DK171951B1 - Fremgangsmaade til solubilisering af ikke-polyanioniske polysaccharider og fremgangsmaade til modificering af de solubiliserede neutrale polysaccharider - Google Patents

Description

i DK 171951 B1

Den foreliggende opfindelse omhandler covalent modificerede neutrale bakterielle polysaccharider, specielt pneu-mococ 14 og lignende polysaccharider, og covalente konju-gater af sådanne polysaccharider knyttet med en bigene-5 risk spacer, som tillader bevis for covalens og letter rensning og koncentration af biologisk ønskede enheder, med immunogen bakteriel membran eller andre proteiner, hvilke konjugater er nyttige komponenter af bakterievacciner. Der beskrives også fremgangsmåder til fremstilling 10 af sådanne polysaccharider og konjugater. Der henvises til DK patentansøgning nr. 2055/85.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til solubilisering af ikke-polyanioniske polysaccharider og til modificering af de solubiliserede polysaccharider.

15 Rensede kapsulære polysaccharider fra bakterier er blevet anvendt til at fremstille vacciner mod beslægtede bakterier, men de resulterende immunrespons har ofte været mindre tilfredsstillende end ønsket, specielt i meget små børn eller individer med umodne eller utilstrækkelige im-20 munologiske systemer. F.eks. fremprovokerer Streptococcus pneumoniae type 14 kapsulært polysaccharid ikke noget immunrespons i småbørn, hvilket gør dette polysaccharid ueffektivt i sig selv ved tilvejebringelse af beskyttelse mod de alvorlige pediatriske medicinske problemer, der 25 forårsages af Streptococcus pneumoniae type 14 bakterier,

Ise f.eks. Douglas et al., J. Infect. Diseases, 148. 131- 137 (1983) and Laurence et al., Am. J. Diseases of Chil-k dren, 137. 846-850 (1983). Forbedringen af immunogenici- I teten af disse polysaccharider kan ofte opnås ved at kom- 30 binere dem med proteiner, Schneerson et al., Infection and Immunity, 45, nr. 3, 582-591 (1984) (der diskuterer konjugation af Streptococcus pneumoniae type 6A).

DK 171951 B1 2

Der må imidlertid udvises omhu ved udvælgelsen af det protein, som skal kombineres med disse polysaccharider. Visse proteiner (f.eks. pertussinogen) er ikke-specifikke stimulatorer for immunsystemet i småbørn. Disse proteiner 5 kan til en vis grad forbedre immunresponset mod polysac-charidantigener, men uheldigvis fører sådanne ikke-speci-fik aktivering til uønskede biologiske virkninger (f.eks. reaktogenicitet). De meget fortrukne specifikt forøgede immunrespons mod disse polysaccharidantigener kan opnås i 10 småbørn ved at "konjugere" disse polysaccharider til passende proteiner som først rapporteret af W. F. Goebel og O. T. Avery i 1929 (J. Exptl. Medicine 5Q, 521-531 (1929)).

Kombinering af polysaccharidet og protein må også udvæl-15 ges omhyggeligt. Hvis den immunologiske forbedring, som det menes, skyldes den molekylære lighed mellem polysac-chariddeterminanterne og proteinbærerdeterminanterne, må i ! disse dele ikke let adskilles i det biologiske system.

Ikke-covalente komplekser, der dannes ud fra den poly-20 anioniske egenskab af mange polysaccharider og den poly-kationiske egenskab af bærerproteiner, kan stimulere immunrespons, men disse komplekser er kemisk labile, og de resulterende immunrespons synes at udvise T-celleuafhæn-gighed. Modsætningsvis ville covalente konjugater af po-25 lysaccharider og protein udvise meget større kemisk stabilitet og kunne udvise T-celleafhængige immunrespons, r

Covalente polysaccharid-proteinkonjugater kendes fra litteraturen, men den eksakte natur af den covalente binding ί er ikke blevet vist eller bestemt kvantitativt, da den \t ' * 30 eneste prøve for covalens har været aktivitet in vivo. Desuden har de i litteraturen omhandlede processer ringe reproducerbarhed. Haemophilus influenzae type b og Streptococcus pneumoniae type 6A polysaccharider blev omsat med cyanogenbromid, derpå med adipinsyre-dihydrazin ef- ! DK 171951 B1 3 terfulgt af kobling med tetanustoxoid eller dolkhale-hæmocyaninproteiner i Schneerson et al. J. Exptl. Med., 152. 361 (1980) og Infection and Immunity, 245 (1983). Pneumococcal type 19F polysaccharid blev koblet 5 med bovinserumalbumin direkte ved dannelse af iminer (Schiffske baser) ud fra reducerende ender af polysaccha-riderne og de modsvarende amingrupper (dvs. lysiner) af proteinet, efterfulgt af reduktion af disse iminer med natriumcyanborhydrid (Lin et al., Immunology, 46 r 333 10 (1982).

Yderligere blev polysaccharider knyttet til diazoterede aromatiske aminer koblet til proteinernes tyrosiner i K.

K. Nixdroff et al., Immunology 22, 87 (1975), og polysaccharider knyttet til aromatiske aminer blev konverteret 15 til isothiocyanater, som derpå blev knyttet til de modsvarende aminogrupper i proteinets lysin i S. B. Svenson og A. A. Lindberg, J. Immunology. Methods 25, 323 (1979).

I hvert tilfælde blev det resulterende konjugat imidlertid kun karakteriseret ved sin opførsel i gelpermeati-20 onschromatografi. I endnu et eksempel (S. Nutani et al..

Infection and Immunity 25, 971 (1982)) blev polysacchari-det pullulan aktiveret med cyanurchlorid, derpå omsat med tetanustoxoid. I dette tilfælde blev konjugaterne karakteriseret ved elektroforese og kun vist at være forskel-25 lige fra udgangsmaterialerne. I ingen af disse tilfælde blev der vist covalens bortset fra ved implikation med en I aggregeret molekylvægt, hvorved man sammenblander cova- I lens med den naturlige interaktion af makromolekylære ar- i ter med og uden ladninger i molekylære komplekser, da I 30 disse komplekser også vil give en aggregatmolekylvægt.

I verserende ansøgning U.S.S.N. 608 738, indleveret den 10. maj 1984 (og hvortil der henvises) er der blevet vist covalent modificerede polyanioniske polysaccharider og proteiner, sammen med covalente konjugater af sådanne po- i & *a DK 171951 B1 4 lysaccharider sammenknyttet med en bigenerisk spacer med immunogen bakteriel membran eller andre proteiner og metoder til fremstilling af disse og bekræftelse af cova-lensen for bindingen mellem polysaccharider og proteiner.

5 Under anvendelse af det nævnte references metodologi er det nu muligt at fremstille kemisk stabile polysaccha-rid/protein-konjugater, som udviser T-celleafhængighed, og som ville være nyttige som vaccinekomponenter til at fremkalde beskyttende serumantistoffer mod, især, de be-10 slægtede bakterier for de polysaccharider, der anvendes. Denne metodologi er imidlertid kun nyttig for covalent modificering af polyanioniske polysaccharider og har ikke været nyttig med vanskelige polysaccharider, som er uopløselige eller kun halvopløselige i organiske opløsnings-15 midler eller saltopløsninger.

Det tilsigtes derfor med den foreliggende opfindelse at udvikle en metode til solubilisering af neutrale polysaccharider og covalent modificering af disse neutrale polysaccharider i præparater til fremstilling af kemisk sta-20 bile polysaccharid/protein-konjugater. Det tilsigtes også med den foreliggende opfindelse at knytte neutrale poly-sacchariddeterminanter til proteinbærerdeterminanter, i kemisk stabile konjugater, så at den molekylære lighed mellem disse dele kunne bibeholdes i biologiske systemer 25 for at disse konjugater kunne være nyttige som komponenter i en mono- eller polyvalent vaccine til at fremkalde \ beskyttende serumantistoffer mod visse bakterier, især de % I beslægtede bakterier for de anvendte polysaccharider. Det I tilsigtes yderligere med den foreliggende opfindelse at i 30 udvikle metoder til behandling under anvendelse af disse konjugater i immunologisk effektive vacciner til anvendelse mod f.eks. meningitis og otitis media.

Den foreliggende opfindelse angår covalent modificerede neutrale bakteriepolysaccharider og kemisk stabile konju- ! DK 171951 B1 5 gater af sådanne neutrale polysaccharider med covalent modificerede immunogene membranproteiner, virale protein-underenheder, syntetiske polypeptider, bakterielle toxoi-der og andre egnede immunogene proteiner, hvilke konju-5 gater er nyttige komponenter af immunogene bakterievacciner. Polysaccharid/protein-konjugater ifølge opfindelsen kobles via bigeneriske spacere indeholdende en covalent thioethergruppe, hvori de bigeneriske spacere er atomkæder, der binder makromolekyler (såsom neutrale polysac-10 charider og proteiner), hvor en del af spareren stammer fra et modificeret molekyle (f.eks. det covalent modificerede neutrale polysaccharid), og den anden del stammer fra det andet modificerede makromolekyle (f.eks. det funktionaliserede protein).

15 I fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det neutrale polysaccharid covalent funktionaliseret i et eller flere trin til fremstilling af et polysaccharid med tilsvarende elektrophile centre eller tilsvarende thiolgrupper. Det neutrale polysaccharid fragmenteres foretrukkent først 20 ved opvarmning i vand med eller uden vandig hydrazin, vandet fjernes, og det fragmenterede polysaccharid deri-vatiseres med et bifunktionelt aktiveringsmiddel, før det omsættes med en bis-nucleophil. Det nucleophil-funktionaliserede neutrale polysaccharid omsættes derpå enten med 25 et reagens til dannelse af tilsvarende elektrophile steder eller omsættes med et reagens til dannelse af tilsva-| rende thiolgrupper. Ved passende udvælgelse af bis-nu- ii cleophilen, dvs. en sådan, som reagerer med det aktivere- f de neutrale polysaccharid og resulterer i et covalent mo- | 30 dificeret polysaccharid med tilsvarende elektrophile ste der eller thiolgrupper, eller udvælgelse af den passende nucleophil, kan yderligere funktionalisering af det nu-cleophil-funktionaliserede neutrale polysaccharid undgås.

