 혈청형 20A 접합체의 속성
Figure pat00025
실시예 26
DMSO 접합을 사용하는 다가 연구를 위한 혈청형 20A 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 220 bar/5회 통과로 제어하였다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 소듐 메타퍼아이오데이트를 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.16 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)로 첨가하였다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 용액에 염화나트륨을 20 mM의 농도로 스파이킹하였다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 1.4 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.5를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 4시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kD NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과하고 (0.5 마이크로미터 프리필터 사용), 이어서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 23. DMSO 접합으로부터의 다가 연구를 위한 혈청형 20A 접합체의 속성
Figure pat00026
실시예 27
DMSO 접합을 사용하는 다가 연구를 위한 혈청형 22F 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 400 bar/5회 통과로 제어하였다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 소듐 메타퍼아이오데이트를 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.12 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)로 첨가하였다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 1.8 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.5를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 1시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kD NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과한 다음, 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 24. DMSO 접합으로부터의 다가 연구를 위한 혈청형 22F 접합체의 속성
Figure pat00027
실시예 28
DMSO 접합을 사용하는 1가 연구를 위한 혈청형 23A 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를, 아세트산을 200 mM로 첨가하여 산 가수분해하고, 90℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션한 다음, 차가운 인산칼륨 pH 7 완충제를 400 mM로 첨가하여 중화시킴으로써 크기-감소시켰다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트는 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.20 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)로 첨가하였다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 용액에 염화나트륨을 50 mM의 농도로 스파이킹하였다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 3.0 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.5를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kD NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과한 다음, 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 25. DMSO 접합으로부터의 1가 연구를 위한 혈청형 23A 접합체의 속성
Figure pat00028
실시예 29
DMSO 접합을 사용하는 다가 연구를 위한 혈청형 23A 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를, 아세트산을 200 mM로 첨가하여 산 가수분해하고, 90℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션한 다음, 차가운 인산칼륨 pH 7 완충제를 400 mM로 첨가하여 중화시킴으로써 크기-감소시켰다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트는 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.20 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)로 첨가하였다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 3.5 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.5를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kD NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과한 다음, 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 26. DMSO 접합으로부터의 다가 연구를 위한 혈청형 23A 접합체의 속성
Figure pat00029
실시예 30
DMSO 접합을 사용하는 1가 연구를 위한 혈청형 23B 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 400 bar/5회 통과로 제어하였다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 소듐 메타퍼아이오데이트를 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.10 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)로 첨가하였다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 용액에 염화나트륨을 최종 농도 50 mM로 스파이킹하였다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 5.0 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.5를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kD NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과한 다음, 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 27. DMSO 접합으로부터의 1가 연구를 위한 혈청형 23B 접합체의 속성
Figure pat00030
실시예 31
DMSO 접합을 사용하는 다가 연구를 위한 혈청형 23B 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 400 bar/5회 통과로 제어하였다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 소듐 메타퍼아이오데이트를 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.13 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)로 첨가하였다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 5.0 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.5를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 4시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kD NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과한 다음, 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 28. DMSO 접합으로부터의 다가 연구를 위한 혈청형 23B 접합체의 속성
Figure pat00031
실시예 32
DMSO 접합을 사용하는 1가 및 다가 연구를 위한 혈청형 24F 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를, 아세트산을 200 mM로 첨가하여 산 가수분해하고, 92℃에서 50분 동안 인큐베이션한 다음, 차가운 인산칼륨 pH 7 완충제를 400 mM로 첨가하여 중화시킴으로써 크기-감소시켰다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트는 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.18 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)로 첨가하였다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 10% w/v의 수크로스 농도를 갖는 2 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 용액에 염화나트륨을 최종 농도 50 mM로 스파이킹하였다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 1.5 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.5를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kD NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과한 다음, 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 29. DMSO 접합으로부터의 1가 및 다가 연구를 위한 혈청형 24F 접합체의 속성
Figure pat00032
실시예 33
DMSO 접합을 사용하는 1가 연구를 위한 혈청형 31 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를, 아세트산을 200 mM로 첨가하여 산 가수분해하고, 90℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 차가운 인산칼륨 pH 7 완충제를 400 mM로 첨가하여 중화시킴으로써 크기-감소시켰다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트는 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.16 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)로 첨가하였다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 4.0 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.5를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 1시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kD NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과한 다음, 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 30. DMSO 접합으로부터의 1가 연구를 위한 혈청형 31 접합체의 속성
Figure pat00033
실시예 34
DMSO 접합을 사용하는 다가 연구를 위한 혈청형 31 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 400 bar/5회 통과로 제어하였다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 소듐 메타퍼아이오데이트를 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.12 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)로 첨가하였다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 용액에 염화나트륨을 최종 농도 50 mM로 스파이킹하였다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 3.5 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.5를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 1시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kD NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과한 다음, 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 31. DMSO 접합으로부터의 다가 연구를 위한 혈청형 31 접합체의 속성
Figure pat00034
실시예 35
DMSO 접합을 사용하는 다가 연구를 위한 혈청형 33F 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 표적 분자 질량으로 크기조정하고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 크기 감소 및 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 균질화시켜 Ps의 분자 질량을 감소시켰다. 균질화 압력 및 균질화기 통과 횟수를 350 bar/4회 통과로 제어하였다.
크기-감소된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 소듐 메타퍼아이오데이트를 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.12 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)로 첨가하였다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197 물질을 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 1.8 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 1.75를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 소듐 시아노보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 1 mol)를 첨가하고, 접합을 22℃에서 4시간 동안 진행하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kD NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과하고 (0.5 마이크로미터 프리필터 사용), 이어서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 32. DMSO 접합으로부터의 다가 연구를 위한 혈청형 33F 접합체의 속성
Figure pat00035
실시예 36
DMSO 접합을 사용하는 1가 연구를 위한 혈청형 35B 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트는 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.05 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)로 첨가하였다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps 및 CRM197을 25 mM 염화나트륨을 함유하는 동일 부피의 DMSO 중에 개별적으로 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 10 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 4.0을 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 접합을 22℃ 에서 2.5시간 동안 진행하였다. 소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 0.025 mol)를 접합 인큐베이션 동안 2회의 스파이크에 걸쳐 첨가하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 22℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kD NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과하고 (0.5 마이크로미터 프리필터 사용), 이어서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 33. DMSO 접합으로부터의 1가 연구를 위한 혈청형 35B 접합체의 속성
Figure pat00036
실시예 37
DMSO 접합을 사용하는 다가 연구를 위한 혈청형 35B 접합체의 제조
폴리사카라이드를 용해시키고, 화학적으로 활성화시키고, 한외여과에 의해 완충제-교환하였다. 활성화된 폴리사카라이드 및 정제된 CRM197을 개별적으로 동결건조시키고, DMSO 중에 재용해시켰다. 이어서 재용해된 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 하기 기재된 바와 같이 합하고 접합시켰다. 생성된 접합체를 한외여과에 의해 정제한 후 최종 0.2-마이크로미터 여과하였다. 각각의 단계 내의 여러 공정 파라미터, 예컨대 pH, 온도, 농도 및 시간을 제어하여 목적하는 속성을 갖는 접합체를 수득하였다.
폴리사카라이드 산화
정제된 폐렴구균 피막 Ps 분말을 물 중에 용해시키고, 0.45-마이크로미터 여과하였다. 용해된 폴리사카라이드를 농축시키고, 10 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 물에 대해 투석여과하였다.
이어서 폴리사카라이드 용액을 아세트산나트륨 완충제에 의해 22℃ 및 pH 5로 조정하여 활성화로 인한 폴리사카라이드 크기 감소를 최소화하였다. 100 mM 소듐 메타퍼아이오데이트 용액을 첨가하여 폴리사카라이드 활성화를 개시하였다. 첨가된 소듐 메타퍼아이오데이트는 표적 폴리사카라이드 활성화 수준을 달성하기 위한 폴리사카라이드 반복 단위 mol당 소듐 메타퍼아이오데이트 0.05 mol (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 알데히드 mol)로 첨가하였다. 산화 반응을 22℃에서 2시간 동안 진행하였다.
활성화된 생성물을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 10 mM 인산칼륨, pH 6.4에 대해 투석여과하고 이어서 물에 대해 투석여과하였다. 한외여과를 2-8℃에서 수행하였다.
CRM197에 대한 폴리사카라이드 접합
이전에 기재된 바와 같이 (WO 2012/173876 A1) 슈도모나스 플루오레센스에서의 발현을 통해 수득된 정제된 CRM197을 5 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 2 mM 포스페이트, pH 7.2 완충제에 대해 투석여과하고, 0.2-마이크로미터 여과하였다.
활성화된 폴리사카라이드를 동결건조를 위해 5% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Ps/mL로 제제화하였다. CRM197을 동결건조를 위해 1% w/v의 수크로스 농도를 갖는 6 mg Pr/mL로 제제화하였다.
제제화된 Ps 및 CRM197 용액을 개별적으로 동결건조시켰다. 동결건조된 Ps를 50 mM 염화나트륨을 함유하는 DMSO 중에 재용해시켰다. 동결건조된 CRM197을 동일 부피의 DMSO 중에 재용해시켰다. 폴리사카라이드 및 CRM197 용액을 블렌딩하여 폴리사카라이드 농도 5.25 g Ps/L 및 CRM197에 대한 폴리사카라이드 질량비 3.5를 달성하였다. 생성된 접합체 내의 CRM197에 대한 폴리사카라이드 비를 제어하도록 질량비를 선택하였다. 접합을 34℃에서 3시간 동안 진행하였다. 소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 0.0375 mol)를 접합 인큐베이션 동안 3회의 스파이크에 걸쳐 첨가하였다.
소듐 보로히드라이드에 의한 환원
소듐 보로히드라이드 (폴리사카라이드 반복 단위 mol당 2 mol)를 접합 반응 후에 첨가하고, 34℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 배치를 대략 4℃에서 대략 0.025% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨 중으로 희석하였다. 이어서 인산칼륨 완충제를 첨가하여 pH를 중화시켰다. 배치를 농축시키고, 30 kD NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 150 mM 염화나트륨, 25 mM 인산칼륨 pH 7에 대해 대략 4℃에서 투석여과하였다.
최종 여과 및 생성물 저장
이어서 배치를 농축시키고, 300 kDa NMWCO 접선 흐름 한외여과 막을 사용하여 4℃에서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 10 mM 히스티딘에 대해 투석여과하였다.
보유물 배치를 0.2 마이크로미터 여과하고 (0.5 마이크로미터 프리필터 사용), 이어서 0.015% (w/v) 폴리소르베이트 20을 갖는 150 mM 염화나트륨, pH 7.0 중 추가의 10 mM 히스티딘에 의해 희석하고, 분취물로 분배하고, ≤ -60℃에서 동결시켰다.
표 34. DMSO 접합으로부터의 다가 연구를 위한 혈청형 35B 접합체의 속성
Figure pat00037
실시예 38-51의 모든 혈청형에 대해 일부 수성 접합 방법을 기재하지 않았다. 본원에 기재되지 않은 상기 수성 접합 방법에 대해, 유사한 방법을 WO 2018/156491에서 찾을 수 있다.
