KR101315599B1 - 폐렴균점막다당질 유형14 （ｃｐｓ１４）와 호스래디시 퍼옥시다제의 당단백중합체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폐렴균점막다당질 유형14 (CPS14)와 캐리어 단백질로서 식물성 전달단백질인 호스래디시 퍼옥시다제 (Horseradish Peroxidase)의 당단백중합체에 관한 것으로서, 상기 제조된 당단백중합체는 SIGN-R1 수용체와 결합하여 장시간 탐식세포들에게 탐식되지 않고 그 세포막에 고정되어 있음을 확인할 수 있었다. 이로써 CPS14C1은 CPS14에 대한 면역반응을 획득시킬 수 있는 효과를 나타내며, 따라서 이를 인체에 무해한 신물질로 개발할 수 있음을 확인하였다.

Description

폐렴균점막다당질 유형14 （ＣＰＳ１４）와 호스래디시 퍼옥시다제의 당단백중합체 {GLYCOPROTEIN CONJUGATE OF CPS14 AND HORSERADISH PEROXIDASE}

본원 발명은 비면역성 폐렴균 점막다당질 항원에 대한 면역능력 획득을 위한 원천기술에 해당하는 것으로서, 새로운 폐렴균 백신 또는 치료의 선구물질 및 이를 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 물질은 새로운 자가면역질환 치료용 면역조절제로도 사용되어질 수 있다. 구체예로 폐렴균 점막다당질 유형 14 (capsular polysaccharide type 14) (CPS 14)를 호스래디시 퍼옥시다제 (Horseradish Peroxidase) (C1) 단백질과 접합시켜 제조한 당단백중합체 및 이의 제조방법을 제공한다.

비면역성 CPS14 연구의 중요성

점막성 세균 (예를 들어, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitides or Haemophilus influenzae)들은 혈류침투성 세균들이며, 비장에서의 선천성면역이 이들 세균으로부터 숙주를 방어하는 데에 중요한 역할을 수행한다.

이들 점막성 세균들의 점막(capsular)의 점막 다당질 (capsular polysaccharide)들은 대표적인 T세포 비의존적, 비면역성 항원들이다. 이러한 점막다당질에 의한 비면역성 특성은 숙주의 면역공격으로부터 이들 세균들을 보호해주고 항체 면역 반응 백신 개발을 어렵게 한다. 따라서 이를 체계적으로 극복하기 위하여 점막성 세균들의 점막 다당질에 대해 면역반응을 일으킬 수 있는 방안에 대한 연구가 요망된다.

폐렴백신 개발의 필요성

현대사회가 급속하게 고령화되어 감에 따라 고령자에서의 폐렴 질병은 국가적 차원의 문제이다. 현대사회에서 증가추세에 있는 각종 면역 결핍 환자에서의 폐렴질병 또한 문제이다.

최근까지 사용된 폐렴백신은 다당질 폐렴백신의 일종인 PneumoVax23 및 당단백 중합 폐렴백신의 일종인 Prevnar 13이 대표적이다. 그러나, 이들 폐렴백신은 모두 성인, 면역결핍환자 또는 노인에서 면역반응이 효과적이지 못한 단점이 있어왔다.

현재 사용중인 대표적인 폐렴백신들의 문제점

또한, 최근 신종플루 공포 확산으로 인해 세균성 폐렴을 예방하기 위한 폐렴백신이 요구되었음에도, 그 공급에 심각한 문제가 있어왔다.

그럼에도 불구하고, 점막다당질에 의한 비면역성 특성으로 항체 면역 반응 백신 개발을 어렵게 하는 문제점이 있어왔다.

구체적으로, 폐렴균 점막 다당질은 생체 내에서 매우 빠르게 (1시간 후 부터) 비장 백질부 (white pulp)의 B세포 밀집지역인 GC (Germinal center)로 이동하며(아래 그림), GC는 선천성면역과 획득성면역을 연결시켜 주는 중요한 면역장소로 알려져 있다. 그러나, 폐렴균 점막다당질은 여전히 싸이토카인 면역반응 또는 항체 면역반응을 일으키지 못하며, 그 이유 또한 명쾌하게 밝혀지지 않고 있다.

