CN104096227B - 一种增强4价流行性脑膜炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种增强4价流行性脑膜炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法，通过在CRM197A中加入万能表位肽P2，并采用基因重组大肠杆菌来生产含有万能表位肽的白喉毒素变异体CRM197的A链的蛋白载体P2CRM197A；然后将4种不同血清群(包括A、C、W135和Y)荚膜多糖通过共价键连接至所述含有万能表位肽的P2CRM197A蛋白载体上形成4价流行性脑膜炎球菌多糖‑P2CRM197A结合物；采用这种方法获得的4价流行性脑膜炎球菌多糖‑P2CRM197A结合物与不含有万能表位肽的对应蛋白载体CRM197A获得的4价流行性脑膜炎球菌多糖‑CRM197A结合物相比较，其免疫原性比对照提高了3‑5倍。

Description

一种增强4价流行性脑膜炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的 方法

技术领域

本发明涉及一种增强4价流行性脑膜炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法。

背景技术

当多糖以共价键连接至蛋白载体上时，能将半抗原的多糖转变成全抗原，使得多糖的免疫原性得到增强。以此方法合成的多糖蛋白结合疫苗已被广泛地应用于小儿，成功地预防了包括肺炎球菌，流行性脑膜炎球菌以及流行性嗜血杆菌b型等细菌的感染。

用于合成多糖蛋白结合物的蛋白载体有多种，如破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素变异体CRM197，以及基因重组技术生产的流行性嗜血杆菌表面蛋白D等；但是，由于不同蛋白的免疫特性，以不同蛋白载体合成的多糖蛋白结合物的免疫原性有差异，动物体免疫后，对于由不同蛋白载体与同一种多糖合成形成的多糖蛋白结合物，所显现的多糖免疫原性也不同。由此可见，采用不同技术生产的蛋白载体，合成出来的多糖蛋白结合物的免疫原性有差异。

进入动物机体内后，抗原经抗原处理细胞(AntigenProcessCell，APC)处理后产生表位肽(Epitope)[1]，在和主要组织相容性复合物(Major Histocompatibility Complex,MHC)分子结合后，进而呈现在APC细胞表面，能够被T淋巴细胞识别，这是免疫学通过实验已经得出的结论。现在知道，一个已知表位肽的免疫原性取决于三个因素：

第一、适当表位肽的产生；

第二，和表位肽结合的主要组织相容性复合物分子的呈现；

第三，识别表位肽与主要组织相容性复合物形成的结合物的T细胞的呈现。

其中，任何一个环节的缺少都将导致免疫应答缺失。

用小鼠进行的试验表明，缺乏适当的表位肽与主要组织相容性复合物形成的结合物分子是最常导致动物体免疫响应缺失的原因。主要组织相容性复合物具有高度的多形态性，已知的表位肽仅通过一个或者几个等位基因(Alleles)就可结合至主要组织相容性复合物，而不是全部表位肽片段。另外，有实验结果显示，由于抗原处理不适当，或者T细胞耐受性空缺，也会导致免疫响应的缺失。

有实验表明，破伤风毒素的表位肽QYIKANSKFIGITEL(称为P2)，可和大量不同的主要组织相容性复合物ClassII结合，显示其能够被T细胞识别，具有万能免疫原性的特性，被称之万能表位肽。

万能免疫原性表位肽具有和多个人类主要组织相容性抗原复合物ClassII分子的同型和异型体结合。这种万能表位肽和人类主要组织相容性抗原复合物ClassII分子随机的结合可用于开发合成疫苗，因为其能够激活人群中的大部分个体的获得性免疫系统的应答。

研究表明，P2表位肽由破伤风毒素的830‐844氨基酸序列组成(QYIKANSKFIGITEL)。在含有该表位肽的蛋白进入机体后，蛋白将被摄入至APC细胞内，被消化降解。但是，这些表位肽将保存完整，在和主要组织相容性复合物结合后，被呈现在APC细胞表面，并被T细胞识别，这表明万能表位肽以相同的方式和多种DR分子作用。

MHC分子是加工后抗原的杂性受体，其功能是在胸腺中的免疫耐受诱导和周边免疫响应外来抗原的过程中，来呈现其抗原中的表位肽。因此，MHC分子必须在呈现大量的表位肽(容许更好的抗原识别，但更多的消耗T细胞储备)，和少许表位肽(大量的T细胞储备，但是少许有效地呈现外来抗原)中达到平衡。也就是说，如果抗原中含有在APC细胞处理后能够保存完整性、并具有代表性的少量表位肽，在和MHC结合后，就能够刺激一定量的T细胞，来建立免疫记忆效应，而这一过程不会消耗过量的T细胞，以避免消耗大量的T细胞，造成免疫耐受。含有这种表位肽的抗原具有更强的免疫原性，这也就解释了为什么破伤风类毒素具有很强的免疫原性的原因。