실시예 38
폐렴구균 접합체 백신의 제제화
상기 실시예에 기재된 바와 같이 상이한 화학을 이용하여 제조된 개별 폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체를 각각 PCV1, PCV7, PCV8, PCV14, PCV15, PCV16, PCV21 및 PCV31로 지칭되는 1-, 7-, 8-, 14-, 15-, 16-, 21- 및 31-가 폐렴구균 접합체 백신의 제제화에 사용하였다.
PCV1 백신 약물 제품 제제는 양성자성 (수성) 용매 또는 비양성자성 (DMSO) 용매 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 접합되고 백신 내 84 μg/mL (w/v) 폐렴구균 폴리사카라이드 (PnPs)의 표적 최종 농도로 20 mM L-히스티딘 pH 5.8, 150 mM NaCl 및 0.1% (w/v) PS-20 중에서 제제화된 혈청형 3을 함유하였다.
PCV7 백신 약물 제품 제제는 양성자성 (수성) 용매 또는 비양성자성 (예를 들어 DMSO) 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 접합되고 20 mM L-히스티딘 pH 5.8, 150 mM NaCl 및 0.1% (w/v) PS-20 중에서 제제화된 혈청형 3, 8, 9N, 10A, 11A, 15A 및 19A를 함유하였다. PCV7 내의 각각의 폴리사카라이드-단백질 접합체를 12 μg/mL (w/v) 폐렴구균 폴리사카라이드 (PnPs)로 백신 내 84 μg/mL PnPs의 표적 최종 농도로 제제화하였다.
PCV8 백신 약물 제품은 비양성자성 용매 (예를 들어 DMSO) 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 접합되고 20 mM L-히스티딘 pH 5.8, 150 mM NaCl 및 0.2% (w/v) PS-20 중에서 제제화된 혈청형 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B를 함유하였다. PCV8 내의 각각의 폴리사카라이드-단백질 접합체를 4 μg/mL (w/v) 폐렴구균 폴리사카라이드 (PnPs)로 백신 내 32 μg/mL PnPs의 표적 최종 농도로 제제화하였다.
PCV14 백신 약물 제품은 양성자성 (수성) 용매 또는 비양성자성 (예를 들어 DMSO) 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 접합되고 20 mM L-히스티딘 pH 5.8, 150 mM NaCl 및 0.1% (w/v) PS-20 중에서 제제화된 혈청형 3, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 16F, 17F, 19A, 20A, 22F 및 33F를 함유하였다. PCV14 내의 각각의 폴리사카라이드-단백질 접합체를 6 μg/mL (w/v) 폐렴구균 폴리사카라이드 (PnPs)로 백신 내 84 μg/mL PnPs의 표적 최종 농도로 제제화하였다.
PCV15 백신 약물 제품은 양성자성 (수성) 용매 중에서 접합되고 20 mM L-히스티딘 pH 5.8, 150 mM NaCl 및 0.2% (w/v) PS-20 중에서 제제화된 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F를 함유하였다. 각각의 폴리사카라이드-단백질 접합체를 4 μg/mL (w/v) 폐렴구균 폴리사카라이드 (PnPs)로, 예외로 6B는 8 μg/mL로, 백신 내 64 μg/mL PnPs의 표적 최종 농도로 제제화하였다.
PCV16 백신 약물 제품은 비양성자성 용매 (예를 들어 DMSO) 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 접합되고 20 mM L-히스티딘 pH 5.8, 150 mM NaCl 및 0.2% (w/v) PS-20 중에서 제제화된 혈청형 6C, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 20A, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B를 함유하였다. 각각의 폴리사카라이드-단백질 접합체를 4 μg/mL (w/v) 또는 8 μg/mL (w/v) 폐렴구균 폴리사카라이드 (PnPs)로 백신 내 64 μg/mL 또는 128 μg/mL PnPs의 표적 최종 농도로 제제화하였다.
PCV21 백신 약물 제품은 비양성자성 용매 (예를 들어 DMSO) 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 접합되고 20 mM L-히스티딘 pH 5.8, 150 mM NaCl 및 각각의 실시예에 정의된 바와 같은 다양한 농도의 PS-20 중에서 제제화된 혈청형 3, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 19A, 20A, 22F, 23A, 23B, 24F, 31, 33F 및 35B를 함유하였다. 각각의 폴리사카라이드-단백질 접합체를 4 μg/mL (w/v) 또는 8 μg/mL (w/v) 폐렴구균 폴리사카라이드 (PnPs)로 백신 내 84 μg/mL 또는 168 μg/mL PnPs의 표적 최종 농도로 제제화하였다. 일부 예에서, PCV21을 알루미늄 포스페이트 형태의 250 μg [Al]/mL와 함께 제제화하였다.
PCV31 백신 약물 제품은 양성자성 용매 (수성) 또는 비양성자성 용매 (예를 들어 DMSO) 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 접합되고 20 mM L-히스티딘 pH 5.8, 150 mM NaCl 및 0.2% PS-20 중에서 제제화된 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 31, 33F 및 35B를 함유하였다. 각각의 폴리사카라이드-단백질 접합체를 4 μg/mL (w/v) 폐렴구균 폴리사카라이드 (PnPs)로, 예외로 6B는 8 μg/mL PnPs로, 백신 내 128 μg/mL PnPs의 표적 최종 농도로 제제화하였다. 일부 예에서, PCV31을 알루미늄 포스페이트 형태의 250 μg [Al]/mL와 함께 제제화하였다.
폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체 혈청형 6A, 6B, 6C, 10A, 15A, 15B, 15C, 16F, 17F, 20A, 23A, 23B, 24F, 31 또는 35B를 이용하여 추가의 1가 PCV 약물 제품 제제를 제조하였다. 추가의 세부사항은 이들 제제에 대한 구체적 실시예에 기재되어 있다.
PCV 약물 제품 제제를 제조하기 위해, 표시된 최종 농도 (w/v) 폐렴구균 폴리사카라이드 (또한 PnPs로도 지칭됨)를 수득하는데 필요한 벌크 접합체의 요구되는 부피를 배치 부피 및 벌크 폴리사카라이드 농도에 기초하여 계산하였다.
제제화 공정은 10-80 mM 히스티딘, 0.0-0.8% (w/v) PS-20 및 150 mM 염화나트륨, pH 5.8 중 PnPs 블렌드의 최종 농도의 1X 내지 4X의 접합체 벌크 블렌드 제제로 이루어졌다.
히스티딘 pH 5.8, PS-20 (이용되는 경우) 및 150 mM 염화나트륨 용액을 제조하고, 제제 용기에 첨가하였다. 동결 저장된 개별 폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체를 2-8℃에서 해동시킨 다음, 제제화 용기에 첨가하였다. 폴리사카라이드-단백질 접합체를 제제화 완충제에 첨가하는 동안 (접합체 블렌드), 자기 교반 막대 또는 자기 임펠러를 사용하여 용기를 혼합함으로써 균질성을 보장하였다. 모든 첨가를 수행하고 용액을 교반한 후에, 접합체 블렌드를 멸균 필터에 통과시키고, 알루미늄 포스페이트 아주반트가 존재 또는 부재하는 용기에 수집하였다. 일부 경우에, 멸균 필터를 150 mM 염화나트륨으로 체이싱하여 배치를 표적 농도로 조정하였다.
제제를 플라스틱 시린지, 유리 시린지 또는 바이알 내로 충전하였다.
실시예 39
폐렴구균 접합체 백신의 안정성 평가
PCV16 (128 μg/mL PnPs) 또는 2종의 PCV21 폐렴구균 접합체 백신 약물 제품 (84 μg/mL 또는 168 μg/mL PnPs)을 시린지 또는 바이알에 충전하였다. 폴리사카라이드 단백질 접합체를 비양성자성 용매 (예를 들어 DMSO) 중에서 환원성 아미노화를 통해 제조하고, 20 mM L-히스티딘, pH 5.8, 150 mM NaCl 및 0.2% (w/v) PS-20 중에서 제제화하였다. 이들 약물 제품을 25℃ 또는 37℃에서 4주 이하 동안 및 4℃에서 12주 이하 동안 두었다. 일부 경우에, 시린지를 수평 회전 플랫폼 상에 놓고, 4℃, 25℃ 또는 37℃에서 1주 동안 저장한 후 18시간 이하 동안 진탕하였다. 이를 수행하여 약물 제품 제조 및 분배에 동반될 수 있는 수송 및 취급 스트레스를 모의실험하였다. PCV16 또는 PCV21 약물 제품의 안정성을 평가하기 위해, HPSEC UV/MALS/RI를 사용하였다. 연속으로 자외선 (UV), 다중-각도 광 산란 (MALS) 및 굴절률 (RI) 검출과 함께 커플링된 2개의 쇼덱스 칼럼 (803 및 806)을 사용하는 고성능 크기 배제 크로마토그래피 (HPSEC)에 의해 저장 동안 PCV 약물 제품 제제의 농도 및 몰 질량을 측정하였다. 농도를 피크에 걸쳐 각각의 시간 간격에 대해 계산한 다음, 모든 간격에서 적분하여 최종 농도 값을 달성하였다. 광 산란은 분석물의 분자 질량과 농도의 곱에 비례하였다. 각각의 간격에서의 몰 질량 또는 분자량을 검출기 신호로부터 계산하였다. 중량 평균 (Mw) 또는 수 평균 (Mn) 분자 질량을 피크에 대한 모든 간격에 걸쳐 계산하고, 평균 분자량으로서 보고하였다.
저장은 접합체 백신의 단백질 및/또는 탄수화물에 대한 손상을 초래할 수 있다. 폴리사카라이드의 반복 단위에 포스포디에스테르 주쇄 결합 또는 다른 불안정성을 갖는 탄수화물 항원은 연장된 시간 및 온도 동안 저장시 가수분해를 통해 탈중합되기 쉬울 수 있다. 추가로, 접합체 백신에 사용되는 담체 단백질 또는 탄수화물은 저장 및 물리적 스트레스시 응집되기 쉬울 수 있다.
도 11에 제시된 바와 같이, PCV16 및 PCV21 약물 제품은 폴리사카라이드 농도와 상관없이 25℃ 및 37℃에서 4주 내내 및 4℃에서 12주까지 안정하였다. 더욱이, 열적 스트레스 후 수평 교반시, PCV16 및 PCV21 약물 제품은 안정한 것으로 나타났다. 이들 열적 및 물리적 스트레스 하에서 용기 또는 그릇의 측면에의 비-특이적 흡착으로 인한 항원 양의 손실은 관찰되지 않았다. 추가적으로, 백신의 총 용량을 추정하는데 있어서 칼럼 상에서의 성능에 영향을 미치는 (예를 들어 칼럼에 비가역적으로 결합하거나 또는 분해 칼럼에 들어가거나/그로부터 나올 수 없는) 약물 제품의 응집은 관찰되지 않았다 (도 12).
