PT1868645E

PT1868645E - Composição conjugada de polissacárido-proteína pneumocócica polivalente

Info

Publication number: PT1868645E
Application number: PT06740419T
Authority: PT
Inventors: William P Hausdorff; Peter R Paradiso; George Rainer Siber
Original assignee: Wyeth Llc
Priority date: 2005-04-08
Filing date: 2006-03-31
Publication date: 2012-05-17
Also published as: TWI511739B; CN113198013A; KR102611449B1; BRPI0607025B1; KR20210022768A; CA2878579A1; IL186367A; EP2425855A1; EP2425853A1; KR20130048262A; KR20150061019A; MX2019008863A; IL282638A; ES2382048T3; HK1257962A1; ZA200709483B; EP3311836A1; PL1868645T3; MY145150A; KR101298053B1

Description

1

DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÃO CONJUGADA DE POLISSACARIDO-PROTEINA PNEUMOCÓCICA POLIVALENTE"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se, genericamente, ao campo da medicina, e especificamente à microbiologia, imunologia, vacinas e à prevenção da infecção por um patogénio bacteriano por meio de imunização.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 Streptococcus pneumoniae é uma importante causa de meningite, pneumonia e doença invasiva grave em lactentes e crianças em todo o mundo. As vacinas polissacaridicas pneumocócicas polivalentes foram licenciadas há muitos anos e se revelaram valiosas na prevenção de doença pneumocócica em adultos idosos e doentes de alto risco. No entanto, lactentes e crianças respondem mal à maioria dos polissacáridos pneumocócicos. A vacina pneumocócica conjugada 7-valente (7vPnC, Prevenar (R)) foi a primeira do seu tipo que demonstrou ser altamente imunogénica e eficaz contra doença invasiva e otite média em lactentes e crianças. Esta vacina é agora aprovada em muitos países em todo o mundo. A vacina Prevenar contém os polissacáridos capsulares dos serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F, cada um conjugado a uma proteína de transporte designada CRM197. A Prevenar abrange cerca de 2 80-90%, 60-80% e 40-80% da doença invasiva pneumocócica (do inglês Invasive Pneumococcal Dísease, IPD), nos ESTADOS UNIDOS, Europa e outras regiões do mundo, respectivamente [1,2]. Dados de prevenção obtidos nos anos a seguir à introdução da Prevenar demonstraram claramente uma redução de doença pneumocócica invasiva em crianças norte-americanas como esperado (FIG. 1) [3,4].

A prevenção da IPD realizada em crianças norte-americanas antes da introdução de Prevenar demonstrou que uma porção significativa da doença devida aos serogrupos 6 e 19 era devido aos serotipos 6A (aproximadamente um terço) e 19A (aproximadamente um quarto) [5,6]. A prevenção da doença invasiva pneumocócica conduzida nos ESTADOS UNIDOS após o licenciamento da Prevenar sugere que uma grande carga da doença ainda é atribuível aos serotipos 6A e 19A (FIG. 1) [3] . Além disso, esses dois serotipos representam mais casos da doença invasiva do que os serotipos 1, 3, 5 e 7F combinados (8,2 vs 3,3 casos/100.000 crianças de 2 anos ou menos). Além disso, os serotipos 6A e 19A estão associadas a taxas elevadas de resistência aos antibióticos (FIG. 2) [7,8,9]. Embora seja possível que a protecção cruzada do serogrupo resulte numa diminuição da doença do serotipo 6A e 19A à medida que mais crianças são imunizados, há evidências que sugerem que haverá um limite para o declínio, e permanecerá uma carga significativa da doença devido a estes serotipos (ver adiante).

Tendo em conta a carga relativa e a importância da doença pneumocócica invasiva devido aos serotipos 1, 3, 5, 6A, 7F e 19A, acrescentar estes serotipos à formulação Prevenar seria aumentar a cobertura para a doença invasiva 3 para >90% nos Estados Unidos e Europa, e até 70%-80% na Ásia e América Latina. Esta vacina expandiria de forma significativa a cobertura para além da Prevenar, e daria cobertura para 6A e 19A, que não são dependentes das limitações da protecção cruzada do serogrupo.

Mbelle et al. (1999, J Infect Dis.; 180(4):1171-6) divulgam uma vacina pneumocócica conjugada 9-valente em que os serotipos 1, 4, 5, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F são conjugados a CRM197.

Hausdorff W. et al. (2000, Clinicai Infectious Deseases, 30:100-121) analisaram conjuntos de dados para comparar os serogrupos que causam a doença invasiva pneumocócica (IPD) com aqueles representados em formulações de vacina conjugadas. O documento US-A-2001/0048929 divulga uma molécula imunogénica polivalente que compreende uma molécula de transporte que contém pelo menos um epitopo de célula T funcional e fragmentos de oligossacáridos de Streptococcus pneumoniae derivado de pelo menos dois polissacáridos capsulares de serotipos de S. Pneumoniae 1, 4, 5, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F. O documento EP-A-0497525 divulga uma composição de vacina que compreende polissacárido capsular, purificado, parcialmente hidrolisado de Streptococcus pneumoniae ligado a uma proteína de transporte imunogénica. O documento WO-A-2004/011027 divulga molécula de conjugado de vacina quimérica polivalente para evitar ou atenuar o Streptococcus do Grupo B, os polissacáridos capsulares bacterianos sendo Streptococcus do Grupo B do tipo Ia, tipo Ib, tipo II, tipo III, tipo V e tipo VIII. 4

Fattom et al. (1999, Vaccine pg. 126-133, Vol. 17) divulgam uma redução de respostas de anticorpos a vários serotipos em murganhos quando a imunogenicidade de vacinas conjugadas polivalentes foi comparada à imunogenicidade de cada vacina monovalente avaliada separadamente. Este fenómeno também foi observado por Dagan et ai. (1998, Infection and Immunity, p. 2093-2098).

Nurkka et ai. (2004, Ped. Inf. Dís. J., 23:1008-1014) divulgam um estudo da imunogenicidade e segurança de uma vacina pneumocócica conjugada contendo a proteína D 11-valente em que não foi observado efeito de iniciação para o serotipo 3 em lactentes que tinham recebido três doses da vacina seguidas por uma dose de reforço da mesma vacina ou de uma vacina com polissacárido pneumocócico.

Gatchlian et al. (2001, 17th Annual Meeting of the Eur. Soc. Paed. Inf. Des (ESPID) , Póster N° 4, PIA Póster Session 1, Istambul, Turquia) divulgam resultados de OPA de lactentes que tinham recebido doses da vacina 11-valente não apresentaram respostas de anticorpo para o serotipo 3 em níveis comparáveis a outros serotipos testados.

Wuorimaa et al. (2001, The Paediatric Infectious Disease Journal, Volume 20(3), pp 272-277) divulga um estudo para avaliar a tolerabilidade e a imunogenicidade em crianças pequenas saudáveis de uma vacina penumocócica conjugada 11-valente que utiliza os toxóides tetânico ou diftérico como transportadores.

Anderson P et al., (2003, Vaccine; 21 (13-14):1554-9) divulgam um estudo comparativo de vacinas conjugadas tetravalentes com cada polissacárido dos tipos 6A, 14, 19F separadamente acoplado ao toxóide tetânico ou diftérico CRMi97 5 ou uma mistura de meias doses de polissacáridos dos tipos 6A, 14, 19F e 23F separadamente acopladas ao toxóide tetânico e diftérico CRM197.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Por conseguinte, a presente invenção proporciona, geralmente, uma composição imunogénica polivalente que compreende 13 conjugados distintos de polissacárido-proteina, em que cada um dos conjugados contém um polissacárido capsular de um serotipo diferente de Streptococcus pneumoniae conjugado com uma proteína de transporte, juntamente com um veículo fisiologicamente aceitável. Opcionalmente, um adjuvante, tal como um adjuvante à base de alumínio, é induzido na formulação. Mais especificamente, a presente invenção proporciona uma composição pneumocócica conjugada 13-valente (13vPnC) que compreende os sete serotipos da vacina 7vPnC (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) mais seis serotipos adicionais (1, 3, 5 , 6A, 7F e 19A). A presente invenção também proporciona uma composição imunogénica polivalente, em que os polissacáridos capsulares são dos serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F de Streptococcus pneumoniae e a proteína de transporte é CRM197. A presente invenção proporciona ainda uma composição imunogénica polivalente, em que os polissacáridos capsulares são dos serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F de Streptococcus pneumoniae, a proteína de transporte é CRM197, e o adjuvante é um adjuvante à base de alumínio, tal como fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e 6 hidróxido de alumínio. Numa forma de realização particular da invenção, o adjuvante é fosfato de alumínio. A presente invenção também proporciona uma composição imunogénica polivalente, que compreende conjugados de polissacárido-proteína em conjunto com um veículo fisiologicamente aceitável, em que cada um dos conjugados compreende um polissacárido capsular de um serotipo diferente de Streptococcus pneumoniae conjugado com uma proteína de transporte, e os polissacáridos capsulares são preparados a partir do serotipo 3 e pelo menos um serotipo adicional.

Numa forma de realização desta composição imunogénica polivalente, o serotipo adicional é seleccionado do grupo que consiste nos serotipos 1, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F. Numa outra forma de realização, a proteína de transporte é CRM197. Em ainda outra forma de realização, a composição compreende um adjuvante, tal como um adjuvante à base de alumínio seleccionado de fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio. Numa forma de realização particular, o adjuvante é fosfato de alumínio. A presente invenção também proporciona uma composição imunogénica polivalente, que compreende conjugados de polissacárido-proteína juntamente com um veículo fisiologicamente aceitável, em que cada um dos conjugados compreende um polissacárido capsular de um serotipo diferente de Streptococcus pneumoniae conjugado com uma proteína de transporte, e os polissacáridos capsulares são preparados dos serotipos 4, 6B1 9V, 14, 18C, 19F, 23F e pelo menos um serotipo adicional.

Numa forma de realização desta composição imunogénica polivalente, o serotipo adicional é seleccionado do grupo que 7 consiste nos serotipos 1, 3, 5, 6A, 7F, e 19A. Numa outra forma de realização, a proteína de transporte é CRMi97 . Em ainda outra forma de realização, a composição compreende um adjuvante, tal como um adjuvante à base de alumínio seleccionado de fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio. Numa forma de realização particular, o adjuvante é fosfato de alumínio. A presente invenção também proporciona um método para induzir uma resposta imune a um conjugado de polissacárido capsular de Streptococcus pneumoniae, que compreende administrar a um ser humano uma quantidade imunologicamente eficaz de qualquer uma das composições imunogénicas que acabamos de descrever. A presente invenção proporciona ainda que qualquer uma das composições imunogénicas administrados é uma dose única de 0,5 mL formulada para conter: 2 pg de cada sacárido, excepto para 6B, a 4 pg; aproximadamente 29 pg da proteína de transporte CRM197; 0,125 mg de adjuvante de alumínio elementar (0,5 mg de fosfato de alumínio); e cloreto de sódio e tampão succinato de sódio como excipientes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG, 1 representa as variações nas taxas de IPD pelo serotipo em crianças norte-americanas com menos de 2 anos de idade desde a linha de base (1998/1999) até 2001. A FIG. 2 representa a distribuição de isolados de pneumococos, com resistência à penicilina (PCN) em crianças com menos de 5 anos de idade (1998). A FIG. 3 representa curvas de distribuição cumulativa reversa (RCDC) de OPA após resultados de terceiras doses do estudo Prevenar D118-P16.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Inclusão dos Serotipos da Prevenar 4, 6B, 9V, 14, 18C,

19F, 23F

Os dados de vigilância de IPD entre 1995 e 1998 estimaram que os sete serotipos na vacina Prevenar foram responsáveis por cerca de 82% da IPD em crianças com menos de 2 anos de idade [5] . No norte da Califórnia, o local do ensaio de eficácia, os serotipos da Prevenar foram responsáveis por 90% de todos os casos de IPD em lactentes e crianças [10]. Desde a introdução da vacina Prevenar em 2000, houve uma diminuição significativa nas taxas totais de IPD devido a uma diminuição na doença devido aos serotipos da vacina [3, 4] . Portanto, não se justifica, neste momento, remover qualquer dos serotipos da Prevenar da próxima geração de vacinas pneumocócicas conjugadas, mas sim adicionar serotipos para obter uma cobertura mais ampla.

Inclusão dos serotipos 1, 3, 5 e 7F

Nos ESTADOS UNIDOS, a taxa de IPD causada pelo serotipo 1 em crianças menores de 5 anos é <2%, cerca da mesma para cada um dos tipos 3 e 7F [1, 6] . Os serotipos 1 e 5 são responsáveis por altas taxas de IPD em populações norte- 9 americanas de alto risco para doença invasiva pneumocócica. Especificamente, o serotipo causa 3,5% de IPD em crianças nativas do Alasca com menos de 2 anos de idade, e 18% em crianças de 2 a 4 anos de idade [11]. Tanto o serotipo 1 como o serotipo 5 significativamente causam doenças em outras partes do mundo e em populações indígenas nos países desenvolvidos [12, 13, 14]. O serotipo 1 pode também estar associado com doença mais grave em comparação com outros serotipos pneumocócicos [15] . Esta observação é baseada na diferença nas taxas de identificação de caso entre os ESTADOS UNIDOS e a Europa, e a diferença associada à prática médica. No geral, a incidência de IPD é menor na Europa do que nos ESTADOS UNIDOS. No entanto, a percentagem de IPD causada pelo serotipo 1 na Europa é desproporcionadamente maior do que nos ESTADOS UNIDOS (6-7%, vs 1-2%, respectivamente). Na Europa, as culturas de sangue são obtidas predominantemente de crianças hospitalizadas. Nos ESTADOS UNIDOS, é uma prática médica de rotina obter hemoculturas em ambiente ambulatório de crianças que apresentam febre ^39 °C e contagens elevadas de células brancas do sangue. Dada a diferença na prática médica, é postulado que a menor percentagem da doença causada pelo serotipo 1 nos ESTADOS UNIDOS pode ser diluída por taxas mais elevadas de outros serotipos que causam doença mais branda, enquanto que a percentagem maior na Europa reflecte doença mais grave. Além disso, estudos de seroepidemiologia de crianças com pneumonia complicada demonstram que o serotipo 1 é representado de forma desproporcional [16, 17, 18]. Isto sugere que a inclusão do serotipo 1 pode reduzir a quantidade 10 de doença pneumocócica grave, bem como contribuir para uma redução total em doença invasiva pneumocócica. A adição dos serotipos 3 e 7F irá aumentar a cobertura contra a IPD na maioria das áreas do mundo em cerca de 3% a 7%, e na Ásia em cerca de 9%. Assim, uma vacina 11-valente cobriria 50% de IPD na Ásia e cerca de 80% em todas as outras regiões [1, 2]. Esses serotipos são também importantes no que diz respeito à cobertura de otite média [19]. Num estudo multinacional de serotipos pneumocócicos causadores de otite média, Hausdorff et al constataram que o serotipo 3 é o oitavo isolado mais comum do fluido do ouvido médio como um todo [20] . O serotipo 3 foi responsável por até 8,7% dos serotipos pneumocócicos associados a otite média. Assim, a importância dos tipos de 3 e 7F na otite média, bem como na IPD, garante a sua inclusão numa vacina pneumocócica conjugada.