现发现的大部分T细胞的刺激表位肽对于不同MHCClassII单体(haplotype)作用有限，不同动物保存和呈现不同的抗原多肽区域(epitopes)来刺激其T细胞。这种T细胞刺激活性的基因限制阻碍了以合成方法来开发疫苗，而这种方法对于基因上不同的人群的应用，应该是非常有效的方法。那些被发现具有刺激多重小鼠个体和/或与大多数人体MHCClassII分子相关联的T细胞刺激表位肽，提供了一个设计万能活化T细胞的有效途径。在普通的蛋白抗原中加入万能表位肽(也称为万能T细胞抗原簇)P2，能够被大多数动物的MHCClassII分子识别。这种T细胞抗原簇能够用于直接诱导T细胞，或提供帮助B细胞生产针对于弱免疫原的抗体，增强机体获得性免疫应答的效应。

致病性细菌通常能够表达高分子量，包裹在细菌表面的是荚膜多糖，简称多糖。对于成人来说，荚膜多糖是具有很好的免疫原性抗原，可用于制备疫苗；但是，对于小儿，即2岁以下的婴幼儿，荚膜多糖被认为是非依赖于T细胞抗原。实验显示，当用作为抗原时，荚膜多糖可诱导野株或者T细胞缺失小鼠生产多糖特异性IgM抗体的响应；但是，并不诱导IgM抗体向IgG抗体的转化。人体实验也显示，作为疫苗，多糖可以诱导成人生产保护性抗体，但无法诱导婴幼儿的免疫应答；也就是说，在小儿重复免疫荚膜多糖抗原后，无第二次抗体增强响应，也无法诱导持续的T细胞记忆。

现代免疫学实验证实，多糖蛋白结合疫苗和纯多糖疫苗比较的优势在于，前者能够诱导免疫响应。当非依赖T细胞的荚膜多糖共价键地连接至载体蛋白而形成的多糖蛋白结合物，在免疫了哺乳动物后，可诱导T细胞来帮助B细胞产生针对于结合物中的多糖部分的IgG抗体。因此，多糖蛋白结合物诱导多糖特异性抗体IgM转化为IgG，记忆B细胞的分化，以及长期存在的T细胞记忆。

流行性脑膜炎是细菌性脑脊液炎中唯一能够造成流行的疾病，可引起相当高的病死率和致残率。流脑从病原体的发现至今已超过100年，呈世界范围发布，全世界每年流脑病例可达30万到35万，是世界范围的一个严重公共健康问题。流脑由脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis，Men)引起。据流行性脑膜炎球菌荚膜多糖的化学结构，已确定13个血清群，其中A、B、C、W135、和Y群引起约95％的病例。

A、C、W135、和Y群的荚膜多糖是良好的免疫原，但多糖疫苗对高发人群—2岁以下儿童几乎不起作用，这多是由于荚膜多糖是非T细胞依赖性抗原。解决此问题的有效方法是制备结合疫苗，即将多糖和蛋白载体进行结合，使非T细胞依赖性抗原转变成T细胞依赖性抗原。这种方法可以改变荚膜多糖的抗原性质，诱导出免疫记忆。

目前临床上使用的4价流行性脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗是由赛诺菲生产，该产品是将4种流行性脑膜炎球菌群，包括A、C、W135和Y分别以共价键连接至破伤风类毒素蛋白载体上，然后将这4种单价结合物混合配制而成。4价流行性脑膜炎球菌多糖结合疫苗的临床应用取得了成效，但是，有些群的免疫原性仍然较弱，需要开发出免疫原性更强的产品来更新。

发明内容

本发明提供了一种增强4价流行性脑膜炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法，结合物中的4种流行性脑膜炎球菌多糖与蛋白载体之间是通过共价键连接，蛋白载体是通过基因重组构建的大肠杆菌工程菌生产的含有万能表位肽QYIKANSKFIGITEL(简称P2)的白喉毒素变异体CRM197的A链(简称P2CRM197A)，4价流行性脑膜炎球菌‐P2CRM197A结合物与不带万能表位肽P2的蛋白载体合成的4价流行性脑膜炎球菌多糖‐CRM197A结合物比较，该结合物的流脑多糖抗体滴度提高了3‐5倍。

本发明采取的技术方案如下：

一种增强4价流行性脑膜炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法，包括如下步骤：

步骤一：在白喉毒素变异体CRM197的A链(简称CRM197A)中加入万能表位肽QYIKANSKFIGITEL(简称P2)，通过基因重组工程菌来生产含有P2的CRM197A蛋白载体(简称P2CRM197A)；

步骤二：将4种不同群的流行性脑膜炎球菌多糖，包括A、C、W135、和Y，通过共价键分别与P2CRM197A蛋白载体连接形成4种单价流行性脑膜炎球菌多糖‐P2CRM197A结合物；

