JPH11502820A - 有機シアン化試薬により活性化された可溶性炭水化物を使用する免疫原性構築物の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、少なくとも１つの第１炭水化物含有成分をＣＤＡＰで活性化して活性化された炭水化物を形成し、そして前記活性化された炭水化物を第２成分に直接的または間接的にカップリングすることによって免疫原性構築物を製造する方法に関する。好ましくは、第１成分は多糖でありそして第２成分はタンパク質である。免疫原性構築物は、この方法により、第１成分および第２成分の直接または間接の結合により製造される。

Description

【発明の詳細な説明】 有機シアン化試薬により活性化された可溶性炭水化物を使用する免疫原性構築物 の製造 関係する出願に対する相互参照 これは１９９５年３月２２日提出の米国特許出願第０８／４０８，７１７号の 一部継続出願であり、後者は１９９３年９月２２日提出の米国特許出願第０８／ １２４，４９１号の一部継続出願である。 政府の権利 本発明は、米国政府の目的のために、特許所有権者に特許使用料を払わないで 製造し、実施許諾し、そして使用されることができる。 発明の背景 ある種の物質、例えば、破傷風トキソイドは免疫応答を固有に誘発することが でき、そして修飾せずにワクチンで投与することができる。しかしながら、他の 重要な物質は免疫原性ではなく、そして免疫原性の分子または構築物に変換され た後、免疫応答を誘発することができる。 本発明は、一般に、免疫原性構築物を製造する有利な方法に関する。本発明は 、また、得られる免疫原性構築物およびそれから製造されたワクチン、およびこ のような免疫原性構築物の使用に関する。 さらに詳しくは、本発明は免疫原性構築物の製造において使用す るために炭水化物含有抗原を活性化する方法に関する。免疫原性構築物は、炭水 化物含有成分を有機シアン化剤、例えば、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ） −ピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）で活性化することによって 非常に好都合に製造される。 種々のシアン化試薬は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーのゲルを 製造するために不溶性粒子を活性化するための試薬として、それ自体知られてい る。参照、Ｗｉｌｃｈｅｃｋ、ｅｔ ａｌ．、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａ ｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ． 、１０４Ｃ：３−５５。Ｗａｋ ｅｌｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃ．Ｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．、１９７６： ２１（１９７６）は、ＣＤＡＰがタンパク質のシステイン基を修飾するために使 用できる温和な試薬であることを報告している。Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｎ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１５：３７５（１９８１）は、アガロース、すなわ ち、不溶性多糖樹脂の活性化剤として、ＣＤＡＰ、Ｎ−シアノトリエチル−アン モニウムテトラフルオロボレート（ＣＴＥＡ）、およびｐ−ニトロフェニルシア ネート（ｐＮＰＣ）を比較した。他の研究者らは、他のタイプの不溶性粒子、例 えば、セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）およびグリセリル制御孔ガラスを活 性化するためにＣＤＡＰを使用した。参照、例えば、Ｃａｒｐｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、５７３：１３ ２−１３５（１９９２）。 米国特許第３，７８８，９４８号明細書（Ｋａｇｅｄａｌ ｅｔ ａｌ．）には 、一般に、第一級または第二級アミノ基を含有する有機化合物を１または２以上 のヒドロキシルおよび／または第一級および／または第二級アミノ基を含有する ポリマーに結合させるため に、例えば、水溶性酵素を水不溶性ポリマーに結合させるために、有機シアネー ト化合物を使用する方法を一般に記載している。Ｋａｇｅｄａｌ ｅｔ ａｌ． は、ある種の有機シアネート化合物、例えば、臭化シアンよりすぐれた利点を有 するｐＮＰＣを使用する方法を記載している。 同様に、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ 、４７：４３９−４４４（１９９１）は、 タンパク質との結合前に、可溶性多糖を活性化するためにＣＤＡＰを使用するこ とを報告している。ここで、シアネートで活性化された低分子量４０ｋＤのデキ ストランに表皮成長因子（ＥＧＦ）が直接結合され、そしてデキストラン−ＥＧ Ｆ複合体を製造するために、ほぼ５０：１（重量／重量）の非常に高いデキスト ラン／ＥＧＦの比が使用されており、そして培養された細胞へのこの複合体の結 合が研究されている。 しかしながら、Ｋａｇｅｄａｌ ｅｔ ａｌ．およびＡｎｄｅｒｓｓｏｎ ｅ ｔ ａｌ．は免疫原性構築物に関するものではない。事実、低分子量デキストラ ンとのタンパク質の複合体は、免疫原性が低いか、または非免疫原性であること が報告された。Ｔ．Ｅ．Ｗｉｌｅｍａｎ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ｏｇｙ 、３８：２６４（１９８５）。 免疫原性の程度は、もちろん、ワクチン接種の目的のために免疫原性構築物の 重要な性質である。ワクチン接種法は、病気を引き起こさないが、病気に対して 保護する抗体、細胞、および他の因子の形成を刺激する抗原で体を免疫化するこ とによって、侵入因子に対してそれ自体を保護する体の生得的能力を使用する。 例えば、死んだ微生物を注射して、細菌性疾患、例えば、腸チフスおよび百日咳 に対して保護し、トキソイドを注射して破傷風およびジフテリアに 対して保護し、そして減衰した微生物を注射してウイルス疾患、例えば、ポリオ および麻疹に対して保護する。 しかしながら、外来因子の注射により抗体形成を刺激することは常に可能であ るというわけではない。ワクチン調製物は免疫原性でなくてはならない、すなわ ち、免疫応答を誘発することができなくてはならない。免疫応答は一般に下記の ように記載することができる複雑な系列の反応である：（ｉ）抗原は体の中に入 り込み、抗原提示細胞と出会い、抗原提示細胞は抗原をプロセシングし、それら の表面上に抗原の断片を保持する；（ｉｉ）抗原提示細胞上に保持された抗原断 片は、Ｂ細胞を助けるＴ細胞により認識される；および（ｉｉｉ）Ｂ細胞は刺激 されて増殖し、抗原に対する抗体を分泌する抗体形成細胞に分割する。 大部分の細菌多糖に対する抗体は、莢膜細菌の感染に対する保護を提供する。 新生児および乳児は、多糖により例示されるようなＴ細胞依存性（ＴＩ）抗原に 対する活力のある応答を装備することができないので、これらの微生物による生 命を脅かす感染に対して極めて感受性である。このＴＩ抗原に対する免疫応答の 障害は、Ｔ細胞のエピトープを多糖に結合し、これによりそれらをＴ細胞依存性 （ＴＤ）抗原に変換することによって克服することができる。 免疫原性多糖構築物の製造に一般に使用される２つの結合法が存在する：（１ ）炭水化物とタンパク質との直接的結合；および（２）２官能性リンカーまたは スペーサー試薬を介する炭水化物とタンパク質との間接的結合。一般に、直接的 結合および間接的結合の双方は、誘導化の前に炭水化物成分の化学的活性化を必 要とする。 化学的活性化は、追加の化学的反応、例えば、官能基の付加または大きい成分 、例えば、タンパク質の付加を実行できる形成に官能基を変換することを意味す る。誘導化は、タンパク質への１または ２以上の官能的化学的基またはスペーサー試薬の付加である。 不都合なことには、活性化法を使用して結合を介して免疫原性構築物を形成す るとき、ある数の問題に当業者は直面する。例えば、複合ワクチンの生産は、む ずかしい課題であった。なぜなら、一成分、多糖およびタンパク質を分解しない か、またはそれらの免疫原性エピトープを崩壊させない条件下に、多糖を活性化 しそしてタンパク質を結合することが困難であるからである。免疫原性構築物の 製造において、使用する方法は重要な抗原部位、すなわち、エピトープを分子上 に保持するために十分に温和であるべきである。したがって、構造の完全性を維 持しかつこれらの化合物におけるエピトープを保存することが望ましい。不都合 なことには、この分野において現在使用されている製造工程はしばしば温和では なく、自然の炭水化物および／またはタンパク質の構造を破壊することがある。 そのうえ、炭水化物を修飾する既知の技術の多くは無水条件を必要とする。し かしながら、不都合なことには、炭水化物は有機溶媒中にしばしば不溶性である 。Ｍａｒｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １０８ ：５２８２（１９８６）。 こうして、炭水化物の修飾を記載する多数の化学文献が存在するが、それらの 多くは水性抗原とともに使用するためには不適当である。１つのアプローチは、 有機溶媒中の多糖の溶解度を増大するように多糖を修飾することであった。例え ば、ある種の酸性多糖上の酸性水素を疎水性テトラブチルアンモニウム対イオン で置換することによって、Ｍａｒｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．は有機溶媒中に多糖を 可溶化し、かつカルボニルジイミダゾール、すなわち、乾燥溶媒中で使用しなく てはならない試薬、でヒドロキシルを活性化することができた。この方法は多糖 、例えば、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ）ＰＲＰおよび肺炎球菌（ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）多糖６Ｂおよび１９Ｆ型とともに使用される。タン パク質のカップリングは、また、還元性アミド化により、アルデヒドを使用して 達成することができ、このアルデヒドは多糖の還元性末端上に存在するか、また は炭水化物の酸化によりつくられる。