본원 발명은 상기 문제점을 해결하여, 저가로 용이하게 제조 공급이 가능하고, 우수한 효과를 지닌 백신을 제조하기 위하여, 비장의 수용체에 오래 머무를 수 있는 신규한 당단백중합체를 제조하는 것을 목적으로 한다.

추가적인 목적으로서, 상기 신규한 당단백중합체는 자가면역질환과 관련성을 가지는 비장의 수용체에 결합함으로써 그 수용체의 역할을 조절할 수 있다. 이러한 연구 결과는 현대사회에서 원인을 알 수 없는 자가면역질환이 크게 증가하고 있고 그 종류가 80여 가지가 넘고 있음을 주지할 때 그 효용성이 크다고 판단된다.

본 발명은 SIGN-R1 수용체가 폐렴균 점막다당질에 높은 친밀도로 결합하고, 탐식세포 (macrophage) 막위에서 면역보체 (complement) 중의 C1q와도 결합하여, 폐렴균을 인식하였을 때 C1q 매개의 면역보체경로를 활성화시킨다는 발견을 기초로 한다.

종래에, 폐렴균 점막다당질은 생체내에서 빠르게 GC로 이동한 후 GC에서 아무런 면역반응을 일으키지 않기 때문에, 면역반응의 생성이 곤란한 점이 알려져 있었다.

본원 발명은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, SIGN-R1 수용체와 폐렴균 점막다당질의 결합을 장시간 유지시켜 면역반응의 생성을 유도하기 위하여 호스래디시 퍼옥시다제 (Horseracish Peroxidase) (C1) 단백질을 CPS 14에 결합시킨 당단백중합체 CPS14C1을 제조하였다. CPS14C1은 탐식세포의 세포막에 고정되어 12시간 이상 탐식되지 않았으며, 생체내 비장과 간에서 5일 정도 체류한 후 분해되는 것을 발견하였다.

폐렴균 점막다당질의 수용체인 SIGN - R1 의 발견

사람 수지상세포 (Dendritic Cell) DC-SIGN의 SIGN-R1은 비장 백질 (white pulp) 주변부에 위치하면서 덱스트란 다당질 뿐만 아니라 폐렴균을 인식하고 탐식함이 생쥐 비장(아래 그림. A)과 SIGN-R1 과발현 세포주 (아래 그림. B)에서 확인되었다. 정제된 폐렴균 점막 다당질을 이용한 실험에서도 동일한 결과를 얻었으며 SIGN-R1은 덱스트란 다당질 보다도 폐렴균 점막다당질에 대해서 훨씬 더 친밀도가 높다는 것이 확인되었다. SIGN-R1이 일시적으로 결핍된 생쥐에서는 폐렴균 및 정제된 폐렴균 점막다당질의 탐식이 저해되었으며, 살아있는 폐렴균을 정상쥐와 SIGN-R1이 일시적으로 결핍된 생쥐에 주입할 경우 SIGN-R1이 일시적으로 결핍된 생쥐의 생존률이 현저히 감소됨을 관찰하였다. 이들에 대한 결과를 본 발명자는 International Immunology (2003.15(2):177-186)와 Proc Natl Acad Sci U S A .(2004.101(1):215-220)에 각각 발표하였다.

폐렴균에 대한 새로운 SIGN - R1 매개 면역보체활성화 경로의 발견

SIGN-R1은 비장의 백색 펄프 (white pulp) 주변부 특정 탐식세포에 발현하면서 폐렴균 점막다당질을 특이적으로 인식하는 주 수용체이다. SIGN-R1은 탐식세포막 위에서 면역보체 중의 C1q와도 결합하며 폐렴균을 인식하였을 때, C1q 매개 고전적 면역보체경로 (classical pathway)를 활성화시킨다. 따라서 본 발명자는 기존의 고전적 보체활성화 경로와는 전혀 다른 SIGN-R1과 C1q의 결합에 의해 매개되는 새로운 SIGN-R1 매개 보체활성화 경로(SIGN-R1 mediated classical pathway)가 존재함을 세계 최초로 발견 (아래 그림)하고 Cell지에 그 내용을 게재하였다 (Cell. 2006.125, 47-58).