HPSEC UV/MALS/RI를 사용하여 폴리사카라이드-단백질 접합체의 분자량을 측정하였다. 약물 제품 내의 폴리사카라이드-단백질 접합체가 분해 또는 탈중합되는 경우, 분자량의 감소가 분명할 것이고, 약물 제품의 응집이 발생하는 경우, 분자량의 증가가 일어날 것이다. 이러한 측정은 백신 약물 제품 또는 중간체의 품질에 대한 추가의 특징화를 제공한다. 도 13에 제시된 바와 같이, 비양성자성 용매 (예를 들어 DMSO) 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 각각 제조된 약물 물질을 포함하는 PCV16 및 PCV21 약물 제품은 약물 제품 제제화시 탄수화물의 탈중합 또는 화학적 분해에 대해 안정하고 단백질의 응집에 대해 안정하였다. 이는 비양성자성 용매, 예컨대 DMSO 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 제조된 폴리사카라이드 단백질 접합체를 사용하는 PCV16 및 PCV21 약물 제품이 승온 및 물리적 스트레스 내내 안정하다는 것을 나타낸다. 제제는 양 및 질 둘 다의 측면에서 탁월한 안정성을 입증하였다. 제제는 용기 또는 다른 표면의 측면에 대한 비-특이적 흡착으로 인해 총 용량을 손실하지 않았고, 제제는 백신 약물 제품의 안정한 분자량 (중량 평균 분자량 (Mw) 및 수 평균 분자량 (Mn))에 의해 나타난 바와 같이 분해되거나 응집되지 않았다.
실시예 40
폐렴구균 접합체 백신의 안정성에 대한 접합 화학의 영향
상기 실시예에 기재된 바와 같이 상이한 화학을 이용하여 제조된 개별 폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체를 64 μg/mL로 PCV15 및 PCV16으로 지칭되는 15- 및 16-가 폐렴구균 접합체 백신의 제제화에 사용하였다. PCV15 백신 약물 제품은 양성자성 용매 (모두 수성) 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 접합되고 20 mM L-히스티딘 pH 5.8, 150 mM NaCl 및 0.2% w/v PS-20 중에서 제제화된 혈청형 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F를 함유하였다 (실시예 38 참조). PCV16 약물 제품은 비양성자성 용매 (예를 들어 모두 DMSO) 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 접합되고 20 mM L-히스티딘 pH 5.8, 150 mM NaCl 및 0.2% (w/v) PS-20 중에서 제제화된 혈청형 6C, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 20A, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B를 함유하였다 (실시예 38 참조). 각각의 폴리사카라이드-단백질 접합체를 4 μg/mL (w/v) 폐렴구균 폴리사카라이드 (PnPs)로, 예외로 PCV15 내의 6B는 8 μg/mL로, 각각의 백신 내 64μ g/mL PnPs의 표적 최종 농도로 제제화하였다.
백신-충전된 용기를 4℃ 또는 37℃에서 1주 이하 동안 두었다. 고유 단백질 형광 분광분석법 (IPFS)을 사용하여 4℃ 및 37℃에서 1주 이하 동안 저장시 PCV15 또는 PCV16 조성물 내의 폐렴구균 폴리사카라이드-접합된 담체 단백질인 CRM197의 안정성을 평가하였다. 주위 실온에서 자스코 FP-6500 분광광도계를 사용하여 1 cm 통로 길이 석영 큐벳 내 비희석 샘플의 형광 방출 스펙트럼 (Em 290-400 nm)을 수집하였다. 100 nm/분의 스캔 속도 및 3nm의 여기 및 방출 대역통과로 280 nm의 여기 파장을 사용하였다.
도 14에 제시된 바와 같이, 비양성자성 용매 (예를 들어 모두 DMSO) 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 제조된 약물 물질을 함유하는 약물 제품 제제는 접합 공정 (모두 수성 접합)에서 환원성 아미노화 동안 양성자성 용매를 사용하여 제조된 약물 물질을 이용하는 백신과 비교하여 우수한 물리적 및 화학적 안정성을 가져왔다. 37℃에서 적게는 16시간 이내에, 접합 공정 동안 양성자성 용매 (모두 수성)에서 환원성 아미노화를 사용하여 제조된 64 μg/mL PnPs의 PCV15 약물 제품의 형광 강도는 감소하였고, 백신의 방출 최대치는 332 nm에서 338 nm로 이동하였다. 비양성자성 용매 (예를 들어 모두 DMSO) 중에서 환원성 아미노화 화학으로 제조된 약물 물질을 이용하는 64 μg/mL PnPs의 PCV16 백신 약물 제품은 형광 강도 또는 방출 최대치 338 nm에 있어서 변화를 나타내지 않았다. IPFS 측정으로부터 얻은 생성된 신호 강도 및 방출 최대치는 다가 복합체 약물 제품에서 개별 약물 물질의 집합적 안정성에 기인하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명자들은 모두 비양성자성 용매 중에서 제조된 약물 물질을 이용하는 백신 약물 제품이 안정한 반면 모두 양성자성 용매 중에서 제조된 약물 물질을 이용하는 백신 약물 제품은 안정하지 않다는 것을 보여주었다.
어떠한 특정한 이론에 얽매이지 않으면서, 이러한 안정성은 담체 단백질의 언폴딩 및 변성을 유발하는 DMSO 중에서의 접합으로 인한 것일 수 있다. 변성된 담체 단백질에 대한 접합은 접합 후 변성 상태의 입체형태를 잠글 것이다. 그렇다면, 이러한 연구는 또한 최종 입체형태가 본원에서 평가된 스트레스 연구 하에서 안정하다는 것을 시사할 것이다. 따라서, 일관되고 안정한 백신 약물 제품을 제공하기 위해 대부분 비양성자성 용매를 사용하여 제조된 접합체를 갖는 백신을 사용하는 것이 바람직하다.
백신 약물 제품 조성물이 접합 공정에서 상이한 환원성 아미노화 용매 (수성 또는 DMSO)를 이용하는 약물 물질, 당접합체 또는 폴리사카라이드 단백질 접합체의 혼합물을 포함한 경우에, 약물 제품 제제로부터 측정된 평균 방출 최대치 또는 강도는 332 nm에서의 각각의 수성 폴리사카라이드 단백질 접합체 방출 및 338 nm에서의 각각의 비-수성 폴리사카라이드 단백질 접합체 방출의 기여로 인해 가중될 것이다. 다가 약물 제품 제제화시 모두가 비양성자성 용매 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 제조된 폴리사카라이드 단백질 접합체를 사용하지는 않는 이러한 혼합물의 경우 승온에서 강도 또는 방출 최대치의 변화가 일어날 것으로 예상될 것이다. 따라서, 일관되고 안정한 백신 약물 제품을 제공하기 위해 대부분 비양성자성 용매를 사용하여 제조된 접합체를 갖는 백신을 사용하는 것이 바람직하다.
실시예 41
선택된 혈청형에 대한 컴파일링된 1가 토끼 면역원성 연구
성체 뉴질랜드 화이트 토끼 (NZWR, n=3/군)를 제0일 및 제14일에 (교대로) 0.25 ml 또는 0.5 mL (15C만)의 각각의 1가 접합체 백신에 의해 근육내로 (IM) 면역화시켰다. 실시예 38에 기재된 제제화 공정에 따라 20 mM L-히스티딘, pH 5.8, 150 mM NaCl 및 0.2% (w/v) PS-20 중에서 제제화된 1가 폐렴구균 백신을 하기와 같이 투여하였다: (1) 면역화당 62.5 μg 알루미늄 포스페이트 아주반트 (APA)를 갖는 1 μg PnPs (6C, 10A, 15A, 16F, 17F, 20A, 23A, 23B, 24F, 31 또는 35B, 각각 CRM197에 접합됨), 또는 (2) 면역화당 125 μg APA를 갖는 2 μg PnPs (15C-CRM197). 연구 시작 전 (면역전) 및 제14일 (투여 1 후, PD1) 및 제28일 (투여 2 후, PD2)에 혈청을 수집하였다. 훈련된 동물 관리 스태프가 NZWR을 질병 또는 고통의 임의의 징후에 대해 적어도 매일 관찰하였다. NZWR에서의 백신 제제는, 백신-관련 유해 사건이 주목되지 않았으므로, 안전하고 내약성이 우수한 것으로 간주되었다. 모든 동물 실험을 미국 국립 보건원의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에서의 권장사항에 따라 엄격하게 수행하였다. NZWR 실험 프로토콜은 머크 앤 캄파니, 인크. (뉴저지주 케닐워스) 및 코반스 (펜실베니아주 덴버) 둘 다에서 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인되었다.
IgG 면역원성을 평가하기 위해 ELISA 검정에서 1-2 mg/mL의 각각의 PnPs 코팅 농도를 사용하여 NZWR 혈청을 시험하였다. 기능적 항체는 옵소타이터(Opsotiter)® 3 소프트웨어를 사용하여 버밍햄 소재 알라바마 대학의 박테리아 호흡기 병원체 참조 실험실에서 온라인으로 이용가능한 이전에 기재된 프로토콜에 기초하여 옵소닌식세포작용 검정 (OPA)을 통해 결정하였다 (UAB Research Foundation, Caro-Aguilar et al. Immunogenicity differences of a 15-valent pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (PCV15) based on vaccine dose, route of immunization and mouse strain. Vaccine 35(6):865-72 (2017); Burton et al. Development and validation of a fourfold multiplexed opsonization assay (MOPA4) for pneumococcal antibodies. Clin Vaccine Immunol 13(9):1004-9 (2006)).
모든 1가 폐렴구균 접합체 백신은 토끼에서 면역원성인 것으로 밝혀졌고 (도 15), 각각의 박테리아 균주를 사멸시키는 기능적 항체를 생성하는 것으로 밝혀졌다 (도 16).
실시예 42
혈청형 15A, 15B, 15C의 교차 보호 평가
토끼를 15A-CRM197/APA, 15B-CRM197/APA 또는 15C-CRM197/APA로 면역화시켜 각각의 혈청형 사이의 교차-반응성을 평가하였다.
성체 뉴질랜드 화이트 토끼 (NZWR, n=3/군)를 제0일 및 제14일에 (교대로) 0.5 ml의 각각의 1가 접합체 백신에 의해 근육내로 (IM) 면역화시켰다. 실시예 38에 기재된 제제화 공정에 따라 20 mM L-히스티딘, pH 5.8, 150 mM NaCl 및 0.2% (w/v) PS-20 중에서 제제화된 1가 폐렴구균 접합체 백신을 면역화당 125 μg APA를 갖는 2 μg PnPs (15A, 15B 또는 15C, 각각 CRM197에 접합됨)로 투여하였다. 연구 시작 전 (면역전) 및 제14일 (투여 1 후, PD1) 및 제28일 (투여 2 후, PD2)에 혈청을 수집하였다. 훈련된 동물 관리 스태프가 NZWR을 질병 또는 고통의 임의의 징후에 대해 적어도 매일 관찰하였다. NZWR에서의 백신 제제는, 백신-관련 유해 사건이 주목되지 않았으므로, 안전하고 내약성이 우수한 것으로 간주되었다. 모든 동물 실험을 미국 국립 보건원의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에서의 권장사항에 따라 엄격하게 수행하였다. NZWR 실험 프로토콜은 머크 앤 캄파니, 인크. 및 코반스 (펜실베니아주 덴버) 둘 다에서 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인되었다.