これらのアプローチの双方は固有の制限を 有し、こうして、高分子量の多糖について、還元性末端を介するカップリングは 通常遅く、非効率的であり、そして酸化はしばしば多糖の切断を生ずるか、また はそうでなければ抗原に影響を与える。 ある種の炭水化物は、結合前にいっそう容易に活性化または誘導化することが できる基、例えば、アミノまたはカルボキシル基を含有する。例えば、シュード モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｆｉｓｈｅｒ Ｉ型中のアミノ基はヨードア セチル基で容易に誘導化され、チオール化タンパク質に結合させることができる 。炭水化物、例えば、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）ＩＩＩ型中のカル ボキシル基は、水溶性カーボジイミド、例えば、ＥＤＣで活性化させ、次いでタ ンパク質に直接カップリングさせることができる。しかしながら、不都合なこと には、炭水化物のこの基は制限される。 他の炭水化物は、末端の還元性末端に、誘導化および結合に利用できるアルデ ヒド基を有する。また、酸化試薬、例えば、過ヨウ素酸ナトリウムを使用してア ルデヒド基をつくることができる。アルデヒド基をタンパク質上のアミノ基と、 または２官能性リンカー試薬と縮合させることができる。しかしながら、この縮 合反応、特に高分子量多糖の末端の還元性末端との縮合反応は、しばしば非常に ゆっくりかつ非効率的に進行する。したがって、この方法を使用するとき、収率 はしばしば非常に低い。そのうえ、過ヨウ素酸ナトリウムは炭水化物を小さい断 片に破壊しおよび／またはエピトープを崩壊し、これらは望ましくないことがあ る。 大部分の炭水化物は結合前に活性化しなくてはならず、そして臭化シアンは活 性化剤としてしばしば選択される。参照、例えば、Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎ ｆ．。＆ Ｉｍｍ． 、４０：２４５（１９８３）、およびＤｉｃｋおよびＢｅｒ ｒｅｔ、″Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃａ ｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ″、Ｃｏｎｊｕｇｔｅ Ｖａｃｃｉｎ ｅｓ 、Ｊ．Ｍ．ＣｒｕｓｅおよびＲ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ（編）、ｖｏｌ．１０、４ ８−１１４（１９８９）。最初の実施許諾された複合ワクチンは、ＣＮＢｒでＨ ＩＢ ＰＲＰを活性化し、次いでこれを酸性ジヒドラジドで誘導化し、水溶性カ ーボジイミドを使用して破傷風トキソイドにカップリングさせることによって製 造された。 ＣＮＢｒ活性化法を簡単に要約すると、臭化シアンを炭水化物と高いｐＨ、典 型的にはｐＨ１０〜１２において反応させる。この高いｐＨにおいて、炭水化物 のヒドロキシル基とシアネートエステルを形成する。引き続いて、シアネートエ ステルを２官能性試薬、通常ジアミンまたはジヒドラジドと反応させる。次いで 、これらの誘導化された炭水化物を２官能性基を介して結合させることができる 。ある種の制限された場合において、シアネートエステルをまたタンパク質と直 接反応させることができる。 高いｐＨはヒドロキシル基をイオン化するために必要とされる。なぜなら、こ の反応はシアネートイオン（ＣＮ-）に対するヒドロキシルイオンの求核性攻撃 を必要とするからである。その結果、臭化シアンは多数の副反応を生成し、副反 応のいくつかはネオ抗原を多糖に付加する。Ｍ．Ｗｉｌｃｈｅｃｋ ｅｔ ａｌ ．、Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ ｏｌ ． １０４Ｃ：３−５５。より重要なことには、多数の炭水化物または成分 、例えば、ＨＩＢ ＰＲＰおよびＰｎ６は、臭化シア ンの活性化の実行に必要な高いｐＨにより、加水分解するか、または損傷される ことがある。 ＣＮＢｒ活性化法を使用するときの他の問題は、形成したシアネートエステル が高いｐＨにおいて不安定であり、急速に加水分解し、誘導化された炭水化物の 収率を減少し、それゆえ、タンパク質に結合した炭水化物の全体の収率を減少す ることである。多数の他の非生産的副反応、例えば、カルバメートまたは線状イ ミドカーボネートを生成する副反応は高いｐＨにより促進される。Ｋｏｈｎ ｅ ｔ ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１５：３７５（１９８１）。その うえ、臭化シアンそれ自体は高度に不安定であり、高いｐＨにおいて自発的に加 水分解し、全体の収率をさらに減少させる。 さらに、臭化シアンの活性化は実行することが困難であり、そして信頼性がな い。臭化シアンは高度に毒性であり、潜在的に爆発性である。生産において使用 されるときのように大量を使用して作業するとき、極端な注意を払わなくてはな らない。すべての操作を適当なフュームフード中で実施しなくてはならない。ま た、臭化シアンのあるバッチはよくはたらくが、あるものははたらかないので、 活性化は再現性がないことはこの分野において知られている。臭化シアンは、ま た、水中によく溶けないので、炭水化物との反応に有効な炭水化物の量をコント ロールすることは困難となる。臭化シアンの同一のバッチおよび明らかに同一の 反応条件を使用してさえ、必ずしも同一の結果が得られるわけではない。 これらの欠点に加えて、臭化シアンを使用することによって達成される炭水化 物の活性化の程度をコントロールすることは非常に困難である。また、この方法 を使用して高いレベルの炭水化物の活性化を達成することは非常に困難である。 臭化シアンの存在量を増加 することは、無効であり、活性化を増加しないで、副反応を増加するだけである 。Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ａｎｄ Ｂｉ ｏｔｅｃｈ． ９：２８５（１９８４）。 したがって、臭化シアンの活性化は非常に有効な試薬であることが証明された が、ある数の制限を有する。例えば、ヒドロキシルをシアネートイオンと反応さ せるために十分に求核性とするために、臭化シアンは高いｐＨ（１０〜１２）を 必要とする。しかしながら、ＣＮＢｒおよびシアネートイオンのいずれも高いｐ Ｈにおいて安定ではなく、結局試薬の大部分は加水分解するか、または非生産的 副反応または不必要な副反応を行う。こうして、多糖の活性化効率は低い。さら に、活性化に要求される高いｐＨは多数のｐＨ感受性多糖を加水分解または損傷 させることがある。さらに、ＣＮＢｒは毒性であり、そして少量で作業すること が困難である。 そのうえ、前述したように、他の結合法は種々の欠点に悩まされる。例えば、 クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏ ｒｍａｎｓ）および肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）の多糖３およびＶＩ 型抗原のような多糖はタンパク質へのカップリングのための調製においてカーボ ジイミドで活性化できるカルボキシル基を有し、そしてシュードモナス（Ｐｓｅ ｕｄｏｍｏｎａｓ）Ｆｉｓｈｅｒ ＩＩＩ型のような多糖は好都合に使用できる アミノ基を有し、これらの抗原はすべての多糖の比較的制限された基を形成する 。したがって、多糖の大部分を活性化または官能化するために、他のアプローチ を必要とする。 １つの提案された解決法は還元アミン化方法であり、この方法において、制限 された数の反応性アルデヒドが生成し、アミンにカップリングされる。参照、Ｐ ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎ． ３９、２３３−２３ ８（１９８３）。他の解決 法はヘテロライゲーション、例えば、Ｍａｒｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．の２種類の スペーサー方法であり、この方法は、加水分解のとき独特のアミノ酸を生ずる、 チオール−エーテル結合を使用する。参照、Ｍａｒｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．、Ｊ ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １０８：５２８２（１９８６）。しかしなが ら、この方法は多糖が乾燥有機溶媒中に溶解すること必要とする。 制限された数のスペーサー基、例えば、ヘキサンジアミンまたはアジピン酸ジ ヒドラジドの付加による制限された誘導化がまた提案された。次いで、これらを 、例えば、臭化シアン法により付加することができる。この方法において、タン パク質のカルボキシルをカーボジイミドで活性化し、アミンまたはヒドラジドと 反応させる。しかしながら、この方法はタンパク質と多糖との高度の架橋および タンパク質の重合を引き起こす。 したがって、温和であり、炭水化物およびタンパク質の構造の完全性を維持し 、化合物中のエピトープを保存し、実施が容易であり、信頼性があり、容易に再 現可能であり、容易に大規模化可能であり、そして広範な種類の多糖を使用して 作業することができる、免疫原性構築物の製造方法がこの分野において要求され ている。 発明の要約 本発明の目的は、免疫原性構築物を製造する温和な方法を達成することである 。他の目的は、炭水化物およびタンパク質の構造の完全性を維持しかつ化合物中 のエピトープを保存する免疫原性構築物を作る方法を達成ことである。追加の目 的は、実施が容易であり、信頼性があり、そして容易に再現可能である免疫原性 構築物を製造する方法を達成することである。他の目的は、種々の多糖とともに 使用できる免疫原性構築物を製造する方法を開発することである。 追加の目的は、可溶性複合ワクチンを製造する好都合な方法を得ることである。 他の目的は、容易に大規模化される方法を達成することである。本発明のこれら および他の目的は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。 本発明は、安全であり、容易であり、費用がかからず、そして炭水化物に対し て温和である、炭水化物の活性化法を使用する結合法により、上記目的を達成し 、これにより免疫原性構築物を製造する既知の方法の問題および欠点を克服する 。そのうえ、この方法は均質反応を好都合に使用する。 本発明の方法は、好都合には、有機シアン化試薬、最も好ましくは１−シアノ −４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ） を使用して、炭水化物含有成分を活性化する。