DK 171951 B1 6

Uafhængigt af den covalente modifikation af det neutrale polysaccharid omsættes det passende bakterielle bærerprotein med reagenser, der danner tilsvarende thiolgrupper, eller med reagenser, der danner tilsvarende elektrophile 5 centre, i en proces med et eller to trin. De passende covalent modificerede neutrale polysaccharider og proteiner omsættes derpå til dannelse af covalente polysaccharid/-protein-konjugater og renses til fjernelse af ukonjugerede makromolekyler og overskud af reagenser for at tilla-10 de, at den immunogene dosis bliver baseret på mængden af covalent bundet polysaccharid på konjugatform.

Immunogene monovalente eller polyvalente vacciner indeholdende immunologisk effektive mængder polysaccha-rid/protein-konjugaterne ifølge opfindelsen eller blan-15 dinger af polysaccharid/protein-konjugaterne ifølge opfindelsen med andre covalente polysaccharid/protein-kon-jugater, såsom de, der er beskrevet i U.S.S.N. 608 738, i indleveret 10. maj 1984, eller med andre immunologe mate rialer eller derivater deraf, kan fremstilles.

20 De covalent modificerede polysaccharider ifølge opfindelsen kan være modificerede versioner af vilkårlige neutrale (dvs. ikke anioniske/ikke sure) polysaccharider, og er ikke tænkt begrænset til nogle særlige typer. Eksempler på sådanne neutrale bakterielle kapsulære polysaccharider 25 er Streptococcus pneumoniae (pneumococcal) type 14, 7F og g 37 polysaccharider, beskrevet af L. Kenne og B. Lindberg ί i The Polysaccharides, bind II, pp. 287-363, Academic

Press (1983) og A. S. Chaudri et al., Carbohydrate Re- i search, 23, 161-172 (1972).

« 30 Proteinerne ifølge opfindelsen har bevist sikkerhed og påviselig immunogenisitet, men er ikke begrænset til nogen særlig type. Egnede proteiner omfatter bakterielle membranproteiner; vilkårlige af forskellige planteproteins å DK 171951 B1 7 ner, såsom edestin eller sojabønnetrypsininhibitor; vira-le proteinunderenheder, såsom hepatitis A eller B, herpes gD eller gC, Epstein-Barr eller varicella zoster underenheder; syntetiske polypeptider; diphtheria toxoid; eller 5 tetanus toxoid, men er foretrukkent Neisseria meningitidis (meningococcal) B serotype ydre membranproteiner, som er T-cellestimulatorer. Et eksempel på disse serotypepro-teiner er blevet beskrevet i Helting et al., "Serotype Determinant Proteins of Neisseria Meningitidis", Acta-10 path. Microbiol. Scand. Sect. C, fiS, 69-78, 1981, og

Frasch et al., J. Bact., 127r 973-981 (1976).

Konjugaterne ifølge opfindelsen kan være vilkårlige stabile polysaccharid/protein-konjugater, koblet via bigeneriske spacere indeholdende en thioethergruppe og alkyl-15 amid, som danner hydrolytisk labile covalente bindinger med det neutrale polysaccharid og proteinet. Foretrukne konjugater ifølge opfindelsen er imidlertid de, som kan repræsenteres ved formlen Ps-A-E-S-B-Pro eller Ps-A'-S-E'-B'-Pro, hvori Ps repræsenterer et ikke-anionisk poly-20 saccharid; Pro repræsenterer et immunogent protein; og A-E-S-B og A'-S-E'-B' udgør bigeneriske spacere, som indeholder hydrolytisk stabile covalente thioetherbindin-ger, og som danner covalente bindinger (såsom hydrolytisk labile ester- eller amidbindinger) med makromolekylerne, 25 Pro og Ps. I spaceren, A-E-S-B er S svovl, E er transformationsproduktet af en thiophil gruppe, som er blevet omsat med en thiolgruppe og som har formlen

O

eller ?? -CCH-, ! ? ί Ϊ DK 171951 B1 8 hvor R er H eller CH3/ og p er 1-3;

WH

II

A er -CN(CH2)BY(CH2)n-NH-, hvor W er 0 eller NH, m er 0-4, n er 0-3, og Y er CH2, 0, S, NR' eller CHCOOH, hvor R' er 5 H eller alkyl med 1 eller 2 carbonatomer, så at hvis Y er CH2, så kan m og n ikke begge være nul, og hvis Y er O eller S, så er m større end 1 og n er større end 1; og B er

Z O

I H

10 -(CH2)pCH(CH2)qD-, hvor q er 0 - 2, Z er NH2, NHCR ’, COOH eller H, hvor R' og p er som defineret i det foregående, og

0 H 0 Q

ii i ii n D er C, NR', N-C(CH2)2C. I spaceren A'-S-E'-B', er S 15 svovl;

W

II

A’ er -CNH(CH2)„r"-, hvor a er 1 - 4, 20 Y' NHC0R', og W p og R' er som defineret i det foregående, og E' er transformationsproduktet af en thiophil gruppe, I som er blevet omsat med en thiolgruppe, og som har form- I len i 25 j* -C-, hvor R er som defineret i det foregående, og B' er

o J

ii r\ r -C-, eller E' er ^JL N- , og B' er -(CH2)pC-, <1 I 0 DK 171951 B1 9 hvori p er 1 til 3. Endvidere er komponenterne E-S-B og A'-S-E'- i de bigeneriske spacere A-E-S-B og A'-S-E'-B' til at bestemme, også kvantitativt, ved denne identificering, der reflekterer covalensen af den konjugatbinding, 5 der knytter siden af thioethersvovlet, som stammer fra det covalente modificerede ikke-anioniske polysaccharid, ved siden af spaceren, som stammer fra det funktionalise-rede protein.

I fremgangsmåden ifølge opfindelsen modificeres polysac-10 charidet covalent ved (a) fragmentering deraf ved opvarmning af polysaccharidet i vand med eller uden vandig hydrazin, med vandet fjernet ved lyophilisering og tørring med P205 i vakuum, hvorpå (b) det aktiveres med et bifunktionelt reagens i et ikke-vandigt, polært, aprotisk 15 opløsningsmiddel, (c) omsætning af dette aktiverede polysaccharid med en bis-nucleophil, og endelig, om nødvendigt, yderligere (d) funktionalisering af dette modificerede polysaccharid ved enten omsætning (i) med et reagens dannende elektrophile (f.eks. thiolphile) steder eller 20 (ii) med et reagens dannende thiolgrupper. Omvendt omsættes proteinet enten (i) med et reagens dannende thiolgrupper eller (ii) med et reagens dannende thiolphile steder, hvorpå det covalent modificerede polysaccharid og den funktionaliserede protein omsættes til dannelse af et 25 stabilt covalent bundet konjugat, og den endelige blanding renses til fjernelse af uomsatte polysaccharider og I proteiner.

^ Fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter også udvælgel- I se af en nucleophil eller bis-nucleophil, som vil reagere 30 med det aktiverede polysaccharid til dannelse af et covalent modificeret polysaccharid med tilsvarende elektrophile steder eller tilsvarende thiolgrupper, hvilket således gør behovet for yderligere funktionalisering af det bis-nucleophilt modificerede polysaccharid indlysende før DK 171951 B1 10 omsætning af det covalent modificerede polysaccharid med et covalent modificerede protein. Også funktionaliserin-gen af proteinet til hver delform kan udføres i mere end et trin efter udvælgelsen af reaktanter i disse trin.

5 A. Fremstilling af polvsaccharidet I første trin med covalent modificering af polysacchari-det må det faste stof, der stort set er uopløseligt polysaccharid, solubiliseres.

Da de neutrale polysaccharider ifølge opfindelsen er uop-10 løselige i organiske opløsningsmidler eller saltopløsninger og kun marginalt opløselige i vand, og da nucleophile alkoholiske hydroxylgrupper i polysaccharidet ikke kan kemisk konkurrere med de elektrophile reagenser med hydroxy lerne i vand i en vandig opløsning, må polysacchari-15 det modificeres til en mere opløselig form, hvorpå det må opløses i ikke-vandige (ikke-hydroxyliske) opløsningsmidler. Egnede opløsningsmidler omfatter dimethylformamid, dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, formamid, N,N'-dime-thylimidazolidinon og andre lignende polære, aprotiske 20 opløsningsmidler, foretrukkent dimethylformamid.

I U.S.S.N. 608 738 blev bakterielle polysaccharider med syregrupper solubiliseret i ikke-hydroxyliske organiske opløsningsmidler ved først at overføre dem i en passende saltform. Modsætningsvis udfører ansøgerne solubiliserin-25 gen af et intakt, eller stort set uopløseligt neutralt polysaccharid ved opvarmning af disse ikke-polyanioniske, neutrale polysaccharider i 30 sekunder til 10 minutter i ved 70-100 °C i destilleret vand, som eventuelt kan inde holde 5-15% vandig hydrazin, hvorved polysacchariderne 30 fragmenteres, men under bevarelse af de neutrale polysac-chariders levedygtighed til imunogen vaccineanvendelse, idet polysaccharidet bringes på en anvendelig form.