폐렴균 점막다당질과 단백질의 중합

폐렴균 점막다당질은 생체 내에서 매우 빠르게 비장 백질부의 B세포 밀집지역인 GC (Germinal center; 림프소절의 중앙부)로 이동한 후, 이동된 폐렴균 점막다당질은 어떠한 면역반응도 일으키지 않는 것으로 알려져 있다.

따라서, 본 발명자는 폐렴균의 세포 밀집지역인 GC로의 이동을 방지하여 탐식세포 표면에 보다 장시간 머무를 수 있다면 면역반응을 일으킬 수 있을 것이라는 것에 착안하여, 이러한 기능을 할 수 있도록 특정 캐리어 단백질을 폐렴균 점막 다당질에 결합시켜 당단백 중합체를 형성시켜 본 발명을 완성하였다. 즉, 본 출원은 상기 SIGN-R1 수용체에 특이적으로 결합하는 당단백중합체를 제조하기 위한 것으로, 이때, 해당 단백질로서 호스래디시 퍼옥시다제 (C1)를 사용하였다.

호스래디시 퍼옥시다제 단백질의 특징 및 면역반응

호스래디시 퍼옥시다제는 44,173.9 달턴의 당단백질이며 4개의 라이신 잔기를 가지고 있다. 호스래디시 퍼옥시다제는 주로 표적분자의 위치를 추적하기 위한 각종 중합체의 제작에 활용되어 왔으며, 생체 내 투여 후 4시간 후부터 매우 빠르게 체내로부터 감소되기 시작한다 (J. Cell Biol. 45:620-632).

호스래디시 퍼옥시다제는 체내에서 무해하여 독자적인 면역반응을 일으키지 않는다. 이러한 점은 여러 문헌에서 입증된 바 있다. 예컨대, 0.2mg의 호스래디시 퍼옥시다제만을 래트의 정맥 내 또는 복강 내로 1차 접종할 경우 비장 및 장관 림프절에서만 매우 미약한 호스래디시 퍼옥시다제 항체를 생성하는 세포가 면역조직화학 염색에 의해 관찰되었다 (Immunology. 1983. 50.53). 또한, 0.125 mg의 호스래디시 퍼옥시다제를 0.025ml의 면역보조제 (Freund's complete adjuvant)와 혼합하여 실험용 생쥐의 뒷발에 1차 접종할 경우에만 C57BL/6와 SJL 종에서만 다른 종에 비해 비교적 높은 면역반응을 보였다. 그러나 호스래디시 퍼옥시다제를 생성하는 면역세포들은 형성되지 않는다는 것이 확인되었다 (Immunology. 1983. 48.367). 또한, 0.125 mg의 호스래디시 퍼옥시다제를 0.025ml의 면역보조제 (Freund's complete adjuvant)와 혼합하여 실험용 생쥐의 뒷발에 2번 접종할 경우 호스래디시 퍼옥시다제 항체 생성 면역세포가 림프절에서 형성되어 비장 등으로 이동됨이 관찰되었다 (Virchows Arch [Cell Pathol].1984. 45:107-112). 마지막으로, 1mg 이상의 호스래디시 퍼옥시다제를 정맥 내 주사할 경우 1시간 후 비장의 적질부 (red pulp)와 주변부에서 관찰되었다. 백질부(white pulp)에서는 산발적으로 관찰되었다. 그러나 24시간 후에는 전혀 관찰되지 않았다 (J. CELL BIOLOGY. 1978.79 184-199)

상기 연구결과, 호스래디시 퍼옥시다제는 체내에서 별도의 작용을 일으키지 않는 무해한 물질로 판단되었다.

본 중합체를 제조하기 위하여, CPS14와 호스래디시 퍼옥시다제 (C1)를 중합시키는 단계 이전에 CPS14를 3,3-N-[e-말레이미도카프로산]히드라지드 트리플루오로아세트산염 (EMCH)로 산화시킨다. C1은 2-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP) 및 디티오트레이톨(DTT)과 반응시켜 C1-SPDP-DTT로 변형시킨다. 마지막으로, 변형된 CPS14-EMCH 와 C1-SPDP-DTT를 반응시켜 중합체를 생성시킨다.