本発明の方法を使用すると、多糖 のみが修飾され、タンパク質を回収可能とする、多糖とタンパク質との複合体を 製造することができる。そのうえ、水溶性成分および／または界面活性剤可溶性 成分の複合体を本発明に従い容易に製造することができる。 １つの好ましい態様において、本発明は活性化された炭水化物含有成分を第２ 成分、例えば、水溶性タンパク質に直接結合することを含む。他の好ましい態様 において、本発明の方法は、官能性（２官能性またはヘテロ官能性）試薬を活性 化された炭水化物含有成分に共有結合させ、さらに官能性試薬を第２成分、例え ば、Ｔ依存性抗原と反応させて、炭水化物含有成分およびＴＤ成分が官能性試薬 により形成されたスペーサーまたはリンカーにより結合されている、複合免疫原 性構築物を形成することを含む。 他の好ましい態様において、免疫原性構築物は関係する米国特許出願第０７／ ８３４，０６７号（１９９２年２月１１日提出）、およびその一部継続出願第０ ８／０５５，１６３号（１９９３年２月 １０日提出）（それらの明細書は引用することによって本明細書の一部とされる ）に記載されている型の二重担体の構築物である。このような構築物の典型的な 一次担体は、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型（Ｐｎ１４）および ＤＮＡポリマーを包含する。 他の好ましい態様において、低いｐＫａを有する求核物質を形成するように誘 導化された第２成分、例えば、タンパク質に、本発明は活性化された炭水化物含 有成分を結合することを含む。このような誘導化に典型的な求核物質は、ヒドラ ジンおよびチオールを包含する。 本発明は、ＣＤＡＰで活性化後、タンパク質に直接的に結合できるか、または スペーサーまたはリンカーを介してタンパク質に間接的に結合できる、広範な種 類の可溶性炭水化物含有成分に適用可能である。本発明は、既知の方法を使用し て製造された免疫原性構築物よりも効率よい、安価な、いっそう有効な免疫原性 構築物の製造を可能とする。 そのうえ、ＣＤＡＰおよび反応条件は非常に温和であるので、炭水化物の構造 の破壊、それゆえ、天然に存在するエピトープの破壊の危険は大きく減少する。 さらに、この方法は、最近採用されている臭化シアンを使用する方法と比較して 、下記表１に要約する利点を有する。 ＣＤＡＰを使用することに対する追加の利点は、ＣＤＡＰを前以て製造し、数 カ月間溶液中に貯蔵することができ、そして活性試薬の濃度を３０１ｎｍにおけ る吸収から容易に測定できることである（Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１５：３７５（１９８１））。これにより、試薬濃度を標 準化し、炭水化物の誘導化をいっそう再現可能とすることができ、これはワクチ ンの製造において使用するために重要である。 本発明の他の利点は、ｐＨのコントロールによる炭水化物とタンパク質との選 択的または優先的カップリングを包含する。タンパク質およびペプチドの中に存 在する共通の求核基の多数は比較的高いｐＫａを有するので、低いｐＨにおいて 低いｐＫａを有する基を活 性化された炭水化物にこれらの他の基の存在において選択的に結合することがで きる。 低いｐＨにおける選択的または優先的カップリングはある数の利点を有する。 活性化された炭水化物は低いｐＨにおいていっそう安定であり、加水分解をより 少なくすることができる。そのうえ、低いｐＨにおいて、炭水化物のヒドロキシ ル基は低い求核性（反応性）を有し、環状中間体の形成を最小にし、なかでも、 シアネートエステルとの鎖間および鎖内の架橋を最小にする。加水分解がより低 くかつ副反応がより少ないので、全体のカップリング反応の効率は増加し、炭水 化物の活性化に要する試薬の量は少なくなり、それゆえ修飾は少なくなり、こう して、抗原性および免疫原性は増加する。 さらに、制限された数の低いｐＫａの求核物質でタンパク質を容易に誘導化す ることができ、こうしてタンパク質の変更を最小とすることができる。低いｐＨ において誘導化タンパク質上の反応性基の数は少ないので、低いｐＨにおける活 性化された炭水化物への誘導化タンパク質のカップリングはタンパク質一多糖の 結合の数を減少する。 そのうえ、ヒドラジドによるタンパク質の誘導化は、ヒドラジン中間体（例え ば、ＴＮＢＳ、放射性プローブ、およびその他）の特性決定の容易さを包含する 追加の利点を有する。これにより、カップリング前の誘導化の程度ならびに抗原 性および免疫原性が変更された程度の測定は容易となり、品質のコントロールお よび誘導化を最適にする機会はいっそうよくなる。さらに、カップリング前後の 遊離ヒドラジドの数を測定することによって、タンパク質−多糖の結合の数を決 定することができる。さらに、遊離ヒドラジドの数の増加をモニターし、複合体 中の結合が加水分解されていることを示 すことができるので、品質のコントロールを改良することができる。 追加の利点は、カルボキシル基またはアミン基の選択的修飾を包含する、タン パク質の中へヒドラジンを導入する非常に多数の方法を包含する。したがって、 この方法は比較的わずかのアミンを有し、一般にカップリング程度が低いトキソ イドのカップリングに対して特に有利であることがある。そのうえ、ヒドラジン とシアネートエステルとの反応生成物は生理的ｐＨにおいて帯電していないが、 アミンとシアネートエステルとの反応生成物は帯電している。 前述の利点は、炭水化物へのタンパク質の直接的結合およびスペーサーを介す る間接的結合の双方に適用される。本発明の追加の目的および利点は、詳細な説 明から明らかとなるであろう。 図面の簡単な説明 第１図は、有機シアン化試薬を使用する炭水化物の活性化の一般化スキームの １例を描写する。 第２図は、タンパク質への活性化された炭水化物の結合の典型的なスキームを 描写し、直接的結合は下部の左側に示されており、そして２官能性試薬を使用す る間接的結合は下部の右側に示されている。 第３図は、免疫原性構築物のモデルを示す。 第４図は、デキストランの中へのＮＨ₂基の組込み／１０ｍｇ／ｍｌのデキス トランにおいてデキストランの１モル当たり添加されたＣＤＡＰのモル数を図解 する。 第５図は、Ｓ４００ＳＦゲル濾過カラムからの³Ｈ−ＢＳＡ−デキストラン複 合体の溶離のプロフィルを図解する。 第６図は、Ｓ４００ＳＦゲル濾過カラムから溶離された、本発明 の方法に従い製造された免疫原性構築物のＯＤ２８０吸収を図解する。 第７図は、Ｓ４００ＳＦゲル濾過カラムからのＨδ^a／１−（ＣＤＡＰ）−デ キストラン複合体の溶離のブロフィルを図解する。 第８図は、Ｈδ^a／ＮＨ₂−（ＣＤＡＰ）−デキストランを負荷したＳ４００Ｓ Ｆゲル濾過カラムから溶離されたＯＤ２８０およびＯＤ４３０値を図解する。 第９図は、本発明の方法を使用して製造された免疫原性構築物の免疫反応性を 図解する。 第１０図は、１．６ｍｇ／ｍｌのデキストラン（ｄｅｘ）におけるヘキサンジ アミンおよびＣＤＡＰによるデキストランの誘導化の結果（ＮＨ₂／１００ｋＤ ａ ｄｅｘ／ｍｇ ＣＤＡＰ／ｍｇ ｄｅｘ）を示す。 第１１図は、ＣＤＡＰ活性化効率／多糖濃度のグラフである。 第１２図は、ＣＤＡＰ活性化についての種々のＣＤＡＰ／多糖の比におけるデ キストランへのＢＳＡの直接的結合を示す。 第１３図は、ＢＳＡ／デキストランの比／ＣＤＡＰ活性化デキストランへのタ ンパク質の添加時間のプロットである。 第１４図は、水中のＣＤＡＰの安定性を示す。 第１５図は、ＣＤＡＰ活性化多糖へのタンパク質のカップリングの反応速度を 図解する。 第１６図は、ＣＤＡＰ活性化へのｐＨの効果を示す。 第１７図は、ＣＤＡＰ活性化デキストランへのＢＳＡのカップリングに対する ｐＨおよび種々の緩衝剤の効果を示す棒グラフである。 詳細な説明および好ましい態様 有機シアン化試薬（これは一般に式Ｒ−ＣＮまたは｛Ｒ⁺−ＣＮ｝Ｘ^-で表すこ とができ、ここでＲは有機成分であり、そしてＸは対イオンである）を使用する 炭水化物の活性化についての一般化スキームは、第１図に示されている。第２図 は、タンパク質への活性化された炭水化物の結合を図解する。 本明細書おいて使用するとき、「免疫原性構築物」は免疫応答を刺激できる実 在物を意味する。免疫原性構築物は少なくとも１つの第２成分に結合した少なく とも１つの第１成分を含んでなる。本明細書おいて使用するとき、「成分」は、 それ自体で、またはカップリングされたとき、免疫系を刺激するために使用でき る物質である。 典型的な成分は、炭水化物、ペプチド、他の抗原、アジュバント分子、ハプテ ン、ＤＮＡ、およびそれらの組み合わせおよび誘導体を包含する。ハプテンは小 さい分子、例えば、化学物質、ダスト、およびアレルゲンを意味し、それらはそ れら自体で抗体の応答を引き出すことができないが、それらがいったん担体、例 えば、ＴＮＰにカップリングされると、前記応答を引き出すことができる。抗原 は、正しい環境下に、抗体の形成を誘発することができる分子である。これらの ハプテンおよび抗原は、細菌、リケッチア、真菌、ウイルス、寄生生物、薬物、 または化学物質から誘導することができるが、これらに限定されない。それらは 、例えば、小さい分子、例えば、ペプチド、オリゴ糖（例えば、インフルエンザ 菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）インフルエンザ菌のポリリボシル−リビトール −ホスフェートオリゴマー）、ＤＮＡオリゴマー、脂質、トキソイド、エンドト キシン、およびその他を包含することができる。好ましい成分は水溶性であるか 、または界面活性剤中で可溶化される。 好ましい態様において、第１成分は炭水化物含有成分である。本 明細書おいて使用するとき、「炭水化物」は、任意の可溶性の単糖、二糖、オリ ゴ糖、または多糖を意味する。好ましくは、第１成分は多糖、より好ましくは水 溶性多糖である。好ましい多糖は、下記の典型的なワクチンのチャートに列挙さ れているものを包含する。 炭水化物含有成分は好ましくは天然に存在する、半合成、または完全に合成の 高分子量の分子である。