! i DK 171951 B1 11

Efterfølgende trin er rettet mod at overkomme de øvrige væsentlige fysisk-kemiske begrænsninger ved fremstilling af covalente bindinger til polysaccharider, nemlig manglen på funktionelle grupper i polysacchariderne, udover 5 hydroxylgrupper, som er reaktive nok med reagenser, der er almene eller praktisk anvendte til funktionalisering af enheder, med hvilke der ønskes binding. Det resterende vand (og hydroxylgrupper) fjernes ved lyophilisering og tørring med P205 i vakuum. Derpå er aktivering af poly-10 saccharidet til dannelse af et aktiveret polysaccharid, omsætning med bis-nucleophiler til dannelse af et nu-cleophil-funktionaliseret polysaccharid og funktionalisering med reagenser, der danner enten elektrophile steder eller thiolgrupper, alle rettet mod covalent modificering 15 af polysaccharidet og udvikling af funktionelle grupper i polysaccharidet ved forberedelse til konjuktion.

I det næste trin aktiveres det depolymeriserede polysaccharid ved omsætning med et bifunktionelt reagens ved ca. 0-50 °C under omrøring i 10 minutter til 1 time, med det 20 afgørende vægtforhold mellem aktiverende middel og polysaccharid i området 1:5 til 1:12. Aktivering med cyano-genbromid er mulig ifølge den foreliggende opfindelse, men dette reagens anvendes dårligt ved aktivering af polysaccharider og er ikke foretrukkent. I stedet foretræk-25 kes bifunktionelle reagenser til aktivering af polysac-charidet, nemlig kulsyrederivater,

1 O

i II

IR2-C-R3, hvor R2 og R3 uafhængigt kan være azolyl, såsom imidazolyl; halogenider; eller phenylestere, såsom p-ni-30 trophenyl eller polyhalogenphenyl.

Carbonyldiimidazol, et særligt foretrukkent reagens, vil reagere med hydroxylgrupperne til dannelse af imidazo-lylurethaner af polysaccharidet, og arylchlorformiater, herunder f.eks. nitrophenylchlorformiat, vil give blande- DK 171951 B1 12 de carbonater af polysaccharidet. I hvert tilfælde er det resulterende aktiverede polysaccharid meget tilgængeligt for nucleophile reagenser, såsom aminer, og transformeres derved til de respektive urethaner.

5 I det næste trin omsættes det aktiverede polysaccharid med et nucleophilt reagens, såsom en amin, især diaminer,

Η H

I I

f.eks. HN( CH2 )mY( CH2 )n-NH, , hvori m er 0-4, n er 0-3, og Y er CH2, 0, S, NR', CHCOOH, hvor R' er H eller alkyl med 1 10 eller 2 carbonatomer, så at hvis Y er CH2/ så kan ikke både m og n være nul, og hvis y er 0 eller S, så er m større end 1, og n er større end 1, i et stort aminover-skud (dvs. f.eks. et 50-100 ganges molært overskud af amin over for anvendt aktiverende middel). Reaktionen 15 holdes i et isbad i 15 minutter til 1 time og holdes derpå i 15 minutter til 1 time ved ca. 17-40 °C.

Et aktiveret polysaccharid, ville, når det omsættes med en diamin, f.eks. 1,4-butandiamin, resultere i en ure-thanform af et polysaccharid med tilsvarende aminer, som 20 derpå yderligere kan funktionaliseres ved acylering. Blandede carbonater vil også let reagere med diaminer resulterende i tilsvarende amingrupper.

Alternativt kan det aktiverede polysaccharid omsættes med en nucleophil, såsom et monohalogenacetamid af en diami-25 noalkan, f.eks. 4-bromacetamidobutylamin (se W. B. Lawson et al., Hoppe Seyler's Z. Physiol Chem., 349 r 251 (1968)), til dannelse af et covalent modificeret polysaccharid med tilsvarende elektrophile steder. Eller det aktiverede polysaccharid kan omsættes med en aminothiol, 30 såsom cysteamin (aminoethanthiol) eller cystein, hvilke eksempler på derivater er velkendte i peptidsyntesetek-nikken, til fremstilling af et polysaccharid med tilhørende thiolgrupper. I begge tilfælde er ingen yderligere DK 171951 B1 13 funktlonalisering nødvendig før kobling af det covalent modificerede polysaccharid til det modificerede bakterielle bærerprotein.

I sidste trin ved fremstilling af polysaccharidet kan 5 yderligere funktionalisering, om nødvendigt, af polysaccharidet finde sted ved enten at omsætte det nucleophil-funkt ional i serede polysaccharid med et reagens til dannelse af elektrophile (dvs. thiophile) steder eller med et reagens til dannelse af thiolgrupper.

10 Reaktanter egnede til anvendelse med dannelse af elektrophile steder omfatter f.eks. de til acylering af a-ha-logenacetyl- eller α-halogenpropionylderivat, såsom OR

XCCHX (hvori R er H eller CH3; X er Cl, Br eller I? og X' 15 er nitrophenoxy, dinitrophenoxy, pentachlorphenoxy, pent-afluorphenoxy, halogenid, 0-(N-hydroxysuccinimidyl) eller azido), især chloreddikesyre eller a-brompropionsyre, idet reaktionen udføres ved et pH på 8-11 (holdt i dette område ved tilsætning af base, om nødvendigt) og ved en 20 temperatur på ca. 0-35 °C i 10 minutter til 1 time. En amino-derivatiseret polysaccharid kan acyleres med aktiverede maleimidoaminosyrer (se O. Keller et al., Helv. Chim. Acta., Sfi, 531 (1975)) til fremstilling af malei-midogrupper

25 II

! » Λ -C(CH2)pN 1|

V

H

i hvor p er 1-3; med et 2-halogenacetyleringsmiddel, såsom 30 p-nitrophenylbromacetat; eller med et a-halogenketoncarb-oxylsyrederivat, f.eks.

a r i DK 171951 B1 14 r\ I? H02C-<' ^-CCH2Br (Ber., £Z, 1204, (1934)) for at fremstille passende funktionaliserede polysaccharider, 5 som er genstand for thiosubstituering.

Reagenser egnede til anvendelse i dannelse af thiolgrup-per omfatter f.eks. acyleringsmidler, såsom thiolaceto-ner, f.eks.

R^CNH—,-(CH,) s ΊΓ / io cA-i hvor R4 er alkyl med 1-4 carbonatomer eller mono- eller bicyclisk aryl, såsom C6H5 eller C10H13, og p er 1-3; NHCOR5 *03SSCH2(CH2)mCH-C0X', hvor m er 0-4, R5 er alkyl med 1-4 15 carbonatomer eller C6H5, og X' er som defineret i det foregående, efterfulgt af behandling med HSCH2CH2OH; eller NHCOR5 C2H5-S-S-CH2( CH2 J^HCOX',hvor m, R5 og X' er som defineret 20 umiddelbart i det foregående, efterfulgt af behandling med dithiothreitol. Sådanne reaktioner udføres i en nitrogenatmosfære ved 0-35 °C og ved et pH på 8-11 (med base tilsat, om nødvendigt, for at holde pH i området), i 1-24 timer. F.eks. kan et aminoderivatiseret polysaccha-25 rid omsættes med nhcoch3 X? til fremstilling af et passende funktionaliseret polysac-charid.

i i .i i i DK 171951 B1 15

Ved disse trin fremstilles der på covalent modificerede neutrale polysaccharider af formerne Ps-A-Εγ- eller Ps-A'-SH-, hvori Εγ er i? o J\.

5 -C<CH ) n jl# og A# A', X og p er som defineret i 2 P \/ a det foregående.

B. Fremstilling af proteinet 10 Separat funktionalisering af proteinet, der skal kobles til polysaccharidet, involverer omsætningen af proteinet med et eller flere reagenser til dannelse af en thiol-gruppe, eller omsætning af proteinet med et eller flere reagenser til dannelse af et elektrophilt (dvs. thiop-15 hilt) center, som vist i U.S.S.N. 608 738.

Til konjugation med et elektrophilt funktionaliseret po-lysaccharid omsættes proteinet i et eller to trin med et eller flere reagenser til dannelse af thiolgrupper, såsom med et af de acyleringsmidler, der anvendes til dannelse 20 af thiolgrupper på polysaccharider, som nævnt i det foregående. Thiolerede proteiner kan også fremstilles ved at aminere carboxyaktiverede proteiner, som vist i Atassi et al., Biochem et Biophys. Acta, 670r 300, (1981), med ami-' nothioler, til dannelse af det thiolerede protein. En j 25 fortrukken udførelsesform for denne proces involverer di- j rekte acylering af de vedhængende aminogrupper (dvs. ly- • sylgrupper) af proteinet med N-acylhomocysteinthiolacton ved ca. 0-35 °C og pH 8-11, i 5 minutter til 2 timer under anvendelse af ækvivalente vægtmængder reagenser.

30 DK 171951 Bl 16 o il 0

B

Når E' B' = / N (CH2) pC ( er betingelserne og

V

6 metoden for fremstilling af funktionaliseret protein som 5 nævnt i det foregående til fremstilling af polysaccharid-modparten ved omsætning med aktiverede maleimidosyrer.

Ved forberedelse af konjugation med et covalent modificeret bakterielt polysaccharid med vedhængende thiolgrupper acyleres proteinet med et reagens, der danner et elektro-10 philt center, såsom acyleringsmidler omfattende

O CH, O

II I II

f.eks. XCH2C—X’ og XCH - CX', hvori X og X' er som defineret i det foregående; og [T^ 'Niich,) Ji-x', 15 hvori X' er som defineret i det foregående. Egnede proteiner med elektrophile centre omfatter f.eks. også de, der fremstilles ved acylering af de vedhængende lysylamino-grupper med et reagens, såsom aktiverede maleimidosyre, 20 f.eks.