본 출원 발명은 CPS14과 C1 (호스래디시 퍼옥시다제)의 당단백중합체 제작 및 중합체 제작 원천기술에 해당한다. 전술한 바와 같이, CPS14와 같은 점막 다당질은 생체내에서 매우 빠르게 GC로 이동하고 아무런 면역 반응을 일으키지 않는다. 이러한 CPS14와는 달리, CPS14-C1는 탐식세포의 세포막에 고정되어 12시간 이상 탐식되지 않으며, 생쥐의 생체 내 비장과 간의 탐식세포들에서 탐식되지 않고 그 세포막에 고정되어 있음을 확인할 수 있었다. CPS14C1은 생체 내 비장과 간에서 5일 정도 체류한 후 분해되었다. 따라서 CPS14C1은 CPS14에 대한 면역반응을 획득시킬 수 있는 효과를 나타내며, 따라서 이를 인체에 무해한 신물질로 개발할 수 있음을 확인하였다.

도 1은 CPS14의 중합체 제작 과정 및 중합체 확인 결과를 나타낸다.
도 2는 CPS14C1 가 SIGN-R1 또는 사람 DC-SIGN 발현 세포주 표면위에 고정되는 것을 나타낸다.
도 3은 CPS14C1의 조직내 분포변화를 나타낸다.
도 4는 CPS14C1이 비장 주변부 SIGN-R1 발현 탐식세포 표면위에 고정되고 세포외로 역류되지 않는 것을 나타낸다.

(1) 폐렴균 점막다당질 ( CPS14 )-호스래디시 퍼옥시다제 (C1) 중합체 제작 방법

실험 재료

- 폴리사카라이드 (폐렴균 점막 다당질) (M.W. : 2,000,000),

- 캐리어 단백질 (호스래디시 퍼옥시다제) (C1) (M.W. : 40,000),

- DTT (디티오트레이톨)(M.W. : 154.25)

- EMCH (3,3-N-[e-말레이미도카프로산]히드라지드 트리플루오로아세트산염) (M.W. : 339.27),

- sulfo-LC-SPDP (설포숙신이미딜 6-[3´(2-피리딜디티오)-프로피온아미도]헥사노에이트 (M.W. : 527.57)

- PB 버퍼 (포스페이트 버퍼) (100mM PB/140mM NaCl, pH 7.5)

- 폴리사카라이드 : EMCH = 1:2,000 몰분율

- C1 : SPDP = 1: 50 몰분율

- 폴리사카라이드 : C1 = 1: 100 몰분율

- 크기 배제 컬럼 (size exclusion column) (10mL 의 컬럼을 사용) 세파덱스 G-15/25

참고사항

- EMCH, SPDP 및 C1 모두 신선하도록 사용전에 만든다.

- C1는 DMSO에 약하므로 소량만 들어가도록 링커 (linker)를 고농도로 희석한다.

- C1는 빛에 민감하므로 (빛에 노출되면 활성이 낮아질수 있다) 컬럼에 은박지를 싸서 보관한다.

중합체 제작 방법

① 폐렴균 점막다당질의 변형

2.1 mg 소디움 퍼아이오데이트 (sodium periodate)에 10mg/ml 폴리사카라이드 100 ul 와 0.1 M 아세트산나트륨 버퍼 (pH 5.5) 900 ul를 넣어 녹인 후 4.3 mg 소디움 퍼아이오데이트를 0.1 M 아세트산나트륨 버퍼 1 ml 에 녹인 욕액을 폴리사카라이드 용액에 추가로 첨가한 후, 상온에서 30분 동안 로테이터 (rotator) 사용하여 반응시켰다. 이 경우에, 상기 재료들을 추가하는 순서는 문제되지 않는다. [6.4 mg (2.1 mg + 4.3 mg) 소디움 퍼아이오데이트 (광 민감성. 은박지로 싸서 빛을 차단) + 900 ul 아세트산나트륨 버퍼 (pH 5.5) + 100 ul of CPS14 (10 mg/ml) (Total Conc. = 1mg of CPS14) + 1 ml 의 아세트산나트륨 버퍼 (pH 5.5)]