好ましい態様において、少なくとも１つの炭水化物含有 成分は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）多糖、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）多糖 、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃ ｃａｌ）多糖（Ｐｎ）、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、クリプトコックス・ネオ フォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、インフル エンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ＰＲＰ、緑膿菌 （Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、 リポ多糖、グループＡおよびグループＢのストレプトコッカス（ｓｔｒｅｐｔｏ ｃｏｃｃｕｓ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、およびそれらの 組み合わせから選択される。 特に好ましい態様において、炭水化物含有成分はデキストランである。本明細 書おいて使用するとき、「デキストラン」（ｄｅｘ）は単一の糖から構成された 多糖を意味し、これは任意の数の源（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から入手す ることができる。他の好ましい炭水化物含有成分はフィコールであり、これは不 活性の、半合成の、非イオン化、高分子量ポリマーである。 炭水化物含有成分は、有機シアン化試薬を使用して活性化される。好ましい有 機シアン化試薬は、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニウムテトラ フルオロボレート（ＣＤＡＰ）、Ｎ−シアノトリエチルアンモニウムテトラフル オロボレート（ＣＴＥＡ） 、およびｐ−ニトロフェニルシアネート（ｐＮＰＣ）である。これらの試薬のう ちで、ＣＤＡＰは最も好ましい。シアネート基、必要に応じて種々の対イオンと の他の有機複合体を使用することができる。特に好ましい有機シアン化試薬は、 非求核性対イオンを有するもの、例えば、テトラフルオロボレートである。 有機シアン化試薬による活性化後、第１成分を第２成分に結合する。好ましく は、第２成分はタンパク質であり、これはウイルス、細菌、寄生生物、動物、お よび真菌のタンパク質から選択することができる。特に好ましい第２成分は、リ ポタンパク質、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、破傷風トキソイド（ＴＴ）、百 日咳トキソイド（ＰＴ）、ジフテリアトキソイド、ジフテリアトキソイド百日咳 トキソイド（ＤＴ）、熱ショックタンパク質、Ｔ細胞超抗原、および細菌の外膜 タンパク質を包含し、それらのすべては生化学または製剤の供給会社から入手で きるか、または標準的方法により製造することができる（参照、例えば、Ｊ．Ｍ ．ＣｒｕｓｅおよびＲ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ（編）、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃ ｉｎｅｓ ｉｎ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ ｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 、ｖｏｌ．１０（１９８９）（これは引用す ることによって本明細書の一部とされる）。他の適当なタンパク質は、この分野 において知られているものから選択することができる。 第２成分の他の好ましい態様は、アルブミン、トキソイド、ペプチド、Ｔ細胞 またはＢ細胞のアジュバント、またはＴ細胞の促進を活性化しかつレスキューす ることができる任意の他の化合物である。第２成分は第３図に表されているよう なＴ依存性抗原であることができる。 本発明の第２成分は、少なくとも１つの炭水化物含有成分に結合 することができる。第２成分は炭水化物含有成分と反応できるか、または炭水化 物含有成分と反応できるように化学的に修飾することができる官能基を含有する ことができる。本発明の特に好ましい態様において、第２成分を誘導化して、選 択的カップリングのために十分に低いｐＫａを有する求核物質を形成する。本明 細書おいて使用するとき、用語「十分に低いｐＫａ」は、カップリングのために 選択されたｐＨにおいて反応するとき、求核物質がプロトン化されないが、他の 反応性基がプロトン化されるように十分な程度に、求核物質のｐＫａがタンパク 質またはペプチド中の他の反応性基のｐＫａより低いことを意味することを意図 する。換言すると、求核物質は、タンパク質またはペプチド中の他の反応性基が 反応性である程度が低い（すなわち、実質的にプロトン化される）特定のｐＨに おいて反応するように、選択される。したがって、カップリングに適当なｐＨは 、他の因子の中でも、使用する特定の求核物質に基づいて選択される。好ましく は、選択するｐＨは約８より低い。適当な求核物質の例示的例は、ヒドラジドお よびチオールを包含する。 特に好ましい態様において、タンパク質またはペプチドの官能基はヒドラジド を形成するように誘導化される。ヒドラジドを当業者に知られている方法に従い タンパク質またはペプチドに付加することができる。 例えば、ポリペプチドの１または２以上のカルボキシル基を、高濃度のビスヒ ドラジド、例えば、アジピン酸ヒドラジドの存在において、カーボジイミド、例 えば、ＥＤＡＣで活性化することができる。メチルイミダゾールおよび／または ＮＨＳの添加により、副反応を抑制できる。カーボジイミド／ポリペプチドのモ ル比により、誘導化の程度をコントロールできる。 同様に、タンパク質上のアミンをトラウト（Ｔｒａｕｔ）試薬、 ＳＰＤＰまたはＳＡＴＡ（引き続いて脱保護を行う）を使用してチオール化し、 次いでヘテロ２官能性試薬、例えば、ＥＭＣＨ（チオール反応性マレイミドおよ びヒドラジドを含有する２官能性）と反応させることができる。誘導化の程度は 初期のチオール化によりコントロールされる。また、標準的ヘテロライゲーショ ン技術を使用してタンパク質をチオール反応性基（求電子試薬、例えば、マレイ ミドまたはヨードアセチル）で誘導化し、次いでチオールヒドラジドと反応させ ることができる。また、アミンを種々のビシナルヒドロキシル基含有試薬と反応 させることができる。次いで、生ずる生成物を過ヨウ素酸ナトリウムで切り放し 、ビスヒドラジドと反応させることができる。 グリコシル化タンパク質を、適当な試薬、例えば、過ヨウ素酸ナトリウムでｐ Ｈ５において酸化することができる。次いで酸化生成物をビスヒドラジドと反応 させて、本発明において使用するのために所望の誘導体を形成できる。 合成の間に、ヒドラジドおよびチオールのような求核物質をタンパク質、ペプ チド、オリゴヌクレオチドおよび多数の薬物の中に混入することができる。また 、システイン残基を所望の位置に配置し、引き続いてＥＭＣＨと反応させること によって、ヒドラジドを付加することができる。同様に、まず所望の部位にα− ハロケトン基を含有するペプチドを合成することによって、ヒドラジドを付加す ることができる。次いでこの基をチオールヒドラジドとの反応によりヒドラジド に変換することができる。参照、Ｂ．Ｉｖａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｏ ｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、６、２６９（１９９５）。 活性化後、第１成分を第２成分に結合する。特定の第２成分の多数のコピーな らびに種々の第２成分を炭水化物含有成分に結合する ことができる。第１成分への第２成分の多数のコピーのカップリングは、第２成 分に対する抗体の産生を有意に増強する。 本発明の方法は、免疫原性構築物の物理的性質および化学的性質の有利なコン トロールを可能とする。本発明によれば、当業者は有利に：第１成分および第２ 成分上の電荷を変更することができ（カチオン化されたタンパク質がいっそう免 疫原性であることができるという証拠に照らして有利である）；炭水化物含有成 分の大きさを変化させることによって構築物の大きさをコントロールすることが でき；鎖間または鎖内の構築物の架橋の程度を選択することができ（３次元のマ トリックスの大きさおよびそれを変化させるために）；炭水化物含有成分に結合 した第２成分のコピー数をコントロールすることができ；そして選択された細胞 集団をターゲッティングする（例えば、マクロファージをターゲッティングして 抗原提示を増強する）ことができる。ＤｉｃｋおよびＢｅｕｒｒｅｔ、″Ｇｌｙ ｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａ ｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ″、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｊ．Ｍ． ＣｒｕｓｅおよびＲ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ（編）、ｖｏｌ．１０、４８−１１４（１ ９８９）。 免疫調節因子および／または細胞ターゲッティング成分の添加により、本発明 の構築物の免疫応答をさらに増強することができる。これらの実在物は、例えば 、下記のものを包含する：（１）解毒されたリポ多糖または誘導体、（２）ムラ ミルジペプチド、（３）細胞表面の決定因子と相互作用して構築物を免疫学的に 関係する細胞にターゲッティングすることができる炭水化物、脂質、およびペプ チド、（４）インターロイキン、（５）抗体、および（６）ＤＮＡオリゴマー。 したがって、別の態様において、第３成分を１または２以上の第 １成分および／または第２成分に、本明細書において記載するＣＤＡＰ活性化の ような方法または他の既知の技術により、結合することができる。米国特許出願 第０７／８３４，０６７号および同第０８／０５５，１６３号明細書に、第３成 分に対する増強された抗体の応答を促進する構築物が記載されている。第１成分 または第２成分に種々の成分を結合するある種の技術は、当業者によく知られて おり、例えば、利用可能な官能基（例えば、アミノ、カルボキシル、チオおよび アルデヒド基）を介するカップリングを包含する。参照、Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ、Ｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ａｎｄ Ｃｒ ｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ （１９９１）、およびＢｒｅｎｋｅ ｌｅｙ ｅｔ ａｌ．