No entanto, as tentativas de produzir uma vacina pneumocócica conjugada polivalente que apresente imunogenicidade significativa em relação aos polissacáridos do serotipo 3 têm sido infrutíferas. Por exemplo, num estudo da imunogenicidade e segurança de uma vacina pneumocócica conjugada contendo a proteína D 11-valente (11-Pn-PD), não foi observado efeito de imunização primária para o serotipo 3 em crianças que receberam três doses da vacina seguidas por uma dose de reforço da mesma vacina ou de uma vacina de polissacárido pneumocócico (Nurkka et al. (2004) Ped. Inf. Dis. J., 23:1008-1014). Em outro estudo, resultados do ensaio opsonofagocítico (OPA) em crianças que receberam doses de 11-Pn-PD não detectaram respostas de anticorpos para o serotipo 3 em níveis comparáveis aos de outros serotipos testados 11 (Gatchalian et al., 17th Annual Meeting of the Eur. Soc. Paed. Inf. Des (ESPID), Póster N° 4, PIA Póster Session 1, Istambul, Turquia, 27 de Março de 2001) . Em ainda outro estudo, que avaliou a eficácia de uma 11-PN-PD na prevenção da otite média aguda, a vacina não proporcionou protecção contra episódios causados pelo serotipo 3 (Prymula et al. www.thelancet.com, Vol. 367: 740-748 (4 de Março de 2006)). Desse modo, uma vacina pneumocócica conjugada que compreende polissacáridos capsulares do serotipo 3 e capaz de eliciar uma resposta imunogénica para os polissacáridos do serotipo 3 proporciona uma melhoria significativa em relação ao estado da técnica actual.

Inclusão dos Serotipos 6A e 19A.

a. Epidemiologia dos Serotipos 6A e 19A

Os dados de vigilância da literatura sugerem que os serotipos 6A e 19A são responsáveis por mais doença invasiva pneumocócica em crianças norte-americanas com menos de 2 anos de idade do que os serotipos 1, 3, 5 e 7F combinados (Fig. 1) [1, 5] . Além disso, estes serotipos estão normalmente associados com a resistência aos antibióticos (FIG. 2) e desempenham um papel importante na otite média [6, 19, 20]. A capacidade da vacina Prevenar actual para proteger contra a doença devido aos serotipos 6A e 19A não é clara. A lógica para a inclusão de componentes 6A e 19A numa vacina 13vPnC é discutida adiante. 12

b. As respostas a 6A e 19A Induzidas pelos Políssacáridos 6B e 19F

As vacinas pneumocócicas polissacarídicas não-licenciadas conjugadas (para utilização em pessoas de pelo menos dois anos de idade) continham o polissacárido capsular 6A ou 6B, mas não ambos [21] . Os dados de imunogenicidade gerados no momento da formulação da vacina pneumocócica polissacaridica 23-valente demonstraram que uma vacina 6B monovalente induziu anticorpo tanto para a cápsula 6A como para 6B. Os dados de diversos ensaios que avaliam respostas de IgG e ensaio opsonofagocitico (OPA) numa variedade de populações com polissacárido livre e com vacinas conjugadas pneumocócicas sugeriram que as respostas de IgG para 6A são induzidas por antigenos 6B, mas as respostas são geralmente mais baixas, e a actividade OPA com organismos 6A é diferente do que com os organismos 6B [22, 23, 24, 25] . Além disso, os indivíduos que respondem com anticorpo 6B elevado podem ter pouca ou nenhuma actividade contra 6A.

Em contraste com a composição química dos polissacáridos capsulares 6A e 6B onde existe um grau elevado de semelhança, as cápsulas 19A e 19F são bastante diferentes, devido à presença de duas cadeias laterais adicionais no polissacárido 19A. Não surpreendentemente, as respostas imunes medidas em voluntários humanos imunizados com a vacina polissacaridica 19F demonstraram que as respostas ao 19F foram induzidas em 80% dos indivíduos, mas apenas 20% dos indivíduos tinham uma resposta a 19A [26]. Os baixos níveis de reactividade cruzada de IgG e respostas OPA ao serotipo 13 19Α após a imunização com o polissacárido 19F foram também documentados em ensaios com vacinas conjugadas [24, 26].

Os dados internos sobre as respostas de reacção cruzada de OPA ao 6A e 19A foram geradas a partir do ensaio abreviado 7vPnC (D118-P16), conduzido em crianças norte-americanas (FIG. 3). Estes estudos estão de acordo com os resultados de outros, e demonstram a indução de reactividade cruzada do anticorpo funcional ao polissacárido 6A após imunização com o polissacárido 6B, embora a um nível inferior, e muito pouco anticorpo funcional para 19A após a imunização com 19F.

Impacto da Imunização com 6B e 19F em 6A e 19A em Modelos Animais

Modelos animais têm sido utilizados para avaliar o potencial de protecção cruzada com a imunização de polissacárido. Num modelo de otite média desenvolvido por Giebink et al., chinchilas foram imunizadas com uma vacina conjugada de proteína de membrana externa de polissacárido tetravalente (OMP) (contendo os sacáridos 6B, 14, 19F, 23F) ou placebo [27]. Neste ensaio, parecia haver alguma protecção cruzada para 6A; no entanto isto não alcançou significância estatística e o nível de protecção foi menor do que com 6B contra a otite média. Neste mesmo modelo, houve 100% de protecção contra a otite média causada por 19F, mas apenas 17% de protecção contra a otite média causada por 19A.

Saeland et al. utilizaram soros de crianças imunizadas com uma vacina conjugada tétano pneumocócica 8-valente (contendo 6B e 19F) para passivamente imunizar murganhos antes de um desafio intranasal com organismos 6A, num modelo 14 de infecção pulmonar [28] . Das 59 amostras de soro, 53% protegeram os murganhos contra bacteremia com 6B e 37% protegeram contra 6A. Os murganhos passivamente imunizados com soro de crianças imunizadas com quatro doses de uma vacina conjugada pneumocócica 11-valente (contendo 19F conjugado ao toxóide tetânico) foram submetidos um desafio intranasal com organismos 19A no mesmo modelo [29] . De 100 murganhos passivamente imunizados e depois desafiados, 60 murganhos não tinham organismos 19A detectados no tecido pulmonar, enquanto que foram identificados organismos em todos os murganhos que receberam placebo salino. No entanto, a imunização passiva não protegeu contra o desafio com organismos 19F neste modelo; portanto, a relevância do modelo para o serogrupo 19 é questionável. Em geral, estes modelos fornecem evidência de algum impacto biológico da imunização com 6B em organismos 6A, embora o efeito sobre o serotipo heterólogo não foi tão grande como o observado com o serotipo homólogo. O impacto da imunização com 19F em organismos 19A não é bem compreendida a partir destes modelos.

Impacto da Imunização com Conjugado Polissacarídico 6B e 19F sobre a Doença 6A e 19A em Ensaios de Eficácia/Efectividade O número de casos da doença devido aos serotipos 6B, 6A, 19F e 19A em ensaios de eficácia de 7vPnC e 9vPnC (7vPnC mais serotipos 1 e 5) é registado no Quadro 1 [30, 10, 31] . 0 número de casos de doença invasiva são pequenos demais para permitir que se tirem quaisquer conclusões para os serotipos 6A e 19A. No entanto, o ensaio finlandês de otite media gerou 15 um grande número de isolados de pneumococos [32] . Na análise por protocolo a 7vPnC foi 84% (95% Cl 62%, 93%) eficaz contra a otite média devido ao serotipo 6B e 57% (95% Cl 24%, 76%) eficaz contra a otite média, devido ao serotipo 6A (Quadro 1). Em contraste, a eficácia serotipo-especifica com a 7vPnC não foi demonstrada para a otite média, quer devido a 19F ou 19A.

Quadro 1. Casos de Doença Pneumocócica Devido aos Serotipos 6B, 6A, 19F e 19A em Ensaios de Eficácia com as

Vacinas 7vPnC e 9vPnC 6B 6A 19F 19A PnC Contr. PnC Contr. PnC Contr. PnC Contr. Ensaio de Eficácia Kaiser 7vPnC (ITT) 1 7 0 1 2* 13 0 1 Ensaio de Eficácia Navajo 7vPnC (ITT) 0 5 1 0 1 1 1 0 Ensaio de Eficácia Sul Africano 9vPnC HIV(-) (ITT) 1 2 1 0 0 1 3 1 Ensaio de Eficácia Sul Africano 9vPnC HIV(+) (ITT) 1 7 3 10 2 3 2 3 Ensaio Finlandês de Otite Média 7vPnC (PP) 9* 56 19* 45 45 58 17 26 16 * Eficácia demonstrada estatisticamente significativa A partir das referências 30, 10 e 33, e comunicações pessoais

Contr. = controlo ITT = intenção de tratar análise PP = análise por protocolo

Dados de vigilância de IPD pós-comercialização também estão disponíveis de um estudo de caso-controlo conduzido pelos Centros de Controle de Doenças para avaliar a eficácia da vacina Prevenar [33]. Casos de doença invasiva pneumocócica que ocorrem em crianças de 3 a 23 meses de idade foram identificados nos laboratórios de vigilância e combinados com três casos de controlo por idade e código postal. Após obtenção do consentimento, foi obtido o histórico médico e de imunização (indivíduos foram considerados imunizados se tivessem recebido pelo menos uma dose de Prevenar) dos pais e fornecedores de serviços médicos para os casos e os controlos. Os resultados preliminares foram apresentados na reunião de 2003 da ICAAC e um sumário dos resultados para a doença 6B, 19F, 19A e 6A está apresentado no Quadro 2. Estes dados indicam que a vacina Prevenar é capaz de prevenir a doença devido a 6A, embora a um nível que pode ser um pouco menor do que o serotipo da doença 6B. Estes dados também indicam que a protecção cruzada para a doença invasiva devido a 19A é limitada.

Quadro 2. Resultados preliminares de um ensaio de controle de caso realizado pelo CDC (apresentado na ICAAC, 2003)

Serotipo Conjuntos Informativos, n VE* (95% Cl) Tipo de vacina. Todos 115 94 (87, 97) 17

Relacionado com Vacina, Todos 36 70 (38, 86) Tipo não-Vacina, Todos 43 -4 (-106, 48) 6B 27 94 (72, 99) 19F 19 73 (16, 92) 6A 15 87 (53, 97) 19A 16 40 (-87, 80) * Eficácia da vacina comparando vacinados (^1 dose) vs. não-vacinados, e ajustada para condições pessoal/confidencial subjacentes Referência 40 e comunicação

Uma análise publicada [3] da utilização de Prevenar também indicou que os serotipos 6B e 19F conferiram uma redução moderada em IPD causada pelos serotipos 6A e 19A entre crianças menores de dois anos de idade (Quadro 1 em [3]). As taxas da doença entre adultos não-imunizados causada pelos serotipos 6A, 9A, 9L, 9N, 18A, 18B, 18F, 19A, 19B, 19C, 23A e 23B ("todos serotipos relacionados com vacina") eram um pouco reduzidas (Quadro 2 em [3] ) . Estes dados estabelecem que a imunidade em massa a partir da utilização de Prevenar em crianças com menos de dois anos de idade foi modesta para os serotipos 6A e 19A, e proporcionam uma base para a inclusão dos serotipos 6A e 19A na vacina 13vPnC da presente invenção.

Conclusão para a adição de 6A e 19A 18

Dados de vigilância de IPD pós-comercialização e os resultados do estudo de caso-controlo indicados na FIG. 1 e no Quadro 2 com a vacina 7vPnC sugerem que, consistente com a outra informação sobre as respostas imunitárias e desempenho em modelos animais descritos acima, pode haver alguma protecção cruzada contra a doença 6A, mas em menor grau do que a doença 6B. Além disso, parece que a protecção contra 19A é limitada. Portanto, uma vacina 13vPnC contendo serotipos 6A e 19A proporciona uma cobertura que não é dependente das limitações de protecção cruzada do serogrupo pelos serotipos 6B e 19F.

Por conseguinte, a presente invenção proporciona uma composição imunogénica polivalente que compreende 13 conjugados distintos de polissacárido-proteína, em que cada um dos conjugados contém um polissacárido capsular diferente conjugado a uma proteína de transporte, e em que os polissacáridos capsulares são preparados a partir dos serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F de Streptococcus pneumoniae, juntamente com um veículo fisiologicamente aceitável, em que a proteína de transporte é o toxóide diftérico designado CRM197. A composição imunogénica pode compreender ainda um adjuvante, tal como um adjuvante à base de alumínio, tal como fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio.

Os polissacáridos capsulares são preparados por técnicas padrão conhecidas dos especialistas na técnica. Na presente invenção, os polissacáridos capsulares são preparados a partir dos serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F de Streptococcus pneumoniae. Estes conjugados pneumocócicos são preparados por processos 19 separados e formulados numa formulação de dosagem única. Por exemplo, numa forma de realização, cada serotipo polissacarídico pneumocócico é cultivado num meio à base de soja. Os polissacáridos individuais são então purificados por meio de centrifugação, precipitação, ultrafiltração, e cromatografia em coluna. Os polissacáridos purificados são quimicamente activados para fazer com que os sacáridos sejam capazes de reagir com a proteina de transporte.