100K 스핀 컬럼을 이용하여 과량의 소디움 퍼아이오데이트를 제거하며, 4 ℃, 3000 g 조건에서 최소한 30 분 이상으로 원심분리기를 작동시키며, 이때 시료의 부피가 50 ul 될때 까지 30 분마다 체크하였다. 이후 세정을 위해 PB 버퍼를 1 ml 넣고 (5회 피펫팅), 4 ℃, 3000 g, >40min 조건하에서 작동시키며, 이때 PB 버퍼에서는 스핀에 의한 침착이 잘 되지 않았다.

새로운 이-튜브 (e-tube)로 옮긴 산화된 폴리사카라이드 (부피 70ul 정도) 에 20 mg/ml EMCH (DMSO에 녹임) 17 ul를 섞어서 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이때, PB 버퍼로 반응부피 200 ul를 맞추고 로테이터를 사용하여 반응시켰다.

100K 스핀 컬럼을 이용하여 반응하지 않은 EMCH를 제거하였다. 4 ℃, 3000 g 조건하에서 10 분 동안 (반응 부피가 200 ul 이므로) 작동시켰다. 세정을 위해 PB 버퍼 700 ul 넣고 (5회 피펫팅), 4 ℃, 3000 g 에서 최소 40분 이상 상기 컬럼을 원심분리시켰다. 이때, 반응하지 않은 링커를 제거하기 위해 2회 세정하였는데, 이러한 세정 단계는 컨쥬게이션 효율을 상승시키는 데에 있어 중요하다.

② 캐리어단백질 C1 변형

50 mg/ml C1 40 ul와 50 mg/ml SPDP (PB 버퍼에 녹임) 26.4 ul를 섞어서 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응부피는 66.4 ul로 Bio-Spin® 부피에 맞추기 위해 고농도의 적은 볼륨으로 준비하였다. 1 M DTT 0.67 ul를 넣고 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응하지 않은 SPDP와 DTT를 제거하기 위해 Bio-Spin® (총 부피 = 75 ul) 을 이용하여 정제하였다. 이때, Bio-Spin® 사용전에 PB 버퍼로 2~3번 세척하고, 재현탁을 여러번 실시해서 버블을 없애도록 하였다. C1-SPDP-DTT를 Bio-Spin®에 넣고 PB 버퍼를 추가하여 아래로 내려오는 용출물을 새로운 이-튜브 (e-tube)에 분리해서 받았다. 이때, 분리 지점은 색으로 구분되므로 색을 기준으로 해서 분리하도록 한다.

③ 폐렴균 점막다당질-캐리어 단백질 C1 중합

폴리사카라이드-EMCH 와 C1-SPDP-DTT를 혼합한 후 4 ℃ 에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응하지 않은 C1 제거를 위해 100K 스핀 컬럼을 이용하여 정제하였다. 4 ℃, 3000 g 조건하에서 30분 동안 원심분리하였다. 세정을 위해 PB 버퍼 500 ul 을 첨가하고 (5회 피펫팅), 4 ℃, 3000 g에서 30분간 원심분리하였다. DPBS 로 100 ul로 부피를 맞췄다.

(2) CPS14C1 의 시험관 내 특성 조사

① FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting)를 이용한 분석방법

배양된 SIGN-R1 또는 DC-SIGN 과발현세포주 (1x104개씩)를 100ul의 PBS에 준비한 후 96웰 디쉬 (96-well dish)에 분주하였다. CPS14C1 (1 또는 10 ug)을 첨가하고, 37 ℃ 또는 4 ℃에서 30분, 1시간, 또는 24시간 배양하였다. PBS를 이용하여 세포들을 4 ℃에서 세척하였다. Alexa488 형광 물질이 중합된 C1항체를 100 ul PBS에 0.001ug이 되도록 첨가하였다. 4 ℃에서 30분간 배양하였다. PBS를 이용하여 세포들을 4 ℃에서 세척하였다. FACS 분석을 수행하였다.