步骤三：将步骤二获得的4种单价流行性脑膜炎球菌多糖‐P2CRM197A结合物进行混合得到免疫原性增强的4价流行性脑膜炎球菌多糖蛋白结合物。

进一步，在所述P2CRM197A中含有X个P2，1≤X≤3。

进一步，在所述P2CRM197A蛋白载体中，P2连结在CRM197A蛋白的N‐末端或C‐末端，或者同时连接在N‐末端和C‐末端。

进一步，所述P2与CRM197A蛋白之间是通过GSGSG氨基酸序列进行连接。

进一步，所述基因重组工程菌是通过基因重组方法构建的大肠杆菌。

进一步，所述流行性脑膜炎球菌多糖是通过分别培养4个不同群的流行性脑膜炎球菌获得的荚膜多糖。

具体实施方式

下面举例说明本发明的具体实施方法，但不局限于以下实例。

本发明用基因重组的方法，在大肠杆菌工程菌表达系统中，对CRM197A蛋白载体和带有万能表位肽P2的CRM197A蛋白载体进行表达并纯化；然后，将4群流行性脑膜炎球菌荚膜多糖(简称Men)共价键地连接至P2CRM197A蛋白载体，制备出Men‐P2CRM197A结合物；将四种单价多糖蛋白结合物混合配制成疫苗后，免疫小白鼠，采血获得免疫血清；用ELISA方法检测小白鼠血清中的多糖特异性抗体滴度，以评估多糖蛋白结合物的免疫原性。

步骤一：蛋白载体和流行性脑膜炎球菌荚膜多糖的制备

为说明本发明的有效性，制备了两种载体蛋白，即含有P2的蛋白载体P2CRM197A和不含P2的蛋白载体CRM197A。其中，CRM197A蛋白载体是用于合成对照用4价流行性脑膜炎球菌多糖‐CRM197A结合物样品。

一、CRM197A蛋白载体和P2CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计

1、CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计

白喉毒素是由带有白喉毒素基因的β噬菌体在白喉杆菌内表达，在细菌胞浆中存在形式为多肽，由560个氨基酸组成，分子量为62,000道尔顿。其氨基酸序列如下：

MSRKLFASILIGALLGIGAPPSAHAGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQG NYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTE EFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS

当分泌至细菌体外前，多肽N‐末端的25个引导氨基酸序列被切除掉，变成了由535个氨基酸组成、分子量为58kD的单链多肽而分泌至细菌体外，其氨基酸序列如下：

GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS

分泌至细菌体外的白喉毒素被酶切为A链和B链，其间由一个二硫键连接而形成一个蛋白分子，这两个多肽链具有不同的功能。A链为白喉毒素蛋白分子的N‐末端片段，分子量为21kD，由193个氨基酸组成，是白喉毒素的毒性功能部分。它是通过在真核生物细胞浆内，将二磷酸三腺苷核糖(ADP‐Ribosyl)的异柠檬酸脱氢酶(NAD+)部分转移至延伸因子2(ElongationFactor‐2，EF‐2)上，从而抑制细胞中的蛋白质合成，进而抑制细胞生长，造成细胞伤亡。B链为白喉毒素蛋白分子的C‐末端片段，分子量大约为37kD，由342个氨基酸组成。B链的功能是识别敏感细胞表面的特异性受体，将白喉毒素吸附在敏感细胞上，帮助A链进入细胞内。

白喉毒素的A链具有良好的水溶性，其氨基酸序列如下：

GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR

研究发现[3]，由于β噬菌体上的毒素基因tox的突变，对于噬菌体的复制没有影响；但是，合成出来的毒素的毒性可能消失，或大大地降低，而形成白喉毒素突变体(CrossReactingMaterial，CRM)，但是白喉毒素突变体的血清学免疫原性仍然和毒素相关联。比如，白喉毒素突变体CRM197，无白喉毒素的毒性，从氨基酸序列分析来看是由于A链中的第52位氨基酸，由甘氨酸(Gly)突变成谷氨酸(Glu)，其氨基酸序列如下：

GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDN ENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSS VEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR

试验研究表明，与其它现在市场上用于肺炎球菌结合疫苗合成的蛋白载体比较，白喉毒素变异体CRM197蛋白A链多肽具备以下一些优势，如其免疫原性和白喉毒素及白喉内毒素相关联，分子量小，水溶性高，易于生产和进行大分子合成反应。长期的白喉类毒素疫苗的临床使用，已经证明其安全性和有效性。

2、含有P2万能表位肽的P2CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计

将万能表位肽P2连接至CRM197A蛋白载体上，构建出一种新的用于合成多糖蛋白质结合物的蛋白载体。所用的万能表位肽P2可连接至CRM197A蛋白载体的N‐末端或C‐末端；也可将两个不同的万能表位肽分别连接至CRM197A蛋白载体的N‐末端或C‐末端；另一种方式是将两个万能表位肽自身连接，然后再连接至CRM197A蛋白载体N‐末端或者C‐末端；还有一种方式是将一个万能表位肽连接至C‐末端或者N‐末端，两个自身连接的万能表位肽连接至另一端。

2‐1、含有万能表位肽P2的P2CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计

2‐1‐1、P2‐N‐末端CRM197A蛋白载体(称为P2‐CRM197A)氨基酸序列的设计

通过将P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL加入至CRM197A蛋白载体的N‐末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下：

QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDW

KEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPL

MEQVGT

EEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR

在P2氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的N‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2‐CRM197A蛋白载体。

2‐1‐2、CRM197AC‐末端‐P2蛋白载体(称为CRM197A‐P2)氨基酸序列的设计

通过将P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL加入至CRM197A蛋白载体的C‐末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：

MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL

在P2氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为CRM197A‐P2蛋白载体。

2‐1‐3、P2‐N‐末端CRM197AC‐末端‐P2蛋白载体(称为P2‐CRM197A‐P2)氨基酸序列的设计

通过将两个P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL分别加入至CRM197A蛋白载体的N‐末端和C‐末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：

QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKA NSKFIGITEL

在P2氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的N‐末端和C‐末端之间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2‐CRM197A‐P2蛋白载体。

2‐1‐4、P2P2‐N‐末端CRM197A蛋白载体(称为P2‐P2‐CRM197A)氨基酸序列的设计

通过将两个P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的N‐末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：

QYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR

在两个自身连接的P2氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的N‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2‐P2‐CRM197A蛋白载体。

2‐1‐5、CRM197AC‐末端‐P2P2蛋白载体(称为CRM197A‐P2‐P2)氨基酸序列的设计

通过将两个P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的C‐末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：

GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKA NSKFIGITEL

在两个自身连接P2氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为CRM197A‐P2‐P2蛋白载体。

2‐1‐6、P2P2‐N‐末端CRM197AC‐末端‐P2蛋白载体(称为P2‐P2‐CRM197A‐P2)氨基酸序列的设计

通过将两个P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的N‐末端；另外，将一个P2加入至CRM197A蛋白载体的C‐末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：

QYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL

在两个自身连接P2氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2P2CRM197AP2蛋白载体。

2‐1‐7、P2‐N‐末端CRM197AC‐末端‐P2P2蛋白载体(称为P2‐CRM197A‐P2‐P2)氨基酸序列的设计

通过将一个P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL连接至CRM197A蛋白载体的N‐末端；另外，将两个P2进行自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的C‐末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下：

QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKA NSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITEL

在两个自身连接P2氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2‐CRM197A‐P2‐P2蛋白载体。

二、CRM197A蛋白载体和含有万能表位肽的P2CRM197A蛋白载体表达质粒的构建

1、CRM197A蛋白载体表达质粒的构建

从GenBank获取CRM197蛋白完整氨基酸序列PRF:224021，确定CRM197蛋白的A链片段，CRM197的氨基酸1‐193为CRM197的A链片段。以此为依据，对该片段的氨基酸的核酸序列进行优化，以便在大肠杆菌表达系统中高效表达。采用自制的表达质粒，用NdeI酶识别质粒位点CATATG，BamHI酶识别位点GGATCC。经过CRM197A的基因序列进行分析，在序列内，无NdeI及BamHI酶切位点。CRM197A蛋白基因合成序列如下：

CATATG

GGTGCGGACGACGTTGTGGACTCCTCAAAATCGTTTGTCATGGAAAACTTCAGCTCTTAT

CATGGCACCAAACCGGGTTACGTGGACTCCATTCAGAAGGGCATCCAAAAACCGAAGTCA

GGCACCCAGGGTAACTACGATGACGATTGGAAGGAATTCTACAGCACGGACAATAAGTAT

GATGCGGCCGGCTACTCTGTTGACAACGAAAATCCGCTGAGTGGTAAAGCAGGCGGTGTG

GTTAAGGTCACCTATCCGGGTCTGACGAAAGTTCTGGCGCTGAAGGTCGATAACGCCGAA

ACCATTAAAAAGGAACTGGGCCTGTCTCTGACCGAACCGCTGATGGAACAAGTGGGTACG

GAAGAATTTATCAAACGTTTCGGCGATGGTGCATCGCGTGTCGTGCTGAGCCTGCCGTTT

GCTGAAGGCAGTTCCTCAGTGGAATACATTAACAATTGGGAACAAGCAAAAGCTCTGTCA

GTTGAACTGGAAATCAATTTCGAAACGCGTGGCAAACGCGGTCAAGATGCTATGTATGAA

TATATGGCTCAGGCGTGTGCGGGCAATCGCGTCCGTCGCTAA

GGATCC

将空白质粒和合成的CRM197A蛋白基因的PCR产物中，分别加入NdeI酶和BamHI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。

2、含有万能表位肽的P2CRM197A蛋白载体表达质粒的构建

2‐1、P2‐CRM197A蛋白载体表达质粒的构建

采用自制的空白表达质粒，用NdeI酶识别质粒位点CATATG，BamHI酶识别位点GGATCC。经过P2CRM197A蛋白载体基因序列进行分析，在序列内，无NdeI及BamHI酶切位点。P2‐CRM197A基因合成全序列如下：

CATATG

CAATACATCAAGGCGAACAGCAAATTCATCGGCATCACGGAACTGGGCTCGGGCTCTGGC

GTGCGGACGACGTTGTGGACTCCTCAAAATCGTTTGTCATGGAAAACTTCAGCTCTTAT

ATGGCACCAAACCGGGTTACGTGGACTCCATTCAGAAGGGCATCCAAAAACCGAAGTCA

GGCACCCAGGGTAACTACGATGACGATTGGAAGGAATTCTACAGCACGGACAATAAGTAT

GATGCGGCCGGCTACTCTGTTGACAACGAAAATCCGCTGAGTGGTAAAGCAGGCGGTGTG

GTTAAGGTCACCTATCCGGGTCTGACGAAAGTTCTGGCGCTGAAGGTCGATAACGCCGAA

ACCATTAAAAAGGAACTGGGCCTGTCTCTGACCGAACCGCTGATGGAACAAGTGGGTACG

GAAGAATTTATCAAACGTTTCGGCGATGGTGCATCGCGTGTCGTGCTGAGCCTGCCGTTT

GCTGAAGGCAGTTCCTCAGTGGAATACATTAACAATTGGGAACAAGCAAAAGCTCTGTCA

GTTGAACTGGAAATCAATTTCGAAACGCGTGGCAAACGCGGTCAAGATGCTATGTATGAA

TATATGGCTCAGGCGTGTGCGGGCAATCGCGTCCGTCGCTAA

GGATCC

将空白质粒和合成的P2CRM197A蛋白基因的PCR产物中，分别加入NdeI酶和BamHI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。