、″Ｂｒｉｅｆ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ Ｗｉｔ ｈ Ｄｙｅｓ，Ｈｐａｔｅｎｓ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ Ａｇｅ ｎｔｓ″、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３：１（Ｊａｎ． １９９２）（これらは引用することによって本明細書の一部とされる）。こうし て、１官能性試薬を第３成分として使用して、例えば、電荷を変更し、疎水性を 変化させ、構築物を標識化し、およびその他をなすことができる。 本発明の方法において、有機シアン化試薬を使用して炭水化物含有成分を活性 化する。有機シアン化試薬は好ましくはＣＤＡＰであり、これはシアネートの求 電子性を増加しそして、炭水化物含有成分と反応するとき、シアノ基を炭水化物 のヒドロキシル基に移し、こうして、それをそれ以上の反応、すなわち、タンパ ク質への直接的または間接的結合のために準備する。活性化反応は中性のｐＨに おいてまたは温和に塩基性の条件（例えば、約８〜約１０のｐＨ）下に実施する ことができ、これは多糖および活性中間体の安定性お よび完全性を改良する。 ＣＤＡＰは高度に安定性でありかつ比較的安全であるので、有利である。ＣＤ ＡＰは水溶性有機シアン化試薬であり、その中のシアノ基の求電子性が増加され ており、温和な条件下にシアン化反応の実施を好都合に可能とする。さらに、Ｃ ＤＡＰを使用して広範な種類の多糖を活性化することができ、次いで活性化され た多糖をジアミンまたはジヒドラジドで官能化することができる。高い活性化お よびＣＤＡＰシアン化反応の温和な条件のために、ワンポット反応においてタン パク質を多糖に直接的に結合することができ、これにより、スペーサー分子の非 存在においてさえ、多糖およびタンパク質成分の双方に対する抗体の応答を誘発 する複合ワクチンの製造は簡素化される。ＣＤＡＰは使用容易であるので、種々 の条件下のタンパク質−多糖複合体の製造が促進され、こうして複合ワクチンの 免疫原性の重要なパラメーターの研究が可能となる。そのうえ、ＣＤＡＰ活性化 多糖を使用して種々の他の有用な免疫学的試薬、例えば、ビオチニル化多糖およ び抗体連鎖デキストラン、例えば、Ｈδ^a／１を製造することができる。 活性化は好ましくは約６〜約１０、より好ましくは約９〜約１０のｐＨにおい て実施される。ｐＨは種々の技術（例えば、緩衝液の使用、ＮａＯＨの添加、お よびその他）により調節して、製造される特定の構築物に適合させることができ る。例えば、活性化は、種々の溶媒中で、この分野において知られている種々の 適当な非求核性緩衝剤の１または２以上を使用して、実施することができる。適 当な溶媒は、生理食塩水、水、およびいくつかの有機溶媒を包含する。適当な非 求核性緩衝剤の例は、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、４−（２−ヒドロキシエチ ル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、リン酸塩、炭酸塩、 およびホウ酸塩である。 本発明の好ましい態様において、ＣＤＡＰを乾燥アセトニトリル中において１ ００ｍｇ／ｍｌ濃度または水中において７５ｍｇ／ｍｌまでの濃度で貯蔵液中に 溶解する。使用する炭水化物含有成分の特質および所望の活性化の程度に依存し て、ＣＤＡＰの種々の量が最適であろう。 好ましい態様において、炭水化物含有成分の濃度は１〜２０ｍｇ／ｍｌ、より 好ましくは１〜１５ｍｇ／ｍｌである。活性化反応は約１００ｍｇ／ｍｌまでの 濃度で首尾よく実施することができる。 好ましくは、タンパク質の直接結合のためのＣＤＡＰ／炭水化物含有成分の比 は約１００：１〜約５００：１モルのＣＤＡＰ／１００ｋＤａの炭水化物含有成 分である。他の好ましい態様において、スペーサーを使用するタンパク質の間接 結合のためのＣＤＡＰ／炭水化物含有成分は約１０：１〜約５００：１モルのＣ ＤＡＰ／１００ｋＤａの炭水化物含有成分である。成分の特質および使用する条 件に依存して、異なる成分の比が最適であることがある。 未反応のＣＤＡＰおよび反応の副生物、例えば、ジメチルアミノピリジンは、 誘導化またはタンパク質へのカップリングの前に、好ましくは酸性条件下に、適 当な精製技術、例えば、透析、限外濾過、または適当なバイオプロセシングビー ズ、例えば、ＳＭ４ビーズ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して除去することができる。 精製された活性化多糖は、また、沈降、例えば、冷エタノールを使用する沈降に より調製可能である。 好ましい態様において、ＣＤＡＰで活性化された炭水化物含有成分を第２成分 に直接的に結合して免疫原性構築物を製造する。本発明の好ましい態様において 、活性化された炭水化物含有成分を適当な２官能性試薬またはヘテロ官能性試薬 に共有結合させる。このような官能性試薬の例は、エチレンジアミン、１，６− ヘキサンジア ミン、アジピン酸ジヒドラジド、シスタミン、リジン、グルタミン酸、チオール ヒドラジド、およびチオールアミンであり、必要に応じて適当に保護される。参 照、Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、″Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ″、ＣＲＣ Ｐｒｅｓ ｓ （１９９１）。次いで、既に他の末端において炭水化物含有成分に共有結合さ れている官能性試薬に、第２成分を共有結合させる。 カップリング反応のために好ましいｐＨ範囲は、約７〜約９、最も好ましくは 約７〜約８．５である。デキストランのような多糖を結合するために、ｐＨは好 ましくは約７．４〜約８である。第２成分を誘導化してジヒドラジドのような求 核物質を形成するとき、カップリング反応のためにｐＨは好ましくは約８より小 さく、より好ましくは約７より小さい。 １つの好ましい態様において、ＣＤＡＰを使用して、多糖をタンパク質に約１ ：１〜約３：１、例えば、１：１の比において結合させる。最適な結果のために は、高い多糖濃度を回避する。好ましい構築物は、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏ ｃｃａｌ）多糖に結合した破傷風トキソイドおよびインフルエンザ菌（Ｈａｅｍ ｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ＰＲＰ結合した破傷風トキソイドを包 含する。本発明に従い製造された他の好ましい複合体は、ＴＴ−ＰＲＰ、Ｐｎ１ ４−ＴＴ、Ｐｎ２３−ＴＴ、マラリア誘導ペプチド−Ｐｎ１４、ＤＴ−Ｐｎ１４ 、Ｐｎ６−ＴＴ、Ｐｎ１９−ＴＴ、およびペプチド−ＴＴ−Ｐｎを包含する。 好ましい態様において、トリエチルアミン（ＴＥＡ）を使用して、中間体フォ ン・ブラウン（Ｖｏｎ Ｂｒａｕｎ）複合体の形成を介して先行することがある 、シアン化反応を促進させる。ＴＥＡの代わりに、フォン・ブラウン複合体を形 成できる他の第三級アミン 使用することができる。Ｊ．Ｖｏｎ Ｂｒａｕｎ、Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ． ３３： １４３８（１９００）。 ある種の結合反応のために、グリシン、アミノエタノール、または他のアミノ 含有試薬を使用して反応をクエンチすることができる。また、複合体の電荷を変 更する１つの方法として、このようなクェンチング試薬を使用することができる 。 他の態様において、本発明は、免疫原性構築物と、薬学上許容される媒質また はデリバリーベヒクルとから構成されたワクチンに関する。このようなワクチン は、患者への適切な投与の形態を提供するために、有効治療量の免疫原性構築物 と、適当量のベヒクルとを含有するするであろう。これらのワクチンは、明礬ま たは他のアジュバントを含んでなることができる。 典型的な薬学上許容される媒質またはベヒクルは、無菌の液体、例えば、水お よび油、例えば、石油、動物、植物または合成由来のもの、例えば、落花生油、 大豆油、鉱油、ゴマ油、およびその他である。医薬組成物を静脈内に投与すると き、生理食塩水は好ましいベヒクルである。また、水性デキストランおよびグリ セロール溶液を液状ベヒクルとして、特に注入用溶液のために、使用することが できる。適当な製剤用ベヒクルは、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （引用することによっ て本明細書の一部とされる）に記載されている。 本発明に従い製造できるワクチンは、下記のものを包含するが、これらに限定 されない：チャート ジフテリアワクチン 破傷風（サブユニット）ワクチン 破傷風ワクチン インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型（リン酸ポリリボース） 肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、すべての血清型大腸菌（Ｅ．ｃｏ ｌｉ）、エンドトキシンまたはＪ５抗原（ＬＰＳ、脂質Ａ、およびゲンタビオー ス） 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｏ多糖（血清型特異的） クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、多糖（血清型特異的）黄色ブドウ球菌 （Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、５および８型（血清型特異的および普通の防御抗原） 表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、血清型多糖Ｉ、ＩＩ、および ＩＩＩ（および普通の防御抗原） 髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、血清型特異的または防御抗原 ポリオワクチン おたふくかぜ、麻疹、風疹のワクチン ＲＳウイルス 狂犬病 Ａ、Ｂ、Ｃ型肝炎、およびその他 ヒト免疫不全ウイルスＩおよびＩＩ（ＧＰ１２０、ＧＰ４１、ＧＰ１６０、ｐ２ ４、およびその他） 単純ヘルペス１および２型 ＣＭＶ（サイトメガロウイルス） ＥＢＶ（エプスタインーバールウイルス） 水痘／帯状ヘルペス マラリア 結核 カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、他のカンジダ ニューモシティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ） マイコプラズマ インフルエンザウイルスＡおよびＢ アデノウイルス グループＡストレプトコッカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ） グループＢストレプトコッカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、血清型、Ｉａ 、Ｉｂ、ＩＩ、およびＩＩＩ 緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（血清型特異的） ライノウイルス パラインフルエンザエ、１、２、および３型 コロナウイルス サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ） シゲラ［赤痢菌］（Ｓｈｉｇｅｌｌａ） ロタウイルス エンテロウイルス トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）および ニューミニエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＴＷＡＲ）クリプトコックス・ネオフ ォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ） 本発明は、また、免疫刺激量のワクチンを投与することによる患者の治療に関 する。