Uma vez activado, cada polissacárido capsular é separadamente conjugado a uma proteina de transporte, para formar um glicoconjugado. Numa forma de realização, cada polissacárido capsular é conjugado à mesma proteina de transporte. Nesta forma de realização, a conjugação é efectuada por aminação redutiva. A activação química dos polissacáridos e a subsequente conjugação com a proteína de transporte são alcançadas através de meios convencionais. Ver, por exemplo, Patentes EUA Nos. 4,673,574 e 4,902,506 [34, 35].

As proteínas de transportes são de preferência proteínas que são não-tóxicas e não-reatogénicas e obteníveis em quantidade e pureza suficientes. Proteínas de transportes devem ser passíveis de procedimentos de conjugação padrão. Na presente invenção, CRM197 é utilizada como proteína de transporte. A CRM197 (Wyeth, Sanford, NC) é uma variante não-tóxica (isto é, toxóide) da toxina da difteria isolada a partir de culturas de Corynebacterium diphteria estirpe C7 (β197) cultivadas em casaminoácidos e meio à base de extracto de levedura. A CRM197 é purificada por meio de ultrafiltração, precipitação com sulfato de amónio, e cromatografia de 20 permuta iónica. Alternativamente, a CRM197 é preparada de forma recombinante de acordo com a Patente EUA N° 5 614 382. Outros toxóides diftéricos são também adequados para utilização como proteínas de transportes.

Outras proteínas de transportes adequadas incluem toxinas bacterianas inactivadas, tais como o toxóide do tétano, toxóide pertussis; toxóide da cólera (por exemplo, como descrito no Pedido de Patente Internacional W02004/083251 [38]), E. coli termo-lábil (TL), E. coli estável (ST), e exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. Proteínas da membrana bacteriana externa, tais como o complexo c da membrana externa (OMPC), porinas, proteínas de ligação à transferrina, pneumolisina, proteína de superfície do pneumococo A (PspA), proteína de adesina pneumocócica (PsaA), peptidase C5a de Streptococcus do Grupo A ou Grupo B, ou proteína D de Haermophilus influenzae, também podem ser utilizadas. Outras proteínas, tais como a ovalbumina, hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina de soro bovino (BSA) ou derivado de proteína purificada de tuberculina (PPD) podem também ser utilizadas como proteínas de transportes.

Após a conjugação do polissacárido capsular com a proteína de transporte, os conjugados de polissacárido-proteína são purificados (enriquecidos com respeito à quantidade de conjugado de polissacárido-proteína) por uma variedade de técnicas. Estas técnicas incluem operações de concentração/diafiltração, precipitação/eluição, cromatografia em coluna, e filtração em profundidade. Ver os exemplos adiante. 21

Após os glicoconjugados individuais serem purificados, os mesmos são combinados para formular a composição imunogénica da presente invenção, que pode ser utilizada como uma vacina. A formulação da composição imunogénica da presente invenção pode ser realizada utilizando métodos reconhecidos na técnica. Por exemplo, os 13 conjugados de pneumocócicos individuais podem ser formulados com um veiculo fisiologicamente aceitável para preparar a composição. Exemplos de tais veículos incluem, mas não estão limitados a, água, soro fisiológico tamponado, polióis (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido) e soluções de dextrose.

Em certas formas de realização, a composição imunogénica irá compreender um ou mais adjuvantes. Tal como aqui definido, um "adjuvante" é uma substância que serve para aumentar a imunogenicidade de uma composição imunogénica desta invenção. Assim, os adjuvantes são frequentemente utilizados para estimular a resposta imune e são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Os adjuvantes adequados para melhorar a eficácia da composição incluem, mas não estão limitados a: (1) sais de alumínio (alúmen), tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc.; (2) formulações de emulsão óleo-em-água (com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos, tais como péptidos muramil (definido adiante) ou componentes de paredes celulares bacterianas), tais como, por exemplo,

a) MF59 (PCT Publ. N° WO 90/14837), contendo 5% de esqualeno, 0,5% de Tween 80, 0,5% de Span 85 e (opcionalmente contendo várias quantidades de MTP-PE 22 (ver adiante, embora não necessário)) formulado em partículas submicrónicas, utilizando um microfluidizador tal como o microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, contendo 10% de esqualeno, 0,4% de Tween 80, 5% de polímero de bloco plurónico L121, e thr-MDP (ver adiante) microfluidizado numa emulsão submicrónica ou centrifugada para gerar uma emulsão de tamanho de partícula maior, e (c) sistema adjuvante Ribi™ (RAS), (Corixa, Hamilton, MT) contendo 2% de esgualeno, 0,2% de Tween 80, e um ou mais componentes da parede celular bacteriana do grupo gue consiste em 3-O-monofosforilípido desacilado A (MPL™) descrito na Patente EUA N° 4,912,094 (Corixa), dimicolato de trealose (TDM), e esgueleto da parede celular (CWS), de preferência MPL + CWS (Detox™); (3) adjuvantes de saponina, tais como Quil A ou Stimulon™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (Patente EUA N° 5,057,540) podem ser utilizados ou partículas geradas daí, tais como ISCOMs (complexos imunoestimulantes); (4) lipopolissacáridos bacterianos, análogos sintéticos de lípido A tais como compostos de fosfato de aminoalguil glucosamina (AGP), ou seus derivados ou seus análogos, gue estão disponíveis de Corixa, e que são descritos na Patente EUA N° 6,113,918; um desses AGP é 2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino]etil-2-desoxi-4-0-fosfono-3-0- [ (R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino]-b-D-glucopiranósido, que é também conhecido como 529 (anteriormente conhecido como 23 RC529), que é formulado como uma forma aquosa ou como uma emulsão estável, polinucleótidos sintéticos tais como oligonucleótidos contendo motivo(s) CpG (Patente EUA N° 6,207,646); 5) citocinas, tais como interleucinas (por exemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, etc.), interferões (por exemplo, interferão gama), factor estimulante de colónias de granulócitos macrófagos (GM-CSF), factor estimulador de colónias de macrófagos (M-CSF), factor de necrose tumoral (TNF), moléculas co-estimulatórias B7-1 e B7-2, etc.; (6) mutantes descontaminados de uma toxina bacteriana de ribosilação do ADP, tais como uma toxina da cólera (CT) , quer sob a forma de um tipo selvagem ou mutante, por exemplo, onde o ácido glutâmico na posição do aminoácido 29 é substituído por outro aminoácido, de preferência uma histidina, em conformidade com o publicado no pedido de patente internacional número WO 00/18434 (ver também os documentos WO 02/098.368 e WO 02/098.369), uma toxina pertussis (PT), ou uma toxina E. coli termo-lábil (LT), particularmente LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129 (ver, por exemplo, os documentos WO 93/13302 e WO 92/19265); e (7) outras substâncias que actuam como agentes imunoestimulantes para aumentar a eficácia da composição. Péptidos muramil incluem, mas não estão limitados a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanina-2-(1'-2'dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxi fosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), etc. 24

As formulações de vacina da presente invenção podem ser utilizadas para proteger ou tratar um ser humano susceptivel a infecção por pneumococos, por meio da administração da vacina através de uma via sistémica ou de mucosa. Estas administrações podem incluir injecção por via intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea; ou por administração via mucosa às vias oral/digestiva, respiratória ou geniturinária. Numa forma de realização, a administração intranasal é utilizada para o tratamento de pneumonia ou otite media (uma vez que o transporte nasof aringeano de pneumococos pode ser mais eficazmente evitado, atenuando assim a infecção, na sua fase inicial). A quantidade de conjugado em cada dose de vacina é seleccionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotectora sem efeitos adversos significativos. Tal quantidade pode variar dependendo do serotipo pneumocócico. Geralmente, cada dose compreenderá de 0,1 a 100 pg de polissacárido, particularmente 0,1 a 10 pg, e mais particularmente 1 a 5 pg.

As quantidades óptimas de componentes para uma vacina particular podem ser determinadas por estudos padrão que envolvem a observação de respostas imunes adequadas nos indivíduos. Após uma vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou várias imunizações de reforço adequadamente espaçadas.

Numa forma de realização particular da presente invenção, a vacina 13vPnC é uma formulação líquida estéril de polissacáridos capsulares pneumocócicos dos serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, e 23F individualmente conjugados com CRM197. Cada dose de 0,5 mL é 25 formulada para conter: 2 pg de cada sacárido, excepto para 6B, a 4 pg; aproximadamente 29 pg da proteína de transporte CRM197; 0,125 mg de adjuvante de alumínio elementar (0,5 mg de fosfato de alumínio); e cloreto de sódio e tampão succinato de sódio como excipientes. O líquido é introduzido em seringas de dose única, sem um conservante. Após agitação, a vacina é uma suspensão branca, homogénea, pronta para administração intramuscular. A escolha do nível de dose para a vacina 13vPnC é semelhante à vacina 7vPnC (Prevenar) comercializada. O nível de dose de sacárido de 2 pg foi seleccionado para todos os serotipos, excepto para ο 6B, que é a 4 pg por dose. A vacina 7vPnC demonstrou segurança desejável, imunogenicidade e eficácia contra IPD ao nível de dose de sacárido de 2 pg para os serotipos 4, 9V, 14, 18C, 19F e 23F, e à dose de 4 pg para 6B . 0 esquema de imunização que pode seguir o designado para a vacina 7vPnC. Por exemplo, o esquema de rotina para lactentes e crianças contra doenças invasivas causadas por S. pneumoniae, devido aos serotipos incluídos na vacina 13vPnC é 2, 4, 6 e 12-15 meses de idade. As composições desta invenção são também adequadas para utilização com crianças mais velhas, adolescentes e adultos.

As composições desta invenção podem ainda incluir um ou mais antigénios adicionais para utilização contra a otite média causada por infecção com outras bactérias. Tais bactérias incluem Haemophilus influenza, Moraxella catarrhalis (anteriormente conhecida como Branhamella catarrhalís) e Alloiococcus otitidis não-tipáveis. 26

Exemplos de antigénios de H. ínfluenzae não-tipáveis adequados para inclusão incluem a proteína P4, também conhecida como proteína “e" (Patente EUA N° 5 601 831; Pedido de Patente Internacional WO03/078453) , a proteína P6, também conhecida como a proteína PAL ou PBOMP-1 (Patente EUA N° 5 110 908; Pedido de Patente Internacional W00100790), a proteína P5 (Patente Reemitida EUA N° 37 741), a proteína de adesão e penetração de Haemophilus (Patentes EUA Nos. 6 245 337 e 6 676 948), a proteína adesina da extremidade de LKP (Patente EUA N° 5 643 725) e a proteína NucA (Patente EUA N° 6 221 365).

Exemplos de antigénios de Moraxella catarrhalis adequados para inclusão incluem a proteína UspA2 (Patentes EUA Nos. 5 552 146, 6 310 190), a proteína CD (Patente EUA N° 5 725 862), a proteína E (Patente EUA N° 5 948 412) e a proteína de membrana externa de 74 kDa (Patente EUA N° 6 899 885) .

Exemplos de antigénios de Alloiococcus otítídís adequados para inclusão incluem aqueles identificados no Pedido de Patente Internacional W003/048304.

As composições desta invenção podem também incluir uma ou mais proteínas de Streptococcus pneumoníae. Exemplos de proteínas de Streptococcus pneumoníae adequados para a inclusão são aqueles identificados no Pedido de Patente Internacional WO02/083855, bem como o exemplo descrito no Pedido de Patente Internacional W002/053761.

As composições desta invenção podem ainda incluir uma ou mais proteínas de Neisseria meningitidis tipo B. Exemplos de proteínas de Neisseria meningitidis tipo B adequados para a inclusão são aqueles identificados nos Pedidos de Patente 27

Internacional WO03/063766, W02004/094596, WOOl/85772, WO02/16612 e WOOl/87939. A divulgação acima descreve, de forma genérica, a presente invenção. Uma compreensão mais completa pode ser obtida por referência aos seguintes exemplos específicos. Estes exemplos são descritos apenas para fins de ilustração e não se destinam a limitar o âmbito da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Preparação do Polissacárido Capsular do Serotipo 1 de S. pneumoniae

Preparação de Bancos de Células de Trabalho e Células

Mestras O serotipo 1 de S. pneumoniae foi obtido da American Type Culture Collection, ATCC, estirpe 6301. Foram criadas várias gerações de estoques de sementes a fim de expandir a estirpe e remover componentes de origem animal (gerações Fl, F2 e F3) . Duas gerações adicionais de estoques de sementes foram produzidas. A primeira geração adicional foi feita a partir de um frasco de F3, e a geração subsequente foi feita a partir de um frasco da primeira geração adicional. Frascos de sementes foram armazenados congelados (<-70 °C) com glicerol sintético como criopreservante. Para além dos frascos congelados, foram preparados frascos liofilizados para a geração de F4. Para a preparação do banco de células, 28 todas as culturas foram cultivadas num meio à base de soja. Antes da congelação, as células foram concentradas por centrifugação, o meio usado foi removido, e granulados de células foram ressuspensos em meio fresco contendo um criopreservante, tal como glicerol sintético.