2‐2、P2‐CRM197A‐P2蛋白载体表达质粒的构建

采用自制的表达质粒，用NdeI酶识别质粒位点CATATG，BamHI酶识别位点GGATCC。经过P2‐CRM197A‐P2蛋白基因序列进行分析，在序列内，无NdeI及BamHI酶切位点。P2CRM197AP2基因合成全序列如下：

CATATG

CAATACATCAAGGCGAACAGCAAATTCATCGGCATCACGGAACTGGGCTCGGGCTCTGGC

GTGCGGACGACGTTGTGGACTCCTCAAAATCGTTTGTCATGGAAAACTTCAGCTCTTAT

ATGGCACCAAACCGGGTTACGTGGACTCCATTCAGAAGGGCATCCAAAAACCGAAGTCA

GGCACCCAGGGTAACTACGATGACGATTGGAAGGAATTCTACAGCACGGACAATAAGTAT

GATGCGGCCGGCTACTCTGTTGACAACGAAAATCCGCTGAGTGGTAAAGCAGGCGGTGTG

GTTAAGGTCACCTATCCGGGTCTGACGAAAGTTCTGGCGCTGAAGGTCGATAACGCCGAA

ACCATTAAAAAGGAACTGGGCCTGTCTCTGACCGAACCGCTGATGGAACAAGTGGGTACG

GAAGAATTTATCAAACGTTTCGGCGATGGTGCATCGCGTGTCGTGCTGAGCCTGCCGTTT

GCTGAAGGCAGTTCCTCAGTGGAATACATTAACAATTGGGAACAAGCAAAAGCTCTGTCA

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TATATGGCTCAGGCGTGTGCGGGCAATCGCGTCCGTCGCTAAGGCTCGGGCTCTGGCCAA

TACATCAAGGCGAACAGCAAATTCATCGGCATCACGGAACTG

GGATCC

将空白质粒和合成的P2‐CRM197A‐P2基因的PCR产物中，分别加入NdeI酶和BamHI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于‐20℃以下冰箱中。

2‐3、CRM197A‐P2、P2‐P2‐CRM197A、CRM197A‐P2‐P2、P2‐P2‐CRM197A‐P2、以及P2‐CRM197A‐P2‐P2蛋白载体表达质粒的构建

方法和上节“2‐1、P2CRM197A蛋白载体表达质粒的构建”相同。

三、含有万能表位肽P2CRM197A蛋白载体和CRM197A蛋白载体的制备

实验结果表明，CRM197A蛋白载体和含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体的特性相似；因此，这些蛋白载体的纯化方法相似，以下以含有P2万能表位肽的CRM197A蛋白载体为例说明方法。

1、表达含有万能表位肽P2CRM197A蛋白载体工程菌的制备

用分子生物学标准方法将各个表达蛋白载体的质粒转入至感受态细胞内，并进行表达检定。筛选出蛋白表达量高，并且通过用抗血清检定合格的克隆，建立主种子库和工作种子库。

2、含有万能表位肽P2CRM197A蛋白载体表达工程菌的发酵

从大肠杆菌工程菌工作种子库低温冰箱中，取出一支含有万能表位肽P2CRM197A蛋白载体的工作种子管，在室温下解冻；将种子管中的菌液无菌转移至50毫升的培养基中，在37℃，摇速为180rpm的摇床中培养至OD₆₀₀＝1.0左右；将菌液无菌接种至1升的培养基中，在37℃，摇速为180rpm的摇床中培养至OD₆₀₀＝1.0左右；接种种子液至50升发酵罐中的20升培养基中，在37℃下，240rpm条件下进行发酵，当OD₆₀₀至7‐8时，加入IPTG诱导重组蛋白在细菌中合成；发酵至14小时后，停止发酵，离心，收集菌体待用。

3、含有万能表位肽的P2CRM197A蛋白载体的纯化

由于构建含有不同万能表位肽的蛋白载体都是以CRM197A为主体，实验表明，尽管加入了万能表位肽，但对蛋白纯化的参数影响不大，只需要在纯化CRM197A蛋白载体的工艺参数上进行一些修饰，就可建立起其他含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体的纯化方法。