IgG 면역원성을 평가하기 위해 ELISA 검정에서 1-2 mg/mL의 각각의 PnPs 코팅 농도를 사용하여 NZWR 혈청을 시험하였다. 기능적 항체는 옵소타이터® 3 소프트웨어를 사용하여 버밍햄 소재 알라바마 대학의 박테리아 호흡기 병원체 참조 실험실에서 온라인으로 이용가능한 이전에 기재된 프로토콜에 기초하여 OPA를 통해 결정하였다 (UAB Research Foundation (Caro-Aguilar et al., 2017; Burton et al., 2006).
혈청군 15의 모든 3종의 1가 폐렴구균 접합체 백신이 토끼에서 면역원성인 것으로 밝혀졌고 (도 17), 각각의 박테리아 균주를 사멸시키는 기능적 항체를 생성하는 것으로 밝혀졌다 (도 18). 추가로, 혈청군 15 1가 폐렴구균 접합체 백신으로 면역화된 토끼는 각각 동종 및 이종 폴리사카라이드 및 박테리아 균주에 대한 동등한 PD2 IgG 및 OPA 역가를 가졌다. 15A-CRM197/APA, 15B-CRM197/APA 또는 15C-CRM197/APA로 면역화된 토끼는 모두 각각의 폐렴구균 폴리사카라이드 (15A, 15B, 15C)에 대한 교차 반응성을 가졌다 (도 17). 투여 2 후 (PD2) 로그 변환된 IgG 데이터를 사용하여 일원 ANOVA와 터키 다중 비교 검정에 의해 분석하였을 때 (P-값=0.354), 혈청군 15에 걸쳐 IgG 역가의 유의한 차이는 없었다. 추가로, 15A-CRM197/APA, 15B-CRM197/APA 또는 15C-CRM197/APA로 면역화된 토끼는, 모든 토끼 과다면역 혈청이 평가된 각각의 균주에 대한 기능적 항체를 가졌고 박테리아를 사멸시켰으므로, 모두 각각의 에스. 뉴모니아에 박테리아 균주 (15A, 15B, 15C)에 대한 교차 반응성을 가졌다 (도 18). 유사하게, 투여 2 후 (PD2) 로그 변환된 OPA 데이터를 사용하여 일원 ANOVA와 터키 다중 비교 검정에 의해 분석하였을 때 (P-값=0.054), 혈청군 15에 걸쳐 OPA 역가의 유의한 차이는 없었다.
실시예 43
뉴질랜드 화이트 토끼에서 PCV21의 면역원성
성체 뉴질랜드 화이트 토끼 (NZWR, n=5/군)를 제0일 및 제14일에 (교대로) 0.1-0.5 mL의 폐렴구균 접합체 백신에 의해 근육내로 (IM) 면역화시켰다. 실시예 38에 기재된 제제화 공정에 따라 20 mM L-히스티딘, pH 5.8, 150 mM NaCl 및 0.2% (w/v) PS-20 중에서 제제화된 PCV21 폐렴구균 백신을 면역화당 4, 2, 1, 0.4, 0.08 또는 0.016 μg PnPs (3, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 19A, 20A, 22F, 23A, 23B, 24F, 31, 33F 또는 35B, 각각 CRM197에 접합됨)로 투여하였다. 연구 시작 전 (면역전) 및 제14일 (투여 1 후, PD1) 및 제28일 (투여 2 후, PD2)에 혈청을 수집하였다. 훈련된 동물 관리 스태프가 NZWR을 질병 또는 고통의 임의의 징후에 대해 적어도 매일 관찰하였다. NZWR에서의 백신 제제는, 백신-관련 유해 사건이 주목되지 않았으므로, 안전하고 내약성이 우수한 것으로 간주되었다. 모든 동물 실험을 미국 국립 보건원의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에서의 권장사항에 따라 엄격하게 수행하였다. NZWR 실험 프로토콜은 머크 앤 캄파니, 인크. 및 코반스 (펜실베니아주 덴버) 둘 다에서 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인되었다.
NZWR 혈청을 멀티플렉스화 전기화학발광 (ECL) 검정을 사용하여 IgG 면역원성에 대해 평가하였다. 본 검정은 전기화학적 자극시 광을 방출하는 술포-태그(SULFO-TAG)™ 표지를 이용하는 메소스케일 디스커버리(MesoScale Discovery) (메릴랜드주 게이더스버그 소재 메소스케일 다이아그노스틱스, 엘엘씨(MesoScale Diagnostics, LLC)의 자회사)에 의해 개발된 기술을 사용하여, 문헌 [Marchese et al. (Optimization and validation of a multiplex, electrochemiluminescence-based detection assay for the quantitation of immunoglobulin G serotype-specific antipneumococcal antibodies in human serum. Clin Vaccine Immunol. 16(3): 387-96 (2009))]에 기재된 인간 검정에 기초하여 토끼 혈청에서 사용하기 위해 개발되었다. 술포-태그™-표지된 항-토끼 IgG를 NZWR 혈청 샘플을 시험하기 위한 2차 항체로서 사용하였다. 기능적 항체는 옵소타이터® 3 소프트웨어를 사용하여 버밍햄 소재 알라바마 대학의 박테리아 호흡기 병원체 참조 실험실에서 온라인으로 이용가능한 이전에 기재된 프로토콜에 기초하여 멀티플렉스화 옵소닌식세포 검정 (MOPA)을 통해 결정하였다 (UAB Research Foundation, Caro-Aguilar et al., 2017 (상기 문헌), Burton et al., 2006 (상기 문헌)).
PCV21 폐렴구균 접합체 백신은 시험된 모든 용량에서 토끼에서 면역원성인 것으로 밝혀졌고 (도 19a, 19b, 20a 및 20b), 백신-유형 박테리아 균주를 사멸시키는 기능적 항체를 생성하는 것으로 밝혀졌다 (도 21a 및 21b).
PnPs당 4, 2, 1 및 0.4 μg으로 투여된 PCV21에서 대등한 PD1 면역원성이 관찰되었으며, 예외로 24F는 4 또는 1 μg 용량과 비교하여 2 μg 용량에서 더 높은 면역원성을 갖고, 15A, 15B 및 15C는 2 μg 용량과 비교하여 0.4 μg 용량에서 더 높은 면역원성을 가졌다 (도 19a 및 19b). 따라서, 더 높은 PnPs 용량 (0.4-4 μg/PnPs)에서 백신 용량 반응이 많은 것은 아니었다. 0.08 및 0.016 μg PnPs 백신 용량에서 더 낮은 면역원성이 관찰되었으며, 2 μg 백신 용량과 비교하였을 때 다수의 혈청형이 유의하게 더 낮았다.
PnPs당 4, 2, 1 및 0.4 μg으로 투여된 PCV21에서 대등한 PD2 면역원성이 관찰되었다 (도 20a 및 20b).
일반적으로, PnPs당 4, 2, 1 및 0.4 μg으로 투여된 PCV21에서 대등한 PD2 MOPA 역가가 관찰되었으며, 다수가 통계적 유의성에 도달하지는 않았지만, MOPA 역가는 0.08 및 0.016 μg PnPs 백신 용량에 대해 더 낮은 경향이 있었다 (데이터는 제시되지 않음). PnPs당 2 μg으로 투여된 PCV21을 MOPA에 대한 대표적인 데이터 세트로서 선택하였다. 구체적으로, 2 μg 용량의 PCV21로 면역화된 토끼는 혈청형 3을 제외하고는 면역전 토끼 혈청과 비교하여 모든 혈청형에 대해 유의하게 더 높은 PD1 MOPA 역가를 가졌다 (도 21a). 본 연구로부터의 토끼 면역전 혈청은 혈청형 16F, 31 및 35B에 대해 더 높은 배경 역가를 가졌음을 주목하여야 한다. 2 μg 용량의 PCV21로 면역화된 토끼는 면역전 토끼 혈청과 비교하여 모든 혈청형에 대해 유의하게 더 높은 PD2 MOPA 역가를 가졌다 (도 21b). 로그 변환 데이터를 일원 ANOVA와 던넷 검정에 의해 분석하여 유의성을 결정하였다.
실시예 44
물질 및 방법
유리 폴리사카라이드 시험
먼저 유리 단백질 및 접합체를 데옥시콜레이트 (DOC) 및 염산에 의해 침전시켜 접합체 샘플 내의 유리 폴리사카라이드 (CRM197과 접합되지 않은 폴리사카라이드)를 측정하였다. 이어서 침전물을 여과하고, 여과물을 HPSEC/UV/MALS/RI에 의해 유리 폴리사카라이드 농도에 대해 분석하였다. 유리 폴리사카라이드를 HPSEC/UV/MALS/RI에 의해 측정된 총 폴리사카라이드의 백분율로서 계산하였다.
유리 단백질 시험
접합체 샘플 내의 유리 폴리사카라이드, 폴리사카라이드-CRM197 접합체 및 유리 CRM197을 모세관 전기영동에 의해 미셀 전기동역학적 크로마토그래피 (MEKC) 모드에서 분리하였다. 간략하게, 샘플을 25mM 보레이트, 100mM SDS, pH 9.3을 함유하는 MEKC 실행 완충제와 혼합하고, 사전조건화된 무가공-융합된 실리카 모세관에서 분리하였다. 분리를 200 nm에서 모니터링하고, 유리 CRM197을 CRM197 표준 곡선에 의해 정량화하였다. 유리 단백질 결과를 HPSEC/UV/MALS/RI 절차에 의해 결정된 총 단백질 함량의 백분율로서 보고하였다.
HPSEC/UV/MALS/RI 검정을 사용하는 접합체의 분자량 및 농도 분석
접합체 샘플을 고성능 크기 배제 크로마토그래피 (HPSEC)에 주입하고 그에 의해 분리하였다. 연속으로 자외선 (UV), 다중-각도 광 산란 (MALS) 및 굴절률 (RI) 검출기를 사용하여 검출을 수행하였다. 단백질 농도를 UV280으로부터 흡광 계수를 사용하여 계산하였다. mL/g으로 보고된 용질 농도의 변화에 대한 용액의 굴절률의 변화인 dn/dc 계수를 사용하여 RI 신호 (단백질 및 폴리사카라이드 둘 다에 의해 기여됨)로부터 폴리사카라이드 농도를 디컨볼루션하였다. 전체 샘플 피크에 걸쳐 측정된 농도 및 광 산란 정보를 사용하여 아스트라 소프트웨어 (와이어트 테크놀로지 코포레이션(Wyatt Technology Corporation), 캘리포니아주 산타 바바라)에 의해 샘플의 평균 분자량을 계산하였다. 다분산된 분자에 대한 다수의 형태의 평균 분자량 값이 존재한다. 예를 들어 수-평균 분자량 Mn, 중량-평균 분자량 Mw 및 z-평균 분자량 Mz (Molecules, 2015, 20, 10313-10341). 명시되지 않는 한, 분자량은 중량-평균 분자량이다.