② 형광현미경을 이용하는 방법

70 %의 혼잡도로 SIGN-R1 또는 DC-SIGN 과발현세포주를 커버 글래스 (cover glass)에서 배양하고, CPS14C1 (1 또는 10 ug)을 첨가한 후, 37 ℃ 또는 4 ℃에서 30분, 1시간, 또는 24시간 배양하였다. PBS를 이용하여 세포들을 4 ℃에서 세척하고, Alexa488 형광 물질이 중합된 C1항체를 100 ul PBS에 0.001ug 이 되도록 첨가하였다. 4 ℃에서 30분간 배양하고, PBS를 이용하여 세포들을 4 ℃에서 세척한 후, SIGN-R1 또는 DC-SIGN항체를 이용하여 세포들을 붉은 형광색으로 이중염색하였다. PBS를 이용하여 세포들을 4 ℃에서 세척하고, 형광현미경으로 관찰하였다.

(3) CPS14C1 의 생체 내 특성 조사

CPS14C1 (1 또는 10 ug)을 생쥐의 안와정맥으로 주사하고, 2시간 또는 24시간 반응시킨 후, 생쥐를 희생시키고 간 및 비장을 적출하여 4 ℃로 냉장된 OCT 화합물에 침전시켰다. -70 ℃에서 1시간 이상 동결시키고, 각 조직을 10 um 두께로 냉동절편하여 슬라이드 글래스에 부착하고, 냉동절편을 100 % 아세톤으로 고정하였다. PBS를 이용하여 냉동절편들을 세척하고, Alexa488 형광 물질이 중합된 C1항체를 100 ul PBS에 0.001ug 이 되도록 첨가하고, 상온에서 1시간 배양한 후, PBS를 이용하여 냉동절편들을 세척하였다. SIGN-R1항체를 이용하여 비장의 SIGN-R1 발현 탐식세포들을 붉은 형광색으로 이중염색하고, PBS를 이용하여 냉동절편들을 세척한 후, 커버 글래스로 시료들을 덮어준 다음 30분간 건조하여 형광현미경으로 관찰하였다.

(4) 실험 결과

① CPS14의 중합체 제작 및 중합 확인

비면역원성 폐렴균 점막 다당질중 하나인 CPS14의 면역반응 유도를 위하여 중합체 단백질 C1, C2 및 C3을 확보하였다. 비면역원성 폐렴균 점막다당질 CPS14의 중합을 위해 ‘2) 실험 방법 (1)의 폐렴균 점막다당질-캐리어 단백질 C1 중합체 제작 방법’을 통해 CPS14C1 중합체들을 제작하고 (도 1. ㄱ), CPS14과 캐리어 단백질들과의 중합여부를 확인하기 위해 CPS14와 각각의 캐리어 단백질 항체들을 이용하여 Dot blotting 분석을 수행하였다 (도 1. ㄴ). 도 1. ㄴ의 결과에서 CPS14-C2와 CPS14-C3는 전달단백질 C2와 C3를 이용하여 CPS14C1에 대한 대조 중합다당질로 사용되었다. 위의 결과를 통해 CPS14-C1,-C2 및 -C3의 중합체가 잘 형성되었음을 확인하였고 CPS14C1의 경우에는 CPS14항체로도 다른 중합체들에 비해 인식이 가능함을 확인하였다.

② CPS14C1은 비장 백질부의 GC로 이동하지 않고 주변부에 14시간 이상 고정되어 있다.

CPS14C1이 SIGN-R1에 의해 탐식되지 않고 세포막에 고정됨을 증명하기 위해 SIGN-R1 과발현 DCEK세포주에 CPS14와 CPS14C1을 30분 및 4시간 반응시키고 형광현미경과 FACS로 분석하였다. CPS14의 경우 수 분 내에 세포 내로 탐식되었지만 CPS14C1의 경우 세포막에만 고정되어 있음이 명확하게 확인되었다 (도 2. ㄱ 및 ㄴ, 모식도 참조).

