CN104107428A - 一种能够增强13价肺炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够增强13价肺炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法，通过在CRM197A中加入万能表位肽OVAp，并采用基因重组大肠杆菌来生产含有万能表位肽的白喉毒素变异体CRM197的A链的蛋白载体OVApCRM197A；然后将13种不同血清型多糖通过共价键连接至所述含有万能表位肽的OVApCRM197A蛋白载体上形成13价肺炎球菌多糖-OVApCRM197A结合物；采用这种方法获得的13价肺炎球菌多糖-OVApCRM197A结合物与不含有万能表位肽的对应蛋白载体CRM197A获得的13价肺炎球菌多糖-CRM197A结合物相比较，其免疫原性比对照提高了3-5倍。

Description

一种能够增强13价肺炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法

技术领域

本发明涉及一种能够增强13价肺炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法。 

背景技术

当多糖以共价键连接至蛋白载体上时，能将半抗原的多糖转变成全抗原，使得多糖的免疫原性得到增强。以此方法合成的多糖蛋白结合疫苗已被广泛地应用于小儿，成功地预防了包括肺炎球菌、流行性脑膜炎球菌以及流行性嗜血杆菌b型等细菌的感染。 

用于合成多糖蛋白结合物的蛋白载体有多种，如破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素变异体CRM197以及基因重组技术生产的流行性嗜血杆菌表面蛋白D等；但是，由于不同蛋白的免疫特性，以不同蛋白载体合成的多糖蛋白结合物的免疫原性有差异，动物体免疫后，对于由不同蛋白载体与同一种多糖合成形成的多糖蛋白结合物，所显现的多糖免疫原性也不同。由此可见，采用不同技术生产的蛋白载体，合成出来的多糖蛋白结合物的免疫原性有差异。 

进入动物机体内后，抗原经抗原处理细胞(Antigen Process Cell,APC)处理后产生表位肽(epitope)[1]，在和主要组织相容性复合物(Major Histocompatibility Complex,MHC)分子结合后，进而呈现在APC细胞表面，能够被T淋巴细胞识别，这是免疫学通过实验已经得出的结论。现在知道，一个已知表位肽的免疫原性取决于三个因素： 

第一、适当表位肽的产生； 

第二、和表位肽结合的主要组织相容性复合物分子的呈现； 

第三、识别表位肽与主要组织相容性复合物形成的结合物的T细胞的呈现。 

其中，任何一个环节的缺少都将导致免疫应答缺失。 

用小鼠进行的试验表明，缺乏适当的表位肽与主要组织相容性复合物形成的结合物分子是最常导致动物体免疫响应缺失的原因。主要组织相容性复合物具有高度的多形态性，已知的表位肽仅通过一个或者几个等位基因(Alleles)就可结合至主要组织相容性复合物，而不是全部表位肽片段。另外，有实验结果显示，由于抗原处理不适当，或者T细胞耐受性空缺，也会导致免疫响应的缺失。 

有实验表明，OVAp表位肽是由ISQAVHAAHAEINEAGR氨基酸序列组成[2]，可和大量不同的主要组织相容性复合物Class II结合，显示其能够被T细胞识别，具有万能免疫原性的特性，被称之万能表位肽。 

万能免疫原性表位肽具有和多个人类主要组织相容性抗原复合物Class II分子的同型和异型体结合。这种万能表位肽和人类主要组织相容性抗原复合物Class II分子随机的结合可用于开发合成疫苗，因为其能够激活人群中的大部分个体的获得性免疫系统的应答。 

研究表明，OVAp表位肽由卵清蛋白的323‐339氨基酸序列组成(ISQAVHAAHAEINEAGR)。在含有该表位肽的卵清蛋白进入机体后，蛋白将被摄入至APC细胞内，被消化降解。但是，这些表位肽将保存完整，在和主要组织相容性复合物结合后，被呈现在APC细胞表面，并被T细胞识别，这表明万能表位肽以相同的方式和多种DR分子作用。 

MHC分子是加工后抗原的杂性受体，其功能是在胸腺中的免疫耐受诱导和周边免疫响应外来抗原的过程中，来呈现其抗原中的表位肽。因此，MHC分子必须在呈现大量的表位肽(容许更好的抗原识别，但更多的消耗T细胞储备)，和少许表位肽(大量的T细胞储备，但是少许有效地呈现外来抗原)中达到平衡。也就是说，如果抗原中含有在APC细胞处理后能够保存完整性、并具有代表性的少量表位肽，在和MHC结合后，就能够刺激一定量的T细胞，来建立免 疫记忆效应，而这一过程不会消耗过量的T细胞，以避免消耗大量的T细胞，造成免疫耐受。含有这种表位肽的抗原具有更强的免疫原性，这也就解释了为什么破伤风类毒素具有很强的免疫原性的原因。 

现发现的大部分T细胞的刺激表位肽对于不同MHC Class II单体(haplotype)作用有限，不同动物保存和呈现不同的抗原多肽区域(epitopes)来刺激其T细胞。这种T细胞刺激活性的基因限制阻碍了以合成方法来开发疫苗，而这种方法对于基因上不同的人群的应用，应该是非常有效的方法。那些被发现具有刺激多重小鼠个体和/或与大多数人体MHCClassII分子相关联的T细胞刺激表位肽，提供了一个设计万能活化T细胞的有效途径。在普通的蛋白抗原中加入万能表位肽(也称为万能T细胞抗原簇)OVAp，能够被大多数动物的MHC Class II分子识别。这种T细胞抗原簇能够用于直接诱导T细胞，或提供帮助B细胞生产针对于弱免疫原的抗体，增强机体获得性免疫应答的效应。 

致病性细菌通常能够表达高分子量，包裹在细菌表面的是荚膜多糖，简称多糖。对于成人来说，荚膜多糖是具有很好的免疫原性抗原，可用于制备疫苗；但是，对于小儿，即2岁以下的婴幼儿，荚膜多糖被认为是非依赖于T细胞抗原。实验显示，当用作为抗原时，荚膜多糖可诱导野株或者T细胞缺失小鼠生产多糖特异性IgM抗体的响应；但是，并不诱导IgM抗体向IgG抗体的转化。人体实验也显示，作为疫苗，多糖可以诱导成人生产保护性抗体，但无法诱导婴幼儿的免疫应答；也就是说，在小儿重复免疫荚膜多糖抗原后，无第二次抗体增强响应，也无法诱导持续的T细胞记忆。 

现代免疫学实验证实，多糖蛋白结合疫苗和纯多糖疫苗比较的优势在于，前者能够诱导免疫响应。当非依赖T细胞的荚膜多糖共价键地连接至载体蛋白而形成的多糖蛋白结合物，在免疫了哺乳动物后，可诱导T细胞来帮助B细胞产生针对于结合物中的多糖部分的IgG抗体。因此，多糖蛋白结合物诱导多糖特异性抗体IgM转化为IgG，记忆B细胞的分化，以及长期存在的T细胞记忆。 