称重50g湿菌体于2升离心杯中，加入300ml1xPBSpH7.0的缓冲液混悬菌体，在磁力搅拌器上搅拌混匀30min；在4℃下，4000rpm，离心20min，弃上清，收集菌体；重复该步骤两次；加入300ml1xPBSpH7.0至菌体离心管，在均质机上进行破碎；在4℃下，10000rpm，离心20min，收集沉淀，弃上清液；加入300ml1xPBSpH7.0缓冲液，在磁力搅拌器上搅拌30min；在4℃下，4000rpm，离心20min，弃上清液，收集包涵体；加入900ml变性缓冲液至洗涤后的包涵体，在25℃下，10000rpm离心30min，收集上清液，弃沉淀；将离心上清液转移至6‐8KD透析袋中，封闭透析袋；置透析袋于10升复性缓冲液1中，室温下，在磁力搅拌器上搅拌透析过夜；次日将透析袋转入10升复性缓冲液2中，室温搅拌透析8‐10小时；将透析袋转入10升复性缓冲液3中，室温搅拌透析过夜；次日将透析袋转入10升复性缓冲液4中，室温搅拌透析8‐10小时；将透析袋转入10升复性缓冲液5中，室温搅拌透析过夜；次日将透析袋转入2升储备缓冲液中，室温搅拌透析8‐10小时；更换储备缓冲液二次，室温透析过夜；取1ml透析液，室温12000rpm离心10min，收集上清，测蛋白质浓度；将蛋白溶液上样至预先平衡的DEAE胶柱，用等梯度洗脱，并收集目的蛋白峰；然后上样至Phenyl疏水柱进一步纯化，收集洗脱峰；最后上样SP胶柱，收集洗脱峰；将收集获得的纯化目的蛋白转至透析袋中，在0.15M的氯化钠中透析，完成后转移至4℃下储存待用。

四、流行性脑膜炎球菌荚膜多糖的制备

1、种子库的建立

由赠送获得的流行性脑膜炎球菌A、C、Y、和W135群菌株作为原始种子株建立主种子库和工作种子。由于这4群脑膜炎球菌的培养特性相同，在这里同一叙述方法。

取出原始种子的种子管，加入0.5ml的流脑培养基将菌种混匀，取0.25ml菌液接种至10ml流脑培养液中。接种后的培养液管置于36℃±1℃的培养摇床上，摇速120rpm，培养12‐20小时。待OD₆₀₀至1.0时，用接种环将菌液接种至流脑琼脂培养基平皿上，置于36℃±1℃的培养箱内培养12‐20小时。用接种环将接种的流脑琼脂培养平皿上的1至数个菌落接种于10ml的流脑培养液中，置于36℃±1℃，在培养摇床上培养12小时，摇速150‐200rpm。培养液中细菌OD₆₀₀长到1.0，取出5ml菌液接种到200ml的新鲜流脑培养液中，置于36℃±1℃的培养摇床上培养12小时左右，摇速150‐200rpm。OD₆₀₀至1.0时，将细菌培养液以1ml分装于200个小试管中，离心(4000rpm，10min)，去除上清培养液，然后加入0.5ml的新鲜的流脑培养液和0.5ml的无菌脱脂牛奶，混匀，在乙醇干冰上快速冷冻。真空冻干，编号，作为主种子批保存于4℃冰箱内。取出主种子批建立，按照主种子建立方法，将细菌培养液接种到另一个200ml的新鲜流脑培养液中，置于36℃±1℃的培养摇床上培养12小时，内培养12小时左右，摇速150‐200rpm。待OD₆₀₀至1.0时，将细菌培养液以1ml分装于200个小试管中，离心(4000rpm，10min)，去除上清培养液，然后加入0.6ml的新鲜流脑培养液和0.4ml的40％甘油溶液，混匀。速冻于干冰上，作为工作种子保存于‐70℃低温冰箱中。

2、细菌发酵

将流行性脑膜炎球菌工作种子接种到平皿培养基上，在36.5℃培养箱过夜。取一个流脑菌斑，接种到5毫升的新鲜流脑培养液中，在36.5℃和300rpm细菌培养摇床培养。当接种的培养液达到了指数生长中期，OD为0.6‐1.0，将菌液转接到250毫升培养瓶中，其中有45毫升的新鲜流脑培养液，在36.5℃和300rpm细菌培养摇床培养。当接种的培养液达到了指数生长中期，OD为0.6‐1.0，将菌液转接到4升培养瓶中，其中有1升的新鲜流脑培养液，在36.5℃和300rpm细菌培养摇床培养。当菌液达到了指数生长中期(约10‐12小时)，OD为0.6‐1.0，将菌液转接到发酵罐中，其中有20升的新鲜流脑培养液。当细菌达到指数生长中期时，加入新鲜流脑培养液和补充培养液，培养了20小时停止发酵。