폴리사카라이드와 담체 단백질 사이의 공유 부착 수의 척도로서의 접합된 단백질 내의 리신 소비의 결정
워터스 AccQ-태그 아미노산 분석 (AAA)을 사용하여 접합체 샘플에서 접합의 정도를 측정하였다. 엘덱스 워크스테이션에서 증기 상 산 가수분해를 사용하여 샘플을 가수분해하여 담체 단백질을 그의 성분 아미노산으로 분해하였다. 유리 아미노산을 6-아미노퀴놀릴-N-히드록시숙신이미딜 카르바메이트 (AQC)를 사용하여 유도체화하였다. 이어서 유도체화된 샘플을 C18 칼럼 상에서 UV 검출을 동반한 UPLC를 사용하여 분석하였다. 리신 이외의 대표적인 아미노산을 사용하여 평균 단백질 농도를 얻었다. 접합체 내의 리신의 평균 측정량과 출발 단백질 내의 리신의 예상량 사이의 차이에 의해 접합 동안의 리신 소비 (즉, 리신 손실)를 결정하였다.
실시예 45
폐렴구균 접합체 백신의 안정성에 대한 접합 공정의 영향
상기 실시예에 기재된 바와 같이 상이한 환원성 아미노화 용매 (수성 또는 DMSO)를 이용하여 제조된 개별 폐렴구균 폴리사카라이드-단백질 접합체를 84 μg/mL로 PCV1, PCV7, PCV14 및 PCV21로 지칭되는 1-, 7-, 14-, 및 21-가 폐렴구균 접합체 백신 약물 제품의 제제화에 사용하였다.
약물 제품 백신-충전된 용기를 4℃ 또는 37℃에서 7일 이하 동안 두었다. 고유 단백질 형광 분광분석법 (IPFS)을 사용하여 4℃ 및 37℃에서 최대 동안 저장시 PCV1, PCV7, PCV14 또는 PCV21 조성물 내의 폐렴구균 폴리사카라이드-접합된 담체 단백질인 CRM197의 안정성을 평가하였다. 주위 실온에서 자스코 FP-6500 분광광도계를 사용하여 1 cm 통로 길이 석영 큐벳 내 비희석 샘플의 형광 방출 스펙트럼 (Em 290-400 nm)을 수집하였다. 100 nm/분의 스캔 속도 및 3nm의 여기 및 방출 대역통과로 280 nm의 여기 파장을 사용하였다.
도 22a-c에 제시된 바와 같이, 모두 비양성자성 용매 (예를 들어 DMSO) 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 제조된 폴리사카라이드-단백질 접합체를 함유하는 약물 제품 제제는 모두 접합 공정에서 환원성 아미노화 동안 수성 용매 (양성자성)를 사용하여 제조된 폴리사카라이드-단백질 접합체를 이용하는 백신과 비교하여 우수한 물리적 및 화학적 안정성을 가져왔다. 37℃에서 적게는 16시간 이내에, 모두 84 μg/mL PnPs로 수성 용매 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 제조된 폴리사카라이드-단백질 접합체를 사용하여 제조된 PCV1, PCV7 및 PCV14 약물 제품의 형광 강도는 감소하였고, 백신의 방출 최대치는 332 nm에서 338 nm로 이동하였다. 비양성자성 용매 (예를 들어 DMSO) 중에서 환원성 아미노화 화학으로 제조된 약물 물질을 이용하는 84 μg/mL PnPs의 PCV1, PCV7 및 PCV14 백신 약물 제품은 형광 강도 또는 338 nm에서의 방출 최대치에 있어서 변화를 나타내지 않았다. 나아가, PCV21 약물 제품을 또한 연구하였다. 이는 비양성자성 용매 (예를 들어 DMSO) 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 제조된 폴리사카라이드-단백질 접합체를 함유하며, 실시예 38에 기재된 바와 같이 20 mM L-히스티딘, pH 5.8, 150 mM NaCl 및 0.1% (w/v) PS-20 중에서 제제화하였다. 본 연구는 37℃에서의 저장 후에 우수한 물리적 및 화학적 안정성을 나타냈다. PCV21은 형광 강도 또는 방출 최대치 338 nm에 있어서 변화를 나타내지 않았다 (도 22d).
IPFS (실시예 40) 측정으로부터 얻은 생성된 신호 강도 및 방출 최대치는 다가 복합체 약물 제품에서 개별 폴리사카라이드-단백질 접합체의 집합적 안정성에 기인하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명자들은 모두 비양성자성 용매 중에서 제조된 폴리사카라이드-단백질 접합체를 이용하는 백신 약물 제품이 안정한 반면 모두 양성자성 용매 중에서 제조된 약물 물질을 이용하는 백신 약물 제품은 스트레스 조건 하에서 안정하지 않다는 것을 보여주었다. 백신 약물 제품 조성물이 양성자성 및 비양성자성 접합 공정 둘 다를 사용하는 폴리사카라이드-단백질 접합체의 혼합물을 포함한 경우에, 약물 제품으로부터 측정된 평균 방출 최대치 또는 강도는 332 nm에서의 각각의 양성자성 폴리사카라이드-단백질 접합체 방출의 기여 및 338 nm에서의 각각의 비양성자성 폴리사카라이드-단백질 접합체 방출의 기여로 인해 가중될 것이다. 양성자성 접합 공정을 사용하여 제조된 폴리사카라이드 단백질 접합체의 존재로 인한 이러한 혼합물의 경우 승온에서 강도 또는 방출 최대치의 가중된 변화가 일어날 것으로 예상될 것이다.
도 23에 제시된 바와 같이, 0.084 mg/mL PnPs로 제조된 PCV21 약물 제품의 안정성을 평가하기 위해, 나노입자 추적 분석 (NTA)을 이용하였다. 상기 기술은 입자 크기 및 농도를 외삽하기 위해 나노입자 집단이 브라운 운동에 의해 이동함에 따라 직접 추적되는 나노입자 집단의 비디오를 수집한다. 클래스 1, 635 nm 레이저는 액체 샘플을 통해 80 마이크로미터 적색 레이저 빔을 집속하여, 신속하게 확산되는 빛의 지점으로 입자를 비춘다. CCD 카메라는 비디오 초당 30개 프레임을 기록하여 시간 경과에 따른 각각의 개별 비춰진 입자의 이동을 추적한다. 시스템 소프트웨어는 비디오로부터 각각의 개별 입자의 중심을 식별하고, 독립적으로 횡단한 거리를 추적하여 평균 제곱 변위를 결정한다. 전체 비디오로부터 수집된 미가공 데이터가 분석될 때까지 각각의 프레임에서 샘플 집단 내의 모든 입자에 대해 동시에 이러한 추적을 수행한다. 추적되는 모든 개별 입자의 평균 제곱 변위를 동시에 측정함으로써, 스토크스-아인슈타인(Stokes-Einstein) 방정식을 적용하여 그의 확산 계수 (Dt) 및 구면 대응치 유체역학 반경 (rh)을 결정한다. 이어서 소프트웨어는 이러한 축적된 데이터를 입자 크기 및 농도 분포로서 나타낸다. 입자 크기 및 농도 뿐만 아니라 개별 입자의 강도 또는 휘도에 대한 미가공 데이터 정보가 수집된다. 종합하여, 데이터를 피팅하고, 입자 크기 대비 입자 강도 및 입자 크기 대비 입자 농도를 개별적으로 플롯팅하고, 이어서 모든 입자 집단의 입자 크기, 농도 및 강도를 비교하는 3차원 컨투어 플롯에 플롯팅한다.
담체 단백질 및 폴리사카라이드 항원으로 구성된 접합체 백신은 함께 또는 개별적으로 10-1000 nm 입자 크기 범위 내에서 응집되기 쉬울 수 있고, 이에 의해 NTA를 응집 현상을 평가하고 정량화하기 위한 적합한 안정성 표시 기술로 만들 수 있다. 약물 제품을 4℃ 및 37℃에서 1주 동안 노출시, 0.025% w/v, 0.05% w/v, 0.1% w/v, 0.15% w/v 및 0.2% w/v PS20의 농도로 PS-20을 함유하는 제제의 경우 NTA에 의해 약물 제품의 유의한 응집이 관찰되지 않았다 (도 23에 제시된 바와 같음). 그러나, 제제를 4℃에서 6시간 동안 교반에 적용한 후에, 폴리소르베이트 20이 결여된 제제는 NTA에 의해 제공된 증가된 D90 입자 크기, 확장된 입자 크기 분포 및 증가된 입자 강도에 의해 입증되는 바와 같이, 약물 제품의 교반 유도된 응집을 완화시키는데 효과적이지 않았다. 따라서, 상용 제조, 저장, 수송 및 취급 동안 약물 제품을 안정화시키기 위해 폴리소르베이트 20을 0.025 내지 0.2% 또는 더 높은 수준 (w/v)으로 유지하는 것이 바람직하다.
실시예 39에 기재된 바와 같이, HPSEC UV/MALS/RI를 사용하여, 실시예 38에 기재된 제제화 공정에 따라 20 mM L-히스티딘, pH 5.8, 150 mM NaCl 및 0 내지 0.2% (w/v) PS-20 중에서 제제화된 21가 (PCV21) 폴리사카라이드-단백질 접합체 약물 제품의 분자량을 측정하였다. 제제를 4℃ 또는 37℃에서 1주 이하 동안 두었다. 일부 경우에, 시린지를 수평 회전 플랫폼 상에 놓고, 4℃ 또는 37℃에서 1주 동안 저장한 후 6시간 이하 동안 진탕하였다. 이를 수행하여 약물 제품 제조 및 분배에 동반될 수 있는 수송 및 취급 스트레스를 모의실험하였다. 약물 제품 내의 폴리사카라이드-단백질 접합체가 분해 또는 탈중합되는 경우, 분자량의 감소가 분명할 것이고, 약물 제품 제제의 응집이 발생하는 경우, 분자량의 증가가 일어날 것이다. 이러한 측정은 PS-20 농도의 함수로서 백신 약물 제품 또는 폴리사카라이드-단백질 접합체의 품질에 대한 추가의 특징화를 제공한다. 도 24에 제시된 바와 같이, 모두 비양성자성 용매 (예를 들어 DMSO) 중에서 환원성 아미노화를 사용하여 각각 제조된 약물 물질을 포함하는 PCV21 약물 제품 제제는 0.05% 내지 0.15% PS-20에서 열 처리로 인한 약물 제품 제제화시 탄수화물의 탈중합 또는 화학적 분해에 대해 안정하고 단백질의 응집에 대해 안정하였다. 총괄적으로, 이는 PCV21 약물 제품이 0.025% 및 0.2% 또는 더 높은 수준의 PS-20을 사용하여 제제화되는 경우에 승온 및 물리적 스트레스 내내 안정하다는 것을 나타낸다.