肺炎球菌，也称肺炎链球菌，是在世界范围内导致人类发病和死亡的主要病菌之一，尤其在婴幼儿、慢性心肺疾病患者、老年人以及免疫功能低下者中，易引发诸如细菌性肺炎、脑膜炎、菌血症和急性中耳炎等疾病。据1999年世界卫生组织(WHO)流行病学调查报告估计，每年至少有一百万5岁以下的婴幼儿和儿童死于肺炎球菌所致的各种疾病。据工业发达国家报道，2岁以下婴幼儿的侵入性肺炎球菌性肺炎的发病率高达每十万人中160个病例；在欧美国家，25％－40％的细菌性脑膜炎是由肺炎球菌引起的。美国每年约有15万～57万例肺炎球菌性肺炎，2600～6200例肺炎球菌性脑膜炎，每年两者共计造成4万人死亡；肺炎球菌菌血症的发病率在15/10万～19/10万左右，病死率约25％～30％。另外，细菌性中耳炎中有50％～67％为肺炎球菌所致，常难以根治，复发率高，影响儿童的健康生长发育。据统计，仅在美国每年婴幼儿因中耳炎到医院就诊就高达七百万人次，给医疗系统带来了沉重负担。因此，当美国惠氏制药研制成功七价肺炎多糖结合疫苗，并得到美国FDA生产销售许可证后，美国儿科学会的传染病委员会以及美国免疫试验顾问委员会于2000年初立即建议在2岁以下的婴幼儿以及免疫力低下的2－4岁的儿童中接种该疫苗。 

多项肺炎球菌的流行病学调查结果表明，不同的国家和地区，肺炎球菌的流行菌株即血清型有所不同。以美国惠氏公司的7价肺炎球菌多糖结合疫苗为例，其疫苗在北美的涵盖率为80‐90％，欧洲的涵盖率约为70‐80％，而在亚洲的涵盖率仅为40‐50％。分析其原因所在，发达国家的肺炎球菌血清型谱的分布比较狭窄，而不发达国家的肺炎球菌血清型谱的分布比较宽广。这就是为什么美国惠氏公司的7价肺炎球菌多糖结合疫苗无法在亚洲地区进行推广应用的根本原因。根据中国以及东南亚地区近5年的临床上0‐5岁的儿童，特别是2岁以下婴幼儿的肺炎球菌的流行病学调查报告，发现有13种血清型基本涵盖了80‐90％的流行菌株，包括1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。据此，美国辉瑞开发出来13价肺炎球菌多糖结合疫苗，欧洲的GSK开发出了10 价肺炎球菌多糖结合疫苗。 

肺炎球菌多糖结合疫苗在预防小儿由肺炎球菌感染导致的肺炎、脑膜炎、中耳炎等严重的传染病中发挥了巨大的作用。不过，市场上现有的肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗的免疫原性变异性较大，这种变异性除了是由于不同血清型多糖的结构差异性的原因外，不同免疫原性蛋白载体的使用，也是导致13价肺炎球菌多糖蛋白结合物的免疫原差异主要原因。在某些高危人群中，比如小儿、老年人或免疫功能低下人，低免疫原性的多糖蛋白质结合疫苗的免疫效果不佳，保护性受到限制。因此，开发出免疫原性更强的肺炎球菌多糖蛋白结合疫苗，仍然是该领域努力的方向。 

发明内容

本发明的目的是提供一种能够增强13价肺炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法，采用基因重组技术生产的含有万能表位肽蛋白载体OVApCRM197A，在多糖蛋白质结合物中引入万能表位肽OVAp。在这种多糖蛋白结合物进入动物体后，经过抗原呈递细胞(APC)吞噬消化降解后，其万能表位肽OVAp和部分肺炎球菌多糖重复单位、主要组织相容性复合物ClassII结合，可有效地刺激T细胞，进而增强结合物中肺炎球菌多糖的免疫原性，导致针对于肺炎球菌荚膜多糖的抗体浓度增加。 

本发明采取的技术方案如下： 

一种能够增强13价肺炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法，其特征在于： 

步骤一：在白喉毒素变异体CRM197的A链(简称CRM197A)中加入万能表位肽ISQAVHAAHAEINEAGR(简称OVAp)，通过基因重组工程菌来生产含有OVAp的CRM197A蛋白载体(简称OVApCRM197A)； 

步骤二：将13种不同血清型的肺炎球菌荚膜多糖，包括1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F，通过共价键分别与OVApCRM197A蛋白载体连接形成13种单价肺炎球菌多糖‐OVApCRM197A结合物； 

步骤三：将步骤二获得的13种单价肺炎球菌多糖‐OVApCRM197A结合物进行混合得到免疫原性增强的13价肺炎球菌多糖蛋白结合物。 

进一步，在所述OVApCRM197A蛋白载体中含有X个OVAp，1≤X≤3。 

进一步，在所述OVApCRM197A蛋白载体中，OVAp连结在CRM197A蛋白的N‐末端或C‐末端，或者同时连接在N‐末端和C‐末端。 

进一步，所述OVAp与CRM197A蛋白之间是通过GSGSG氨基酸序列进行连接。 

进一步，所述基因重组工程菌是通过基因重组方法构建的大肠杆菌。 

进一步，所述肺炎荚膜多糖是通过分别培养13个不同血清型的肺炎球菌获得的荚膜多糖。 

具体实施方式

下面举例说明本发明的具体实施方法，但不仅局限于以下实例。 

第一步，载体蛋白和肺炎球菌多糖的制备 

为说明本发明的有效性，制备了两种载体蛋白，即含有OVAp的蛋白载体OVApCRM197A和不含OVAp的蛋白载体CRM197A。其中，CRM197A蛋白载体是用于合成对照用13价肺炎球菌多糖‐CRM197A结合物样品。 

一、CRM197A蛋白载体和OVApCRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计 

1、CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计 

白喉毒素是由带有白喉毒素基因的β噬菌体在白喉杆菌内表达，在细菌胞浆中存在形式为多肽，由560个氨基酸组成，分子量为62,000道尔顿。其氨基酸序列如下： 

MSRKLFASILIGALLGIGAPPSAHAGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSE SPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS 