0 S

J ^ 0 / \ INI! / || 1 N0C(CH2)nN , ( ( o o eller ved omsætning af det carboxyaktiverede protein med 25 monohalogenacetylderivater af diaminer. I begge fremstillingsreaktioner er temperaturen 0-35 °C i 5 minutter til 1 time og pH er 8-11.

f

J

i \ % DK 171951 B1 17 C. Dannelse af korrjuqatet

Dannelsen af konjugatet er derefter blot et spørgsmål om omsætning af vilkårlige af de covalent modificerede poly-saccharider med vedhængende elektrophile centre med vil-5 kårlige af proteinerne med vedhængende thiolgrupper ved pH 7-9, i passende vægtforhold, i en nitrogenatmosfære, i 6-24 timer ved ca. 17-40 °C til opnåelse af et covalent konjugat. Eksempler på sådanne reaktioner er OH O «fHC0CH3

Ps-CNCH2CH2CH2CH2NHCCH2Br + HSCHjCHjCHCO-Pro _^ 10 r ? rcocH3

PsCNCH2CH2CH2CH2NHCCH2SCH2CH2CHCOPcor hvori et aktiveret polysaccharid, som er blevet omsat med 4-bromacetamidobutylamin, omsættes med et protein, som er blevet omsat med N-acetylhomocysteinthiolacton, til dan-15 nelse af et konjugat, og 0

U

r η Λ ? i? PSCNY“-NCCH2N^J + HSCH2CH2NHCCH2CH2CPro ^ ii o o 9 ff /S ff ff 20 PsCNHY"NHCCH2-N JL CH2CH2NHCCH2CH2CPro o j hvor Y" er en alkylgruppe med 2-8 carbonatomer, hvori et aminoderivatiseret polysaccharid, som er blevet omsat med aktiverede maleimidosyrer, omsættes med et carboxyaktive-25 ret protein, som er blevet amineret med en aminothiol, til dannelse af et konjugat.

! DK 171951 B1 18

Tilsvarende kan vilkårlige af de covalent modificerede polysaccharider med vedhængende thiolgrupper omsættes med vilkårlige af de proteiner, der har vedhængende elektro-phile centre, til opnåelse af et covalent konjugat. Et 5 eksempel på en sådan reaktion er: S J I"

PsCNHCH2CH2SH ·* ProCCH2CH2C-N(CH2)4NHCOCH2Br _y

Jf 91 9 S

PsCNCH2CH2SCH2CN(CH2)4NHCCH2CH2CPro, hvori et aktiveret polysaccharid, som er blevet omsat med 10 en aminothiol, omsættes med et carboxyaktiveret protein, som er blevet omsat med monohalogenacetylderivater af en diamin, til dannelse af en konjugat

Disse konjugater centrifugeres derpå ved ca. 100 000 gange G under anvendelse af en rotor med fast vinkel i ca. 2 15 timer ved ca. 1-20 °C, eller underkastes vilkårlige af en række andre rensningsprocedurer, herunder gelpermeation, iodeksklusionschromatografi, gradientcentrifugering eller anden differentierende adsorptionschromatografi, til fjernelse af ikke-covalent konjugerede polysaccharider og 20 proteiner, under anvendelse af covalensprøven for den bigeneriske spacer (se det følgende) som metode for at følge den ønskede biologiske aktivitet.

D Analyse for at bekræfte covalens

Analyse af konjugatet for at bekræfte covalensen og der-25 med konjugatets stabilitet udføres af ansøgerne ved at i hydrolysere (foretrukkent med 6 N HC1 ved 110 °C i 20 ti mer) konjugatet, dernæst kvantitativt analysere for aminosyren fra den hydrolytisk stabile spacer indeholdende thioetherbindingen og aminosyrebestanddele fra proteinet.

30 Aminosyrernes bidrag til proteinet kan fjernes, om nødvendigt, ved at sammenligne med den passende aminosyre- ! i DK 171951 B1 19 standard for det involverede protein, med den tilbageblevne aminosyreværdi afspejlende covalensen for konjuga-tet, eller aminosyren i spaceren kan konstrueres til at forekomme uden for aminosyrestandarden for proteinet i 5 analysen. Covalensprøven er også nyttig til at vise rensningsprocedurer for at markere forbedringen af koncentration af biologisk aktive komponenter. I ovennævnte eksempler resulterer hydrolyse af OH 0 NHCOCH- jll II l 3

PsCNCH2CH2CH2CH2NHCCH2SCH2CH2CHCOPro i frigørelse af S-carboxymethylhomocystein, NH, I 2 H02CCH2SCH2CH2CHC02Hj hydrolyse af f 15 PsLhY"NhHcH2H^^ ^CH2CH2NHCCH2CH2Spro n o resulterer i frigørelse af aminodicarboxylsyren

HO„C 2 I

HC^CCh^CHSCH^Ch^NI-^ » °9 hydrolyse af OH OH 0 0 2Q PsCNCH2CH2SCH2CN(CH2)4NHCCH2CH2CPro resulterer i frigørelse af S-carboxymethylcysteamin, H2NCH2CH2SCH2C02H ved spaltning af Ps-A-E-S-B-Pro-molekylet ved peptidbindingerne eller andre hydrolytisk-ustabile bindinger. Chromatografiske metoder, såsom metoderne af 25 Spackman, Moore og Stein, kan hensigtsmæssigt anvendes, og forholdet mellem aminosyrebestanddele bestemmes.

i i j DK 171951 B1 20 e. Anvendelser

Et eller flere af konjugaterne ifølge opfindelsen kan anvendes i pattedyrarter til enten aktiv eller passiv beskyttelse, profylaktisk eller terapeutisk, mod bacteremia 5 forårsaget af den tilsvarende organisme. I foretrukne udførelsesformer for opfindelsen kan konjugaterne anvendes i mono- eller polyvalente vacciner, enten alene, med andre konjugater indeholdende andre neutrale polysacchari-der, såsom Streptococcus pneumoniae 7F, 14 og 37, med an-10 dre konjugater indeholdende polyanioniske polysacchari-der, såsom Haemophilus influenzae type b eller Streptococcus pneumoniae type 6B, 19F eller 23F organismer, eller med ukonjugerede polysaccharider, såsom Streptococcus pneumoniae type 3 polysaccharid.

15 Aktiv beskyttelse kan udføres ved at injicere en effektiv mængde (en mængde i stand til at give målelige mængder antistoffer, f.eks. 2 - 50 μg) polysaccharid på konjugat-form af hvert af konjugaterne, der administreres pr. dosis, eller af ukonjugerede polysaccharider, der admini-20 streres pr. dosis hel-antiserum opnået fra dyr tidligere doseret med konjugatet eller konjugaterne, eller globulin eller andre antistofholdige fraktioner af nævnte antisera, med eller uden en farmaceutisk acceptabel bærer, såsom aseptisk saltvandsopløsning. Sådant globulin opnås 25 fra hel-antiserum ved chromatografi, salt- eller alkoholfraktionering eller elektroforese. Passiv beskyttelse kan opnås ved standardiseret monoklonale antistofprocedurer eller ved immunisering af egnede pattedyrsværter. Anvendelsen af et adjuvans (f.eks. alun) betragtes også som ‘ 30 værende inden for opfindelsens ramme.

I en foretrukken udførelsesform for opfindelsen anvendes monovalente eller polyvalente præparater omfattende blandt andet konjugaterne ifølge opfindelsen, til aktiv ! i DK 171951 B1 21

Inununogen vaccination af mennesker, specielt neonatale og småbørn. Til yderligere stabilitet kan disse konjugater også lyophiliseres i nærværelse af lactose (f.eks. ved 50 μg/ml pneumococ polysaccharid/10 mg/ml lactose) før an-5 vendelse.

En foretrukken dosis er en mængde af hver af konjugaterne eller derivat deraf administreret svarende til 25 μg po-lysaccharid på konjugatform for konjugater af pheumococ polysaccharider, 25 μg ukonjugerede polysaccharider og 10 doser af konjugater eller derivater deraf af konjugater indeholdende polyanioniske polysaccharider ifølge U.S.S.N. 608 738, i en enkelt administrering. Om nødvendigt kan der også administreres yderligere en eller to doser konjugat eller derivat deraf af H. influenzae type 15 b polysaccharid i en mængde svarende til 10 μg af poly-saccharidet på konjugatform.

Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

EKSEMPEL 1 20 Fremstilling af streptococ pheumoniae type 14 kapsulært polysaccharid

Inoculum og podestofudvikling .TriCL-Å: Udarbeidninq af podepræparat

Et lyophiliseret rør med Streptococcus pneumonia type 14 25 bakterier i inoculumpodemedium (modtaget fra Dr. Robert Austrian, University of Pennsylvania) blev suspenderet i 1 ml steril oksehjerteinfusionsbouillon (25 g hjerteinfusionsbouillon (Difco) i 0,9 liter vand), og denne suspension blev spredt på 5 kaninblodagarplader (20 g renset 30 agar, 25 g hjerteinfusionsbouillon, 100 ml defibrineret DK 171951 B1 22 kaninblod, 0,9 liter destilleret vand) med ca. 0,2 ml kultur på hver. Efter ca. 18 timers inkubering ved 37 °C blev væksten på pladerne gensuspenderet på hver kanin-blodagarplade (med 5 ml oksehjerteinfusionsbouillon hver) 5 og samlet. % ml af denne gensuspenderede vækst blev anvendt til at inoculere hver af 6 kolber med væskeformigt blodmedium (90 ml oksehjerteinfusionsbouillon og 10 ml defibrineret kaninblod), som derpå blev inkuberet uden omrøring ved 37 °C i ca. 18 timer.