用語「患者」は、治療が有益である任意の被検体を意味し、そして哺乳動 物、特にヒト、ウマ、雌牛、イヌ、およびネコ、ならびに他の動物、例えば、ニ ワトリを包含する。「免疫刺激量」は、疾患の予防、改善、または治療のために 患者の免疫応 答を刺激することができるワクチンの量を意味する。本発明のワクチンは、任意 の適当なルートにより投与できるが、好ましくは静脈内、筋肉内、鼻内、または 皮下の注射により投与される。 本発明は、また、患者を前述のワクチンで免疫化し、こうしてドナーがワクチ ンに対して向けられた抗体を生産するようにすることによって、細菌、ウイルス 、寄生生物、または化学物質により引き起こされる感染に対する免疫治療因子を 調製する方法に関する。抗体は単離するか、またはＢ細胞を取得した後、骨髄腫 細胞と融合してモノクローナル抗体をつくることができる。モノクローナル抗体 をつくる方法は、一般に、この分野において知られている（参照、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）（詳しくは引用す ることによって本明細書の一部とされる）。本明細書において使用するとき、「 免疫治療因子」は、患者の受動的治療において使用するための特定の免疫原に対 して向けられた抗体の組成物を意味する。血漿ドナーは、ワクチン中に含有され ている免疫原に対する抗体を産生するためのワクチンで注射される任意の被検体 である。実施例１ スペーサーを使用する炭水化物含有成分の誘導化 材料： ＣＤＡＰ、ピリジン、ヘキサンジアミン、ホウ酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、お よびトリエチルアミン（ＴＥＡ）をアルドリッヒ（Ａｌｄｒｉｃｈ）（ウィスコ ンシン州ミルウォーキー）から購入した。炭水化物含有成分、Ｔ２０００デキス トラン（平均分子量２０００ｋＤａを有する）は、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ）（ニュージャージイ州パルシパニイ）から入手した。 乾燥アセトニトリル中のＣＤＡＰの１００ｍｇ／ｌの貯蔵液を−２０℃におい て貯蔵し、使用するとき、氷上に保持した。Ｔ２０００デキストランを生理食塩 水＋０．０２％のアジド中において１０．５ｍｇ／ｍｌで調製した。水性トリエ チルアミンの貯蔵液を０．２Ｍで調製し、使用の間、氷上に保持した。 ヘキサンジアミンを０．１Ｍのホウ酸ナトリウム中において０．５Ｍで調製し た。 トリニトロベンゼンスルホネート（ＴＮＢＳ）および１１，０００ｍ^-1の吸光 係数を３６６ｎｍにおいて使用して、アミノ基を測定した。Ｆｒａｎｃｉ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、８６：１５５（１９８６）。Ｍ．Ｍ ｏｎｓｉｇｎｙ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、１７５：５２５（１９ ８８）の方法により、標準としてＴ２０００デキストランを使用して、炭水化物 をアッセイした。 コントロール反応： 下記の実施例により、本発明の誘導化反応において使用する化合物の重要性を 証明する。最終の複合体中のアミノ基は炭水化物に共有結合されており、そして アミノ基の存在は人工物または最終生成物の中への試薬の「キャリオーバー」の ためではないことを、結果は示す。実施した実験について、試薬の省略または置 換は表２に示す通りであった。 すべての試薬を使用する手順において（表２の第１行）、ＣＤＡＰを３００μ ｌのデキストラン（３．１ｍｇ）の撹拌溶液に添加し、氷のバケツに戻した。３ ０秒後、ＴＥＡを撹拌溶液に添加した。ＣＤＡＰの添加後２分に、２００μｌの ジアミンを添加し、この溶液を氷上にさらに１時間保持した。試料を一夜透析し 、ミレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）ＧＶフィルターで濾過し、さらに１×１５ｃｍの Ｐ６ＤＧカラム（ＢｉｏＲａｄ）上で脱塩した。 下記表２に示すように、アミノ基はデキストラン、ＣＤＡＰ、ＴＥＡ、および ヘキサンジアミンの存在においてデキストランの中に最適に取込まれた。表２の データかさらに示すように、検出されたアミノ基は最終生成物の中への未結合試 薬のキャリオーバーのためではない。これらの結果はＴＥＡが誘導化のために不 必要であることを示すが、ＴＥＡが存在しないとき、誘導化の程度は低いことが 示される（後述するように、多分低いｐＨのためである）。 ヘキサン１，６−ジアミンによるＴ２０００デキストランの誘導化 この実験は、炭水化物を誘導化してアミノ基を高い比および低い比で導入する ためにＣＤＡＰを使用できることを証明する。デキストランＴ２０００をモデル の炭水化物として使用した。デキストランはグルコースモノマーから構成された ポリマーである。 多数の複合ワクチンの製造における第１工程はスペーサーの添加である（Ｄｉ ｃｋおよびＢｅｕｒｒｅｔ、″Ｇｌｙｃｏｃｎｊｕｇａｔｅｓ ｏｆ Ｂａｃｔ ｅｒｉａｌ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ″、Ｃｏｎｊｕｇａ ｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ 、 Ｊ．Ｍ．ＣｒｕｓｅおよびＲ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ（編）、ｖｏｌ．１０、ｐｐ．４ ８−１１４（１９８９））。この系列の実験は、表３に要約されており、スペー サーを多糖に容易に添加できることを強調している。 この実験を２つの温度において実施した。表３の第１〜７および １１行に要約する実験において、すべての試薬を氷冷し、そして第８〜１０行に 要約する実験において、試薬は室温であった。手順および試薬を表２に要約する 実験について前述したように使用し、そして試薬の添加量は表３に示す通りであ った。第１１行に表す実験において、ジアミンを０．１５ＭのＨＥＰＥＳ中の溶 液として添加した。この反応は低いｐＨにおいて効率がわずかに低かった。他の 実験において、ヘキサンジアミンを０．１Ｍのホウ酸塩、ｐＨ９、中で調製した 。 効率は、百分率として表した、使用したＣＤＡＰの１モル当たり取込まれたス ペーサー基のモル数として定義される。最後の列（誘導化％）は、スペーサーで 修飾されたデキストランのグルコースモノマー単位の百分率である。 結果はさらに第４図に図解されており、第４図は取込まれたアミノ基の合計数 （例えば、添加されたスペーサー試薬）／デキストランの１モル当たり添加され たＣＤＡＰのモル数／デキストランのモル数を示す。このデータをＮＨ₂の取込 み／ＣＤＡＰのモル数／デキストランの１モル当たり添加されたＣＤＡＰのモル 数に変換したとき、１より小さいＣＤＡＰ／グルコース比は高いレベルのＮＨ₂ の取込みのために十分であることが明らかである。したがって、高いＮＨ₂基の 取込みのために、デキストラン多糖の最小の修飾が必要である。 さらに、活性シアネートエステルの未決定量がスペーサー添加なしで加水分解 されるので、ＣＤＡＰ／グルコース比はポリマーの修飾度の過大評価である。し たがって、実際の修飾度は計算されたＣＤＡＰ／グルコース比より低い。 試験した最低の試薬投与量（第１行）３．１％におけるスペーサー基の取込み の程度を、複合ワクチンの合成に使用されたそれと比 較する（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆ．＆ Ｉｍｍ．、４０：２４５（１９８ ３）；ＤｉｃｋおよびＢｅｕｒｒｅｔ、″Ｇｌｙｃｏｃｎｊｕｇａｔｅｓ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ″、Ｃｏ ｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ 、Ｊ．Ｍ．ＣｒｕｓｅおよびＲ．Ｅ．Ｌｅｗ ｉｓ（編）、Ｖｏｌ．１０、ｐｐ．４８−１１４（１９８９）。 表および図面は、スペーサー試薬を添加するためのＣＤＡＰ反応の高い効率を 証明する。反応条件のさらに最適化すると、効率を増加することができる。また 、ＣＤＡＰを使用して可能である、多糖の中へのスペーサー基の非常に高い取込 みレベルが示されている。最大のＣＤＡＰの添加量（第７行）において、グルコ ース単位の５のうちのほぼ１がスペーサーで修飾された（２０％）。臭化シアン でこの程度のスペーサーの取込みを得ることができない（Ｋａｇｅｄａｌおよび Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ、Ａｃｔａ Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃａｎ．、２５：１８５５ （１９７１））。 反応の間に、デキストラン多糖の明らかな沈降が存在した。対照的に、多糖の 凝集および沈降は臭化シアン法を使用するときの１つの問題であることがある（ ＫａｇｅｄａｌおよびＡｋｅｒｓｔｒｏｍ、Ａｃｔａ Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃａ ｎ． 、２５：１８５５（１９７１））。 これらの反応は小さい体積（＜１ｍｌ）で実施され、こうして多数の試験的実 験を好都合に実施することができた。