3、多糖纯化

将流脑菌液离心沉淀的菌体，悬浮在2升的蒸馏水中，用磁力搅拌器混匀。加入200ml的12％Deoxycholatesodium溶液入细菌悬浮液中，搅拌混匀30分钟，然后转入到10℃±3℃冷柜中搅拌8–24小时，保证菌体完全裂解、多糖释放出来。用50％的醋酸调节细菌裂解液的pH值到6.4–6.8，温度为20℃±5℃，停止搅拌，静置12–24小时。以10,000rpm离心1小时，收集上清液，丢弃沉淀物。用0.05M的磷酸盐pH7.0透析多糖上清液。加入等体积的0.2％HB溶液，用磁力搅拌器混匀30分钟，然后，转入到4℃冷柜中静置过夜。以10,000rpm离心30min，收集沉淀，丢弃上清液，加入100ml的0.5M氯化钠溶液溶解沉淀；加入680ml无水乙醇，混匀，然后，转入到4℃冷柜中静置过夜。以10,000rpm离心30min，收集上清液，丢弃沉淀，加入5.2升无水乙醇，混匀，然后，转入到4℃冷柜中静置过夜。以10,000rpm离心30min，收集沉淀，丢弃上清液，加入500ml的蒸馏水溶解沉淀，透析。冻干。

步骤二：四种流行性脑膜炎球菌多糖P2CRM197A结合物的制备

本发明采用ADH法来合成流行性脑膜炎球菌多糖P2CRM197A结合物，该方法分两个步骤，即多糖的衍化和结合物合成。

一、流行性脑膜炎球菌A群多糖‐P2‐CRM197A结合物(称为MenA‐P2‐CRM197A)的合成

1、流行性脑膜炎球菌A群多糖衍化

将20mg的MenA多糖用4ml纯水溶解后，加入溴化氰进行活化。向反应液中加入10ml的ADH溶液，最终浓度为0.4M，在2～8℃混合反应过夜。将反应液在0.2mol/L氯化钠溶液中透析。将反应液上样G‐50柱，收集外水体积峰。将结合物溶液至于透析袋中，用纯水透析，冷冻真空干燥，得到固体的衍化多糖。多糖衍生物应保存在‐20℃或以下。

2、流行性脑膜炎球菌A群多糖‐P2‐CRM197A结合物的合成

称取5mg衍化MenA多糖至反应瓶中，加入0.5ml的0.15MNaCl至反应瓶中，搅拌溶解多糖，先在室温下，然后转至4℃下过夜，以保证多糖溶解完全，溶液中多糖浓度为20mg/ml。用0.45μm膜无菌过滤多糖溶液至反应瓶，用0.1MNaOH或者0.1MHCl调节pH值至5.5。加入相当于5mg的P2CRM197A溶液至反应瓶中，搅拌混匀。加入2.9mg的EDC至培养瓶中。在室温下搅拌反应4小时。转移反应混合液至透析袋(MWCO6‐8000)，用0.15MNaCl溶液，4℃下透析，换液三次。上样SepharoseCL‐4B纯化，收集外水体积峰。根据分析结果，合并结合物峰值管。无菌过滤，储存在4℃下待用。

3、其它单价流行性脑膜炎球菌多糖‐P2‐CRM197A结合物的合成

参照上节“流行性脑膜炎球菌A群多糖‐P2‐CRM197A结合物的合成”方法来合成其它三种结合物，包括流行性脑膜炎球菌C群多糖‐P2‐CRM197A结合物(称为MenC‐P2‐CRM197A)、流行性脑膜炎球菌W135群多糖‐P2‐CRM197A结合物(称为MenW135‐P2‐CRM197A)、以及流行性脑膜炎球菌Y群多糖‐P2‐CRM197A结合物(称为MenY‐P2‐CRM197A)。

二、其它含有万能表位肽P2的CRM197A蛋白载体的4种流行性脑膜炎球菌多糖CRM197A结合物的合成

参照“流行性脑膜炎球菌A群多糖‐P2‐CRM197A结合物的合成”方法，用其它六种含有万能表位肽的蛋白载体，包括CRM197A‐P2、P2‐CRM197A‐P2、P2‐P2‐CRM197A、CRM197A‐P2‐P2、P2‐P2CRM197A‐P2、P2‐CRM197A‐P2‐P2、以及对照样品合成用蛋白载体CRM197A，合成了其它结合物，即MenA‐CRM197A‐P2、MenC‐CRM197A‐P2、MenW135‐CRM197A‐P2、MenY‐CRM197A‐P2；MenA‐P2‐CRM197A‐P2、MenC‐P2‐CRM197A‐P2、MenW135‐P2‐CRM197A‐P2、MenY‐P2‐CRM197A‐P2；MenA‐P2‐P2‐CRM197A、MenC‐P2‐P2‐CRM197A、MenW135‐P2‐P2‐CRM197A、MenY‐P2‐P2‐CRM197A；MenA‐CRM197A‐P2‐P2、MenC‐CRM197A‐P2‐P2、MenW135‐CRM197A‐P2‐P2、MenY‐CRM197A‐P2‐P2；MenA‐P2‐P2‐CRM197A‐P2、MenC‐P2‐P2‐CRM197A‐P2、MenW135‐P2‐P2‐CRM197A‐P2、MenY‐P2‐P2‐CRM197A‐P2；MenA‐P2‐CRM197A‐P2‐P2、MenC‐P2‐CRM197A‐P2‐P2、MenW135‐P2‐CRM197A‐P2‐P2、MenY‐P2‐CRM197A‐P2‐P2。