当分泌至细菌体外前，多肽N‐末端的25个引导氨基酸序列被切除掉，变成了由535个氨基酸组成，分子量为58kD的单链多肽而分泌至细菌体外，其氨基酸序列如下： 

GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS 

分泌至细菌体外的白喉毒素被酶切为A链和B链，其间由一个二硫键连接而形成一个蛋白分子。这两个多肽链具有不同的功能，A链为白喉毒素蛋白分子的N‐末端片段，分子量为21kD，由193个氨基酸组成。它是白喉毒素的毒性功能部分，通过在真核生物细胞浆内，将二磷酸三腺苷核糖(ADP‐Ribosyl)的异柠檬酸脱氢酶(NAD⁺)部分转移至延伸因子2(Elongation Factor‐2，EF‐2)上，从而抑制细胞中的蛋白质合成，进而抑制细胞生长，造成细胞伤亡。B链为白喉毒素蛋白分子的C‐末端片段，分子量大约为37kD，由342个氨基酸组成。B链的功能是识别敏感细胞表面的特异性受体，将白喉毒素吸附在敏感细胞上，帮助A 链进入细胞内。 

白喉毒素的A链具有良好的水溶性，其氨基酸序列如下： 

GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR

研究发现[3]，由于β噬菌体上的毒素基因tox的突变，对于噬菌体的复制没有影响；但是，合成出来的毒素的毒性可能消失，或大大地降低，而形成白喉毒素突变体(Cross Reacting Material，CRM)，而且白喉毒素突变体的血清学免疫原性仍然和毒素相关联。比如，白喉毒素突变体CRM197，无白喉毒素的毒性，从氨基酸序列分析来看是由于A链中的第52位氨基酸，由甘氨酸(Gly)突变成谷氨酸(Glu)，其氨基酸序列如下： 

GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR

试验研究表明，与其它现在市场上用于肺炎球菌结合疫苗合成的蛋白载体比较，白喉毒素变异体CRM197蛋白A链多肽具备以下一些优势，如其免疫原性和白喉毒素及白喉内毒素相关联、分子量小、水溶性高、易于生产和进行大分子合成反应。长期的白喉类毒素疫苗的临床使用，已经证明其安全性和有效性。 

2、含有OVAp万能表位肽的OVApCRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计 

将万能表位肽OVAp连接至CRM197A蛋白载体上，构建出一种新的用于合成多糖蛋白质结合物的蛋白载体。所用的万能表位肽OVAp可连接至CRM197A蛋白的N‐末端或C‐末端；也可将两个不同的万能表位肽分别连接至CRM197A蛋白载体的N‐末端或C‐末端；另一种方式是将两个万能表位肽自身连接，然后再连 接至CRM197A蛋白载体N‐末端或者C‐末端；还有一种方式是将一个万能表位肽连接至C‐末端或者N‐末端，两个自身连接的万能表位肽连接至另一端。 

2‐1、含有万能表位肽OVAp的OVApCRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计 

2‐1‐1、OVAp‐N‐末端CRM197A蛋白载体(称为OVAp‐CRM197A)氨基酸序列的设计 

通过将OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR加入至CRM197A蛋白载体的N‐末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下： 

ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDW 

KEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGT 

EEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR 

在OVAp氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的N‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为OVAp‐CRM197A蛋白载体。 

2‐1‐2、CRM197AC‐末端‐OVAp蛋白载体(称为CRM197A‐OVAp)氨基酸序列的设计 

通过将OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR加入至CRM197A蛋白载体的C‐末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下： 

MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR

在OVAp氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为CRM197A‐OVAp蛋白载体。 

2‐1‐3、OVAp‐N‐末端CRM197AC‐末端‐OVAp蛋白载体(称为OVAp‐CRM197A‐OVAp)氨基酸序列的设计 

通过将两个OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR分别加入至CRM197A蛋白载体的N‐末端和C‐末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下： 

ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRL

在OVAp氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的N‐末端和C‐末端之间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为OVAp‐CRM197A‐OVAp蛋白载体。 

2‐1‐4、OVAp‐OVAp‐N‐末端CRM197A蛋白载体(称为OVAp‐OVAp‐CRM197A)氨基酸序列的设计 

通过将两个OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的N‐末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下： 

ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR 

在两个自身连接的OVAp氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的N‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为OVAp‐OVAp‐CRM197A蛋白载体。 

2‐1‐5、CRM197AC‐末端‐OVAp‐OVAp蛋白载体(称为CRM197A‐OVAp‐OVAp)氨基酸序列的设计 

通过将两个OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR自身连接，然后再加入 至CRM197A蛋白载体的C‐末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下： 

GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR

在两个自身连接OVAp氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为CRM197A‐OVAp‐OVAp蛋白载体。 

2‐1‐6、OVAp‐OVAp‐N‐末端CRM197AC‐末端‐OVAp蛋白载体(称为OVAp‐OVAp‐CRM197A‐OVAp)氨基酸序列的设计 

通过将两个OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的N‐末端；另外，将一个OVAp加入至CRM197A蛋白载体的C‐末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下： 

ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR

在两个自身连接OVAp氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为OVAp‐OVAp‐CRM197A‐OVAp蛋白载体。 

2‐1‐7、OVAp‐N‐末端CRM197AC‐末端‐OVAp‐OVAp蛋白载体(称为OVAp‐CRM197A‐OVAp‐OVAp)氨基酸序列的设计 

通过将一个OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR连接至CRM197A蛋白载体的N‐末端；另外，将两个OVAp进行自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白 载体的C‐末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下： 

ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR

在两个自身连接OVAp氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C‐末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为OVAp‐CRM197A‐OVAp‐OVAp蛋白载体。 

二、CRM197A蛋白载体和含有万能表位肽的OVApCRM197A蛋白载体表达质粒的构建 

1、CRM197A蛋白载体表达质粒的构建 

从GenBank获取CRM197蛋白完整氨基酸序列PRF:224021，确定CRM197蛋白的A链片段，CRM197的氨基酸1‐193为CRM197的A链片段。以此为依据，对该片段的氨基酸的核酸序列进行优化，以便在大肠杆菌表达系统中高效表达。采用自制的表达质粒，用NdeI酶识别质粒位点CATATG，BamHI酶识别位点 

GGATCC。经过对CRM197A的基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。CRM197A蛋白基因合成序列如下： 

CATATG 

GGTGCGGACGACGTTGTGGACTCCTCAAAATCGTTTGTCATGGAAAACTT 

CAGCTCTTAT 

CATGGCACCAAACCGGGTTACGTGGACTCCATTCAGAAGGGCATCCAAAA 

ACCGAAGTCA 

GGCACCCAGGGTAACTACGATGACGATTGGAAGGAATTCTACAGCACGGA 

CAATAAGTAT 

GATGCGGCCGGCTACTCTGTTGACAACGAAAATCCGCTGAGTGGTAAAGC 

AGGCGGTGTG 

GTTAAGGTCACCTATCCGGGTCTGACGAAAGTTCTGGCGCTGAAGGTCGA 

TAACGCCGAA 

ACCATTAAAAAGGAACTGGGCCTGTCTCTGACCGAACCGCTGATGGAACA 

AGTGGGTACG 

GAAGAATTTATCAAACGTTTCGGCGATGGTGCATCGCGTGTCGTGCTGAG 

CCTGCCGTTT 

GCTGAAGGCAGTTCCTCAGTGGAATACATTAACAATTGGGAACAAGCAAA 

AGCTCTGTCA 

GTTGAACTGGAAATCAATTTCGAAACGCGTGGCAAACGCGGTCAAGATGC 

TATGTATGAA 

TATATGGCTCAGGCGTGTGCGGGCAATCGCGTCCGTCGCTAA 

GGATCC 

将空白质粒和合成的CRM197A蛋白基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子，并储存于‐20℃以下冰箱中。 