CPS14C1이 세포막에 얼마 정도 고정되어 있을 수 있는지를 확인하기 위해 도 2.ㄴ)과 동일한 실험을 DCEK-SIGN-R1 과발현 세포주에서 수행하였다. SIGN-R1 과발현 세포주와 CPS14C1을 30분, 1시간, 4시간 및 14시간을 처리해 주었다. 세포의 세포막을 손상시키지 않은 채 세포를 회수하여 녹색 형광색의 C1항체로 세포들을 염색한 후 FACS로 C1에 대한 신호를 분석한 결과 14시간 까지 대부분의 CPS14C1이 세포막에 고정되어 있음을 확인하였다 (결과 미기재). 위의 결과들은 중합단백질 C1에 의해 CPS14가 생체 내에서 SIGN-R1 또는 다른 탐식세포에 의해 인식되고 이를 세포표면에서 다른 면역세포들에게 매우 장시간 항원을 제공해줄 수 있음을 암시하는 매우 중요한 결과이다.

③ CPS14C1은 간과 비장 백질부의 GC로 전혀 이동하지 않고 주변부에 12시간 이상 고정되어 있다.

CPS14는 정상 생쥐의 정맥 내로 주사해줄 경우 비장에서 2시간 내 매우 빠르게 백질부의 GC로 이동한다. 그러나 CPS14C1의 경우 SIGN-R1발현 탐식세포가 존재하는 주변부에서 12시간 이상 고정된 채 GC로 이동하지 않는 특성을 보여주었다 (도 3. 위). 고정된 CPS14C1은 5일 이후 동일한 장소에서 신호가 사라짐이 관찰되었고 (결과 미기재), 이를 통해 생체 내에서 일정 시간 후 분해되어 사라짐을 확인하였다. 또한 CPS14의 경우 (80-90 % 정도가 간으로 이동)와는 달리 CPS14C1의 경우 간으로는 10 % 이하로 이동함이 관찰되었다 (도 3. 아래). 이와 같은 결과는 CPS14C1의 구조변경을 통해 간에서는 CPS14C1을 대부분 인식하지 못하고 비장의 SIGN-R1발현 탐식세포만이 특이적으로 인식할 수 있음을 보여주는 결과이다. 또한 CPS14C1은 CPS14와는 달리 탐식 및 세포 외 역류가 진행되지 않고 세포막에 고정되는 특성을 보여주는 결과이다.

④ CPS14C1은 비장주변부 SIGN-R1발현 탐식세포에 의해 탐식 및 세포외 역류가 되지 않고 세포막에 고정된다.

CPS14C1이 비장 주변부의 SIGN-R1발현 탐식세포에 고정되는지를 정확하게 규명하기 위해 CPS14C1과 SIGN-R1에 대한 면역형광염색을 수행하였다. 예상했던 바와 같이 CPS14C1은 매우 특이적으로 SIGN-R1발현 탐식세포에만 고정되어 있음이 확인되었고 (도 4. 윗줄), 확대하여 관찰한 결과 세포 내로 탐식된 것이 아니라 세포막에만 고정되어 있는 것이 관찰되었다 (도 4. 아랫줄 및 모식도).

Claims (6)

1. 폐렴균점막다당질 유형14 (CPS14)와 캐리어 단백질로서 호스래디시 퍼옥시다제 (Horseradish Peroxidase) (C1)가 중합된 당단백중합체.
2. 제1항에 있어서, CPS14는 산화되고, C1은 2-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP) 및 디티오트레이톨(DTT)에 의해 변형된 것인 당단백중합체.
3. CPS14와 C1를 중합하는 단계를 포함하는 제1항의 당단백중합체의 제조방법.
4. 제3항에 있어서, CPS14를 산화시키는 단계를 더 포함하는 당단백중합체의 제조방법.
5. 제4항에 있어서, CPS14를 3,3-N-[e-말레이미도카프로산]히드라지드 트리플루오로아세트산염 (EMCH)로 산화시키는 것인 당단백중합체의 제조방법.
6. 제3항 또는 제4항에 있어서, C1를 2-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP) 및 디티오트레이톨(DTT)과 반응시켜 C1-SPDP-DTT를 제조하는 단계를 더 포함하는 당단백중합체의 제조방법.

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