Fermentação e Colheita

Culturas do banco de células de trabalho foram utilizadas para inocular frascos de sementes contendo um meio à base de soja. Os frascos foram incubados a 36 °C ± 2 °C sem agitação até gue as exigências de crescimento foram atendidas. Uma garrafa de semente foi utilizada para inocular um fermentador de sementes contendo meio à base de soja. Um pH de cerca de 7,0 foi mantido com solução estéril de carbonato de sódio. Depois da densidade óptica alvo ser atingida, o fermentador de sementes foi utilizado para inocular o fermentador de produção contendo meio à base de soja. O pH foi mantido com uma solução estéril de carbonato de sódio. A fermentação foi terminada após a cessação do crescimento ou quando o volume de trabalho do fermentador foi atingido. Uma quantidade apropriada de desoxicolato de sódio estéril a 12% foi adicionada à cultura para lisar as células bacterianas e libertar os polissacáridos associados às células. Após a lise, o conteúdo do fermentador foi arrefecido. O pH do caldo de cultura lisado foi ajustado para um pH de aproximadamente 6,6 com ácido acético. O lisado foi clarificado por centrifugação de fluxo continuo seguido por filtração em profundidade e microfiltração por um filtro de 0,45 pm. 29

Num processo alternativo, o pH da fermentação de cerca de 7,0 foi mantido com NaOH 3 N. Depois da densidade óptica alvo ser atingida, o fermentador de sementes foi utilizado para inocular o fermentador de produção contendo meio à base de soja. O pH foi mantido com NaOH 3 N. A fermentação foi terminada após a cessação do crescimento ou quando o volume de trabalho do fermentador foi atingido. Uma quantidade apropriada de desoxicolato de sódio estéril a 12% foi adicionada à cultura para obter uma concentração de 0,12% no caldo, para lisar as células bacterianas e libertar o polissacárido associado às células. Após a lise, o conteúdo do fermentador foi mantido, com agitação, por um intervalo de tempo compreendido entre 8 e 24 horas a uma temperatura entre 7 °C e 13 °C, para assegurar que tinha ocorrido a lise celular completa e a libertação de polissacárido. Agitação durante este período de espera impediu que o sedimento do lisado assentasse sobre as paredes do fermentador e a sonda de pH, permitindo assim que a integridade da sonda de pH fosse mantida. Em seguida, o pH do caldo de cultura lisado foi ajustado para um pH de aproximadamente 5,0 com 50% de ácido acético. Depois de um tempo de espera sem agitação, durante um intervalo de tempo entre 12 e 24 horas a uma temperatura entre 15 °C e 25 °C, uma porção significativa das proteínas previamente solúveis desprendeu-se da solução como um precipitado sólido, com pouca perda ou degradação do polissacárido, que permaneceu em solução. A solução com o precipitado foi então clarificada por centrifugação de fluxo contínuo seguida por filtração em profundidade e microfiltração por um filtro de 0,45 pm. 30

Purificação A purificação do polissacárido pneumocócico consistiu em várias operações de concentrações/diafiltração, precipitação/eluição, cromatografia em coluna, e etapas de filtração em profundidade. Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que especificado em contrário. 0 caldo clarificado a partir das culturas do fermentador do serotipo 1 de S. pneumoniae foi concentrado e diafiltrado utilizando um filtro com membrana MWCO de 100 kDa (peso molecular de corte kDa) . A diafiltração foi realizada utilizando tampão fosfato de sódio a um pH neutro. A diafiltração removeu os componentes médios de baixo peso molecular dos biopolimeros de maior peso molecular tais como ácido nucleico, proteína e polissacárido. O polissacárido foi precipitado da solução concentrada e diafiltrada pela adição de brometo de hexadeciltrimetil amónio (HB) de uma solução-mãe para dar uma concentração final de HB a 1% (p/v). O precipitado de polissacárido/HB foi capturado num filtro de profundidade e o filtrado foi descartado. O precipitado de polissacárido foi ressolubilizado e eluído por recirculação de uma solução de cloreto de sódio através do filtro de profundidade contendo o precipitado. Os filtros foram então lavados com solução adicional de cloreto de sódio.

Iodeto de sódio (Nal) foi adicionado à solução de polissacárido a partir de uma solução-mãe de Nal para atingir uma concentração final de 0,5% para precipitar o HB. 0 31 precipitado foi removido por filtração em profundidade. 0 filtrado contém o polissacárido alvo. 0 vaso de precipitação e o filtro foram lavados com uma solução de NaCI/Nal e o lavado foi combinada com a solução de polissacárido parcialmente purificada. 0 filtro foi descartado. 0 polissacárido foi então filtrado através de um filtro de 0,2 pm. A solução de polissacárido foi concentrada num ultrafiltro com membrana MWCO de 30 kDa e diafiltrada com uma solução de cloreto de sódio. A solução de polissacárido parcialmente purificada foi ainda purificada por filtração através de um filtro de profundidade impregnado com carvão activado. Depois da filtração, o filtro de carvão foi enxaguado com uma solução de cloreto de sódio. 0 lavado é combinado com a solução de polissacárido, que é então filtrada através de um filtro de 0,2 pm. A solução de polissacárido foi concentrada num ultrafiltro com membrana MWCO de 30 kDa e ajustada com um tampão fosfato de sódio 1 M para atingir uma concentração final de 0,025 M de fosfato de sódio. O pH foi verificado e ajustado em 7,0 ± 0,2. A coluna de cerâmica de hidroxiapatita (HA) foi equilibrada com tampão fosfato de sódio contendo cloreto de sódio para obter a condutividade apropriada (<15 pS) . A solução de polissacárido foi então carregada na coluna. Nestas condições, as impurezas ligadas à resina e ao polissacárido foram recuperadas no fluxo passante da coluna. A solução de polissacárido foi filtrada através de filtros de 0,2 pm em linha localizados antes e depois da coluna. 32 A solução de polissacárido foi concentrada utilizando um filtro com membrana MWCO de 30 kDa. O concentrado foi então diafiltrado com Água para Injecção (WFI, do inglês Water for Injection). A solução de polissacárido diafiltrada foi filtrada através de um filtro com membrana de 0,2 pm para dentro de garrafas de polipropileno. As amostras foram removidas para o teste de libertação e o polissacárido purificado foi armazenado congelado a -25° ±5 °C.

Caracterização

Os dados de RMN de 1H foram consistentes com a estrutura química pela atribuição de sinais atribuídos aos protões da molécula de polissacárido. O espectro de 1H-RMN mostrou uma série de sinais bem resolvidos (protões do grupo metilo) para a quantificação do grupo funcional 0-acetilo no polissacárido. A identidade do polissacárido monovalente foi confirmada por imunoeletroforese contracorrente utilizando anti-soros específicos.

Cromatografia de filtração em gel de alto desempenho acoplada com índice de refracção e detectores de espalhamento multiangular de luz a laser (MALLS) foi utilizada em conjunto com a concentração da amostra para calcular o peso molecular.

Cromatografia de exclusão por tamanho dos meios (CL-4B) foi utilizada para determinar o perfil da distribuição de tamanho molecular relativa do polissacárido.

Exemplo 2 33

Preparação do Conjugado Sacárido pneumocócico - CRMi97 do Serotipo 1

Activagão e conjugação

Recipientes de polissacárido purificado foram descongelados e combinados num vaso de reacção. Ao vaso foi adicionado carbonato de sódio 0,2 M, pH 9,0 para desacetilação parcial (hidrólise) durante 3 horas a 50 °C. A reacção foi arrefecida a 20 °C e a neutralização foi realizada por ácido acético 0,2 Μ. A oxidação na presença de periodato de sódio foi realizada por incubação a 2-8 °C, e a mistura foi agitada durante 15-21 horas. A mistura de reacção de activação foi concentrada e diafiltrada 10 vezes com NaCl a 0,9% utilizando uma membrana MWCO de 30 K. 0 retentado foi filtrado num filtro de 0,2 pm. O sacárido activado foi colocado dentro de garrafas de vidro de liofilização de 100 mL e congelado superficialmente (shell-frozen) a -75 °C e liofilizado. "Shell-freezing" é um método para a preparação de amostras para a liofilização (secagem por congelamento). Os frascos são automaticamente girados por rolos motorizados num banho refrigerado contendo álcool ou qualquer outro líquido apropriado. Uma fina camada do produto é congelada uniformemente em torno da "parede" interior de um balão, permitindo que um volume maior de material seja processado de forma segura durante cada ciclo de liofilização. Estas unidades automáticas de refrigeração, proporcionam um meio simples e eficaz de pré-congelamento de muitos frascos de uma 34 só vez, produzindo os revestimentos desejados na parte interna, e fornecendo área de superfície suficiente para uma liofilização eficiente.

Garrafas de material liofilizado foram levadas à temperatura ambiente e ressuspensas em solução de CRMi97 a uma proporção de sacárido/proteína de 2:1. À mistura de sacárido/proteína foi adicionado tampão fosfato de sódio 1 M a uma força iónica final de 0,2 M e um pH de 7,5, em seguida, foi adicionado cianoboro-hidreto de sódio. A reacção foi incubada a 23 °C durante 18 horas, seguido por uma segunda incubação a 37 °C durante 72 horas. Após as incubações de cianoboro-hidreto, a mistura de reacção foi diluída com solução salina fria, seguido pela adição de carbonato de sódio 1 M para ajustar a mistura de reacção ao pH 9,0. Os aldeídos que não reagiram foram neutralizados pela adição de boro-hidreto de sódio por incubação a 23 °C durante 3-6 horas. A mistura de reacção foi diluída duas vezes com solução salina e transferida através de um pré-filtro de 0,45-5 pm para um recipiente de retentado. A mistura de reacção é diafiltrada 30 vezes com tampão fosfato 0,15 M, pH 6, e 20 vezes com solução salina. O retentado foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm. A solução de conjugado foi diluída até um alvo de 0,5 mg/mL em solução salina a 0,9% e, em seguida esterilizada por filtração em contentores de concentrado em bruto final (FBC, do inglês Final Bulk Concentrate) num capuz Classe 100. 0 conjugado foi armazenado a 2-8° C.

Caracterização 35

Cromatografia de exclusão por tamanho dos meios (CL-4B) foi utilizada para determinar o perfil da distribuição de tamanho molecular relativa do conjugado. A identidade do conjugado foi confirmada pelo ensaio slot-blot utilizando anti-soros especificos.

As concentrações do sacárido e da proteína foram determinadas pelo ácido urónico e ensaios de Lowry, respectivamente. A proporção de sacárido para a proteína no complexo conjugado ligado covalentemente foi obtido pelo cálculo: pg/mL de sacárido Razão = ---------- pg/mL de proteína

0 teor de O-acetilo foi medido pelo método de Hestrin (Hestrin et. al., J. Biol. Chem. 1949, 180, p. 249). A proporção da concentração de O-acetilo para a concentração total de sacárido deu pmoles de O-acetilo por mg de sacárido.

Exemplo 3

Preparação do Polissacárido Capsular do Serotipo 3 de S. Pneumoniae

Preparação de Bancos de Células de Trabalho e Células

Mestras 36 O serotipo 3 de S. Pneumoniae foi obtido do Dr. Robert Austrian, Universidade da Pensilvânia, Filadélfia, Pensilvânia. Para a preparação do sistema de banco de células, ver o Exemplo 1.

Culturas do banco de células de trabalho foram utilizadas para inocular frascos de sementes contendo um meio à base de soja. Os frascos foram incubados a 36 °C ± 2 °C sem agitação até que as exigências de crescimento foram atendidas. Uma garrafa de semente foi utilizada para inocular um fermentador de sementes contendo meio à base de soja. Um pH de cerca de 7,0 foi mantido com solução estéril de carbonato de sódio. Depois da densidade óptica alvo ser atingida, o fermentador de sementes foi utilizado para inocular um fermentador de semente intermédio. Depois da densidade óptica alvo ser atingida, o fermentador de semente intermédio foi utilizado para inocular o fermentador de produção. 0 pH foi mantido com uma solução estéril de carbonato de sódio. A fermentação foi terminada depois que o volume de trabalho do fermentador foi atingido. Uma quantidade apropriada de desoxicolato de sódio estéril a 12% foi adicionada à cultura para lisar as células bacterianas e libertar os polissacáridos associados às células. Após a lise, o conteúdo do fermentador foi arrefecido. O pH do caldo de cultura lisado foi ajustado para um pH de aproximadamente 6,6 com ácido acético. O lisado foi clarificado por centrifugação de fluxo continuo seguido por filtração em profundidade e microfiltração por um filtro de 0,45 pm.

Purificação 37 A purificação do polissacárido pneumocócico consistiu em várias operações de concentrações/diafiltração, precipitação/eluição, cromatografia em coluna, e etapas de filtração em profundidade. Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que especificado em contrário. 0 caldo clarificado a partir das culturas do fermentador do serotipo 3 de S. pneumoniae foi concentrado e diafiltrado utilizando um filtro com membrana MWCO de 100 kDa. A diafiltração foi realizada utilizando tampão fosfato de sódio a um pH neutro. A diafiltração removeu os componentes médios de baixo peso molecular dos biopolimeros de maior peso molecular tais como ácido nucleico, proteína e polissacárido.

Antes da adição de brometo de hexadeciltrimetil amónio (HB) um volume calculado de uma solução-mãe de NaCl foi adicionado ao concentrado e solução de polissacárido diafiltrada para dar uma concentração final de 0,25 M de NaCl. 0 polissacárido foi então precipitado pela adição de HB de uma solução-mãe para dar uma concentração final de HB a 1% (p/v). O precipitado de polissacárido/HB foi capturado num filtro de profundidade e o filtrado foi descartado. O precipitado de polissacárido foi ressolubilizado e eluído por recirculação de uma solução de cloreto de sódio através do filtro de profundidade contendo o precipitado. Os filtros foram então lavados com solução adicional de cloreto de sódio.

Iodeto de sódio (Nal) foi adicionado à solução de polissacárido a partir de uma solução-mãe de Nal para atingir uma concentração final de 0,5% para precipitar o HB. O 38 precipitado foi removido por filtração em profundidade. 0 filtrado continha o polissacárido alvo. 0 vaso de precipitação e o filtro foram lavados com uma solução de NaCI/Nal e o lavado foi combinado com a solução de polissacárido parcialmente purificada. O filtro foi descartado. O polissacárido foi então filtrado através de um filtro de 0,2 pm. A solução de polissacárido foi concentrada num ultrafiltro com membrana MWCO de 30 kDa e diafiltrada com uma solução de cloreto de sódio. A solução de polissacárido parcialmente purificada foi ainda purificada por filtração através de um filtro de profundidade impregnado com carvão activado. Depois da filtração, o filtro de carvão foi lavado com uma solução de cloreto de sódio. O lavado foi combinado com a solução de polissacárido, que foi então filtrada através de um filtro de 0,2 pm. A solução de polissacárido foi concentrada num ultrafiltro com membrana MWCO de 30 kDa e ajustada com um tampão fosfato de sódio 1 M para atingir uma concentração final de 0, 025 M de fosfato de sódio. 0 pH foi verificado e ajustado em 7,0 ± 0,2. A coluna de cerâmica de hidroxiapatita (HA) foi equilibrada com tampão fosfato de sódio contendo cloreto de sódio para obter a condutividade apropriada (<15 pS) . A solução de polissacárido foi então carregada na coluna. Nestas condições, as impurezas ligadas à resina e ao polissacárido foram recuperadas no fluxo passante da coluna. A solução de polissacárido foi descarregada através da coluna com tampão e foi filtrada através de um filtro de 0,2 pm. 39 A solução de polissacárido foi concentrada utilizando um filtro com membrana MWCO de 30 kDa. O concentrado foi então diafiltrado com Água para Injecção (WFI). A solução de polissacárido diafiltrada foi filtrada através de um filtro com membrana de 0,2 pm para dentro de recipientes de aço inoxidável. As amostras foram removidas para o teste de libertação e o polissacárido purificado foi armazenado congelado a -25° ± 5 °C.