10 Trin_B: 2-Liters Erlenmever-kolber uden ledeplader

To af kolberne med Streptococcus pneumoniae type 14 bak-teriepodemedium fra trin A blev kombineret, og 20 ml af dette podemedium blev inoculeret i hver af fem 2-liters Erlenmeyer-kolber uden ledeplader indeholdende 900 ml 15 sterilt pneumococcus inoculummedium (se det følgende) og 100 ml 25%'s dextroseopløsning. pH for kolberne blev holdt ved pH 6,0 - 7,0 ved tilsætning af 12%'s natriumbi-carbonatopløsning, og efter 7 timers inkubering ved 37 °C (på hvilket tidspunkt der typisk var en OD 660 værdi på 20 2,90) blev væksten fra fire af kolberne samlet (den sam lede portion havde en 0D66o på 2,80 og et pH på 6,8).

Pneumococcus inoculummedium Y

Sojapepton 20 g Gærekstraktultrafiltrat (1) 100 ml 25 NaCl-reagens 5 g K2HP04 2,5 g 2% phenolrødt 0,5 ml

Destilleret vand 1 liter Y Opløsningen blev steriliseret ved autoklavering ved 121 30 °C i 25 minutter.

DK 171951 B1 23

Saltene og sojapeptonen blev opløst i små volumen varmt, pyrogenfrit vand og bragt til korrekt slutvolumen ved tilsætning af varmt, pyrogenfrit vand. Fermentorerne eller kolberne blev derpå steriliseret i ca. 25 minutter 5 ved 121 °C, og efter afkøling blev gærekstraktultrafil-tratet (1) sat aseptisk til kolberne eller fermentorerne før inoculering.

(1) Gærekstraktultrafiltrat: 100 g bryggerigærekstrakt (Amber) blev opløst i 1 liter destilleret vand og ultra-10 filtreret i en Amicon DC-30 hulfiber med H10X50-patroner til fjernelse af molekyler med molekylvægt 50000. Filtratet blev samlet og passeret gennem en 0,22 μ membran som et sterilt produkt.

Trin C: 70-Liters podefermentor 15 Det samlede produkt fra trin B blev anvendt til at inocu-lere en 70-liters fermentor indeholdende Pneumococcus podemediet (fremstillet som beskrevet i det følgende) med et udgangs-pH på 6,8.

Fermenteringen blev opretholdt ved 37 °C med en omrøring 20 på 100 omdr./min. og vist optisk massefylde (O.D.), glu-cosetest og pH-bestemmelser, indtil der var nået en O.D. på 3,25 (efter ca. 4 timers forløb).

Komplet pneumococcus· podemedium

Soj apepton 800 g 25 Gærekstraktultrafiltrat (1) 4 liter K2HP04-reagens 100 g

NaCl-reagens 200 g 25% dextroseopløsning (2) 4 liter "Ucon B625 Antifoam" 14 ml 30 Destilleret vand 31,8 liter t i i DK 171951 B1 24 (2) Dextrose blev fremstillet som en 25%'s opløsning i glasdestilleret vand og sat til den 70-liters fermentor med gærekstraktultrafiltratet.

Tria B: 800-Liters produktionsfermentor 5 Ca. 40 liter af produktet fra trin C blev anvendt til at inoculere en 800-liters fermentor indeholdende 530 liter Pneumococcus produktionsmedium (fremstillet som beskrevet i det følgende).

Fermenteringen blev opretholdt ved 37 °C med en omrøring 10 på 100 omdr./min. med O.D., glucose og pH kontrolleret for ca. hver 2 timers forløb, indtil O.D. var af samme størrelsesorden i en 2-timers periode, på hvilket tidspunkt fermenteringen blev afsluttet (en typisk endelig O.D.-værdi var 5,2 efter 6 timers forløb).

15 Pneumococcus produktionsmedium

Sojapepton 10,5 kg Gærekstraktultrafiltrat (1) 52,5 liter K2HP04-reagens 1,313 kg

NaCl-reagens 2,625 kg 20 25% dextroseopløsning (2) 58 liter

Ucon B625 Antifoam 95 ml

Destilleret vand 418,5 liter Høst oo inaktivering

Portionen blev inaktiveret ved høstning i en dræbertank 25 indeholdende 8,2 liter væskeformigt phenol.

i i 34 og 58%'s ethanoludfældning

Til 640 liter af den dræbte kultur blev der sat 213,3 liter 95%'s ethanol med en hastighed på 3,6 liter/min. under omrøring ved 20 - 26 °C efterfulgt af 117 liter 95%'s

C

£ l i i DK 171951 B1 25 ethanol ved en hastighed på 2 liter/min., til et totalt slutvolumen på 950 liter og en endelig koncentration på 35 volumen-% ethanol. Blandingen blev omrørt yderligere 4 timer ved 22 °C for at sikre fuldstændig fraktionering, 5 og den overliggende væske blev samlet via en bank med fem 4-inch "Sharpies"-centrifuger ved 15000 omdr./min. (strømningshastighed på ca. 4 liter/min.). Den uopløselige pellet blev bortkastet, og den rensede væske blev bragt til 58%'s ethanol ved tilsætning af 559 liter yder-10 ligere 95%'s ethanol ved en hastighed på 7,6 liter/min. Blandingen blev omrørt ved 21 °C i endnu 5 timer for at sikre fuldstændig udfældning.

Udvinding af den anden pellet

Det resulterende 34%'s ethanolopløselige 58%'s ethanol-15 uopløselige bundfald blev samlet ved centrifugering i 4-inch Sharpies-centrifugen ved 15000 omdr./min. (strømningshastighed på ca. 4 liter/min.), og den 58%'s etha-noloverliggende væske blev bortkastet. Det rå produktudbytte var 2,435 kg våd pasta.

20 24%1 s isonronanoludfældning

De 2,435 kg 58%'s ethanoluopløselige materiale blev kombineret med 1,626 kg materiale produceret fra en anden fermentering på lignende måde, og det resulterende 4,061 kg materiale blev blandet i en Daymax-dispersionsbeholder 25 ved 15 - 29 °C med 30 liter glasdestilleret vand i 12 minutter, indtil suspensionen var homogen. Ca. 66 yderligere liter destilleret vand blev sat til suspensionen, og i denne blanding blev omrørt i 4 timer. 24 Liter 5%' s na triumacetatopløsning blev sat til blandingen, og pH blev 30 indstillet til 6,5 ved tilsætning af iseddikesyre.

De 120 liter opløsning blev bragt til 24%'s isopropanol-koncentration ved tilsætning af 37,9 liter isopropanol DK 171951 B1 26 ved 0,3 liter/min. efter omrøring ved 15 - 29 °C. Efter yderligere omrøring i 4 timer blev blandingen centrifugeret gennem en 4-inch Sharples-centrifuge ved 15000 omdr./min. (strømningshastighed = 0,35 liter/min.) i 5,75 5 timer, og gennem en electronucleonic's K3-ultracentrifuge (28000 omdr./min.) ved 200 - 400 ml/min., indtil effluenten syntes klar, og den uopløselige pellet blev bortkastet.

39% * s isopropanoludfældning oa samling af rå produktpasta 10 Den 24%'s isopropanolopløselige overliggende væske fra det foregående trin blev bragt til 39%'s isopropanol ved tilsætning af 38,8 liter isopropanol med en hastighed på 0,3 liter/min. under omrøring. Blandingen (194 liter) fik derpå lov at henstå under omrøring i 3,25 timer, hvorpå 15 der blev centrifugeret i ca. 18 timer i en 4-inch Sharples-enhed ved 15000 omdr./min. (strømningshastighed = 0,5 liter/min.) for at samle det pelletterede rå poly-saccharid (2,006 kg).

Diafiltrerina 20 Pellet fra centrifugeringen blev overført til Daymaxblan-dere indeholdende 20 liter destilleret vand og blandet i 30 minutter, indtil suspensionen var homogen. Denne suspension blev derpå fortyndet med 300 liter koldt, glasde-stilleret vand og diafiltreret til en konstant lednings-25 evne ved ca. 23 °C på et Romicon-ultrafiltreringsapparat under anvendelse af HF26,5-45-XM50-patroner. Retentatet blev koncentreret til et minimumvolumen, Romicon-enheden blev skyllet, og skyllevæsken blev sat til retentatet, så at det endelige volumen var 86 liter. Ultrafiltratet blev 30 bortkastet. 1 t \ DK 171951 B1 27

Cetavlonudfældning 1,84 kg cetavlon (N,N,N-trimethyl-l-hexadecanaminiumbro-mid) blev opløst i 6 liter destilleret vand, og denne opløsning blev under omrøring i løbet af ca. 1 time sat til 5 de 86 liter retentat fra det foregående trin. Efter henstand i ca. 4 timer blev de udfældede urenheder (1,925 kg) samlet ved centrifugering i K3-ultracentrifugen (28000 omdr./min.) ved 5 °C i 8 timer, og den overliggende væske blev samlet.

10 Isopropanolfraktionering 28,55 kg natriumacetat-trihydrat blev i løbet af 10 minutter sat til de 86 liter overliggende væske fra det foregående under omrøring, og pH af opløsningen blev indstillet til 6,6 med iseddikesyre. Opløsningen blev bragt 15 til 28%'s isopropanol med 45,1 liter isopropanol ved 0,38 liter/min. under omrøring, og efter yderligere 4 timers omrøring ført ind i K3-ultracentrifugen (28000 omdr./min.), hvorfra 12 g bundfald blev samlet og bortkastet. 38,9 Liter isopropanol (slutkoncentration = 42%) 20 blev tilsat med en hastighed på 0,3 liter/min. til de 116 liter overliggende væske, under omrøring, og efter yderligere 4 timers omrøring blev opløsningen cirkuleret til to 4-inch Sharples-centrifuger ved 15 - 29 °C med 15000 omdr./min. (1,3 liter/min. strømningshastighed i hver), 25 og effluentet blev bortkastet.