2、含有万能表位肽的OVApCRM197A蛋白载体表达质粒的构建 

2‐1、OVAp‐CRM197A蛋白载体表达质粒的构建 

采用自制的空白表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。经过对OVAp‐CRM197A蛋白载体基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。OVAp‐CRM197A基因合成全序列如下： 

CATATG 

ATCAGCCAAGCGGTTCACGCAGCCCACGCCGAAATTAACGAAGCGGGTCG 

CGGTAGCGGT 

TCTGGCGGTGCAGACGATGTTGTTGACTCCAGCAAATCATTCGTCATGGA 

AAACTTTAGC 

TCTTATCATGGCACCAAACCGGGTTACGTGGACTCCATTCAGAAAGGCAT 

CCAAAAACCG 

AAATCAGGCACCCAGGGTAACTATGATGACGATTGGAAAGAATTCTACTC 

TACGGACAAC 

AAATACGATGCGGCCGGCTACTCTGTTGACAACGAAAATCCGCTGAGTGG 

TAAAGCAGGC 

GGTGTGGTTAAAGTCACCTATCCGGGTCTGACGAAAGTTCTGGCGCTGAA 

AGTCGATAAC 

GCCGAAACCATCAAAAAAGAACTGGGCCTGTCGCTGACCGAACCGCTGAT 

GGAACAAGTG 

GGTACGGAAGAATTTATCAAACGTTTCGGCGATGGTGCATCGCGTGTCGT 

GCTGAGCCTG 

CCGTTTGCTGAAGGCAGTTCCTCAGTGGAATACATTAACAATTGGGAACA 

AGCAAAAGCT 

CTGAGTGTTGAACTGGAAATCAATTTCGAAACGCGTGGTAAACGCGGTCA 

GGACGCAATG 

TATGAATATATGGCCCAGGCTTGTGCAGGCAACCGTGTTCGCCGTTAA 

GGATCC 

将空白质粒和合成的OVAp‐CRM197A蛋白基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3) 感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子，并储存于‐20℃以下冰箱中。 

2‐2、其它OVApCRM197A蛋白载体表达质粒的构建 

根据上节“2‐1、OVAp‐CRM197A蛋白载体表达质粒的构建”方法构建下列OVApCRM197A蛋白载体表达质粒：CRM197A‐OVAp、OVAp‐CRM197A‐OVAp、OVAp‐OVAp‐CRM197A、CRM197A‐OVAp‐OVAp、OVAp‐OVAp‐CRM197A‐OVAp以及OVAp‐CRM197A‐OVAp‐OVAp。 

三、含有万能表位肽OVApCRM197A蛋白载体和CRM197A蛋白载体的制备 

本发明的实验结果表明，CRM197A蛋白载体和含有万能表位肽的OVApCRM197A蛋白载体的特性相似；因此，这些蛋白载体的纯化方法相似，以下以含有万能表位肽的OVApCRM197A蛋白载体为例说明方法。 

1、表达含有万能表位肽OVApCRM197A蛋白载体工程菌的制备 

用分子生物学标准方法将各个表达蛋白载体的质粒转入至感受态细胞内，并进行表达检定。筛选出蛋白表达量高，并且通过用抗血清检定合格的克隆，建立主种子库和工作种子库。 

2、含有万能表位肽OVApCRM197A蛋白载体表达工程菌的发酵 

从大肠杆菌工程菌工作种子库低温冰箱中，取出一含有万能表位肽OVApCRM197A蛋白载体的工作种子管，在室温下解冻；将种子管中的菌液无菌转移至50毫升的培养基中，在37℃，摇速为180rpm的摇床中培养至OD₆₀₀＝1.0左右；将菌液无菌接种至1升的培养基中，在37℃，摇速为180rpm的摇床中培养至OD₆₀₀＝1.0左右；接种种子液至50升发酵罐中的20升培养基中，在37℃下，240rpm条件下进行发酵，当OD₆₀₀至7‐8时，加入IPTG诱导重组蛋白在细菌中合成；发酵至14小时后，停止发酵，离心，收集菌体待用。 

3、含有万能表位肽的OVApCRM197A蛋白载体的纯化 

由于构建含有不同万能表位肽的蛋白载体都是以CRM197A为主体，实验表明，尽管加入了万能表位肽，但对蛋白纯化的参数影响不大，只需要在纯化CRM197A蛋白载体的工艺参数上进行一些修饰，就可建立起其他含有万能表位肽的OVApCRM197A蛋白载体的纯化方法。 

称重50g湿菌体于2升离心杯中，加入300ml1xPBSpH7.0缓冲液混悬菌体，在磁力搅拌器上搅拌混匀30min；在4℃下，4000rpm，离心20min，弃上清，收集菌体；重复该步骤两次；加入300ml1xPBSpH7.0至菌体离心管，在均质机上进行破碎；在4℃下，10000rpm，离心20min；收集沉淀，弃上清液；加入300ml1xPBSpH7.0缓冲液，在磁力搅拌器上搅拌30min；在4℃下，4000rpm，离心20min；弃上清液，收集包涵体，加入900ml变性缓冲液至洗涤后的包涵体，在25℃下，10000rpm离心30min，收集上清液，弃沉淀；将离心上清液转移至6‐8KD透析袋中，封闭透析袋；置透析袋于10升复性缓冲液1中，室温下，在磁力搅拌器上搅拌透析过夜；次日将透析袋转入10升复性缓冲液2中，室温搅拌透析8‐10小时；将透析袋转入10升复性缓冲液3中，室温搅拌透析过夜；次日将透析袋转入10升复性缓冲液4中，室温搅拌透析8‐10小时；将透析袋转入10升复性缓冲液5中，室温搅拌透析过夜；次日将透析袋转入2升储备缓冲液中，室温搅拌透析8‐10小时；更换储备缓冲液二次，室温透析过夜；取1ml透析液，室温12000rpm离心10min，收集上清，测蛋白质浓度；将蛋白溶液上样至预先平衡的DEAE胶柱，用等梯度洗脱，并收集目的蛋白峰；然后上样至Phenyl疏水柱进一步纯化，收集洗脱峰；最后上样SP胶柱，收集洗脱峰；将收集获得的纯化目的蛋白转至透析袋中，在0.15M的氯化钠中透析，完成后转移至4℃下储存待用。 