Caracterização

Os dados de RMN de 1H foram consistentes com a estrutura quimica pela atribuição de sinais atribuídos aos protões da molécula de polissacárido. A identidade do polissacárido monovalente foi confirmada por imunoeletroforese contracorrente utilizando anti-soros específicos.

Exemplo 4 40

Preparação do Conjugado Sacárido Pneumocócico - CRM197 do Serotipo 3

Activação e Conjugação

Recipientes de sacárido do serotipo 3 purificado foram descongelados e combinados num vaso de reacção. Ao vaso, foram adicionados WFI e carbonato de sódio 0,2 M até uma concentração final de sacárido de 0,2 M e 2 mg/mL. A temperatura da reacção foi elevada para 85 °C por uma hora para hidrolisar o polissacárido. A reacção foi arrefecida a <25 °C e cloreto de magnésio 1 M foi adicionado a uma concentração final de 0,01 M. A oxidação na presença de periodato de sódio foi realizada por incubação durante 16 -24 horas a 23 °C. A mistura de reacção de activação foi concentrada e diafiltrada 10 vezes com WFI utilizando uma membrana MWCO de 100 K. O retentado foi filtrado por um filtro de 0,2 pm.

Para a composição, fosfato de sódio 0,2 M, pH 7,0 foi adicionado ao sacárido activado até uma concentração final de 10 mM e um p H de 6,0-6,5. A proteina de transporte CRTMi97 foi misturada com a solução de sacárido a uma proporção de 2 g de sacárido para 1 g de CRMi97 . A solução combinada de sacárido/proteina foi colocada dentro de garrafas de liofilização de vidro de 100 mL com um enchimento alvo de 50 mL, foi congelada superficialmente (shell-frozen) a -75 °C e liofilizada. 41

Garrafas de material de sacárido/proteína co-liofilizado foram levadas à temperatura ambiente e ressuspensas em tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,0, até uma concentração final de sacárido de 20 mg/mL. O pH foi ajustado em 6,5 e depois um equivalente molar de 0,5 de cianoboro-hidreto de sódio foi adicionado. A reacção foi incubada a 3 7 °C durante 48 horas. Após a incubação com cianoboro-hidreto, a mistura de reacção foi diluida com succinato frio 5 mM /tampão salino a 0,9%. Os aldeídos que não reagiram foram neutralizados pela adição de boro-hidreto de sódio por incubação a 23 °C durante 3-6 horas. A mistura de reacção foi transferida através de um pré-filtro de 0,45-5 pm para um recipiente de retentado. A mistura de reacção foi diafiltrada 30 vezes com tampão fosfato 0,15 M, (pH 9), 20 vezes com tampão fosfato 0,15 Me 20 vezes com succinato 5 mM/solução salina a 0,9%. O retentado foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm. A solução de conjugado foi diluída até um alvo de sacárido de 0,5 mg/mL e, em seguida esterilizada por filtração em contentores FBC num capuz Classe 100. O conjugado foi armazenado a 2-8° C.

Caracterização

Cromatografia de exclusão por tamanho dos meios (CL-4B) foi utilizada para determinar o perfil da distribuição de tamanho molecular relativa do conjugado. 42 A identidade do conjugado foi confirmada pelo ensaio slot-blot utilizando anti-soros específicos.

As concentrações de sacárido e de proteína foram determinadas pelos ensaios de Anthrone e Lowry, respectivamente. A proporção de sacárido para a proteína no complexo conjugado ligado covalentemente foi obtido pelo cálculo: pg/mL de sacárido

Razão = -------------- pg/mL de proteína

Exemplo 5

Preparação do Polissacárido Capsular do Serotipo 5 de S. pneumoniae O serotipo 5 de S. pneumoniae foi obtido do Dr. Gerald Schiffman da Universidade Estadual de Nova Iorque, Brooklyn, Nova Iorque. Para a preparação do sistema de banco de células, ver o Exemplo 1. Para a fermentação, colheita, purificação e caracterização do polissacárido, ver o Exemplo 1.

Processo de Fermentação Alternativo

Culturas do banco de células de trabalho foram utilizadas para inocular frascos de sementes contendo um meio à base de soja e uma solução estéril de NaHCCc 10 mM. Os frascos foram incubados a 36 °C ± 2 °C sem agitação até que as 43 exigências de crescimento foram atendidas. Uma garrafa de semente foi utilizada para inocular um fermentador de sementes contendo meio à base de soja e uma solução estéril de NaHCCb 10 mM. Um pH de cerca de 7,0 foi mantido com NaOH 3 N. Depois da densidade óptica alvo ser atingida, o fermentador de sementes foi utilizado para inocular o fermentador de produção contendo meio à base de soja com uma concentração de 10 mM de NaHC03. O pH foi mantido com NaOH 3 N. A fermentação foi terminada após a cessação do crescimento ou quando o volume de trabalho do fermentador foi atingido. Uma quantidade apropriada de desoxicolato de sódio estéril a 12% foi adicionada à cultura para obter uma concentração de 0,12% no caldo, para lisar as células bacterianas e libertar os polissacáridos associados às células. Após a lise, o conteúdo do fermentador foi mantido, com agitação, durante um intervalo de tempo entre 8 e 24 horas a uma temperatura entre 7 °C e 13 °C para assegurar que ocorreu a completa lise celular e libertação de polissacárido. Agitação durante este período de espera impediu que o sedimento do lisado assentasse sobre as paredes do fermentador e a sonda de pH, permitindo assim que a integridade da sonda de pH fosse mantida. Em seguida, o pH do caldo de cultura lisado foi ajustado para um pH de aproximadamente 4,5 com 50% de ácido acético. Depois de um tempo de espera sem agitação, durante um intervalo de tempo entre 12 e 24 horas a uma temperatura entre 15 °C e 25 °C, uma porção significativa das proteínas previamente solúveis desprendeu-se da solução como um precipitado sólido, com pouca perda ou degradação do polissacárido, que permaneceu em solução. A solução com o precipitado foi então clarificada por centrifugação de fluxo 44 contínuo seguida por filtração em profundidade e microfiltração p0r um filtro de 0,45 pm.

Exemplo 6

Preparação do Conjugado Sacárido Pneumocócico - CRMi97 do Serotipo 5

Activação e Conjugação

Recipientes de sacárido do serotipo 5 foram descongelados e combinados num vaso de reacção. . Ao vaso, acetato de sódio 0,1 M, pH 4,7, foi adicionado seguido de oxidação na presença de periodato de sódio por incubação durante 16-22 horas a 23 °C. A mistura de reacção de activação foi concentrada e diafiltrada 10 vezes com WFI utilizando uma membrana MWCO de 100 K. O retentado foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm. O sacárido activado de serotipo 5 foi combinado com CRM197 numa proporção de 0,8:1. A solução combinada de sacárido/proteína foi colocada dentro de garrafas de vidro de liofilização de 100 mL (enchimento alvo de 50 mL) , congelada superficialmente (shell-frozen) a -75 °C e co-liofilizada.

Garrafas de material co-liofilizado foram levadas à temperatura ambiente e ressuspensas em tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,5, e cianoboro-hidreto de sódio foi adicionado. A reacção foi incubada a 30 °C durante 72 horas, 45 seguido por uma segunda adição de cianoboro-hidreto e incubada a 30 °C durante 20-28 horas.

Após as incubações em cianoboro-hidreto, a mistura de reacção foi diluída 2 vezes com solução salina e transferida através de um pré-filtro de 0,45-5 pm para um recipiente de retentado. A mistura de reacção foi diafiltrada 30 vezes com tampão de fosfato 0,01 M, pH 8, 20 vezes com tampão fosfato 0,15 M, pH 6, e 20 vezes com solução salina. O retentado foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm. A solução de conjugado foi diluída até um sacárido alvo de 0,5 mg/mL e, em seguida esterilizada por filtração em recipientes FBC num capuz Classe 100. 0 conjugado foi armazenado a 2-8 °C.

Para a caracterização do conjugado, ver o Exemplo 2.

Exemplo 7

Preparação do Polissacárido Capsular do Serotipo 6A de S. pneumoniae O serotipo 6A de S. pneumoniae foi obtido do Dr. Gerald Schiffman da Universidade Estadual de Nova Iorque, Brooklyn, Nova Iorque. Para a preparação do sistema de banco de células, ver o Exemplo 1. Para a fermentação, colheita, purificação e caracterização do polissacárido, ver o Exemplo 1, excepto que durante a purificação, é omitida a etapa de 46 concentração em membrana MWCO de 30 kDa, antes da etapa de cromatografia.

Exemplo 8

Preparação do Conjugado Sacárido Pneumocócico - CFMi97 do Serotipo 6A

Activação e Conjugação 0 polissacárido do serotipo 6A é um polimero de elevado peso molecular que tinha de ser reduzido em tamanho antes da oxidação. Recipientes de sacárido do serotipo 6A foram descongelados e combinados num vaso de reacção. Ao vaso, ácido acético 2 M foi adicionado a uma concentração final de 0,1 M para hidrólise durante 1,5 horas a 60 °C. A reacção foi arrefecida a 23 °C e a neutralização foi realizada pelo ajuste da mistura de reacção com NaOH 1 M ao pH 6. A oxidação na presença de periodato de sódio foi realizada por incubação a 23 °C durante 14-22 horas. A mistura de reacção de activação foi concentrada e diafiltrada 10 vezes com WFI utilizando uma membrana MWCO de 100 K. O retentado foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm. O serotipo 6A foi combinado com sacarose e colocado dentro de garrafas de vidro de liofilização de 100 mL (enchimento alvo de 50 mL) e congelado superficialmente (shell-frozen) a -75 °C e liofilizado. 47

Garrafas de material liofilizado foram levadas à temperatura ambiente e ressuspensas em dimetilsulfóxido (DMSO) a uma proporção de sacárido/proteina de 1:1. Após a adição de cianoboro-hidreto de sódio, a mistura de reacção foi incubada a 23 °C durante 18 horas. Após a incubação em cianoboro-hidreto, a mistura de reacção foi diluída com solução salina fria. Os aldeídos que não reagiram foram neutralizados pela adição de boro-hidreto de sódio por incubação a 23 °C durante 3 a 20 horas. A mistura de reacção diluída foi transferida através de um pré-filtro de 5 pm para um recipiente de retentado. A mistura de reacção foi diafiltrada 10 vezes com NaCl a 0,9% e 30 vezes com NaCl tamponado com succinato. O retentado foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm. A solução de conjugado foi diluída até um sacárido alvo de 0,5 mg/mL e, em seguida esterilizada por filtração em recipientes FBC num capuz Classe 100. 0 conjugado foi armazenado a 2-8 °C.

Para a caracterização do conjugado, ver o Exemplo 2. Exemplo 9

Preparação do Polissacárido Capsular do Serotipo 7F de S. pneumoniae O serotipo 7F de S. pneumoniae foi obtido do Dr. Gerald Schiffman da Universidade Estadual de Nova Iorque, Brooklyn, 48

Nova Iorque. Para a preparação do sistema de banco de células e para a fermentação e colheita do polissacárido, ver Exemplo 3. Para um processo de fermentação e colheita alternativo, ver o processo alternativo descrito no Exemplo 1.

Purificação A purificação do polissacárido pneumocócico consistiu em várias operações de concentração/diafiltração, precipitação/eluição, cromatografia em coluna, e etapas de filtração em profundidade. Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que especificado em contrário. 0 caldo clarificado a partir das culturas do fermentador do serotipo 7F de S. pneumoniae foi concentrado e diafiltrado utilizando um filtro com membrana MWCO de 100 kDa. A diafiltração foi realizada utilizando tampão fosfato de sódio a um pH neutro. A diafiltração removeu os componentes médios de baixo peso molecular dos biopolimeros de maior peso molecular tais como ácido nucleico, proteina e polissacárido. O serotipo 7F não forma um precipitado com HB. Em vez disso, as impurezas foram precipitadas da solução concentrada e diafiltrada, adicionando o HB de uma solução-mãe a uma concentração final de HB a 1%. O precipitado foi capturado num filtro de profundidade e o filtro foi descartado. O polissacárido estava contido no filtrado. 49

Iodeto de sódio (Nal) foi adicionado à solução de polissacárido a partir de uma solução-mãe de Nal para atingir uma concentração final de 0,5% para precipitar o HB. O precipitado foi removido por filtração em profundidade. 0 filtrado continha o polissacárido alvo. O vaso de precipitação e o filtro foram lavados com uma solução de NaCl/Nal e os lavados foram combinados com a solução de polissacárido parcialmente purificado. O filtro foi descartado. O polissacárido foi então filtrado através de um filtro de 0,2 pm. A solução de polissacárido foi concentrada num ultrafiltro com membrana MWCO de 30 kDa e diafiltrada com uma solução de cloreto de sódio. A solução de polissacárido parcialmente purificada foi ainda purificada por filtração através de um filtro de profundidade impregnado com carvão activado. Após a filtração, o filtro de carvão foi lavado com uma solução de cloreto de sódio. O lavado foi combinado com a solução de polissacárido, que foi então filtrada através de um filtro de 0,2 pm. A solução de polissacárido foi concentrada num ultrafiltro com membrana MWCO de 30 kDa e ajustada com um tampão fosfato de sódio 1 M para atingir uma concentração final de fosfato de sódio de 0,025 Μ. O pH foi verificado e ajustado em 7,0 ± 0,2. A coluna de cerâmica de hidroxiapatita (HA) foi equilibrada com tampão fosfato de sódio contendo cloreto de 50 sódio para obter a condutividade apropriada (< 15 pS) . A solução de polissacárido foi então carregada na coluna. Nestas condições, as impurezas ligadas à resina e ao polissacárido foram recuperadas no fluxo passante da coluna. A solução de polissacárido foi descarregada através da coluna com tampão e foi filtrada através de um filtro de 0,2 pm. A solução de polissacárido foi concentrada utilizando um filtro com membrana MWCO de 30 kDa. O concentrado foi então diafiltrado com WFI. A solução de polissacárido diafiltrada foi filtrada através de um filtro com membrana de 0,2 pm para dentro de recipientes de aço inoxidável. As amostras foram removidas para o teste de libertação e o polissacárido purificado foi armazenado a 2-8 °C.