Triturering og opsamling af slutprodukt

Den resulterende polysaccharidpellet blev tritureret i en 1-gallon Waring-blender under anvendelse af metoden med 30 sekunder tilsluttet og 30 sekunder slukket med 3 liter 30 absolut ethanol, indtil pastaen blev et hårdt hvidt pulver. Dette pulver blev samlet på en Biichnertragt udstyret med en teflonfilterskive og vasket in situ med fire 1- i > DK 171951 B1 28 liters portioner absolut ethanol og med to 2-liters portioner acetone. Produktet blev fjernet fra tragten og overført til tarerede skåle til tørring i vakuum ved 20 -25 °C (i ca. 18 timer). Det endelige udbytte af produktet 5 var 315,2 g tørvægt, og dets egenskaber var som følger:

Tabel 1-1

Pneumococ type 14 polysaccharid Kemiske prøvedata

Prove Resultat 10 Fugt (TG) 6,3%

Protein 4,8%

Nucleinsyre 0,6%

Hexosamin 28,6%

Nitrogen 1,6% 15 Phosphor 0,2%

Molekylstørrelse 0,19-0,21 (KD på Sepharose® 4B) Følgende procedurer blev anvendt ved udførelse af ovennævnte prøver.

20 1. Fugt - Standardtermogravimetri (vægttab til 100 °C) under anvendelse af en Perkin-Elmer termobalance TSG-1.

2. Protein - Lowry-metoden; Lowry et al., J. Biol.Chem., 193: 265 (1951).

3. Nucleinsyre - U.V. metoden; Warburg og Christian, Bio-25 chem Z., 2X0.: 384 (1942).

4. Hexosamin - Elson og Morgan, Biochem. J., 22: 1824 (1933).

i i i DK 171951 B1 29 5. Nitrogen - Forbrændingsmetoden under anvendelse af Perkin-Elmer 240-CHN elementaranalyseapparat.

6. Phosphor - Molybdatmetoden; Chen et al., Anal. Chem.

5 20.'· 1756 (1956).

EKSEMPEL 2

Fremstilling af Neisseria meningitidis Bil serotype 2 10 membranprotein_ A. Fermentering 1. Neisseria meningitidis gruppe Bil 15

Et rør indeholdende den lyophiliserede kultur af Neisseria meningitidis (opnået fra Dr. M. Artenstein, Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR), Washington, D.C.) blev åbnet, og Eugonbroth (BBL) blev tilsat. Kultu-20 ren blev udstreget på chokoladeagarplader (BBL) og inkuberet ved 37 "C med 5%'s C02 i 36 timer, efter hvilket tidsrum væksten blev høstet i 10%'s skummetmælksmedium (Difco), delt i lige store dele og frosset ved -70 'C. Organismen blev positivt identificeret ved agglutinering 25 med specifikt antiserum leveret af WRAIR og typeserum leveret af Difco.

Denne førstepassageskultur blev udstreget på chokoladeagarplader og inkuberet ved 37 *C med 5% COz i 18 timer, 30 efter hvilket tidsrum væksten blev høstet i 10%'s skummetmælksmedium, delt i lige store mængder på 1 ml og frosset ved -70 ’C. Organismen blev igen positivt identificeret ved agglutinering med specifikt antiserum leveret af WRAIR og typeserum leveret af Difco.

35 ! i i ί i i DK 171951 B1 30

Et glas af kulturen fra den anden passage blev optøet og udstreget på 10 Columbia fåreblodagarplader (CBAB-BBL).

Pladerne blev inkuberet ved 37 ”C med 5% C02 i 18 timer, 5 hvorefter væksten blev høstet i 100 ml 10%'s skummetmælksmedium, delt i mængder på 0,5 ml og frosset ved -70 'C. Organismen blev positivt identificeret ved agglutinering med specifikt antiserum, sukkerfermentering og gramfarvning.

10

Et glas af kulturen fra denne passage blev optøet, fortyndet med Mueller-Hinton bouillon og udstreget på 40 Mu-eller-Hinton agarplader. Pladerne blev inkuberet ved 37 ’C med 6% C02 i 18 timer, hvorefter væksten blev høstet i 15 17 ml 10%'s skummetmælksmedium, delt i 0,3 ml portioner og frosset ved -70 "C. Organismen blev positivt identificeret ved gramfarvning, agglutinering med specifikt antiserum og oxidasetesten.

20 2. Fermentering og samling af cellepasta a. inoculumudviKling

Inoculum blev dyrket fra to 0,5 ml frosne glas med Neis-25 seria meningitidis gruppe B, B-ll fra det foregående (passage 4). Fire Mueller-Hinton agar Blake-beholdere blev inoculeret, høstet ca. 18 timer senere og anvendt som inoculum for 5 liter Gotschlich's gærdialysatmedium ved pH 7,29. O.D. blev indstillet til 0,065 ved 660 run 30 (Perkin-Elmer). Organismen blev dyrket i 5 to-liters Er-lenmeyer-kolber (hver indeholdende 1 liter medium, se det følgende) ved 37 °C i en ryster. O.D. blev undersøgt ved intervaller på 45, 75 og 120 minutter. Der dannedes ca. 4 liter bouillonkultur ved en OD660 på 0,81 (Spectronic 20).

35 DK 171951 B1 31

En 3 ml prøve blev udtaget til gramfarvning, isolationsstreger på CBAB, Mueller-Hinton og gærekstrakdextrosepla-der og agglutineringskontrol. Alle reaktioner var tilfredsstillende .

5 b. 70-liters podefermentor

Ca. 3600 ml podekultur blev anvendt til at inoculere en steril 70-liters fermentor indeholdende 42,6 liter kom-10 plet produktionsmedium (se i det følgende).

Betingelserne for den 70-liters fermentering var 37 ‘C, 185 omdr./min. med 10 liter luft/min. igennem og konstant pH-kontrol ved pH 7,0 i 5,5 timer.

15

Kulturen blev udbredt på Mueller-Hinton-agarplader, gær-ekstraktdextrose og kaninblodagarplader (Merck) ved 37 *C og afprøvet for agglutinering for N. meningitidis gruppe B antiserum. Væksten på Mueller-Hinton-agarplader, gær-20 ekstraktdextroseplader og kaninblodagarplader var normal, og agglutineringsreaktionen var positiv. For denne portion blev den endelige O.D.-værdi 0,840 ved 660 micron efter 5,5 timers forløb.

25 c. 800-liters produktionsfermentor

Ca. 46,2 liter podekultur blev anvendt til at inoculere en steril 800 liters fermentor indeholdende 568,2 liter komplet produktionsmedium (se i det følgende). Portionen 30 blev inkuberet ved 37 ‘C, 100 omdr./min. med 60 li ter /min. lufttilførsel og konstant pH-kontrol ved pH 7,0.

Før portionen blev inaktiveret blev kulturen udbredt på Mueller-Hinton-agarplader, gærekstraktdextroseplader og 35 kaninblodagarplader ved 37 'C og afprøvet for agglutinering med N. meningitidis gruppe B antiserum. Væksten på DK 171951 B1 32

Mueller-Hinton-agarplader, gæragardextrose og kaninblod-agarplader var normal, og agglutineringsreaktionen var positiv. For denne portion var den endelige O.D. 2,24 13 timer efter inoculering.

5 3. Komplet medium for nephelometer-kolber oa 70- og 800 liters fermentorer

Fraktion A

10 __ L-glutaminsyre__1,5 g/liter

NaCl__6,0 g/liter

Na2HP04, vandfrit 2,5 g/liter NH4C1_1,25 g/liter KC1__0,09 g/liter L-cystein-HCl_0,02 g/liter

Fraktion B (Gotschlich*s gærdialvsat 1280 g Difco-gærekstrakt blev opløst i 6,4 liter destil-15 leret vand. Opløsningen blev dialyseret i en 2 Amicon DC-30 hulfiberdialyseenhed med tre HlOSM-patroner. Dialysa-tet og 384 g MgS04.7H20 og 3200 g dextrose blev opløst i dialysatet, og det totale volumen blev bragt op på 15 liter med destilleret vand. pH blev indstillet til 7,4 med 20 NaOH og steriliseret ved filtrering gennem Millipore (0,22 μ) og sat til fermentoren indeholdende fraktion A.

For nephleometerkolberne: 1 liter fraktion A og 25 ml fraktion B blev tilsat, og pH blev indstillet til 7,0 til 25 7,2 med NaOH.

For 70-liters fermentoren: 41,8 liter fraktion A og 900 ml fraktion Bl blev tilsat, og pH blev indstillet til 7,0-7,2 med NaOH.

DK 171951 B1 33

For 800-liters fermentoren: 553 liter fraktion A og 15,0 liter fraktion Bl blev tilsat, og pH blev indstillet til 7,0-7,2 med NaOH.

5 d. Hast og inaktivering

Efter fuldendt fermentering blev der til en separat beholder sat phenol (0,5 vol.-%'s slutkoncentration), hvortil cellebouillonen derpå blev overført. Materialet blev 10 holdt ved stuetemperatur med forsigtig omrøring, indtil kulturen ikke længere var levedygtig (ca. 24 timer).

e. Centri fugering 15 Efter 24 timers forløb ved 4 ‘C blev 614,4 liter inakti-veret kulturvæske centrifugeret gennem Sharpies-centrifuger. Vægten af cellepastaen efter phenoltilsætning var 3,875 kg.

20 B. Isolation

Trin I; Vask af bakterieceller

For hver isolering blev en aliquot på 200 g af ovennævnte 25 0,2% phenol-inaktiverede pasta suspenderet i en 800 ml portion sterilt destilleret vand og omrørt magnetisk til granulære suspensioner. De suspenderede celler blev pel-leteret ved 20000 x g i 60 minutter ved 5 °C (Beckman 19 Ti rotor, 14500 omdr./min.).