四、细菌荚膜多糖的制备 

本发明对肺炎球菌的13种血清型肺炎球菌荚膜多糖，包括1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F，进行纯化，以便用于多糖结合物的合 成，其质量达到WHO合成多糖蛋白结合疫苗的多糖质量标准。 

1、肺炎球菌种子库的建立 

从ATCC购买的13个血清型肺炎球菌，包括1(货号：9163)、3(货号：10813)、4(货号：BAA‐334)、5(货号：BAA‐341)、6A(货号：BAA‐659)、6B(货号：700675)、7F(货号：10351)、9V(货号：700671)、14(货号：6314)、18C(货号：10356)、19A(货号：700673)、19F(货号：700905)和23F(货号：700669)。取出ATCC购买的菌种(原始种子批)，加入0.5ml的肺炎球菌AHC液体培养基将菌种混匀，取0.25ml菌液于5％羊血AHC培养液中。接种后的5％羊血AHC培养液管置于36℃±1℃的培养摇床上，摇速120rpm，培养12‐20小时。待OD₆₀₀至1.0时，用接种环将5％羊血AHC培养液接种至AHC琼脂培养基平皿上，置于36℃±1℃的培养箱内培养12‐20小时。用接种环将AHC琼脂平皿上的1至数个菌落接种于10ml的AHC培养液中，置于36℃±1℃，在培养摇床上培养12小时，摇速150‐200rpm。培养液中细菌OD₆₀₀长到1.0，取出5ml细菌AHC培养液接种到200ml的新鲜AHC培养液中，置于36℃±1℃的培养摇床上培养12小时左右，摇速150‐200rpm。OD₆₀₀至1.0时，将细菌培养液以1ml分装于200个小试管中，离心(4000rpm，10min)，去除上清培养液，然后加入0.5ml的新鲜AHC培养液和0.5ml的无菌脱脂牛奶，混匀，在乙醇干冰上快速冷冻。真空冻干，编号，作为主种子批保存于4℃冰箱内。取出主种子批建立，按照主种子建立方法，将细菌培养液接种到另一个200ml的新鲜AHC培养液中，置于36℃±1℃的培养摇床上培养12小时左右，摇速150‐200rpm。待OD₆₀₀至1.0时，将细菌培养液以1ml分装于200个小试管中，离心(4000rpm，10min)，去除上清培养液，然后加入0.6ml的新鲜AHC培养液和0.4ml的40％甘油溶液，混匀。速冻于干冰上，作为工作种子保存于‐70℃低温冰箱中。 

2、肺炎球菌的发酵 

从种子库中取出冻干工作种子管，加入1mlAHC富集培养液溶解冻干细菌。 将溶解的菌液接种于5mlAHC富集培养液试管中，在CO₂培养箱中静置培养过夜。观察有细菌生长时，将菌液接种于100ml的AHC富集培养液三角瓶中。置培养瓶于摇床中，36℃下，200rpm/min培养至OD₆₀₀为1.0。将100ml细菌培养液分别接种于2个装有1‐升的AHC富集培养液瓶中。置培养瓶于摇床中，36℃下，200rpm/min培养至OD₆₀₀为1.0。将35升的无菌过滤AHC富集培养液注入50升发酵罐中。接种2升OD为1的菌液至发酵罐中。当细菌生长到达平台期，杀菌，收获培养上清液。 

3、荚膜多糖的纯化 

用深层滤膜过滤，进一步去除残存细菌及碎片。将无菌的上清培养液用100Kd超滤膜超滤浓缩十倍(约600ml)。以6升25mM醋酸钠溶液进行超滤清洗。加入HB储存液使得最终浓度为1％(w/v)，混匀，将溶液放置于冷库过夜。离心，4000rpm，1小时，收集多糖/HB沉淀，摈弃离心液。加入25mM的sodium acetate+1％HB至多糖/HB沉淀容器中，搅拌悬浮沉淀，离心，4000rpm，1小时，收集多糖/HB沉淀，摈弃离心液。重复3次该步骤。用600ml的0.25M氯化钠溶液溶解沉淀。离心，4000rpm，1小时，丢弃不溶的核酸污染物。加入10％碘化钾溶液入多糖+HB混合溶液中，混匀，碘化钾最终浓度为0.5％，将溶液置于冷库中过夜。用深层过滤器过滤溶液，除去溶液中的HB/I沉淀，并用0.25M氯化钠/0.5％碘化钾溶液清洗深层过滤器上的沉淀，收集过滤液，弃去沉淀。将粗制的多糖溶液通入活性炭深层过滤器进行循环过滤30分钟(4％活性炭/0.5mg/ml多糖粗制溶液)。加入磷酸钠缓冲液pH6.8，最终浓度25mM加入到多糖溶液中。将以上溶液过HA柱(50‐100ml)，循环30分钟。用相同磷酸盐溶液洗柱4‐5个柱体积。用30Kd膜超滤浓缩多糖溶液5‐倍，用无热源水超滤清洗多糖溶液。用0.22μm膜过滤，冻干。 

第二步：13种血清型单价肺炎球菌多糖‐OVApCRM197A结合物的制备 

不同肺炎球菌血清型荚膜多糖的化学结构中含有不同的基团，需要采用不同 的合成方法将多糖共价键地连接至蛋白载体形成结合物，并且不同方法合成的结合物的产量和免疫原性有所不同。本发明根据实验结果，采用三种合成方法，即还原胺法、CDAP法(1‐(3‐二甲基氨基丙基)‐3‐乙基碳化二亚胺盐酸盐法)和ADH法(己二酰二肼法)，来合成特定的多糖蛋白结合物。 

一、13种肺炎球菌血清型荚膜多糖‐OVAp‐CRM197A结合物的合成 

1、肺炎球菌血清型1荚膜多糖‐OVAp‐CRM197A蛋白结合物合成 

称取5mg的Pn1降解多糖于反应瓶中，量取0.5ml的1mol/LNaCl加入反应瓶中；磁力搅拌使多糖完全溶解。记录多糖溶液的初始pH，分别量取适量的CDAP溶液，加入反应瓶中。室温下搅拌反应1.5min，30s时测定溶液的pH。1.5min后，用0.2mol/LNaOH调节溶液的pH至9.5，室温下搅拌反应3min(用0.2mol/LNaOH维持pH在9.5)。3min后立即向反应瓶中加入5mg的OVAp‐CRM197A蛋白，在室温下(25℃)搅拌反应1h。量取37.5μl2mol/L赖氨酸加入反应瓶中，用0.1NHCl调节溶液pH至9.0。室温下搅拌反应30min，将反应瓶转移到4℃下反应过夜。将反应混合物转移至透析袋(MWCO6‐8000)中，在4℃下，对0.85％NaCl溶液透析3次，6L/次。透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用SepharoseCL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。 