Para a caracterização do polissacárido, ver o Exemplo 3. Exemplo 10

Preparação do Conjugado Sacárido Pneumocócico - CRM197 do Serotipo 6A

Activação e Conjugação A oxidação na presença de periodato de sódio foi realizada por incubação durante 16-24 horas a 23 °C. 51 A mistura de reacção de activação foi concentrada e diafiltrada 10 vezes com NaOAc 10 mM, pH 4,5, utilizando uma membrana MWCO de 100 K. O retentado foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm. O serotipo 7F foi colocado dentro de garrafas de vidro de liofilização de 100 mL (preenchimento alvo de 50 mL) e congelado superficialmente (shell-frozen) a -75 °C e liofilizado.

Garrafas de serotipo 7F liofilizado e CRM197 foram levadas à temperatura ambiente e ressuspensas em DMSO a uma proporção de sacárido/proteina de 1,5:1. Após a adição de boro-hidreto de sódio, a reacção foi incubada a 23 °C durante 8-10 horas. Os aldeídos que não reagiram foram neutralizados por meio da adição de boro-hidreto de sódio por incubação a 23 °C durante 16 horas. A mistura de reacção foi diluída 10 vezes com solução salina fria e transferida através de um pré-filtro de 5 pm para um recipiente de retentado. A mistura de reacção foi diafiltrada 10 vezes com solução salina a 0,9% e 30 vezes com solução salina tamponada com succinato. 0 retentado foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm. A solução de conjugado foi diluída até um alvo de sacárido de 0,5 mg/mL solução salina a 0,9% e, em seguida esterilizada por filtração em recipientes FBC num capuz Classe 100. O conjugado foi armazenado a 2-8 °C. 52

Para a caracterização do conjugado, ver o Exemplo 4.

Exemplo 11

Preparação de Polissacárido Capsular do Serotipo 19A de S. pneumoniae 0 serotipo 19A de S. pneumoniae foi obtido do Dr. Gerald Schiffman da Universidade Estadual de Nova Iorque, Brooklyn, Nova Iorque. Para a preparação do sistema de banco de células, ver o Exemplo 1. Para fermentação, colheita e purificação do polissacárido, ver o Exemplo 7. Para caracterização, ver o Exemplo 3.

Exemplo 12

Preparação do Conjugado Sacárido Pneumocócico - CRMi97 do Serotipo 19A

Activação e Conjugação

Recipientes de sacárido do serotipo 19A foram descongelados e combinados num vaso de reacção. Acetato de sódio foi adicionado a 10 mM e a oxidação foi realizada na presença de periodato de sódio por incubação por 16-24 horas a 23 °C. A mistura de reacção de activação foi concentrada e diafiltrada 10 vezes com acetato 10 mM, pH 5,0, utilizando uma 53 membrana MWCO de 100 K. O retentado foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm. O sacárido activado foi combinado com sacarose seguido pela adição de CRMi97. A mistura de sacárido activado do serotipo 19A e CRMi97 (proporção de 0,8:1) foi colocada dentro de garrafas de vidro de liofilização de 100 mL (enchimento alvo de 50 mL) e congelada superficialmente (shell-frozen) a -75 °C e liofilizada.

Garrafas de material liofilizado foram levadas à temperatura ambiente e ressuspensas em (DMSO). À mistura de sacárido/proteína, foi adicionado cianoboro-hidreto de sódio (100 mg/mL). A reacção foi incubada a 23 °C durante 15 horas. Após a incubação em cianoboro-hidreto, os aldeídos que não reagiram foram neutralizados pela adição de boro-hidreto de sódio por incubação a 23 °C durante 3 a 20 horas. A mistura de reacção foi diluída 10 vezes com solução salina fria e transferida através de um pré-filtro de 5 pm para um recipiente de retentado. A mistura de reacção foi diafiltrada 10 vezes com NaCl a 0,9%, filtrada num filtro de 0,45 pm, e 30 vezes com diafiltração utilizando succinato 5 mM/tampão NaCl a 0,9%, pH 6. O retentado foi filtrado através de um filtro de 0,2 pm. A solução de conjugado foi diluída até um alvo de 0,5 mg/mL utilizando succinato 5 mM/solução salina a 0,9% e, em seguida esterilizada por filtração em recipientes FBC num capuz Classe 100. O conjugado foi armazenado a 2-8 °C. 54

Para a caracterização do conjugado, ver o Exemplo 4. Exemplo 13

Preparação de Polissacárido Capsular dos Serotlpos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F de S. pneumoniae

Preparação da Cultura de Semente de S. Pneumoniae

Os serotipos 4, 6B, 9V, 18C 19C e 23F de S. pneumoniae foram obtidos do Dr. Gerald Schiffman da Universidade Estadual de Nova Iorque, Brooklyn, Nova Iorque. 0 serotipo 14 de S. pneumoniae foi obtido da ATCC, estirpe 6314.

Separadamente, foi utilizado um frasco de cada um dos serotipos desejados de Streptococcus pneumoniae para iniciar um lote de fermentação. Dois frascos contendo um meio à base de soja e vermelho de fenol foram ajustados para uma gama de pH de 7,4 ± 0,2 utilizando carbonato de sódio, e o volume necessário de solução de dextrose a 50%/sulfato de magnésio a 1% foi então adicionado às garrafas. Os dois frascos foram inoculados com quantidades diferentes de sementes. Os frascos foram incubados a 36° ±2 °C até que o meio ficasse amarelo. Após a incubação, as amostras foram removidas de cada frasco e testadas quanto à densidade óptica (OD) (0,3 a 0,9) e pH (4,6 a 5,5). Uma das duas garrafas foi seleccionada para inoculação do fermentador de semente. 55 0 meio à base de soja foi transferido para o fermentador de semente e esterilizado. Em seguida, um volume de solução de dextrose a 50%/ sulfato de magnésio a 1% foi adicionado ao fermentador. 0 pH e a agitação do fermentador de semente foram monitorizados e controlados (pH 6,7 a 7,4). A temperatura foi mantida a 36° ± 2 °C. O inoculo de semente (frasco) foi conectado de forma asséptica ao fermentador de semente e o inoculo foi transferido. O fermentador foi mantido em controlo de pH e amostras foram periodicamente removidas e testadas quanto a Densidade Óptica e pH. Quando a densidade óptica desejada de 0,5 a 600 nm foi atingida, o fermentador intermédio foi inoculado com o caldo de fermentação do fermentador de semente. O meio à base de soja foi transferido para o fermentador intermédio e esterilizado. Em seguida, um volume de solução de dextrose a 50%/sulfato de magnésio a 1% foi adicionado ao fermentador. O pH e a agitação do fermentador de produção foram monitorizados e controlados (pH 6,7 a 7,4) . A temperatura foi mantida a 36 ° + 2 °C. O conteúdo do fermentador de semente foi transferido para o fermentador intermédio. O fermentador foi mantido em controlo do pH e as amostras foram periodicamente removidas e testadas quanto a OD e pH. Quando a densidade óptica desejada de 0,5 a 600 nm foi atingida, o fermentador de produção foi inoculado com o caldo de fermentação do fermentador intermédio. O meio à base de soja foi transferido para o fermentador de semente e esterilizado. Em seguida, um volume de solução de dextrose a 50%/sulfato de magnésio a 1% foi 56 adicionado ao fermentador. O pH e a agitação do fermentador de produção foram monitorizados e controlados (pH 6,7 a 7,4). A temperatura foi mantida a 36° ± 2 °C. O fermentador foi mantido em controlo do pH e as amostras foram periodicamente removidas e testadas quanto a OD e pH até que a fermentação estivesse completa.

Deoxicolato de sódio foi adicionado ao fermentador até uma concentração final de cerca de 0,12% p/v. A cultura foi misturada durante um mínimo de trinta minutos e o ponto de ajuste de temperatura foi reduzida para 10 °C. A cultura foi incubada de um dia para o outro e após confirmação da inactivação, o pH da cultura foi ajustado para entre 6,4 e 6,8, conforme necessário, com ácido acético a 50%. A temperatura do fermentador foi aumentada para 20 ° ± 5 °C e o conteúdo foi transferido para o tanque de espera de clarificação. 0 conteúdo do tanque de espera de clarificação (incluindo os detritos celulares) foi processado através de uma centrífuga, a um caudal entre 25 e 600 litros por hora (excepto o serotipo 4, em que os detritos de células foram descartados e o caudal reduzido para entre 25 e 250 litros por hora). As amostras do sobrenadante foram removidas e testadas quanto a OD. A densidade óptica desejada durante a centrifugação foi de ^0,15.

Inicialmente, o sobrenadante foi recirculado através de uma montagem de filtro de profundidade até que uma OD de 0,05 ± 0,03 foi alcançada. Em seguida, o sobrenadante foi passado 57 através da montagem de filtro de profundidade e através de um filtro com membrana de 0,45 pm filtro para o tanque de espera do filtrado.

Subsequentemente, o produto foi transferido através de tubos fechados para a área de purificação para processamento.

Todas as operações acima (centrifugação, filtração e transferência) foram realizadas entre 10 °C a 30 °C.

Para uma fermentação e processo de colheita alternativos para os serotipos 4 e 6B, ver o processo alternativo descrito no Exemplo 1.

Purificação A purificação de cada polissacárido pneumocócico consistiu em várias operações de concentrações/diafiltração, precipitação/eluição, cromatografia em coluna, e etapas de filtração profunda. Todos os procedimentos foram realizados à temperatura ambiente, a menos que especificado em contrário. O caldo clarificado das culturas do fermentador do serotipo de S. pneumoniae desejado foi concentrado e diafiltrado usando um filtro de MWCO de 100 kDa. A diafiltração foi realizada utilizando tampão fosfato de sódio a um pH <9,0. A diafiltração removeu os componentes médios de baixo peso molecular dos biopolimeros de maior peso molecular tais como ácido nucleico, proteína e polissacárido. 58 0 polissacárido foi precipitado da solução concentrada e diafiltrada pela adição de HB a partir de uma solução-mãe para dar uma concentração final de HB a 1% (p/v) (excepto o Serotipo 23F, que tinha uma concentração final de 2,5%). 0 precipitado de polissacárido/HB foi capturado num filtro de profundidade e o filtrado foi descartado. (Nota: o Serotipo 14 não precipita; por conseguinte, o filtrado foi retido). 0 precipitado do polissacárido foi resolubilizado e eluido por recirculação de uma solução de cloreto de sódio através do filtro de profundidade contendo o precipitado. Os filtros foram então lavados com solução adicional de cloreto de sódio.

Iodeto de sódio (Nal) foi adicionado à solução de polissacárido a partir de uma solução-mãe de Nal para atingir uma concentração final de 0,5% para precipitar HB (excepto para o Serotipo 6B, que tinha uma concentração final de 0,25%). O precipitado foi removido por filtração em profundidade. O filtrado continha o polissacárido alvo. O filtro foi descartado. O polissacárido foi então filtrado através de um filtro de 0,2 pm. A solução de polissacárido foi concentrada num ultrafiltro com membrana MWCO de 30 kDa e diafiltrada com uma solução de cloreto de sódio. A solução de polissacárido parcialmente purificada foi ainda purificada por filtração através de um filtro de profundidade impregnado com carvão activado. Após filtração, o filtro de carvão foi lavado com uma solução de cloreto de 59 sódio. 0 lavado foi combinado com a solução de polissacárido, que foi então filtrada através de um filtro de 0,2 pm. A solução de polissacárido foi concentrada num ultrafiltro com membrana MWCO de 30 kDa e o filtro foi lavado com uma solução de cloreto de sódio. O pH foi verificado e ajustado para 7,0 ± 0,3. A coluna de cerâmica de hidroxiapatita (HA) foi equilibrada com tampão fosfato de sódio contendo cloreto de sódio até um pH de 7,0 ± 0,3 e a condutividade era de 26 ± 4 pS. A solução de polissacárido foi então carreqada na coluna. Nessas condições, as impurezas liqadas à resina e ao polissacárido foram recuperadas no fluxo passante da coluna. A solução de polissacárido foi filtrada através de um filtro de 0,2 pm. A solução de polissacárido foi concentrada utilizando um filtro com membrana MWCO de 30 kDa. 0 concentrado foi então diafiltrado com WFI até que a condutividade fosse de <15 pS. A solução de polissacárido diafiltrada foi filtrada através de um filtro com membrana de 0,2 pm em grandes recipientes e armazenada a 2-8 °C.

Exemplo 14

Preparação de Conjugados de Sacárido Pneumocócico -CRM197 para os Serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F 60

Processo de Activação

Os sacáridos de diferentes serotipos seguem vias diferentes para a activação (hidrólise ou sem hidrólise antes da activação) e conjugação (reacções aquosas ou DMSO), como descrito neste exemplo. O polissacárido foi transferido dos grandes recipientes para o recipiente do reactor. 0 polissacárido foi então diluído em WFI e fosfato de sódio até uma gama de concentração final de 1,6-2,4 mg/mL.

Etapa 1.

Para os serotipos 6B, 9V, 14, 19F e 23F, o pH foi ajustado ao pH 6,0 ± 0,3.

Para o serotipo 4, ácido clorídrico (concentração final do ácido de 0,01 M) foi adicionado e a solução foi incubada durante 25-35 minutos a 45° ± 2 °C. A hidrólise foi parada por arrefecimento a 21-25 °C e adição de fosfato de sódio 1 M até um alvo de pH 6,7 ± 0,2. Foi realizado um teste durante o processo para confirmar um nível apropriado de despiruvilação.

Para o serotipo 18C, ácido acético glacial

(concentração final do ácido de 0,2 M) foi adicionado e a solução foi incubada durante 205-215 minutos a 94 ° ± 2 °C. A 61 temperatura foi então reduzida para 21-25 °C e fosfato de sódio 1-2 M foi adicionado até um alvo de pH 6,8 ± 0,2.

Etapa 2: Reacção com Periodato

Os equivalentes molares de periodato de sódio necessários para a activação pneumocócica foram determinados utilizando o conteúdo total de sacárido (excepto para o serotipo 4). Para o serotipo 4, foi utilizada uma proporção de 0,8-1,2 moles de periodato de sódio por mole de sacárido. Com mistura completa, a reacção de oxidação foi deixada prosseguir entre 16 a 20 horas a 21-25 °C para todos os serotipos excepto 19F para o qual a temperatura foi de ^15 °C.