30

Trin 2; Ekstraktion

De vaskede celler blev suspenderet i 2000 ml 0,1 M Tris/0,01 M EDTA-puffer pH 8,5 med 0,5% natriumdeoxycho-35 lat (TED-puffer) med en Sorvall 2 quart omnimixer ved indstilling 3 i 60 sekunder.

DK 171951 B1 34

Den homogene suspension blev overført til 16 500 ml Er-lenmeyer-kolber til ekstraktion ved 56 "C i et rystevandbad i 15 minutter (ved temperaturen).

5 Ekstrakten blev centrifugeret ved 20000 x g i 60 minutter ved 5 ‘C (Beckman 19 Ti rotor, 14500 omdr./min.). De viskose overliggende væsker blev derpå dekanteret (total-volumen = 1980 ml) og opbevaret ved 4 "C.

10 Den ekstraherede cellepellet blev gensuspenderet i 2000 ml TED-puffer som beskrevet umiddelbart i det foregående. Suspensionen blev ekstraheret i 15 minutter ved 56 'C og centrifugeret som i det foregående. De overliggende væsker blev dekanteret (volumen = 2100 ml) og opbevaret ved 15 4 *C.

Trin 3: Koncentration ved ultrafiltrering

Ekstraktionssupernatanterne fra trin 2 blev samlet 20 (totalvolumen = 4005 ml). 2 liter af den samlede mængde blev sat til en 2 liter New Brunswich-fermenteringsbehol-der tilknyttet et Millipore Pellicon-filtreringsapparat udstyret med to 0,45 micron Durapore-membraner (overfladeareal h ft.2). Ekstraktsupernatanterne blev holdt ved 25 25 "C i fermenteringsbeholderen under den 90 minutters koncentrationsproces. Prøven blev koncentreret 10 gange ved et gennemsnitstransmembrantryk på 27,5 psi.

Trin 4; Opsamling og vask af serotvpeproteinet 30

Retentatet fra trin 3 (205 ml) blev centrifugeret til en pellet af serotypeproteinet ved 160000 x g i 2 timer ved 5 'C (Beckman 45 Ti rotor, 37000 omdr./min.). Supernatan-terne blev dekanteret og bortkastet.

35 DK 171951 B1 35

Proteinpellets blev vejet (8,12 g) og derpå suspenderet i TED-puffer (190 ml puffer, 20 ml/g pellet) manuelt med en glasstang og en Dounce-homogenisator. Suspensionen blev ekstraheret ved 55 'C i 15 minutter (ved temperaturen) i 5 en 500 ml Erlenmeyer-kolbe under omrystning. Suspensionen blev centrifugeret ved 160000 x g i 2 timer ved 5 ’C (Beckman 45 Ti rotor, 37000 omdr./min.). Den overliggende væske blev dekanteret og bortkastet (volumen = 190 ml). Pellets blev vasket den anden gang i 190 ml TED-puffer 10 som i det foregående.

Trin 5: Udvinding af produkt

De vaskede proteinpellet fra trin 4 blev suspenderet i 15 100 ml destilleret vand med en glasstang og en Dounceho- mogenisator for at sikre fuldstændig suspension. en Lowry-proteinværdi på 17,0 mg/ml blev opnået fra denne suspension. På dette tidspunkt blev 200 mg af suspensionen reserveret til eksperimentel anvendelse. Den reste-20 rende massesuspension (91 ml) blev fortyndet til 8,0 mg/ml med 102,4 ml glasdestilieret vand. Den vandige suspension blev centrifugeret ved 12000 x g i 15 minutter til klaring deraf fra aggregater (Beckman 45 Ti rotor, 10000 omdr./min.).

25

Supernatantproduktet blev udtaget omhyggeligt med pipette for at undgå den bløde aggregatpellet. Produktet blev mærket (volumen = 182,5 ml), og aliquoter blev afprøvet for sterilitet og pyrogenicitet (sterilt produkt; ingen 30 pyrogener). Produktet blev opbevaret ved 4 ‘C som en steril masse indtil anvendelse ved konjugation, på hvilket tidsrum de blev analytisk karakteriseret. Udbytte var 9,5 mg Lowry-protein/g oprindelig cellepasta.

35 DK 171951 B1 36 TABEL 2-1

Meningococ B serotype 2 proteinopløsning Kemiske prøvedata 5 __

Prøve_Resultat_

Protein__

Lowry_4,1 mg/ml_

Nucleinsyre*__ RNA (Bial)__1, 8%_ DNA (diphenylamin)_0, 6%_

Neutrale sukkerarter*__

Anthron__1,05_

Sialsyre*__3,0%_

Molekylvægt__ SDS-PAGE_ 40000d_ * Beregnet som % af Lowry-protein.

Følgende procedurer blev anvendt ved udøvelse af prøver-10 ne: 1. Protein - som i eksempel 1.

2. Nucleinsyre - farveudvikling blev observeret med or- 15 cinolreaktionen (Bial), som svarer til 1,8% RNA be regnet som en procentdel af proteinkoncentrationen. Diphenylamintesten for DNA indikerede et DNA-henhold på 0,6% beregnet som en procentdel af proteinet i masseopløsningen.

20 3. Neutrale sukkerarter - indholdet af neutralt sukker beregnet som en procentdel af protein blev fundet under anvendelse af den anthron-kolorimetriske test. (Scott and Melvin, Anal. Chem. 2ϋ, 1656, 1953).

DK 171951 B1 37 4. Sialsyre - sialsyreindholdet blev fundet under anvendelse af resorcinol-HCl-metode (Svennerholm, Blochem. Biophys., Acta 24, 604, 1957).

5 5. Molekylvægt - molekylvægten for det mercaptoethanol- denaturerede protein som bestemt ved SDS-polyacryl-amidgelelektroforese (Nature 227:680 (1970), LKB Application Note 306).

10 EKSEMPEL 3

Fremstilling af S. pneumoniae type 14 polysaccharid-N.-meningitidis B serotype ydre membranproteinkonjugat under anvendelse af centrifugering i konjugationstrinnet 15 I. Fragmentering af pneumococ type 14 polvsaccharid med vandia hydrazin

En 100 ml rundbundet kolbe blev forsynet med 24 ml H20 og 20 1,92 ml 97%'s hydrazin og derpå behandlet i et bad med kogende vand, indtil temperaturen var 100 *C (ca. 3 minutter). Dertil blev der på én gang sat 240 mg S. pneumoniae type 14 polysaccharid (Pn 14), og den resulterende opløsning blev hurtigt omrørt i 1,0 minut. Kolben blev 25 derpå afkølet hurtigt i et isbad, og dens indhold blev dialyseret i Spectropor 2 rør (molvægtsafskæring 12000-14000) mod 32 liter H20 i 5 timer. Derpå blev dialysen gentaget med endnu 32 liter H20 i 16 timer. Dialysatet blev overført til et 50 ml centrifugerør og centrifugeret 30 i en klinisk centrifuge til fjernelse af et slam. Super-natanten blev lyophiliseret, hvilket gav 163 mg fragmenteret Pn 14.

35 DK 171951 B1 38 II. Dannelse af butandiamlnderivatet af depolvmeriseret Pn 14 150 mg fragmenteret Pn 14 blev anbragt i en tør 50 ml 5 rundbundet kolbe og dækket med 9 ml dimethylsulfoxid (DMSO) og lukket med N2. Blandingen blev omrørt i 5,0 minutter ved 54 'C og derpå 5 minutter ved stuetemperatur. Næsten alt fragmenteret Pn 14 var i opløsning på dette tidspunkt. 36 ml carbonyldiimidazol blev derpå tilsat, og 10 opløsningen blev omrørt i 40 minutter. I løbet af denne tid blev der fremstillet en 1,4-butandiamin-dihydrochlo-ridopløsning (300 ml/6ml H20; pH indstillet til 9,45 med 2,5 N NaOH) og afkølet i isbad. Efter de 40 minutters omrøring blev DMSO-opløsningen sat til den afkølede butan-15 diaminopløsning og omrørt ved stuetemperatur i 4,5 timer.

Den blev derpå dialyseret med 30 liter H20 i 17,25 timer og derpå endnu 4 liter H20 i 4 timer. Den resulterende dialysat blev frysetørret, hvilket gav 152 mg af butan-diaminderivatet af Pn 14, Pn-BuA2. KD = 0,70 massenephe-20 lometrienheder (153% basispolysaccharid); Fluorescaminti-ter = 150 nm NH2/mg.

III. Bromacetylering af 1.4-butandlaminderivatet af Pn 25 140 mg Pn-14-BuA2 blev opløst i 10 ml pH 9,15 puffer, og til denne opløsning blev der sat 140 mg p-nitrophenyl-bromacetat opløst i 1 ml acetonitril. Denne opløsning blev tilproppet og omrørt ved 4 °C i 22,5 timer. Den blev 30 derpå dialyseret med 4 liter H20 i 6 timer, endnu 4 liter H20 i 16 timer og yderligere 4 liter H20 i 7 timer. Dia-lysatet blev derpå lysophiliseret, hvilket gav 139 mg af bromacetylderivatet af Pn 14-BuA2 (Pn 14-BuA2-BrAc). KD = 0,79 massenephelometrienheder = 120% basispolysaccharid.

35 DK 171951 B1 39

Flurescamin-titer = 6 nanomol/mg ifølge forskel (Δ = 150- 6) indikerer 144 nanomol bromacetylgrupper/mg.

IV. Konjugation af Pn 14-BuA2-BrAc til funktionallseret 5 N-meningitidis-protein (NMP)

Alle centrifugeringer blev foretaget i polycarbonatrør, medmindre andet er angivet, ved 43000 omdr./min. i 2 timer ved 4 * C i en Beckman Ti 75 rotor.