2、肺炎球菌血清型3荚膜多糖‐OVAp‐CRM197A蛋白结合物合成 

称取20mg的Pn3降解多糖于反应瓶中，量取2ml的0.15MNaCl加入反应瓶中；磁力搅拌使多糖完全溶解。量取适量的CDAP溶液，加入反应瓶中。室温下搅拌反应1.5min，30s时测定溶液的pH。1.5min后，用0.2mol/LNaOH调节溶液的pH至9.5，室温下搅拌反应3min(用0.2mol/LNaOH维持pH在9.5)。加入最终浓度为0.8M的ADH至反应瓶中，搅拌混匀，室温下反应2小时。将衍化后的多糖转至10KD的透析袋中对0.15MNaCl溶液进行透析，换液三次。上样G‐50柱，用0.15MNaCl洗脱，收集外水体积峰。然后转移至透析袋中，对 水透析，换液三次。称取5mg衍化后的Pn3多糖，溶解至0.5ml的0.15M NaCl溶液中，加入5mg的OVAp‐CRM197A蛋白，搅拌混匀后，加入30mM的EDC，在室温下反应4小时，转移到4℃下反应过夜。将反应混合物转移至透析袋(MWCO6‐8000)中，在4℃下，对0.85％NaCl溶液透析3次，6L/次。透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。 

3、肺炎球菌血清型4荚膜多糖‐OVAp‐CRM197A蛋白结合物合成 

称取5mg活化多糖至反应瓶中，量取100μl的0.5M磷酸钠缓冲液，加入反应瓶中，量取5mg的OVAp‐CRM197A蛋白至反应瓶中，磁力搅拌使多糖完全溶解；量取0.5ml纯水加入反应瓶中，磁力搅拌混匀；称取5.0mg的sodium cyanoborohydride，加入反应瓶中。将反应体系置于30℃的干浴器中反应12h。反应结束后，量取1.5ml的0.15Msodium chloride solution加入反应瓶中。称取2.5mg的sodium borohydride，加入反应瓶中。反应体系置于22℃下反应5h；将反应混合物转移至透析袋(MWCO12‐14Kd)，在4℃下，对0.15M sodiumchloride solution透析3次，每次透析液量6L；透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。 

4、肺炎球菌血清型5荚膜多糖‐OVAp‐CRM197A蛋白结合物合成 

称取5.0mg活化多糖，加入至反应瓶中，向反应瓶中加入100μl的0.5M磷酸钠缓冲液；称取4.0mg的OVAp‐CRM197A蛋白，加入反应瓶中，量取0.5ml纯水加入反应瓶中，磁力搅拌使反应物溶解，测定反应体系的pH；称取5.0mgsodium cyanoborohydride，加入反应瓶中；将反应体系置于室温下反应48小时；称取2.5mg的sodium borohydride，溶解于10μl纯水中，用移液枪混匀溶解完全后，加入反应瓶中；将反应体系置于23℃下搅拌反应5小时；将反应混合物转移至透析袋(MWCO6‐8KD)中，在4℃下，对0.15M氯化钠溶液透析3次， 每5小时换液一次；透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。 

5、肺炎球菌血清型6A荚膜多糖‐OVAp‐CRM197A蛋白结合物合成 

称取6.0mg活化Pn6A多糖，溶解于1mL纯化水中，搅拌至完全溶解后测初始pH值；用0.1MNaOH调节反应液pH值至7.0；向反应体系中加入4mg的OVAp‐CRM197A蛋白，搅拌混匀；称取5.0mg的sodium cyanoborohydride，加入上述反应瓶中，在室温反应18小时；反应结束后取样送检；称取2.7mg的Sodium borohydride，加入上述反应瓶中，在室温反应5小时；反应结束后取样送检；将反应混合物转移至透析袋，在4℃下，对0.15M氯化钠溶液透析5次，6L/次。透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。 

6、肺炎球菌血清型6B荚膜多糖‐OVAp‐CRM197A蛋白结合物合成 

称取5.0mg的Pn6B溶解于1mL纯化水中，搅拌至完全溶解后测初始pH值；用0.1M NaOH调节反应液pH值至7.0；向反应体系中加入2.5mg的OVAp‐CRM197A蛋白，搅拌混匀；称取5.0mg的sodium cyanoborohydride，加入上述反应瓶中，在室温反应20小时；称取2.5mg的Sodium borohydride，加入上述反应瓶中，在室温反应6小时；将反应混合物转移至透析袋，在4℃下，对0.15M NaCl溶液透析5次，6L/次；透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。 

7、肺炎球菌血清型7F荚膜多糖‐OVAp‐CRM197A蛋白结合物合成 

称取10.0mg的Pn7F多糖，溶解于1mL纯化水中，搅拌至完全溶解；分别滴加0.1M NaOH溶液至多糖溶液中，调节pH至7.0；向反应体系中加入3.5mg的OVAp‐CRM197A蛋白，搅拌混匀；称取5.0mg的sodium cyanoborohydride， 加入上述反应瓶中，在室温反应20小时；往反应瓶中加入990μl纯水，搅拌混匀；称取2.5mg的Sodium borohydride，加入上述反应瓶中，在室温反应6小时；将反应混合物转移至透析袋(MWCO6000‐8000)，在4℃下，对5mM succinate/0.9％氯化钠缓冲液透析5次，6L/次；透析结束后将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用Sepharose CL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。 

8、肺炎球菌血清型9V荚膜多糖‐OVAp‐CRM197A蛋白结合物合成 

称取10mg的Pn9V活化多糖，量取125μl的磷酸钠缓冲液，量取125μl纯水加入反应瓶中，磁力搅拌使多糖完全溶解；量取15mg的OVAp‐CRM197A蛋白至加入反应瓶中，搅拌溶解完全；称取10mg的NaBH₃(CN)，加入反应瓶中；将反应体系置于22℃下反应48小时；称取2.5mg的NaBH₄，加入反应瓶中，22℃下反应5小时；将反应混合液10000rpm，离心10min后取上清液，采用AKTA系统，SepharoseCL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合峰。 

9、肺炎球菌血清型14荚膜多糖‐OVAp‐CRM197A蛋白结合物合成 

称取5mg的Pn14活化多糖，量取1ml3.9mg的OVAp‐CRM197A蛋白，加入反应瓶中，磁力搅拌使多糖完全溶解；加入弱还原剂sodium cyanoborohydride5mg后，在22℃下反应48小时；加入强还原剂sodium borohydride2.5mg，室温下反应4小时；将反应混合液转移至透析袋(MWCO12‐14KD)中，用2ml的透析液润洗反应瓶；在4℃下，对0.15M氯化钠溶液透析3次，6L/次，每5小时换液一次。透析结束以后收集透析液，10000rpm，离心10min后取上清，采用SepharoseCL‐4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰。 