Etapa 3: Ultra filtração O sacárido oxidado foi concentrado e diafiltrado com WFI (tampão fosfato de sódio 0,01 M, pH 6,0 para o serotipo 19F) num ultrafiltro com membrana MWCO de 100 kDa (ultrafiltro de 5 kDa para 18C) . O permeato foi descartado e o retentado foi filtrado através de um filtro de 0,22 pm.

Etapa 4: Liofilização

Para os serotipos 4, 9V, e 14 o sacárido concentrado foi misturado com a proteína de transporte CRM197, colocado dentro de garrafas de vidro, congelado superficialmente {shell-frozen) e armazenado a <65 °C. O concentrado sacárido-CRMi97 congelado foi liofilizado e, em seguida, armazenado a -25° ± 5 °C. 62

Para os serotipos 6B, 19F e 23F uma quantidade especificada de sacarose foi adicionada a qual foi calculada para atingir uma concentração de sacarose de 5% ± 3% na mistura de reacção da conjugação. 0 serotipo 18C não necessita adição de sacarose. 0 sacárido concentrado foi então colocado dentro de frascos de vidro, congelado superficialmente (shell-frozen) e armazenado a <65 °C. 0 sacárido concentrado congelado foi liofilizado e, em seguida, armazenado a -25° ± 5 °C.

Processo de Conjugação

Foram utilizados dois processos de conjugação: conjugação aquosa para os serotipos 4, 9V, 14 e 18C, e conjugação com DMSO para os serotipos 6B, 19F e 23F.

Conjugação aquosa

Etapa 1: Dissolução

Para os serotipos 4, 9V e 14, a mistura sacárido-CRMi97 liofilizada activada foi descongelada e equilibrada à temperatura ambiente. 0 sacárido-CRM197 liofilizado activado foi então reconstituído em tampão fosfato de sódio 0,1 M a uma proporção típica de:

• 1 L de tampão por 16-24 g de sacárido para os serotipos 4 e 9V • 1 L de tampão por 6-10 g de sacárido para o serotipo 14 63 A mistura de reacção foi incubada a 37° ± 2 °C, até a dissolução total para o serotipo 9V e a 23° ± 2o C para os serotipos 4 e 14.

Para o serotipo 18C, o sacárido liofilizado foi reconstituído numa solução de CRM197 em fosfato de sódio dibásico 1 M numa proporção típica de 0, 11 L de fosfato de sódio para 1 L de solução de CRM197 · A mistura de reacção (concentração de sacárido de 8-12 g/L) foi incubada a 23° ± 2 °C até à dissolução total. 0 pH foi testado como um controlo durante o processo nesta fase.

Etapa 2: Reacção de Conjugação

Para os serotipos 4 e 9V, a reacção de conjugação foi iniciada pela adição da solução de cianoboro-hidreto de sódio (100 mg/mL) para atingir 1,0-1,4 moles de cianoboro-hidreto de sódio por mole de sacárido. A mistura de reacção foi incubada durante 44-52 horas a 37° ± 2 °C. A temperatura foi então reduzida para 23° ± 2 °C e cloreto de sódio a 0,9% foi adicionado ao reactor. Solução de boro-hidreto de sódio (100 mg/mL) foi adicionada para atingir 1, 8-2,2 equivalentes molares de boro-hidreto de sódio por mole de sacárido. A mistura foi incubada durante 3-6 horas a 23° ± 2 °C. A mistura foi diluída com cloreto de sódio a 0,9% e o reactor foi lavado. A mistura de conjugação diluida foi filtrada 6 4 utilizando um pré-filtro de 1,2 pm para dentro de um vaso de espera.

Para os serotipos 14 e 18C, a reacção de conjugação foi iniciada pela adição da solução de cianoboro-hidreto (100 mg/mL) para atingir 1,0-1,4 moles de cianoboro-hidreto de sódio por mole de sacárido. A mistura de reacção foi incubada durante 12-24 horas a 23° ± 2 °C. A temperatura foi aumentada para 37° ±2 °C e a reacção foi incubada durante 72-96 horas. A temperatura foi então reduzida para 23° ± 2 °C e cloreto de sódio a 0,9% foi adicionado ao reactor. Solução de boro-hidreto de sódio (100 mg/mL) foi adicionada para atingir 1,8-2,2 equivalentes molares de boro-hidreto de sódio por mole de sacárido. A mistura foi incubada durante 3-6 horas a 23° ± 2 °C. A mistura foi diluida com cloreto de sódio a 0,9% e o reactor foi lavado. A mistura de conjugação diluida foi, em seguida, filtrada utilizando um pré-filtro de 1,2 pm para dentro de um vaso de espera.

Etapa 3: Ultra filtração com membrana de 100 kDa A mistura de conjugação diluida foi concentrada e diafiltrada num ultrafiltro com membrana MWCO de 100 kDa com um minimo de 15 volumes (serotipo 4) ou 40 volumes (serotipos 9V, 14, e 18C) de cloreto de sódio a 0,9%. O permeato foi descartado.

Para o serotipo 4, o retentado foi filtrado através de um filtro de 0,45 pm. 65

Nesta fase foi realizado um controlo durante o processo (teor de sacárido).

Etapa 4: purificação em coluna de HA

Esta etapa foi realizada somente para o conjugado do serotipo 4. A coluna de HA foi primeiro neutralizada utilizando tampão de fosfato de sódio 0,5 M (pH 7,0 ± 0,3) e em seguida equilibrada com cloreto de sódio a 0,9%. O retentado filtrado (serotipo 4) foi carregado na coluna a um caudal de 1,0 Umin. A coluna foi lavada com cloreto de sódio a 0,9% a um caudal de ^2,0 Umin. O produto foi então eluido com tampão fosfato de sódio 0,5 M a um caudal de ^2,0 Umin. A fracção de HA foi então concentrada e diafiltrada numa membrana MWCO de 100 kDa com um minimo de 20 volumes de cloreto de sódio a 0,9%. 0 permeado foi descartado.

Etapa 5: Filtração Estéril O retentado após a diafiltração com membrana MWCO de 100 kDa foi filtrado através de um filtro de 0,22 pm. Foram realizados controlos no produto filtrado durante o processo (teor de sacárido, proteína livre, sacárido livre e cianeto). Foram realizados controlos no retentado filtrado durante o processo para determinar se a concentração, diafiltração e/ou de diluição adicionais eram necessárias para cumprir os 66 objectivos de FBC. Estes testes adicionais foram repetidos em amostras de FBC.

Conforme necessário, o conjugado filtrado foi diluído com cloreto de sódio a 0,9%, a fim de obter uma concentração final inferior a 0,55 g/L. Nesta fase foram realizados testes de libertação quanto ao teor de sacárido, teor de proteína e proporção de sacárido:proteína.

Finalmente, o conjugado foi filtrado (0,22 pm) e colocado dentro de recipientes de aço inoxidável de 10 L a uma quantidade típica de 2,64 g/recipiente. Nesta fase, o rendimento, o teor de sacáridos, teor de proteína, pH, proporção de sacárido :proteína e teor de lisina foram realizados como controlos durante o processo. Nesta fase foram realizados testes de libertação (aparência, proteína livre, sacárido livre, endotoxina, determinação de tamanho molecular, cianeto residual, identidade do sacárido, identidade da CRMi97) .

Conjugação com DMSO

Etapa I: Dissolução O sacárido liofilizado activado dos serotipos 6B, 19F, 23F e a proteína de transporte CRM197 liofilizada foram equilibrados à temperatura ambiente e reconstituídos em DMSO. A concentração de dissolução tipicamente variou de 2-3 gramas de sacárido (2-2,5 g de proteína) por litro de DMSO. 67

Etapa II: Reacçao de Conjugação 0 sacárido activado e a proteína de transporte CRMi97 foram misturados por 60-75 minutos a 23° ± 2 °C a uma proporção na gama de 0,6 g-1,0 g de sacárido/g de CRM197 para os serotipos 6B e 19F ou 1,2 a 1,8 g de sacárido/g de CRM197 para o serotipo 23F. A reacção de conjugação foi iniciada pela adição da solução de cianoboro-hidreto de sódio (100 mg/mL) a uma proporção de 0,8-1,2 de equivalentes molares de cianoboro-hidreto de sódio para um mole de sacárido activado. WFI foi adicionada à mistura de reacção até um alvo de 1% (v/v) e a mistura foi incubada durante mais de 40 horas a 23 °± 2 °C.

Uma solução de boro-hidreto de sódio, 100 mg/mL (equivalentes molares típicos de 1,8-2,2 de boro-hidreto de sódio por mole de sacárido activado) e WFI (meta 5% v/v) foram adicionados à reacção e a mistura foi incubada durante 3-6 horas em 23 a 23 °± 2 °C. Este procedimento reduziu quaisquer aldeídos que não reagiram presentes nos sacáridos. Em seguida a mistura de reacção foi transferida para um tanque de diluição contendo cloreto de sódio a 0,9% a <15 °C.

Etapa C. III: Ultra filtração com membrana de 100 kDa A mistura conjugada diluída foi filtrada através de um filtro de 1,2 pm e concentrada e diafiltrada numa membrana MWCO de 100 kDa com um mínimo de 15 volumes de cloreto de sódio a 0,9% (fosfato de sódio 0,01 M/NaCl tampão 0,05 M foi 68 utilizado para o serotipo 23F). 0 permeado foi descartado. 0 retentado foi filtrado através de um filtro de 0,45 pm. Nesta fase foi tomada uma amostra de teor de sacárido durante o processo.

Etapa IV: Purificação em Coluna de DEAE

Esta etapa foi realizada somente para o serotipo 23F. A coluna de DEAE foi equilibrada com tampão fosfato de sódio 0,01 M/cloreto de sódio 0,05 Μ. O retentado filtrado (serotipo 23F), foi carregado na coluna e lavado com tampão fosfato de sódio 0,01 M/cloreto de sódio 0,05 Μ. A coluna foi então lavada com tampão fosfato de sódio 0,01 M/NaCl a 0,9%. O produto foi então eluido com tampão fosfato de sódio 0,01 M/cloreto de sódio 0,5 M.

Etapa V: Ultra filtração com membrana de 100 kDa O retentado de 6B e 19F foi concentrado e diafiltrado com pelo menos 30 volumes de cloreto de sódio a 0,9%. O permeado foi descartado. O eluato do serotipo 23F foi concentrado e diafiltrado com um minimo de 20 volumes de cloreto de sódio a 0,9%. O permeado foi descartado.

Etapa VI: Filtração Estéril 69 O retentado após a diafiltração com membrana MWCO de 100 kDa foi filtrado através de um filtro de 0,22 pm. Controlos durante o processo (teor de sacárido, proteina livre, sacárido livre DMSO residual e cianeto residual) foram realizados no produto filtrado. Controlos durante o processo foram realizados no retentado filtrado para determinar se concentração, diafiltração e/ou de diluição adicionais eram necessárias para cumprir os objectivos de FBC. Estes testes adicionais foram repetidos em amostras de FBC.

Conforme necessário, o conjugado filtrado foi diluido com cloreto de sódio a 0,9%, a fim de obter uma concentração final inferior a 0,55 g/L. Nesta fase foram realizados testes de libertação quanto ao teor de sacárido, teor de proteina e proporção de sacárido:proteina.

Finalmente, o conjugado foi filtrado (0,22 pm) e colocado dentro de recipientes de aço inoxidável de 10 L a uma quantidade de 2,64 g/recipiente. Nesta fase, o rendimento, o teor de sacáridos, teor de proteina proporção de sacárido:proteina e teor de lisina realizados como controlos durante o processo. Nesta fase foram realizados testes de libertação (aparência, proteina livre, sacárido livre, endotoxina, determinação de tamanho molecular, cianeto residual, identidade do sacárido, identidade da CRMi97) .

Exemplo 15 70

Formulação de uma Vacina Pneumocócica Conjugada Polivalente

Os concentrados em bruto finais dos 13 conjugados contêm 0,85% de cloreto de sódio. Os concentrados em bruto tipo 3, 6A, 7F e 19A também contêm tampão succinato de sódio 5 mM ao pH 5,8. Os volumes necessários de concentrados em bruto foram calculados com base no volume do lote e as concentrações de sacáridos em bruto. Depois de 80% do cloreto de sódio a 0,85% (soro fisiológico) e a quantidade necessária de tampão succinato terem sido adicionados ao vaso de formulação pré-rotulado, os concentrados em bruto foram adicionados. A preparação foi então submetida a esterilização por filtração através de uma membrana de 0,22 pm para um segundo recipiente utilizando uma unidade de filtro com membrana Millipore Durapore. O primeiro recipiente foi lavado com os 20% restantes de cloreto de sódio a 0,85% e a solução foi passada através do mesmo filtro e recolhida para dentro do segundo recipiente. O volume formulado foi misturado suavemente durante e após a adição de fosfato de alumínio em bruto. O pH foi verificado e ajustado, se necessário. O produto em bruto formulado foi armazenado a 2-8 °C. O produto em bruto formulado foi colocado dentro de seringas de vidro de borosilicato Tipo 1 obtidos da Becton Dickinson. A vacina foi monitorizada a intervalos regulares quanto a turvação para garantir a uniformidade da operação de enchimento. A vacina enchida (produto final) foi armazenada a 2-8 °C. 71

Exemplo 16

Imunogenicidade da Vacina Conjugada 13-valente

Até à data, os estudos pré-clínicos realizados sobre a vacina 13vPnC têm sido em coelhos. Os estudos #HT01-0021 e #HT01-0036 foram concebidos para examinar de forma independente o efeito da conjugação química de polissacáridos capsulares (PSs) de 5. pneumoniae a CRM197 e o efeito do adjuvante fosfato de alumínio (AIPO4) sobre a resposta imunológica à vacina 13vPnC em coelhos. Estes efeitos foram caracterizados por ELISA antigénio-específico para as concentrações séricas de IgG e para a função de anticorpos por ensaio opsonofagocítico (OPA).