10

Den ufunktionaliserede protein (10 ml, 5,5 mg/ml) blev centrifugeret, og pellet blev gensuspenderet under anvendelse af en Dounce-homogenisator i 7 ml af en thiole-ringsblanding indeholdende 59 mg ethylendiamintetraeddi-15 kesyre, 11,2 mg dithiothreitol og pH 11,3 natriumborat-puffer. Efter gensuspendering af blandingen overføres den til et centrifugerør, der lukkes med en serumprop, og luften erstattes med N2. Dette blev overført til en nitrogenboks, og dertil blev der sat 54 mg N-acetyl-homo-20 cysteinthiolacton. Der blev tilproppet og derpå lagret i N2-boksen i 22 timer, hvorpå pH blev indstillet til 8,0 ved tilsætning af 1 M KH2P04. Den resulterende blanding blev centrifugeret, og pellet blev derpå gensuspenderet i 10 ml 0,1 M P04 pH 8,0 puffer. Der blev derpå gencentri-25 fugeret til fjernelse af de tilbageblevne små molekyler.

Den anden pellet blev gensuspenderet under anvendelse af Dounce-homogenisator i 8,5 ml pH 8,0 puffer. Ellman-prø-ven indikerer i alt 6,4 pmol thiol.

30 Til det gensuspenderede thiolerede protein blev der sat 50 mg Pn 14-BuA2BrAc, og den resulterende opløsning henstod i 17 timer ved stuetemperatur i nitrogenboksen.

Det blev derpå dialyseret mod 4 liter H20 i 6 timer. Halvdelen af opløsningen (5 ml) blev overført til et cen-35 trifugerør, og 4,0 g CsCl blev opløst deri. Røret blev fyldt til toppen (10 ml) med H20 og centrifugeret i 20 40 DK 171951 B1 timer ved 43000 omdr./min. ved 4 'C i en Ti 75 rotor. Det resulterende CsCl-gradientmassefyIdecentrifugat blev fraktioneret under anvendelse af et Haake Buchler Auto Densi Flow 2C apparat, i 1,3 ml fraktioner. Ni fraktioner 5 blev samlet og fraktion nr. 5, 6 og 7 blev kombineret, anbragt i et centrifugerør, 3,5 g CsCl blev tilsat, blandingen blev påfyldt H20 og centrifugeret i 24 timer som i det foregående. Centrifugatet blev fraktioneret som i det foregående, passende fraktioner blev detekteret ved mas-10 senephelometri, og fraktionerne 3 og 4 blev dialyseret mod 4 liter 0,1 M P04 puffer (pH 7) i 16 timer og derpå mod 4 liter H20 i 4 timer. Det resulterende dialysat blev fortyndet til 10 ml med H20.

15 Fundet: Polysaccharid 0,205 mg/ml protein 0,550 mg/ml

Spinco: S-carboxymethylhomocystein: 0,020 pmol lysin 0,156 pmol 20 forhold 0,128 EKSEMPEL 4

Fremstilling af S. pneumoniae type 14 polysaccharid-N-25 meningitidis B serotype ydre membranproteinkonjugat under anvendelse af en søjle i konjugationstrinnet_

Bromacetyleret 1,4-butandiaminderivat af pneumococ type 14 polysaccharid, fremstillet efter trin I, II og III i 30 eksempel 3 blev derpå konjugeret til proteinet fremstillet efter eksempel 2 i en variation af trin IV i eksempel 3.

35 l i DK 171951 B1 41

Konjugation af Pn 14-BuA2-BrAc til det ydre membranprote-in af Neisseria meningitidis (NMP)_ 1,2 ml af en opløsning af NMP (12,4 mg/ml) blev anbragt i 5 et centrifugerør sammen med 0,4 ml af en pufferopløsning indeholdende mættet NaB03 (pH 11,00) og 42 mg/ml ethylen-diamintetraeddikesyre og 8 mg/ml dithiothreitol. Røret blev lukket med en serumpakke, afgasset, og luften blev erstattet med nitrogen. I en nitrogenboks blev der derpå 10 tilsat 10 mg N-acetylhomocysteinthiolacton. Opløsningen henstod i 17 timer ved stuetemperatur. To "Sephadex"® G25 søjler (PD/10) blev derpå bragt i ligevægt med pH 8,0 phosphat (0,1 M) puffer. Til reaktionsblandingen blev der sat 0,9 ml af pH 8 pufferen, og derpå blev hele mængden 15 påført den første søjle. Denne blev elueret med 3,5 ml pH puffer. 2,5 ml af eluatet blev sat til en anden G-25 søjle, og denne blev elueret med 3,5 ml pH 8 puffer. Dette eluat havde 525 nanomol thiol (i alt) Ifølge Ellman's prøve. Dertil blev der sat 13 mg Pn 14-BuA2-BrAc, og 20 blandingen fik lov at henstå i 7 timer under N2. Den blev derpå dialyseret 2 gange mod separate portioner på 4 liter vand (i 5 timer og 16 timer). En lille prøve blev ly-ophiliseret til aminosyreanalysen. Der blev fundet 0,0073 pmol S-carboxymethylhomocystein og 0,104 pmol. Produktet 25 blev centrifugeret ved 100000 x g, og pellet blev resus-penderet i 10 ml H20 og recentrifugeret. Resuspension i 10 ml gav opløsning af Ps-14-BuA2-BrAc NMP konjugat. Po-lysaccharid:protein = 0,25. S-carboxymethylhomocyste in: lysin = 0,07.

30 35 DK 171951 B1 42 EKSEMPEL 5

Antistofresponstest i mus mod S. pneumoniae type 14 poly-saccharid - N. meningitidis B serotype ydre membranprote-5 inkonjugat_

En S. pneumoniae type 14 polysaccharid-N. meningitidis B serotype ydre membranproteinkonjugaropløsning fremstillet ifølge eksempel 4 blev afprøvet for immunogent respons i 10 mus, og resultaterne er angivet i tabelform i det følgende.

Serumantistofrespons for mus

Prøve Dosis, mcg Art RIA titer polys. (GMT) ng ab ____N/ml_

Konjugat 0,1 Spæd ICR/Ha 18046γγ mus (7 dage 22256 __gammel)__

Konjugat 0,1* ICR/Ha mus 19024 "_0,5*__" " " 74664_

Konjugat_0, 5*_CBA/N mus__7066_

Polysaccharid 0,5 spæd ICR/Ha 49 kontrol__mus__ 15 * Måde: injiceret i.p. på dag nr. 0, 7 og 28; tappet for blod på dag 34-35.

** Resultater repræsenterer serologi fra to forskellige kuld 20

Claims (9)

1. Fremgangsmåde til solubilisering af ikke-polyanioniske polysaccharider, kendetegnet ved, at man op- 5 varmer polysacchariderne i destilleret vand, fjerner restvandet og opløser polysaccharidet i det ikke-vandige polære, aprotiske opløsningsmiddel.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 10 ved, at der sættes 5-15%'s vandig hydrazin til det destillerede vand.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at polysaccharidet opvarmes i 30 sekunder til 10 mi- 15 nutter til 70-100 °C, vandet fjernes ved lyophilisering og tørring med P205 i vakuum, og det ikke-vandige, polære, aprotiske opløsningsmiddel er dimethylformamid, di-methylsulfoxid, dimethylacetamid, formamid eller N,N'-dimethylimidazolidinon. 20

4. Fremgangsmåde til covalent modificering af neutrale polysaccharider, som er solubiliserede ifølge krav 1-3, kendetegnet ved, at man: 25 (a) aktiverer polysaccharidet med et bifunktionelt rea gens , og derpå (b) omsætter dette aktiverede polysaccharid med en bis-nucleophil. 30

5 II O hvor p er 1-3, og X' er som defineret i det foregående.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den også omfatter omsætning af det aktiverede polysaccharid, som er blevet omsat med en bis-nucleophil, med et reagens, der danner modsvarende elektrophile ste- 35 der. DK 171951 B1

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at polysaccharidet fragmenteres ved opvarmning deraf i destilleret vand efterfulgt af fjernelse af vandet ved lyophi li sering og tørring med P205 i vakuum; det ikke-5 vandige, polære, aprotiske opløsningsmiddel er dimethyl-formamid, dimethylsulfoxid, dimethylacetamid, formamid eller N,Ν'-dimethylimidazolidinon; det bifunktionelle reagens vælges blandt kulsyrederivater, 0

10 R2-C-R3, hvori R2 og R3 separat er azolyl; halogenider; eller phe-nylestere; og bis-nucleophilen er en diamin med formlen H2N(CH2)nY(CH2)nNH2, hvor m er 0-4, n er 0-3, og Y er CH2,

15 O, S, NR', CHCOOH, hvor R' er H eller alkyl med 1 eller 2 carbonatomer, så at m og n ikke begge kan være nul, hvis Y er CH2, og m er større end 1, og n er større end 1, hvis Y er 0 eller S.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at det ikke-vandige, polære, aprotiske opløsningsmiddel er dimethylformamid, det bifunktionelle reagens er carbonyldiimidazol, og bis-nucleophilen er 1,4-butandi-amin. 25

8. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at det reagens, der danner elektrophile steder, er OR IH X ' CCHX, 30 hvor X' er nitrophenoxy, dinitrophenoxy, pentachlorphen-oxy, pentafluorphenoxy, halogenid, 0-(N-hydroxysuccinimi-dyl) eller azido, R er H eller CH3, og X er Cl, Br eller I; eller en aktiveret maleimidosyre 35 DK 171951 B1 O !i ,?, Λ X 1 C (CHo ) N >1 p \y

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet 10 ved, at det reagens, der danner elektrophile steder, er p-nitrophenylbromacetat.