10、肺炎球菌血清型18C荚膜多糖‐OVAp‐CRM197A蛋白结合物合成 

称取5mg的Pn18C降解多糖，用1mL1M氯化钠溶液溶解；溶解完全后测其初始pH值；加入适量的CDAP溶液，室温下搅拌1.5min，加入0.2M NaOH溶液调节溶液的pH至9.0。之后于室温反应3min；加入10mg的OVAp‐CRM197A 蛋白，于25℃下反应45min；反应结束后，加入37.5μl2M赖氨酸溶液；25℃下反应30min后置于4℃反应过夜；将反应混合液转至透析袋(MWCO6000‐8000)中，在4℃下，对0.85％氯化钠溶液透析，换液3次。6L/次，每5小时换液一次。透析结束以后收集透析液，10000rpm离心10min，取上清，采用CL‐4B凝胶纯化该结合多糖，并收集结合物峰；检测结合物溶液中的蛋白及多糖含量。 

11、肺炎球菌血清型19A荚膜多糖‐OVAp‐CRM197A蛋白结合物合成 

称取10.0mg氧化Pn19A多糖，溶解于0.5mL的缓冲液中，置磁棒于反应瓶中，搅拌至多糖完全溶解；加入10mg的OVAp‐CRM197A蛋白；搅拌混匀，称取5.0mg的sodium cyanoborohydride，加入至反应瓶中，在室温下反应20小时；称取2.5mg的sodium borohydride，加入反应瓶中，在室温下反应5小时；将反应混合液转至透析袋(MWCO6000‐8000)中，在4℃下，对0.85％氯化钠溶液透析，换液3次。6L/次，每5小时换液一次；透析结束以后收集透析液，10000rpm离心10min，取上清，采用CL‐4B凝胶纯化该结合多糖，并收集结合物峰；检测结合物溶液中的蛋白及多糖含量。 

12、肺炎球菌血清型19F荚膜多糖‐OVAp‐CRM197A蛋白结合物合成 

称取5.2mg氧化Pn19F多糖，溶解于1ml纯水，置磁棒于反应瓶中，在磁力搅拌器上室温下搅拌至多糖完全溶解；加入3.0mg的OVAp‐CRM197A蛋白；搅拌混匀后，称取4.9mg的sodium cyanoborohydride，加入置反应瓶中，在磁力搅拌器上一直保持搅拌；在室温18℃下反应24小时；称取2.5mg的sodium borohydride，加入至反应瓶；在恒温箱18℃下反应5小时；将反应混合物转移至透析袋(MWCO12‐14000)，在4℃下，对缓冲液透析5次，每次透析液量6L，每5小时换液一次；透析结束以后收集透析液，10000rpm离心10min，取上清，采用CL‐4B凝胶纯化该结合多糖，并收集结合物峰；检测结合物溶液中的蛋白及多糖含量。 

13、肺炎球菌血清型23F荚膜多糖‐OVAp‐CRM197A蛋白结合物合成 

称取4.9mg氧化Pn23F多糖，溶解于1ml纯水，置磁棒于反应瓶中，在磁力搅拌器上室温下搅拌至多糖完全溶解；加入5.0mg的OVAp‐CRM197A蛋白；称取5.1mg的sodium cyanoborohydride，加入置反应瓶中，在磁力搅拌器上一直保持搅拌；在恒温箱18℃下反应17小时；称取2.5mg的sodium borohydride，加入至反应瓶；在恒温箱18℃下反应5小时；将反应混合物转移至透析袋(MWCO12‐14000)，在4℃下，对0.15M氯化钠溶液透析，每次透析液量6L。每5小时换液一次，共5次；透析结束以后收集透析液，10000rpm离心10min，取上清，采用CL‐4B凝胶纯化该结合多糖，并收集结合物峰；检测结合物溶液中的蛋白及多糖含量。 

二、其它含有万能表位肽的OVApCRM197A蛋白载体的13种肺炎球菌荚膜多糖OVApCRM197A结合物的合成 

本发明设计并生产出共7种OVApCRM197A蛋白载体来合成的多糖蛋白结合物，由于蛋白质的结构相似，用于特定的肺炎球菌血清型多糖合成时，所采用的方法是还原胺法，ADH法或者CDAP法中的一种。在前节示例中的13种肺炎球菌多糖‐OVAp‐CRM197A合成物的合成方法相似，在此不一一列举具体方法。 

第三步：13价肺炎球菌多糖OVApCRM197A结合物的制备及免疫原性的评估 

用制备获得的肺炎球菌多糖蛋白结合物来配制相应的疫苗，对小白鼠进行免疫注射、采血、用ELISA法检测血清中多糖抗体浓度以及调理吞噬试验，来评估不同结合物的免疫原性。 

一、13价肺炎球菌多糖‐OVApCRM197A结合物的制备及免疫原性的评估 

为评估OVApCRM197A蛋白载体合成的肺炎球菌荚膜多糖OVApCRM197A结合物的免疫原性优于不含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体合成的肺炎球菌荚膜多糖CRM197A结合物，本发明合成了13价肺炎球菌多糖‐CRM197A作为对照，进行免疫原性增强效果的评估。 

1、13价肺炎球菌多糖‐OVAp‐CRM197A结合疫苗和13价肺炎球菌多糖‐CRM197A结合疫苗的制备 

用Millipore的Labscale超滤系统分别将1，3，4，5，6A，7F，9V，14，18C，19A，19F和23F肺炎球菌血清型荚膜多糖蛋白结合物溶液浓缩至多糖浓度为40μg/ml；6B血清型结合物溶液浓度浓缩至多糖浓度大约为80μg/ml；按照下列表格计算加入相应容量的单价血清型结合物溶液至制剂瓶中。 

将结合物混合液用0.22μm膜除菌过滤；加入无菌磷酸铝胶，最终铝离子浓度为125mg/ml；用缓冲液定容至最终体积；灌装，0.5ml/瓶。 

2、含有其它OVApCRM197A蛋白载体的13价肺炎球菌多糖OVApCRM197A结合疫苗的制备 

参照上节“13价肺炎球菌多糖‐OVAp‐CRM197A结合物的制备及免疫原性的评估”方法，本发明配制了以下6种13价肺炎球菌多糖OVApCRM197A结合相应的疫苗，并用以免疫原性评估实验，包括13Pn‐CRM197A‐OVAp、 

13Pn‐OVAp‐CRM197A‐OVAp、13Pn‐OVAp‐OVAp‐CRM197A、 

13Pn‐CRM197A‐OVAp‐OVAp、13Pn‐OVAp‐OVAp‐CRM197‐OVAp以及 

13Pn‐OVAp‐CRM197A‐OVAp‐OVAp。 

3、注射小白鼠免疫注射及采血 

取5‐6周的CM57系小鼠70只，每支小鼠注射制备的13价肺炎球菌多糖‐OVAp‐CRM197A蛋白结合疫苗，注射容量为0.1ml/支小鼠/次。免疫注射小鼠分为三组，一组注射本发明配制的13价肺炎球菌多糖‐OVAp‐CRM197A蛋白疫苗，另一组免疫注射13价肺炎球菌多糖‐CRM197A结合疫苗作为对照，第三组为多糖对照，具体注射疫苗和采集免疫血清程序表如下： 