Estudo ΦΗΤ01 -0021 0 estudo #HT01-0021 examinou a capacidade da vacina 13vPnC com o adjuvante AIPO4 para eliciar respostas imunes específicas ao serotipo da vacina. Os serotipos pneumocócicos representados na vacina 13vPnC incluem os tipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 1801 19A, 19F e 23F. Os objectivos secundários incluíam uma avaliação da cinética e a duração da resposta de anticorpos. Coelhos brancos da Nova Zelândia foram imunizados por via intramuscular na semana 0 e semana 2 com a dose clínica humana planeada de cada polissacárido (2 pg de cada PS, excepto 4 pg de 6B) formulado com ou sem AIPO4 (100 pg/dose). Os soros foram colectados em vários pontos temporais. O serotipo IgG-específico foi medido por ELISA e a actividade funcional foi avaliada por OPA. 72 0 Quadro 3 mostra o título médio geométrico (GMT) obtido em amostras de soro combinadas, na sequência de duas doses da vacina 13vPnC. Uma proporção de IgG GMTs foi utilizada para comparar as respostas da semana 4 à semana 0. Estes dados demonstram que a inclusão de AlPCg na formulação de 13vPnC elicitou níveis mais elevados de anticorpo IgG em comparação com a mesma vacina sem adjuvante. Embora as respostas de anticorpos fossem maiores quando o AlPCg foi incluído na formulação, estes aumentos não foram estatisticamente significativos.

As respostas de anticorpos funcionais foram também avaliadas em coelhos após a imunização com as duas formulações de 13vPnC (Quadro 4) . Ao comparar as formulações de vacinas com ou sem adjuvante, GMTs OPA mais elevados foram observados no grupo de tratamento da vacina 13vPnC + AIPO4. Títulos OPA foram detectados nas combinações de soros da semana 4 de todos os serotipos de vacinas em ambos os grupos. Para a maioria dos serotipos, os títulos de OPA medidos na semana 4 eram pelo menos 4 vezes mais elevados do que aqueles na semana 0 (linha de base).

As respostas cinéticas para cada um dos serotipos da vacina 13vPnC foram avaliados a partir de combinações de soro de ambos os grupos de tratamento. Titulos de IgG para cada serotipo foram medidos a partir de sangue colhido na semana 0 e semanas 1, 2, 3, 4, 8, 12, 26, e 39 e depois comparados. Com a excepção do serotipo 1, as respostas de anticorpos em animais que receberam a vacina com adjuvante foram superiores 73 aos que receberam a vacina sem adjuvante e atingiram um pico na semana 2 do esquema de vacinação (dados não apresentados).

Como um todo, os dados indicam que a vacina 13vPnC formulada com fosfato de alumínio é imunogénica em coelhos, elicia respostas significativas de anticorpos aos polissacáridos capsulares de pneumococos contidos na vacina e estas respostas são associadas com a actividade funcional. As respostas observadas para os sete serotipos do núcleo após a imunização com 13vPnC + AIPO4 são consistentes com as respostas históricas de coelhos à formulação heptavalente.

Quadro 3. Respostas Imunes Contra IgG de Coelho (GMTs) Após Imunização com Duas Doses de Glicoconjugado Pneumocócico 13-valente

Sero- tipo Diluente com ALP04a 13vPnC* 13vPnC + ALP04a Semana 0 Semana 4 Propor^ ção Sem 4: Sem 0 Semana 0 Semana 4 (Cl a 95%) Prcpor^ ção Sem 4: Sem 0 Semana 0 Semana 4 (CL a 95%) Proporção Sem 4: Sem 0 1 <100 <100 1, 0 50 5.926 (2.758-12.733) 119 50 11.091 (5.327-23.093) 222 3 <100 <100 1, 0 50 6.647 (2.773- 15.932) 133 58 16.443 (7.096-38.106) 284 4 <100 <100 1, 0 50 13.554 (8.031- 22.875) 271 50 29.183 (15.342-55.508) 584 5 134 <100 0, 4 50 5.859 (2.450-14.009) 117 50 16.714 (6.959-40.140) 334 6A 141 <100 0, 4 74 22.415 (11.987-14.914) 303 83 63.734 (21.141-192.146) 768 74 6B <100 <100 1,0 57 8.108 (3.564- 18.444) 142 54 23.505 (11.286-48.955) 435 7F 3.859 579 0, 2 171 43.591 (26.931- 70.557) 444 143 84.888 (46.445-155.151) 496 9V 289 995 3,4 205 15.780 (7.193- 34.616) 125 208 43.301b (23.256-71.510) 217 14 437 177 0,4 61 6.906 (3.416- 13.962) 113 70 16.076 (9.649-26.785) 322 18C <100 <100 1,0 50 21.283 (15.770- 28.725) 426 50 35.040 (24.708-49.692) 107 19A <100 <100 1,0 121 113.599 (54.518- 236.707) 939 144 280.976 (119.587-660.167) 9.587-660.167) 1.951 19F <100 <100 1,0 50 14.365 (7.346- 28.090) 287 50 24.912 (9.243-67.141) 498 +23F <100 <100 1,0 50 5.323 (1.894- 14.962) 106 50 15.041 (4.711-48.018) 301 a: GMTs de soros combinados consistiram em volumes iguais de soro de cada coelho individual dentro de um grupo b: Estatisticamente diferente (p=0,022) do grupo de tratamento sem ALP04

Quadro 4. GMTs ΟΡΆ de S. pneumoniae para Combinações de Soro de Coelho Branco da Nova Zelândia Após Imunizações com Duas Doses de Glicoconjugado Pneumocócico 13-valente

Serotipo 13vPbCa 13vPnC + ALP04a Semana 0 Semana 4 Proporção Sem 4 : Sem 0 Semana 0 Semana 4 Proporção Sem 4 : Sem 0 1 <8 64 16 <8 64 16 3 <8 8 2 <8 16 4 4 <8 16 4 <8 32 8 5 <8 128 32 <8 512 128 6A 8 128 16 8 512 64 6B <8 256 64 8 1.024 128 75 7F 8 64 8 8 128 16 9V 8 64 8 8 128 16 14 16 32 2 16 32 2 18C 8 256 32 <8 256 64 19A <8 256 64 <8 1.024 256 19F <8 128 32 <8 512 128 23F 8 64 8 <8 256 64 a: Combinações consistiram de volumes iguais de soro de coelhos individuais dentro de um grupo de tratamento (n=12)

Estudo #HT01-0036 0 estudo #HT01-0036 comparou respostas imunes de coelho aos polissacáridos (PSs) contidos na vacina, após a imunização com a vacina 13vPnC com ou sem conjugação com a proteína CRMi97. Coelhos brancos da Nova Zelândia foram imunizados por via intramuscular na semana 0 e semana 2 com uma dose de 2,2 pg de cada PS (excepto 4,4 pg de 6B) . Os animais receberam uma das três preparações de vacina: (a) 13vPnC (PS directamente conjugado com CRMi97), (b) , (13vPnPS, (PS livre) ou (c) 13vPnPS + CRMi97 (PS livre misturado com CRMi97). Todas as preparações de vacinas continham AIPO4 como o adjuvante a 125 pg/dose.

As respostas imunes específicas para o serotipo para todas as preparações de vacinas foram avaliadas num ELISA de IgG e mediada pelo complemento OPA que mede o anticorpo funcional. As respostas imunes foram comparadas entre os grupos de tratamento. 0 Quadro 5 apresenta os dados de GMT obtidos de sangramentos da semana 4 analisados em ELISAs de IgG antigénio-específico. Análises adicionais mostram a proporção 76 dos valores GMT na semana 4 para a semana 0. Os dados indicam que a preparação de vacina conjugada eliciou maiores títulos séricos de IgG do que a vacina de PS livre ou PS livre + CRM197. Com excepção de S. pneumoniae tipo 14, a vacina 13vPnC foi capaz de induzir anticorpos funcionais para as estirpes representativas de S. pneumoniae num OPA (Quadro 6). Depois de duas imunizações com a vacina 13vPnPS ou 13vPnPS + CRM197, nenhum pôde induzir títulos OPA > 8 vezes na semana 4 em relação à semana 0 para 10 dos 13 serotipos medidos (Quadro 6) .

Em conclusão, estes resultados indicam que a conjugação dos polissacáridos das vacinas pneumocócicas 13-valente produz títulos séricos IgG mais elevados e actividade de anticorpo funcional total maior do que observada só com polissacárido livre ou misturado com CRM197 não conjugada.

Quadro 5. Respostas de IgG de Coelho (GMTs) a PnPS por ELISA Após imunização com Duas Doses de Glicoconjugado Pneumocócico 13-valente

Sero- tipo 13vPnPS (PS livre) 13vPnPS = CRM197 (PS misturado com CRM197 13vPnC Serrana 0 Sanaria 4 (Cl a 95%) Proporção Sem 4: Sem 0 Semana 0 Semana 4 (d a 95%) Propor^ r»5r> Sem 4: San 0 Serrana 0 Semana 4 (Cl a 95%) Propor^ r»5r> San 4: San 0 1 378 2.290 (843- 5.790) 5, 8 395 1.959 (809- 4.739) 5, 0 472 35.970 (29,130-44.417) 76,2 3 57 240 (64-908) 4, 2 89 163 (74-358) 1, 8 50 10.414 (10.414-16.676) 208, 3 4 50 379 (150- 7, 6 50 607 (313- 12,1 50 12.890 (9.117-18.224) 257, 8 77 959) 1.178) 5 343 226 (113- 450) 4, 5 50 321 (147-701) 6,4 50 35.264 (24.467-50.824) 705, 3 6A 154 466 (316- 688) 3, 0 98 201 (95-464) 2, 1 163 234.245 (167.152- 328.283) 1.437,1 6B 63 727 (384- 1.375) 11,6 62 745 (384- 1.440) 12,0 131 33.599 (22.934-49.222) 256,5 7F 50 61 (39-95) 1,2 50 72 (47-111) 1, 4 50 35.702 (24.350-52.347) 714, 0 9V 50 104 (48-195) 2,1 55 169 (74-390) 3, 0 50 50.033 (34.765-72.007) 11000,7 14 6 6 298 (117 — 757) 4,5 50 195 (71-535) 3, 9 50 20.121 (12.087-32.138) 402, 4 18C 89 1.555 (655- 3.688) 17,5 6 6 761 (300- 1.935) 11,5 101 71.451 (32.745-124.641) 707, 4 19A 50 (44-179) 89 1,8 50 80 (39-163) 1, 6 50 23.485 (12.857-42.723) 469, 7 19F 6 1.362 (559- 3.317) 22,3 61 991 (370- 2.654) 16,3 67 19.358 (12.553-33.173 288, 9 23F 73 1.085 (487- 2.420) 14,9 121 638 (311- 1.311) 5, 3 68 45.972 (22.134-84.089) 676, 1

Quadro 6. Títulos OPA de S. Pneumoniae para Combinações de Soro de Coelho Após Imunização com Duas Doses de Vacinas Pneumocócicas 13-valente

Serotipo Tratamento Na 13PnPS (PS livre) 13vPnPS + CRM197 (PS livre misturado com CRM197) 13vPnC Semana 0a Semana 4 Proporção Sem 4:Sem 0 Semana 4 Proporção Sem 4:Sem 0 Semana 4 Proporção Sem 4:Sem 0 1 4 16 4 16 4 8 32 78 3 4 4 1 4 1 4 8 4 4 4 1 4 1 4 64 5 4 32 8 16 4 16 64 6A 8 32 8 18 4 16 664 6B 8 64 8 32 4 32 32 7F 16 32 2 16 1 16 16 9V 16 16 1 32 2 32 8 14 16 16 1 16 1 16 2 18C 4 16 4 16 4 8 64 19A 8 8 1 8 1 16 64 19F 4 4 1 4 1 8 64 23F 16 32 2 16 1 32 32 a: Utilizado como valores da semana 0 para todos os grupos

Lisboa, 1

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REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora muito cuidado tenha sido tomado na compilação das referências, erros e omissões não podem ser excluídos e o IEP não assume qualquer responsabilidade neste sentido.

Documentos de Patente citados na descrição us 20010048929 A [0007] EP 0497525 A [0008] wo 2004011027 A [0009] us 4673574 A [0043] [0231] us 4902506 A [0043] [0231] us 5614382 A [0045] wo 2004083251 A [0046] wo 9014837 A [0049] us 4912094 A [0049] us 5057540 A [0049] us 6113918 A [0049] us 6207646 B [0049] wo 0018434 A [0049] wo 0209836 £ A [0049] wo 0209836 £ A [0049] wo 9313302 A [0049] wo 9219265 A [0049] us 5601831 A [0058] wo 03078453 A [0058] us 5110908 A [0058] 2 wo 0100790 A [0058] us 37741 A [0058] us 6245337 B [0058] us 6676948 B [0058] us 5643725 A [0058] us 6221365 B [0058] us 5552146 A [0059] us 6310190 B [0059] us 5725862 A [0059] us 5948412 A [0059] us 6899885 B [0059] wo 03048304 : A [0060] wo 02083855 i A [0061] wo 02053761 . A [0061] wo 03063766 A [0062] wo 2004094596 A [0062] wo 0185772 A [0062] wo 021661 A [0062] wo 0187939 A [0062]

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Pilishvili T; Farley M; Vazquez M; Reingold A; Nyquist A et al. Effectiveness of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children. Abst G-1079, 2003 [0231]

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição imunogénica polivalente, que compreende 13 conjugados de polissacárido-proteína distintos, juntamente com um veiculo fisiologicamente aceitável, em que cada um dos conjugados compreende um polissacárido capsular de um serotipo diferente de Streptococcus pneumoniae conjugado com uma proteína de transporte, e os polissacáridos capsulares são preparados a partir dos serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, e 23F, em que a proteína de transporte é CRMi97.

2. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 1, que compreende ainda um adjuvante.

3. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 2, em que o adjuvante é um adjuvante à base de alumínio.

4. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 3, em que o adjuvante é seleccionado do grupo que consiste em fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio.

5. Composição imunogénica de acordo com a reivindicação 4, em que o adjuvante é fosfato de alumínio.

6. Composição imunogénica polivalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para utilização como uma vacina. 2

7. Formulação líquida estéril de polissacáridos pneumocócicos dos serotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, e 23F, conjugados individualmente com a CRM197 para utilização como uma vacina.

8. Formulação líquida estéril de acordo com a reivindicação 7, em que cada dose de 0,5 mL é formulada para conter: 2 pg de cada sacárido, excepto para 6B a 4 pg; aproximadamente 29 pg de proteína de transporte CRM197; 0,125 mg de adjuvante de alumínio elementar (0,5 mg de fosfato de alumínio); e cloreto de sódio e tampão succinato de sódio como excipientes.