실시예 46
마우스에서의 챌린지로부터의 PCV21 보호
어린 암컷 스위스 웹스터 마우스 (6-8주령, n=10/군)를 제0일, 제14일 및 제28일에 0.1-0.5 mL의 21-가 폐렴구균 접합체 백신 (PCV21)에 의해 복강내로 (IP) 면역화시켰다. PCV21 폐렴구균 백신을 면역화당 4, 2, 0.4, 0.08 또는 0.016 μg PnPs (3, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 19A, 20A, 22F, 23A, 23B, 24F, 31, 33F 및 35B, 각각 CRM197에 접합됨)로 투여하였다. 훈련된 동물 관리 스태프가 마우스를 질병 또는 고통의 임의의 징후에 대해 적어도 매일 관찰하였다. 마우스에서의 백신 제제는, 백신-관련 유해 사건이 주목되지 않았으므로, 안전하고 내약성이 우수한 것으로 간주되었다. 제52일에 마우스에게 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 혈청형 24F를 기관내로 챌린지하였다. 에스. 뉴모니아에의 지수기 배양물을 원심분리하고, 세척하고, 멸균 PBS 중에 현탁시켰다. 마우스를 이소플루란으로 마취시킨 후 챌린지하였다. 0.1 mL의 PBS 중 105 cfu의 에스. 뉴모니아에를 마우스의 앞니에 의해 수직으로 매달리게 그의 목구멍에 두었다. 혀를 바깥쪽으로 서서히 잡아당기고 콧구멍을 덮음으로써 박테리아의 흡인을 유도하였다. 마우스를 매일 칭량하고, 체중 감소가 출발 체중의 20%를 초과한 경우에 안락사시켰다. 혈액을 24시간, 48시간 및 72시간에 수집하여 박테리아혈증을 평가하였다. 훈련된 동물 관리 스태프가 마우스를 질병 또는 고통의 임의의 징후에 대해 적어도 1일 2회 관찰하였다. 모든 동물 실험을 미국 국립 보건원의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에서의 권장사항에 따라 엄격하게 수행하였다. 마우스 실험 프로토콜은 머크 앤 캄파니, 인크.에서 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인되었다.
마우스 혈청을 멀티플렉스화 전기화학발광 (ECL) 검정을 사용하여 IgG 면역원성에 대해 평가하였다. 본 검정은 전기화학적 자극시 광을 방출하는 술포-태그™ 표지를 이용하는 메소스케일 디스커버리 (메릴랜드주 게이더스버그 소재 메소스케일 다이아그노스틱스, 엘엘씨의 자회사)에 의해 개발된 기술을 사용하여, 문헌 [Marchese et al., Clin Vaccine Immunol. (2009) 16(3):387-96]에 기재된 인간 검정에 기초하여 마우스 혈청에서 사용하기 위해 개발되었다. 술포-태그™-표지된 항-마우스 IgG를 마우스 혈청 샘플을 시험하기 위한 2차 항체로서 사용하였다. 기능적 항체는 알라바마 대학 (UAB) 연구 재단이 소유하고 그로부터 허가되는 옵소타이터® 3 소프트웨어를 사용하여 www.vaccine.uab.edu에 있는 이전에 기재된 프로토콜에 기초하여 멀티플렉스화 옵소닌식세포 검정 (MOPA)을 통해 결정하였다 (문헌 [Caro-Aguilar I. et al., Vaccine (2017) 35(6):865-72 및 Burton R.L. and Nahm M.H. Clin. Vaccine Immunol. (2006) 13(9):1004-9] 참조).
PCV21 면역화는 백신 내의 모든 혈청형에 대해 스위스 웹스터 마우스에서 항체 역가를 생성하였다 (데이터는 제시되지 않음). PCV21은 또한 Balb/c 및 CD1 마우스에서 면역원성이었다 (데이터는 제시되지 않음). PCV21 면역화된 스위스 웹스터 마우스를 또한 에스. 뉴모니아에 혈청형 24F를 사용한 챌린지로부터 보호하였다 (도 25). 만텔 콕스 로그-순위 검정은 모든 PCV21 면역화된 군이 나이브 군과 비교하였을 때 챌린지로부터 유의하게 보호되었음을 나타낸다 (P<0.05). 마찬가지로, PCV21 면역화된 마우스 군은 박테리아혈증을 거의 내지 전혀 갖지 않았고, 이는 나이브 군과 비교하여 유의하게 더 적었다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 47
토끼에서의 PCV 면역원성 및 기능적 항체
성체 뉴질랜드 화이트 토끼 (NZWR, n=5/군)를 제0일 및 제14일에 (교대로) 0.1 mL의 PCV에 의해 근육내로 (IM) 면역화시켰다. 알루미늄 포스페이트 아주반트 (APA) 형태의 25 μg [Al]을 갖는 PCV를 면역화당 혈청형당 0.4 μg PnPs로 투여하였다. PCV31의 경우, 혈청형 6B의 투여 농도를 면역화당 0.8 μg PnPs로 2배로 하였다. PCV21 (실시예 38에 기재된 바와 같음)은 각각 CRM197에 접합된 혈청형 3, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 19A, 20A, 22F, 23A, 23B, 24F, 31, 33F 및 35B로부터의 정제된 폴리사카라이드를 포함하였다. 각각의 폴리사카라이드-단백질 접합체를 아주반트의 효과를 평가하기 위해 아주반트 첨가 없이 제조하거나 또는 알루미늄 포스페이트 또는 APA 형태의 250 μg [Al]/mL와 함께 제제화하였다 (PCV21/APA). 또한 8종의 신규 ST (PCV8: 6C, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B, 각각 CRM197에 접합됨, 아주반트 첨가되지 않음), 어떠한 허가된 PCV에도 포함되지 않는 16종의 ST (PCV16 : 6C, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 20, 23A, 23B, 24F, 31 및 35B, 각각 CRM197에 접합됨, 아주반트 첨가되지 않음)를 포함하는 보다 낮은 결합가의 PCV 또는 백신 결합가 증가에 따른 담체 억제를 평가하기 위한 PCV31 (1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 6C, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15A, 15C, 16F, 17F, 18C, 19A, 19F, 20A, 22F, 23A, 23B, 23F, 24F, 33F 및 35B, 각각 CRM197에 접합됨, 알루미늄 포스페이트 형태의 250 μg [Al]/mL와 함께 제제화됨) (PCV31/APA)을 (실시예 38에 기재된 바와 같이) 제제화하였다. 각각의 백신은 4 μg/mL (w/v) 폐렴구균 폴리사카라이드 (PnPs)로 제제화된 폴리사카라이드 단백질 접합체를 사용하였고, 예외로 PCV31 또는 PCV31/APA에서는 8 μg/mL (w/v) 폐렴구균 폴리사카라이드 (PnPs)로 제제화된 6B를 사용하였다. 각각의 백신 내의 폐렴구균 폴리사카라이드 (PnPs)의 최종 농도는 PCV31에서 128 μg/mL PnPs, PCV21에서 84 μg/mL PnPs, PCV16에서 64 μg/mL 및 PCV8에서 32 μg/mL였다.
연구 시작 전 (면역전) 및 제14일 (PD1) 및 제28일 (PD2)에 혈청을 수집하였다. 훈련된 동물 관리 스태프가 NZWR을 질병 또는 고통의 임의의 징후에 대해 적어도 매일 관찰하였다. NZWR에서의 백신 제제는, 백신-관련 유해 사건이 주목되지 않았으므로, 안전하고 내약성이 우수한 것으로 간주되었다. 모든 동물 실험을 미국 국립 보건원의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에서의 권장사항에 따라 엄격하게 수행하였다. NZWR 실험 프로토콜은 머크 앤 캄파니, 인크. 및 코반스 (펜실베니아주 덴버) 둘 다에서 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인되었다.
토끼 혈청을 멀티플렉스화 전기화학발광 (ECL) 검정을 사용하여 IgG 면역원성에 대해 평가하였다. 본 검정은 전기화학적 자극시 광을 방출하는 술포-태그™ 표지를 이용하는 메소스케일 디스커버리 (메릴랜드주 게이더스버그 소재 메소스케일 다이아그노스틱스, 엘엘씨의 자회사)에 의해 개발된 기술을 사용하여, 문헌 [Marchese et al., Clin Vaccine Immunol. (2009) 16(3):387-96]에 기재된 인간 검정에 기초하여 토끼 혈청에서 사용하기 위해 개발되었다. 술포-태그™-표지된 항-토끼 IgG를 NZWR 혈청 샘플을 시험하기 위한 2차 항체로서 사용하였다. 기능적 항체는 알라바마 대학 (UAB) 연구 재단이 소유하고 그로부터 허가되는 옵소타이터® 3 소프트웨어를 사용하여 www.vaccine.uab.edu에 있는 이전에 기재된 프로토콜에 기초하여 멀티플렉스화 옵소닌식세포 검정 (MOPA)을 통해 결정하였다 (문헌 [Caro-Aguilar I. et al., Vaccine (2017) 35(6):865-72 및 Burton R.L. and Nahm M.H. Clin. Vaccine Immunol. (2006) 13(9):1004-9] 참조).
토끼 혈청을 멀티플렉스 전기화학발광 검정에서 면역전 및 PD1에 대해 풀로서 시험하고 PD2에 대해 개별적으로 시험하여 항체 역가를 결정하였다. PCV는 백신을 사용한 면역화 후 모든 혈청형에 대해 토끼에서 항체 역가를 생성하였다 (데이터는 제시되지 않음). 혈청형 15B 폴리사카라이드는 PCV16, PCV21 또는 PCV31에 포함되지 않았지만, 혈청형 15B에 대한 항체 역가가 PCV16, PCV21 및 PCV31을 사용한 면역화 후에 모두 관찰되었다.
아주반트가 없는 PCV21은 APA가 있는 PCV21과 비교하였을 때 대등한 또는 유의하게 더 높은 면역원성 (혈청형 3, 7F, 10A, 19A, 23A 및 23B)을 가졌으며 (도 26a-b 및 도 28), 이는 백신에 APA가 포함된 경우 토끼에서 추가의 면역원성 이익이 없음을 시사한다.
담체 유도된 에피토프 억제는 동일한 담체 단백질 (예컨대 CRM197)에 커플링된 항원 (예컨대 피막 폴리사카라이드)에 대한 항체 반응의 간섭을 지칭한다. 간섭은 제한된 수의 담체 특이적 프라이밍된 T 헬퍼 세포에 대한 경쟁으로부터 발생하는 것으로 생각된다. 그 결과, 피막 폴리사카라이드에 대한 반응이 감소될 수 있다. 화이자는 백신 결합가가 7가에서 13가로 증가함에 따라 공유된 혈청형의 백신 면역원성의 감소를 관찰하였다 [프레브나르 (7가) vs 프레브나르13의 IgG 항체 GMC의 비교. (표 9, 페이지 29의 PCV13 모노그래프)]. 따라서, 본 발명자들은 PCV21과 비교하여 더 낮은 결합가 PCV의 면역원성을 조사하고자 하였다 (도 27a-c). PCV8 (8종의 신규 혈청형)은 PCV21에 비해 8종의 공유된 혈청형에 대해 대등한 면역원성을 가졌다 (도 29). PCV16 (PCV21 마이너스 PCV15로부터의 5종의 중첩되는 혈청형)은 PCV21에 비해 16종의 공유된 혈청형 중 15종에 대해 대등한 면역원성을 가졌다 (도 29). 혈청형 31은 PCV16에서 더 높은 면역원성을 가졌다 (도 29). 전체적으로, NZWR에서 PCV21에 의한 담체 억제의 주요 경향은 존재하지 않았다. PCV31/APA는 PCV21/APA에 비해 21종의 공유된 혈청형 중 12종에 대해 대등한 면역원성을 가졌다. 10종의 혈청형 (6C, 7F, 9N, 12F, 15A, 15B (PCV21에서는 아님), 15C, 17F, 19A 및 23A)은 PCV31에서 2.9배 내지 11배 범위의 더 높은 면역원성을 가졌다 (도 30). 전체적으로, NZWR에서 PCV31에 의한 담체 억제의 주요 경향은 존재하지 않았다.