価値ある炭水化物およびタンパク質を浪費 しないで手順を最適化するとき、これは重要である。したがって、小さい体積の 例示された試薬ならびに本明細書において記載する他の情報から、当業者は商業 的使用のために大規模化するとき所望のように多い量を使用して本発明を容易に 実施することができる。対照的に、非常に少量の臭化シアンを使用 して好都合に作業することは困難である。なぜなら、臭化シアンは水溶性が低く 、効力および毒性が不確実であるからである。 そのうえ、表３の第８〜１０行をだい１〜７および１１行と比較すると、カッ プリング反応を０℃または室温において実施したとき、デキストラン中へのアミ ノ基の取込みレベルはほぼ同一であったように思われる。ＣＤＡＰを使用する結合反応の効率の証明および放射性標識化タンパク質を使用 する結合の証明 ＣＤＡＰを使用する結合反応はタンパク質濃度を推定するために通常使用され る波長２８０ｎｍにおいて多少の吸収を引き起こしたので、放射性標識化タンパ ク質をデキストランに直接結合させた。タンパク質の収率および回収を決定した 。 特にＢｒｕｎｓｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎ ｏｌ． 、１４０：３３６４（１９８８）に開示されているように、ＢＳＡをＮ− ヒドロキシスクシンイミド（３Ｈ−２，３）−プロピオネート（Ａｍｅｒｓｈａ ｍ）で放射性標識化した。放射性標識化ＢＳＡをＰＢＳ＋０．０２％アジドの中 に完全に透析し、Ｓ１００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上のゲル濾過クロマトグ ラフィーにかけて凝集を除去し、そしてＹＭ３０フィルター（Ａｍｉｃｏｎ）を 使用して限外濾過した。ＢＳＡ濃度は、２８０ｎｍ（４４，０００Ｍ^-1）におけ るその吸光係数から決定して、２１ｍｇ／ｍｌであった。液体シンチレーション 計数により決定された貯蔵液の比活性は５．４８×１０¹²ｃｐｍ／モルであった 。 他の試薬は下記の通りであった：Ｔ２０００デキストラン（ほぼ２０００ｋＤ ａ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を１０．５ｍｇ／ｍｌにおいて水中に溶解した。Ｃ ＤＡＰを乾燥アセトニトリル中において１００ｍｇ／ｍｌで調製し、トリエタノ ールアミン（ＴＥＡ）を水 中において０．２Ｍで調製した。グリシン（ｐＨ５．０）を水中において１Ｍで 調製した。 プロトコール：試薬を氷上に保持し、そしてすべての反応を氷上で実施した。 反応混合物を各添加の間に撹拌した。２５μｌのＣＤＡＰを０．５ｍｌのデキス トラン（５．２５ｍｇ）に添加し、３０秒後、２５μｌのＴＥＡを添加した。合 計２．５分後、５．２５ｍｌの放射性ＢＳＡを添加した。３０分後、反応を１０ ０μｌのグリシンの添加によりクエンチし、４℃において一夜放置した。次いで スピン（Ｓｐｉｎ）−Ｘ膜（ＣＯＳＴＡＲ）を使用して、０．６ｍｌのアリコー トを濾過した。濾過前後における放射性アリコートを比較すると、放射能の本質 的１００％がフィルターの中に回収されたことが証明された。生理食塩水＋０． ０２％のアジドと平衡化させた１×５７ｃｍのＳ４００ＳＦゲル濾過カラム（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ）に５００μｌのフィルターを適用し、０．２ｍｌ／分におい て展開させた。０．８９ｍｌの画分を集め、分析した。Ｍｏｎｓｉｇｎｙ ｅｔ ａｌ．の方法により４８０ｎｍにおける吸収を使用して、デキストラン濃度を 測定した。各管から採った５０μｌのアリコートの放射能を液体シンチレーショ ン計数により測定し、そして³Ｈ−ＢＳＡ濃度をその比活性を使用して計算した 。カラムの溶離における未結合ＢＳＡの位置を独立のカラムの展開において決定 した。 第５図に示すように、ＢＳＡの大きい部分（ｃｐｍで表わされる）は高分子量 の形態であり、これはデキストランと同一位置において展開し、ＯＤ４８０で表 わされる。未結合タンパク質を表す小さい残留ＢＳＡピークが存在する。表４は 精製データを含む。 このカラムは、未結合タンパク質からデキストラン−ＢＳＡ複合体をきれいに 分離しなかった。これは異常である。なぜなら、高分子量ポリマーはゲル濾過カ ラムにおいてテイリングをしばしば引き起こすからである。さらに、Ｔ２０００ デキストランは未分画であったので、ある範囲の大きさを有した。遊離ＢＳＡお よび結合ＢＳＡがオーバーラップする領域における結合したＢＳＡの量を推定す るために、結合ＢＳＡ／デキストランの一定比を仮定した。合計の結合ＢＳＡ（ ＢＳＡ／デキストラン比×デキストランの合計のモル量から計算された）は２． ５５ｍｇとして決定された。これにより示されるように、タンパク質の８７％が 結合した形態に変換された。 このＢＳＡ−デキストランの実験結果を表５（第１行）に、異なる量のＣＤＡＰ およびＴＥＡを使用する３つの他の試験（第２〜４行 ）と一緒に要約する。ＴＥＡの量およびＣＤＡＰの量の双方は、直接的結合によ り高いタンパク質／多糖の比を得ることを促進する。この方法は少量を使用して 好都合な実験を可能とするので、試薬の最適な量を容易に決定することができる カーボジイミドまたはヘテロライゲーションのカップリング法と異なり、直接 的結合反応は未結合タンパク質を修飾せず、またそれは苛酷な条件を使用しない ことを強調すべきである。したがって、それ以上の使用のために未結合タンパク 質を回収できるであろう。多数のタンパク質抗原が価値があるので、これは直接 的結合法の１つの主要な利点である。実施例２Ａ ＰＴ−Ｐｎ１４複合体の製造 これらの実験の目的は下記の通りである：（１）低分子量の形態から高分子量 の形態へのタンパク質の転換が炭水化物へのタンパク質の直接的結合の結果であ ることを証明すること；（２）１つの特定の組の条件下に、タンパク質の結合に 必要なシアン化試薬の最小量を決定すること；および（３）臨床的に関係する複 合体を本発明の方法を使用して製造できることを証明すること。 百日咳トキソイド（ＰＴ）（Ｍａｓｓ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｂｉｏ ｌ．Ｌａｂｓ、マサチュセッツ州ボストンから入手した）を０．５ＭのＮａＣｌ 、０．０２Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．８、中に０．２８９ｍｇ／ｌにおい て溶解した。ＰＴの１００ｍｌ当たり０．１ｍｌの０．１Ｍのホウ酸ナトリウム 、ｐＨ９．１、または０．７５ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、を添加した。肺炎 球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型（Ｐｎ１４）（ＡＴＣＣロット８３９ ０９）を０．１５Ｍの生理食塩水＋０．０２％のアジド中に５ｍｇ／ｍｌにおい て溶解した。トリエチルアミン（ＴＥＡ ）水中に０．２Ｍにおいて溶解した。ＣＤＡＰをアセトニトリル中に１００ｍｇ ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌにおいて溶解した（−２０℃において調製しかつ貯 蔵した）。グリシンを１．０Ｍ、ｐＨ５．０において調製した。グリシン／ＨＣ ｌの代わりに、アミノエタノールまたは他のアミノ試薬を使用できる。実験１ − 直接的結合による有効な条件下に構築物の合成：ＰＴ−Ｐｎ１４ 各管は氷上において２５０μｇのＰｎ１４（５０μｌ）を含有した。時間ゼロ において、表に示す種々の量のＣＤＡＰを添加し、３０秒後、２５μｌのＴＥＡ を添加した。２分後、１ｍｌのＰＴを添加した。約１時間後、１００μｌのグリ シン溶液を添加した。 試料を４℃に一夜保持した。次の日に、試料をコスター（Ｃｏｓｔａｒ）０． ４５ミクロンの回転フィルターで濾過し、ＨＰＬＣ ＴＳＫ−ゲル濾過カラム上 で０．２ＭのＫＣｌ中で展開させた。ＨＭＷ％は高分子量ＯＤ２８０複合体ピー クの面積／未結合成分を示すＯＤ２８０ピークの面積である。それは（空隙体積 のピークの面積％）／（空隙体積のピークの面積％＋未結合成分のピークの面積 ％）により定義される。ＨＰＬＣ展開から得られた面積％は、下記の通りであっ た： ＰＴ対照は２２％のＨＭＷを有するので、反応条件により引き起こされるＰＴ の凝集が少量で存在することがある。この組のデータは、また、ＣＤＡＰ／多糖 （Ｐｓ）回転を変化させることによって、最終複合体におけるタンパク質／炭水 化物の比をコントロールできることを示す。実験２ − ＰＴへの単糖の結合 この系列において、Ｐｎ１４多糖の代わりに１５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌのモ ノマーのグルコースの溶液を使用した。実施例１に類似する条件を使用したが、 ただしホウ酸塩の代わりにＰＴをＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５、０．０７５Ｍ）中で 調製した。また、２５μｌのＴＥＡの代わりに２０μｌを使用した。これらの条 件は下記のものを生じた： Ｎｏ．２および３は、ＣＤＡＰが百日咳トキソイドそれ自体を重合しないこと 、したがって、ＰＴの高分子量形態への変換が高分子量多糖へのそのカップリン グのためであり、タンパク質の重合のためでないことを示す。ＨＰＬＣの展開か ら、ＰＴの分子量のわずかの増加が存在したので、グルコースがＰＴに結合した ことが明らかであった。実験３ − スペーサーを介する有効なワクチン構築物の合成：ＰＴ−Ｐｎ１４ ヘキサンジアミンで誘導化されたＰｎ１４を下記のようにして調製した。１０ μｌのＣＤＡＰ（アセトニトリル中の１００ｍｇ／ｍｌ）を添加した（１９３モ ルのＣＤＡＰ／１００ｋＤａの多糖）。３０秒後、；２０μｌのＴＥＡ（０．２ Ｍ）を添加した。合計２．５分後、３００μｌの０．１Ｍのホウ酸ナトリウム（ ｐＨ９．１）中の０．５Ｍのヘキサンジアミンを添加した。１時間後、この溶液 を水中に透析し、濾過し、Ｐ６ＤＧ（ＢｉｏＲａｄ）カラム上で生理食塩水中に 脱塩した。空隙体積をプールし、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）３０装置 （Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮した。それは３３アミノ基／１００ｋＤａのＰｎ１４多 糖を有することが決定された。 百日咳トキソイドをヘテロライゲーション化学を使用してアミノ−Ｐｎ１４に 結合した（Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．）