采集小鼠血液至离心管，在室温下静置2小时，在10000rpm条件下离心10分钟，用移液枪小心吸取离心上清血清，储存于4℃冰箱中，待检。 

4、ELISA法检测小鼠血清中多糖抗体浓度 

分别配制13种不同血清型肺炎球菌多糖储备液1mg/ml(1×PBS溶液中)，存储于4℃冰箱。稀释待检血清型肺炎球菌多糖存储液至包被缓冲液2‐4μg/ml， 加100μl包被溶液到每一个孔中来包被ELISA板，在室温下孵育过夜。用洗板缓冲液洗4次，加入100μl封闭缓冲液，在室温下孵育2小时，用洗板缓冲液洗4次，可在4℃下保存一周。 

将小鼠注射结合疫苗及对照样品获得的相应待测血清1:10稀释成工作样品血清，稀释适当倍数，加入到ELISA板第一排孔内，总体积200μl，从第一排开始向下进行二倍系列稀释，在室温下孵育2小时。用洗板缓冲液洗4次，加入100μl碱性磷酸酶标记羊抗鼠抗体(1:2000稀释)，在室温下孵育4小时。用洗板缓冲液洗4次，加入100μl磷酸‐4‐硝基苯酯二钠盐底物溶液，在405nm读盘。 

小鼠血清中的特异性肺炎球菌血清型多糖抗体浓度结果如下表： 

结果显示，本发明肺炎球菌多糖结合疫苗，即以OVApCRM197A为蛋白载体合成的13价肺炎球菌荚膜多糖‐OVAp‐CRM197A结合物的免疫原性要优于13价肺炎球菌荚膜多糖CRM197A结合物。注射三针后的小鼠血清中抗特异性肺炎球菌多糖的IgG抗体浓度显著高于注射一针和二针的血清中IgG抗体浓度；注射三针后的各个血清型抗体浓度高于注射一针的4倍以上，符合WHO对于多糖蛋白结合疫苗浓度提高的标准。与13价肺炎球菌荚膜多糖‐CRM197A结合物比较，13价肺炎球菌荚膜多糖‐OVAp‐CRM197A结合物的各个血清型抗体的浓度，在注射三针后，小鼠血清中的多糖特异性抗体浓度更高。 

5、调理吞噬试验(Opsonophagocytic Assay，OPA) 

调理吞噬试验是评价13价肺炎球菌多糖‐OVAp‐CRM197A结合疫苗杀菌效力方法，根据UAB‐MOPA的“肺炎链球菌荚膜多糖特异性抗体多型调理吞噬杀菌试验方法”对获得的小鼠免疫血清进行试验。OPA浓度结果如下表： 

试验结果可见，注射三针后的13价肺炎球菌多糖‐OVAp‐CRM197A结合物组的合并小鼠免疫血清和13价肺炎球菌多糖‐CRM197A结合物组的合并小鼠免疫血清比较，其抗体的OPA浓度有明显提高。 

二、其它13价肺炎球菌多糖‐OVApCRM197A结合物的制备及免疫原性的评估 

和上节“13价肺炎球菌多糖‐OVAp‐CRM197A结合物的制备及免疫原性的评估”的方法相似，其它含有OVAp的蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖‐OVApCRM197A结合物的抗多糖抗体IgG浓度结果如下表，本表只是列出免疫注射三针后的多糖IgG抗体浓度。 

从以上表中结果可见，所有含有OVAp万能表位肽CRM197A蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖结合物的免疫原性和不含有OVAp万能表位肽CRM197A蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖结合物比较，有明显的增强。含有两个OVAp万能表位肽的OVApCRM197A蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖OVApCRM197结合物的免疫原性要高于只含有一个OVAp万能表位肽OVApCRM197A蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖CRM197A结合物。将CRM197A蛋白载体中的OVAp万能表位肽数量增加至三个时，和含有两个OVAp万能表位肽的蛋白载体合成的13价肺炎球菌多糖OVApCRM197A结合物的免疫原性比较无明显变化。将CRM197A蛋白载体中的OVAp万能表位肽加至N‐末端和加至C‐末端的13价肺炎球菌多糖OVApCRM197A结合物免疫原性没有差别。 

参考文献 

1、Panina‐Bordignono P,Tano A,Termijtelen A,Universally immunogenic T cell epitopes promiscuous binding to human MHC class II and promiscuous recognition by T cells,Eur.J.Immunol.19:2237‐2242,1989. 

2、Su Y,Rossi R,De Groot AS,Regulatory T cell(Tregitopes)in IgG induce tolerance in vivo and lack immunogenicity per se.J Leukoc Biol.94(2):377‐383,2013. 

3、Giannini G,Rappuoli R,Ratti G,The amino‐acid sequence of two non‐toxic mutants of diphtheria toxin:CRM45and CRM197.Nucleic acids research,12:4063‐4069,1984。 

Claims (6)

1.一种能够增强13价肺炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法，其特征在于：

步骤一：在白喉毒素变异体CRM197的A链(简称CRM197A)中加入万能表位肽ISQAVHAAHAEINEAGR(简称OVAp)，通过基因重组工程菌来生产含有OVAp的CRM197A蛋白载体(简称OVApCRM197A)；

步骤二：将13种不同血清型的肺炎球菌荚膜多糖通过共价键分别与OVApCRM197A蛋白载体形成的13种单价肺炎球菌多糖‐OVApCRM197A结合物。

步骤三：将步骤二获得的13种单价肺炎球菌多糖‐OVApCRM197A结合物进行混合得到免疫原性增强的13价肺炎球菌多糖蛋白结合物。

2.根据权利要求1所述的能够增强13价肺炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法，其特征在于：在所述含有OVApCRM197A的蛋白载体中含有X个OVAp，1≤X≤3。

3.根据权利要求1所述的能够增强13价肺炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法，其特征在于：在OVApCRM197A蛋白载体中，OVAp连结在CRM197A蛋白的N‐末端或C‐末端，或者同时连接在N‐末端和C‐末端。

4.根据权利要求1、2或3所述的能够增强13价肺炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法，其特征在于：所述OVAp与CRM197A蛋白之间是通过GSGSG氨基酸序列进行连接。

5.根据权利要求1所述的能够增强13价肺炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法，其特征在于：所述基因重组工程菌是通过基因重组方法构建的大肠杆菌。

6.根据权利要求1所述的能够增强13价肺炎球菌多糖蛋白结合物免疫原性的方法，其特征在于：所述肺炎荚膜多糖是通过分别培养出13个不同血清型的肺炎球菌获得的荚膜多糖。