PCV는 토끼에서 면역원성인 것으로 밝혀졌고, 백신-유형 박테리아 균주를 사멸시키는 기능적 항체를 생성하였다. 토끼 혈청을 멀티플렉스화 옵소닌식세포 검정 (MOPA)에서 시험하여 기능적 항체 역가를 결정하였다. PCV21은 PCV21/APA, PCV8 및 PCV16과 비교하였을 때 대등하거나 더 높은 PD2 OPA 역가를 가졌다 (도 31). 로그 변환 데이터를 일원 ANOVA와 던넷 검정에 의해 분석하여 유의성을 결정하였다. PCV21은 PCV8과 비교하여 혈청형 16F에 대해 및 PCV21/APA와 비교하여 혈청형 12F, 23A 및 19A에 대해 유의하게 더 높은 OPA 역가를 가졌다. PCV31은 PCV21과 비교하여 혈청형 23A에 대해 유의하게 더 높은 OPA 역가를 가졌다.
실시예 48
성체 레서스 마카크에서의 PCV21 면역원성
성체 레서스 마카크 면역원성 모델에서 PCV21을 또한 평가하였다. 레서스 마카크를 제0일, 제28일 및 제56일에 PCV21로 근육내 면역화시켰다. PCV21을 면역화당 0.25 mL 부피 중 1 μg PnPs (3, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 19A, 20A, 22F, 23A, 23B, 24F, 31, 33F 및 35B, 각각 CRM197에 접합됨)로 투여하였다. 연구 시작 (면역전, 제0일) 및 제14일 (PD1), 제28일, 제42일 (PD2), 제56일, 제70일 (PD3) 및 제84일에 혈청을 수집하였다.
레서스 혈청을 멀티플렉스화 전기화학발광 (ECL) 검정을 사용하여 IgG 면역원성에 대해 평가하였다. 본 검정은 전기화학적 자극시 광을 방출하는 술포-태그™ 표지를 이용하는 메소스케일 디스커버리 (메릴랜드주 게이더스버그 소재 메소스케일 다이아그노스틱스, 엘엘씨의 자회사)에 의해 개발된 기술을 사용하여, 문헌 [Marchese et al. and Skinner et al. (Marchese R.D. et al., Clin. Vaccine Immunol. (2009) 16(3):387-96 및 Skinner, J.M. et al.,Vaccine (2011) 29(48):8870-8876]에 기재된 인간 검정에 기초하여 레서스 혈청에서 사용하기 위해 개발되었다.
술포-태그™-표지된 항-인간 IgG를 레서스 혈청 샘플을 시험하기 위한 2차 항체로서 사용하였다. 기능적 항체는 알라바마 대학 (UAB) 연구 재단이 소유하고 그로부터 허가되는 옵소타이터® 3 소프트웨어를 사용하여 www.vaccine.uab.edu에 있는 이전에 기재된 프로토콜에 기초하여 멀티플렉스화 옵소닌식세포 검정 (MOPA)을 통해 결정하였다 (문헌 [Caro-Aguilar I. et al., Vaccine (2017) 35(6):865-72 및 Burton R.L. and Nahm M.H. Clin. Vaccine Immunol. (2006) 13(9):1004-9] 참조).
PCV21은 성체 원숭이에서 면역원성인 것으로 밝혀졌고, 시험된 모든 시점에서 백신-유형 박테리아 균주를 사멸시키는 기능적 항체를 생성하였다 (도 32 및 33). 또한, 폴리사카라이드 접합체 15A-CRM197 및 15C-CRM197을 함유하는 PCV21이 ECL에서 입증된 바와 같이 15B에 대한 교차-반응성을 제공한다는 것이 주목된다. PCV21은 원숭이에서 백신의 1회 용량으로 면역원성이었다 (도 32). 대부분의 혈청형은 PD1에서 그의 최대 역가에 도달하였고, 예외로 ST 6C, 12F 및 24F는 추가의 면역화로부터 이익을 얻었다. 성체 레서스 마카크는 새끼 레서스 마카크에서의 이전 PCV 연구와 비교하여 더 높은 기존 항체 역가를 가졌다. MOPA에서 혈청 샘플을 시험할 때 기존 항체 역가가 가장 뚜렷하였으며, 이는 옵소닌식세포 역가를 결정하기 어렵게 만들었다. MOPA에서 풀링 또는 개별 샘플로서 모든 연구 시점을 시험하였지만, PD1과 PD3 사이의 OPA 역가에는 큰 차이가 존재하지 않았기 때문에, 보다 용이하게 보기 위해 단지 면역전, PD1 및 PD3 사이만이 제시된다 (도 33).
PCV21 면역화된 성체 레서스 마카크 혈청을 다른 에스. 뉴모니아에 박테리아에 대한 교차 보호에 대해 평가하였다 (도 34). PCV21 면역화된 마카크 혈청은 혈청형 6A, 6B 및 23F과의 교차 보호를 가졌지만 19F와는 그렇지 않았다. 6A 및 6B에 대한 교차 보호는 다가 PCV21의 일부로서 폴리사카라이드 접합체 6C-CRM197을 사용한 면역화에 기인하였을 가능성이 있다. 유사하게, 다가 PCV의 일부로서 폴리사카라이드 접합체 23A-CRM197 및 23B-CRM197을 사용한 면역화는 혈청형 23F에 대한 교차 보호를 가져왔다. 폴리사카라이드 접합체 19A-CRM197을 포함하는 PCV21을 사용한 면역화는 19F에 대한 교차 보호를 제공하지 않았다.
실시예 49
성체 레서스 마카크에서의 PCV21 면역원성 - 아주반트 및 담체 억제의 평가
또 다른 원숭이 연구는 APA를 갖는 및 갖지 않는 PCV21의 평가 및 공유된 혈청형 면역원성의 비교에 의한 담체 억제의 평가를 포함하였다. 성체 레서스 마카크 (n=5/군)를 연구 제0일에 절반 인간 용량의 백신에 의해 근육내로 면역화시켰다. PCV21을 면역화당 0.25 mL 부피 중 1 μg PnPs (3, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 19A, 20, 22F, 23A, 23B, 24F, 31, 33F 및 35B, 각각 CRM197에 접합됨)로 투여하였다. 한 군은 알루미늄 포스페이트 형태의 62.5 μg [Al]으로 아주반트 첨가된 PCV21을 포함하였다. 또 다른 군은 면역화당 0.25 mL 부피 중 1 μg PnPs (1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F, 23F 및 33F, 각각 CRM197에 접합됨, 6B는 2 μg으로 투여됨)로 투여되고 알루미늄 포스페이트 형태의 62.5 μg [Al]으로 아주반트 첨가된 PCV15를 포함하였다. 또 다른 군은 면역화당 0.25 mL 부피 중 1.1 μg PnPs (1, 3, 4, 5, 6A, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F 및 23F, 각각 CRM197에 접합됨, 6B는 2.2 μg으로 투여됨)로 투여되는 프레브나르13 ® (PCV13)을 포함하였다. 연구 시작 (면역전, 제0일) 및 제28일에 혈청을 수집하였다.
PCV21은 성체 원숭이에서 면역원성인 것으로 밝혀졌고, 백신-유형 박테리아 균주를 사멸시키는 기능적 항체를 생성하였다. 아주반트를 갖지 않는 PCV21은 APA를 갖는 PCV21과 비교하였을 때 대등하거나 유의하게 더 높은 면역원성 (혈청형 15A 및 15B)을 가졌다 (도 35). PCV21은 혈청형 15B를 포함하지 않았다.
PCV21 면역화된 원숭이를 PCV15 및 프레브나르13으로 면역화된 원숭이와 비교하였다. PCV21 및 PCV15는 5종의 공유된 혈청형 (3, 7F, 19A, 22F, 33F)을 가졌고; PCV21 또는 PCV15로 면역화된 원숭이들 사이에 상기 5종의 혈청형의 면역원성 차이는 없었다 (도 36). PCV21 및 프레브나르13은 3종의 공유된 혈청형 (3, 7F, 19A)을 가졌고; 혈청형 7F 및 19A에 대한 면역원성 차이는 없었다. 프레브나르13 면역화된 원숭이는 PCV21과 비교하여 혈청형 3에 대해 더 낮은 항체 역가를 가졌다 (도 36). 이러한 발견은 혈청형 3이 머크의 PCV15 백신에서 더욱 면역원성인 것을 보여주는 PCV15 인간 임상 데이터와 일치한다. 종합하면, 이들 결과는 프레브나르13 또는 PCV15와 비교하였을 때 PCV21로 면역화된 성체 레서스 마카크에서 담체 억제가 관찰되지 않았음을 시사한다.
실시예 50
혈청형 6A, 6B 및 6C 교차 반응성 - 1가 연구
1가 약물 제품을, 폐렴구균 폴리사카라이드 6A-CRM197 접합체 또는 폐렴구균 폴리사카라이드 6B-CRM197 접합체를 사용하여 제조하고, 20 mM 히스티딘 pH 5.8 및 150 mM 염화나트륨 및 0.1% w/v 폴리소르베이트-20 (PS-20) 중에서 어느 혈청형이나 4.0 μg/mL의 표적 총 폴리사카라이드 농도로 제제화하였다. CRM197 단백질을 폐렴구균 폴리사카라이드 (PnPs) 유형 (-6A 또는 -6B)에 개별적으로 접합시켜 접합체를 제조하였다. 개별 혈청형의 표적 농도를 수득하는데 필요한 벌크 접합체의 요구되는 부피를 배치 부피 및 개별 벌크 폴리사카라이드 농축물의 농도에 기초하여 계산하였다. 개별 접합체를 히스티딘, 염화나트륨 및 PS-20의 용액에 첨가하여 2X 접합체 블렌드를 생성하였다. 2X 접합체 블렌드를 함유하는 제제화 용기를 자기 교반 막대를 사용하여 혼합하고, 또 다른 용기 내로 멸균 여과하였다. 이어서, 멸균 여과된 2X 블렌드를 염수로 희석하여 목적하는 표적 총 폴리사카라이드 및 부형제 농도를 달성하였다. 이어서 제제를 바이알 내로 충전하고, 2-8℃에서 저장하였다.