步骤三、4价流行性脑膜炎球菌多糖P2CRM197A结合物配制及免疫原性的评估

一、4价流行性脑膜炎球菌多糖‐P2‐CRM197A结合物的配制

用Millipore的Labscale超滤系统将制备的MenA‐P2‐CRM197A、MenC‐P2‐CRM197A、MenW135‐P2‐CRM197A、以及MenY‐P2‐CRM197A结合物溶液浓缩至多糖浓度大约为1000μg/ml，然后用0.85％的NaCl溶液稀释并混合至每个群多糖浓度为100μg/ml的4价流行性脑膜炎球菌多糖‐P2‐CRM197A结合物(称为4Men‐P2‐CRM197A)，用0.22μm膜除菌过滤，加入无菌磷酸铝佐剂，最终浓度为125mg/ml，置于2‐8℃冰箱中储存待用。

按照以上方法分别配制其它4价流行性脑膜炎球菌多糖P2CRM197A结合物：

4Men‐CRM197A‐P2、4Men‐P2‐CRM197A‐P2、4Men‐P2‐P2‐CRM197A、4Men‐CRM197A‐P2‐P2、4Men‐P2‐P2‐CRM197A‐P2、以及4Men‐P2‐CRM197A‐P2‐P2结合物。

二、免疫动物

取5‐6周的KM57系小鼠240只，每支小鼠免疫注射制备的7种Men‐P2CRM197A结合疫苗，注射容量为0.1ml/支小鼠/次。每种结合疫苗设定为三组，即免疫注射一针、二针和三针。

采集小鼠血液至离心管，在室温下静置2小时，在10000rpm条件下离心10分钟，用移液枪小心吸取离心上清血清，储存于4℃冰箱中，待检。

三、ELISA法检测小鼠血清中流脑多糖抗体IgG滴度及结合物免疫原性的评估

配制特定血清群流脑荚膜多糖储备液1mg/ml(1×PBS溶液中)，存储于冰箱。用包被缓冲液稀释至4μg/ml，加100μl包被溶液到每一个孔中来包被ELISA板，在室温下孵育过夜。用洗板缓冲液洗4次，加入100μl封闭缓冲液，在室温下孵育2小时，用洗板缓冲液洗4次，可在4℃下保存一周。

将小鼠免疫结合疫苗及对照样品获得的待测血清，以1:10稀释成工作样品血清，稀释适当倍数，加入到ELISA板第一排孔内，总体积200μl，从第一排开始向下进行二倍系列稀释，在室温下孵育2小时。用洗板缓冲液洗4次，加入100μl碱性磷酸酶标记羊抗鼠抗体(1:2000稀释)，在室温下孵育4小时。用洗板缓冲液洗4次，加入100μl磷酸‐4‐硝基苯酯二钠盐底物溶液，在405nm读盘。

下表为小鼠结合物免疫血清中多糖IgG抗体滴度结果表：

从以上各群流脑多糖抗体滴度可见，和不含有P2万能表位肽蛋白载体合成的4价流行性脑膜炎球菌多糖CRM197A结合物比较，含有P2万能表位肽的4价流行性脑膜炎球菌多糖P2CRM197A结合物，多糖特异性抗体IgG滴度提高3‐5倍，第三针血清和第一针血清中抗体滴度比较，IgG滴度提高了4倍以上，(p值<0.05)，符合WHO对多糖蛋白结合物免疫原性提高的标准。

参考文献

1、Panina‐Bordignono P,Tano A,Termijtelen A,Universally immunogenicTcell epitopes promiscuous binding to human MHC class II and promiscuousrecognition by T cells,Eur.J.Immunol.19:2237‐2242,1989。

2、Su Y,Rossi R,De Groot AS,Regulatory T cell(Tregitopes)in IgG inducetolerance in vivo and lack immunogenicity per se.J Leukoc Biol.94(2):377‐383,2013。

3、Giannini G,Rappuoli R,Ratti G,the amino‐acid sequence of two non‐toxic mutants of diphtheria toxin:CRM45and CRM197.Nucleic acids research,12:4063‐4069,1984。

Claims (2)

1.一种增强4价流行性脑膜炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法，其特征在于：

步骤一：在白喉毒素变异体CRM197的A链(简称CRM197A)中加入万能表位肽QYIKANSKFIGITEL(简称P2)，通过基因重组工程菌来生产含有P2的CRM197A蛋白载体(简称P2CRM197A)；

步骤二：将4种不同群的流行性脑膜炎球菌多糖，包括A、C、W135、和Y，通过共价键分别与P2CRM197A蛋白载体连接形成4种单价流行性脑膜炎球菌多糖-P2CRM197A结合物；

步骤三：将步骤二获得的4种单价流行性脑膜炎球菌多糖-P2CRM197A结合物进行混合得到免疫原性增强的4价流行性脑膜炎球菌多糖蛋白结合物；

在所述P2CRM197A载体蛋白中含有1个P2；

在所述P2CRM197A蛋白载体中，P2连结在CRM197A蛋白的N-末端或C-末端；

所述P2与CRM197A蛋白之间是通过GSGSG氨基酸序列进行连接；

所述基因重组工程菌是通过基因重组方法构建的大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的增强4价流行性脑膜炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法，其特征在于：所述流行性脑膜炎球菌多糖是通过分别培养4个不同群的流行性脑膜炎球菌，即A、C、W135、和Y群，获得的荚膜多糖。