토끼를 6A-CRM197 또는 6B-CRM197로 면역화시켜 혈청군 6 내의 교차-반응성을 평가하였다. 성체 뉴질랜드 화이트 토끼 (NZWR, n=3/군)를 제0일 및 제14일에 (교대로) 0.25 mL의 각각의 1가 접합체 백신에 의해 근육내로 (IM) 면역화시켰다. 실시예 38에 기재된 제제화 공정에 따라 20 mM L-히스티딘 pH 5.8, 150 mM NaCl 및 0.1% (w/v) PS-20 중에서 제제화된 1가 폐렴구균 접합체 백신을 1 μg PnPs (6A 또는 6B, 각각 CRM197에 접합됨)로 투여하였다. 연구 시작 전 (면역전) 및 제14일 (투여 1 후, PD1) 및 제28일 (투여 2 후, PD2)에 혈청을 수집하였다. 훈련된 동물 관리 스태프가 NZWR을 질병 또는 고통의 임의의 징후에 대해 적어도 매일 관찰하였다. NZWR에서의 백신 제제는, 백신-관련 유해 사건이 주목되지 않았으므로, 안전하고 내약성이 우수한 것으로 간주되었다. 모든 동물 실험을 미국 국립 보건원의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에서의 권장사항에 따라 엄격하게 수행하였다. NZWR 실험 프로토콜은 머크 앤 캄파니, 인크. 및 코반스 (펜실베니아주 덴버) 둘 다에서 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인되었다.
IgG 면역원성을 평가하기 위해 ELISA 검정에서 2 μg/mL의 각각의 PnPs 코팅 농도를 사용하여 NZWR 혈청을 시험하였다. 기능적 항체는 UAB 연구 재단이 소유하고 그로부터 허가되는 옵소타이터® 3 소프트웨어를 사용하여 www.vaccine.uab.edu에 있는 이전에 기재된 프로토콜에 기초하여 옵소닌식세포작용 검정 (OPA)을 통해 결정하였다 (문헌 [Caro-Aguilar I. et al., Vaccine (2017) 35(6):865-72 및 Burton R.L. and Nahm M.H. Clin. Vaccine Immunol. (2006) 13(9):1004-9] 참조).
6A-CRM197 및 6B-CRM197은 둘 다 토끼에서 면역원성인 것으로 밝혀졌고 (도 37), 각각의 박테리아 균주를 사멸시키는 기능적 항체를 생성하는 것으로 밝혀졌다 (도 38). 추가로, 혈청군 6 1가 폐렴구균 접합체 백신으로 면역화된 토끼는 각각 동종 및 이종 폴리사카라이드 및 박테리아 균주에 대한 동등한 PD2 IgG 및 OPA 역가를 가졌다. 6A-CRM197 또는 6B-CRM197로 면역화된 토끼는 모두 각각의 폐렴구균 폴리사카라이드 (PnPs 6A, PnPs 6B 및 PnPs 6C)에 대한 교차 반응성을 가졌다 (도 37). 투여 2 후 (PD2) 로그 변환된 IgG 데이터를 사용하여 일원 ANOVA에 의해 분석하였을 때, 혈청군 6에 걸쳐 IgG 역가의 유의한 차이는 없었다. 추가로, 6A-CRM197 또는 6B-CRM197로 면역화된 토끼는, 모든 토끼 과다면역 혈청이 평가된 각각의 균주에 대한 기능적 항체를 가졌고 박테리아를 사멸시켰으므로, 모두 각각의 에스. 뉴모니아에 박테리아 균주 (6A, 6B 및 6C)에 대한 교차 반응성을 가졌다 (도 38). 유사하게, 투여 2 후 (PD2) 로그 변환된 OPA 데이터를 사용하여 일원 ANOVA에 의해 분석하였을 때, 혈청군 6에 걸쳐 OPA 역가의 유의한 차이는 없었다.
실시예 51
혈청형 20A 및 20B 교차 반응성 - 1가 연구
1가 약물 제품을, 폐렴구균 폴리사카라이드 20A-CRM197 접합체를 사용하여 제조하고, 20 mM 히스티딘 pH 5.8 및 150 mM 염화나트륨 및 0.2% w/v 폴리소르베이트-20 (PS-20) 중에서 4.0 μg/mL로 제제화하였다. 제제를 아주반트로서 알루미늄 포스페이트 형태의 250.0 μg [Al]/mL와 함께 제조하였다 (20A-CRM197/APA). CRM197 단백질을 폐렴구균 폴리사카라이드 (PnPs) 유형 20에 개별적으로 접합시켜 접합체를 제조하였다. 개별 혈청형의 표적 농도를 수득하는데 필요한 벌크 접합체의 요구되는 부피를 배치 부피 및 개별 벌크 폴리사카라이드 농축물의 농도에 기초하여 계산하였다. 단일 접합체를 히스티딘, 염화나트륨 및 PS-20의 용액에 첨가하여 16.0 μg/mL의 4X 접합체 블렌드를 생성하였다. 접합체 블렌드를 함유하는 제제화 용기를 자기 교반 막대를 사용하여 혼합하고, 또 다른 용기 내로 멸균 여과하였다. 이어서 멸균 여과된 4X 블렌드를 알루미늄 포스페이트 아주반트를 함유하는 또 다른 용기에 첨가하여 목적하는 표적 총 폴리사카라이드, 부형제 및 아주반트 농도를 달성하였다. 이어서 제제를 유리 바이알 내로 충전하고, 2-8℃에서 저장하였다.
토끼를 20A-CRM197/APA 또는 PCV21로 면역화시켜 혈청군 20 내의 교차-반응성을 평가하였다. 성체 뉴질랜드 화이트 토끼 (NZWR, n=3/군)를 제0일 및 제14일에 (교대로) 폐렴구균 접합체 백신에 의해 근육내로 (IM) 면역화시켰다. 상기 기재된 바와 같이 제제화된 1가 폐렴구균 접합체 백신을 0.25 ml 중 1 μg PnPs (CRM197에 접합된 ST20A 및 아주반트로서 알루미늄 포스페이트 형태의 62.5 μg [Al]을 사용)로 투여하고, 실시예 38에 기재된 제제화 공정에 따라 20 mM L-히스티딘 pH 5.8, 150 mM NaCl 및 0.2% (w/v) PS-20 중에서 제제화된 PCV21 다가 폐렴구균 접합체 백신 (84 μg/mL PnPs)을 0.1 ml 중 0.4 μg PnPs (혈청형 3, 6C, 7F, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15A, 15C, 16F, 17F, 19A, 20, 22F, 23A, 23B, 24F, 31, 33F 및 35B, 각각 CRM197에 접합됨)로 투여하였다. 연구 시작 전 (면역전) 및 제14일 (투여 1 후, PD1) 및 제28일 (투여 2 후, PD2)에 혈청을 수집하였다. 훈련된 동물 관리 스태프가 NZWR을 질병 또는 고통의 임의의 징후에 대해 적어도 매일 관찰하였다. NZWR에서의 백신 제제는, 백신-관련 유해 사건이 주목되지 않았으므로, 안전하고 내약성이 우수한 것으로 간주되었다. 모든 동물 실험을 미국 국립 보건원의 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에서의 권장사항에 따라 엄격하게 수행하였다. NZWR 실험 프로토콜은 머크 앤 캄파니, 인크. 및 코반스 (펜실베니아주 덴버) 둘 다에서 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인되었다.
기능적 항체를 평가하기 위해 UAB 연구 재단이 소유하고 그로부터 허가되는 옵소타이터® 3 소프트웨어를 사용하여 www.vaccine.uab.edu에 있는 이전에 기재된 프로토콜에 기초하여 옵소닌식세포작용 검정 (OPA)에서 NZWR 혈청을 시험하였다 (문헌 [Caro-Aguilar I. et al., Vaccine (2017) 35(6):865-72 및 Burton R.L. and Nahm M.H. Clin. Vaccine Immunol. (2006) 13(9):1004-9] 참조).
1가 20A-CRM197/APA 및 다가 PCV21 백신 둘 다로 면역화된 토끼는 에스. 뉴모니아에 혈청형 20A 및 20B 둘 다를 사멸시키는 기능적 항체를 생성하였다 (도 39). 이는 혈청형 20A 및 20B가 구조적 유사성을 공유하여, 혈청군 내에서 교차-반응성을 가져온다는 것을 시사한다.
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Claims (13)

  1. 다가 면역원성 조성물을 포함하는, 환자에서 침습성 폐렴구균성 질환(IPD) 및 폐렴구균성 폐렴(PP)을 예방하기 위한 제약 조성물로서, 여기서 다가 면역원성 조성물은 에스. 뉴모니아에(S. pneumoniae) 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 포함하고, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 특정한 에스. 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에 혈청형은 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 탈-O-아세틸화된 15B, 17F, 및 20A로 이루어지고, 담체 단백질은 CRM197인, 제약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 탈-O-아세틸화된 15B 폴리사카라이드가 5% 미만의 반복 단위당 O-아세틸 함량을 가지는 것인, 제약 조성물.
  3. 다가 면역원성 조성물을 포함하는, 환자에서 침습성 폐렴구균성 질환(IPD) 및 폐렴구균성 폐렴(PP)을 예방하기 위한 제약 조성물로서, 여기서 다가 면역원성 조성물은 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 포함하고, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 특정한 에스. 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에 혈청형은 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 및 20A로 이루어지고, 담체 단백질은 CRM197인, 제약 조성물.
  4. 다가 면역원성 조성물을 포함하는, 환자에서 침습성 폐렴구균성 질환 (IPD) 및 폐렴구균성 폐렴 (PP)을 예방하기 위한 제약 조성물로서, 여기서 다가 면역원성 조성물은 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 포함하고, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 특정한 에스. 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서 에스. 뉴모니아에 혈청형은 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 및 20A로 이루어지고, 담체 단백질은 CRM197인, 제약 조성물.
  5. 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물로서, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 특정한 에스. 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서:
    1) 에스. 뉴모니아에 혈청형이 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 탈-O-아세틸화된 15B, 17F, 및 20A로 이루어지고;
    2) 담체 단백질은 CRM197이고;
    3) 각각의 폴리사카라이드의 농도가 8μg/mL (w/v)인,
    면역원성 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 아주반트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 아주반트가 알루미늄 포스페이트 아주반트인 면역원성 조성물.
  8. 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물로서, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 특정한 에스. 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서:
    1) 에스. 뉴모니아에 혈청형이 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15C, 17F, 및 20A로 이루어지고;
    2) 담체 단백질은 CRM197이고;
    3) 각각의 폴리사카라이드의 농도가 8μg/mL (w/v)인,
    면역원성 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 아주반트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 아주반트가 알루미늄 포스페이트 아주반트인 면역원성 조성물.
  11. 에스. 뉴모니아에 폴리사카라이드 담체 단백질 접합체를 포함하는 면역원성 조성물로서, 여기서 각각의 접합체는 담체 단백질에 접합된 특정한 에스. 뉴모니아에 혈청형의 폴리사카라이드를 포함하고, 여기서:
    1) 에스. 뉴모니아에 혈청형이 3, 7F, 19A, 22F, 33F, 6A, 15A, 16F, 23A, 23B, 24F, 31, 35B, 8, 9N, 10A, 11A, 12F, 15B, 17F, 및 20A로 이루어지고;
    2) 담체 단백질은 CRM197이고;
    3) 각각의 폴리사카라이드의 농도가 8μg/mL (w/v)인,
    면역원성 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 아주반트를 추가로 포함하는 면역원성 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 아주반트가 알루미늄 포스페이트 아주반트인 면역원성 조성물.
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