。５０μｌの０．７５ＭのＨＥ ＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を０．４４ｍｌのアミノ−Ｐｎ１４に添加した。そ れを１０μｌの０．１ＭのヨードアセチルプロピオネートＮ−ヒドロキシ−スク シンイミド（ＳＩＡＰ）でヨードアセチル化した。百日咳トキソイドを２０倍モ ル過剰量のＳＡＴＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カリフォルニア州ラジョラ）でチ オール化した。各々を生理食塩水中に脱塩し、混合し、１／９体積の０．７５Ｍ のＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、および０．５Ｍのヒドロキシルアミンを含 有する緩衝液を添加した。最終体積は１．１ｍｌであった。一夜インキュベート した後、この溶液をメルカプトエタノール中で１時間０．２ｍＭとし、次いでヨ ードアセタミド中で１０分間１０ｍＭとし、次いでそれをＳ４００ＳＦゲル濾過 カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で分画した（第６図 参照）。百日咳トキソイドのほぼ５０％が結合した形態で回収された。最終複合 体は０．７モルのＰＴ／１００ｋＤａのＰｎ１４多糖を含有した。ブラッドフォ ード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）により標準としてＰＴを使 用して、複合体中のタンパク質濃度を決定した。Ｍｏｎｓｉｇｎｙ ｅｔ ａｌ ．の方法により標準としてＰｎ１４を使用して、多糖濃度を決定した。実施例２Ｂ ＣＴＥＡを使用するＰｎ１４へのタンパク質の直接的結合： Ｋｏｈｎ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１５：３７５（１ ９８１）に記載されているように、ＣＴＥＡは副反応がＣＤＡＰより少ないとい う利点を提供し、より純粋な生成物に導く。その欠点は、それが湿分感受性であ り、閉じた容器中で秤量しなくてはならず、そして貯蔵液として生ずる調製でき ないということである。 １ｍｌの肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型多糖（Ｐｎ１４）（生 理食塩水中の５ｍｇ／ｍｌ）を０℃に保持する。ＣＴＥＡ（入手先、Ａｌｄｒｉ ｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ウイスコンシン州ミルウォーキー）を乾燥窒素下に貯 蔵する。２ｍｇのＣＴＥＡを閉じた秤量容器中で秤量し、冷却し、激しく混合し たＰｎ１４に添加する。２０μｌのＴＥＡ（水中の０．２Ｍ）を混合しながら直 ちに添加する。６０秒後、５ｍｇの百日咳トキソイド（１．５ｍｇ／ｍｌ）を撹 拌した溶液に添加する。３０分後、反応を２００μｌの１Ｍのグリシン（ｐＨ５ ．０）クエンチする。さらに１時間後、この溶液を濾過し、生理食塩水と平衡化 させたＳ４００ＳＦゲル濾過カラム上に通過させる。１：１複合体が生成する。ＣＴＥＡを使用する肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型多糖へのスペ ーサー試薬の添加 ： １ｍｌのＰｎ１４（生理食塩水中の５ｍｇ／ｍｌ）を０℃に保持する。ＣＴＥ Ａ（入手先、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、ウイスコンシン州ミルウォー キー）を乾燥窒素下に貯蔵する。１ｍｇのＣＴＥＡを閉じた秤量容器中で秤量し 、冷却し、激しく混合したＰｎ１４に添加する。直ちに２０μｌをＴＥＡ（水中 の０．２Ｍ）に混合しながら添加する。１時間後、この溶液を生理食塩水中に完 全に透析し、滅菌濾過する。１８７モルのＣＴＥＡ／１００ｋＤａのＰｎ１４の 比を使用するので、ほぼ１８アミン／１００ｋＤａのＰｎ１４を有する複合体が 生成する。実施例３ インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）多糖（Ｐ ＲＰ）への百日咳トキソイドの直接的結合 平均分子量３５０ｋＤａのＰＲＰを、マサチュセッツ・パブリック・ヘルス・ バイロジカル・ラボラトリー（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈ ｅａｌｔｈ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から入手した。百 日咳トキソイドを同一源から入手した。１５μｌのＣＤＡＰ（１００ｍｇ／ｍｌ ）を氷上の１００μｌ（２ｍｇ）のＰＲＰに添加した。３０秒後、３０μｌのＴ ＥＡを添加した。これは３１９モルのＣＤＡＰ／１００ｋＤのＰＲＰを表した。 さらに２分後、０．７５ｍｌの百日咳トキソイド（１．１ｍｇ）を添加した。４ ０分後、２００μｌの１Ｍのグリシン（ｐＨ５．０）を添加して反応をクエンチ した。さらに１時間後、この溶液を生理食塩水と平衡化させたＳ４００ＳＦゲル 濾過カラム上に通過させた（第７図参照）。空隙体積をプールし、滅菌濾過した 。生成物は１．１のＰＴ／１００ｋＤａのＰＲＰを有すると決定され、全体の収 率は６８％であった。 Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．、Ｉｎｆ．＆ Ｉｍｍ．、４０：２４５（ １９８３）によりワクチンを調製し、このワクチンは３７７モルの臭化シアン／ １００ｋＤａのＰＲＰを使用し、そして１．４〜２．１のＰＴ／１００ｋＤａの ＰＲＰの比を有し、収率は５０％より低かった。したがって、本発明の直接的結 合法は同様な複合体を生じたが、より少ない作業で、より高い収率を生じ、毒性 の試薬を使用しなかった。 ＰＲＰ複合体を製造する多数の発表されたプロトコールはスペーサーを使用し て誘導化されたＰＲＰで開始する（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏ ｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５２：３６１（１９８０）；Ｄｉ ｃｋおよびＢｅｕｒｒｅｔ、″Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｏｆ Ｂａｃ ｔｅｒｉａｌ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ″、Ｃｏｎｊｕｇ ａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ 、Ｊ．Ｍ．ＣｒｕｓｅおよびＲ．Ｅ．Ｌｅｗｉｓ（編 ）、Ｖｏｌ．１０、ｐｐ．４８−１１４（１９８９））ので、ＣＤＡＰが、また 、スペーサーをＰＲＰに添加するために使用された。使用される条件は前述した 通りであったが、百日咳トキソイドの代わりに１００μｌの０．１Ｍのホウ酸塩 中の０．１Ｍのヘキサンジアミンが添加された。生成物を生理食塩水中に透析し た。それは１０２アミノ基／１００ｋＤａのＰＲＰを有することが決定された。 これは発表された手順において使用されたより高い比であるので、なおさらに少 ないＣＤＡＰを使用できたであろう。実施例４ ＣＤＡＰ化学を使用して製造されたワクチンとして有効な免疫原性構築物ＣＤＡ Ｐおよび２官能性試薬を使用する結合 簡単に述べると、配偶子特異的タンパク質ｐｆｓ２５からのマラリア誘導ペプ チド、ｐ２８（ＣＮＩＧＫＰＮＶＱＤＤＱＮＫ）を破傷風トキソイド（ＴＴ）に 結合した。ｐ２８はマラリア伝達ブロッ キング抗体を誘導することが示された。次いでＣＤＡＰを使用してｐ２８−ＴＴ を肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型（Ｐｎ１４）多糖に結合した。 ＦＤＡ承認破傷風トキソイドをＨＥＰＥＳ中に一夜透析し、そして３０倍モル 過剰のヨードアセチル化剤（ＳＩＡＰ）と反応させた。３時間後、試薬をマクロ セプ（Ｍａｃｒｏｓｅｐ）３０（Ｆｉｌｔｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使 用する限外濾過により除去し、新鮮なＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ、ｐＨ７．５、緩 衝液中に洗浄した。おだやかに撹拌しながら、トリチウム標識化ｐ２８を固体と して誘導化ＴＴに添加した。４℃において一夜反応性させた後、混合物を０．２ ｍＭのメルカプトエタノールで処理して残留する活性基をブロックし、次いでＨ ＥＰＥＳ緩衝液と平衡化したＰ６ＤＧカラム上で脱塩した。ペプチドの特異的活 性から、生成物は２０モルのｐ２８ペプチド／モルのＴＴを含有することが決定 された。複合体を生理食塩水中に透析し、滅菌濾過した。ＣＤＡＰを使用する直接的結合 Ｐｎ１４（入手先、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅ ｃｔｉｏｎ、ＡＴＴＣ）は高分子量を有した（約１０⁶ダルトン）。ｐ２８−Ｔ Ｔを下記のようにしてＰｎ１４に直接的に結合した。ＣＤＡＰ（アセトニトリル 中の１００ｍｇ／ｍｌの貯蔵液から１０μｌ）をＰｎ１４（１５０μｌの生理食 塩水中の１．１ｍｇ）。３０秒後、２０μｌのトリエチルアミン（０．５Ｍ）を 添加した。２分後、０．５５ｍｇ（０．８ｍｌの生理食塩水中の）のｐ２８−Ｔ Ｔを添加し、そして１時間後、反応を２００μｌの１．０Ｍのグリシン（ｐＨ５ ）でさらに１時間クエンチした。次いで生理食塩水と平衡化させたＳ４００ＳＦ ゲル濾過カラム上に複合体を通し、複合体を含有する空隙体積をプールした。第 ９図は、ｐ２ ８−ＴＴの事実上すべてが空隙体積の中に複合体の形態で見出されたことを示す 。免疫原性構築物の免疫活性 ５匹のＤＢＡ／２マウスのグループを生理食塩水中の１０μｇのｐ２８−ＴＴ または（ｐ２８−ＴＴ）−Ｐｎ１４複合体で静脈内免疫化し、３週後に採血し、 そして血清をＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノアッセイ）により組換えｐｆｓ２５タ ンパク質に対する活性についてアッセイした。ペプチドｐ２８をｐｆｓ２５から 誘導化する。マウスの他の組をアジュバントの明礬（Ｉｍｊｅｃｔ、Ｐｉｅｒｃ ｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、イリノイ州ロックフォード）で沈降させた同一 抗原で免疫化した。 関係する出願と一致して、表７は高分子量の複合体のみがすぐれた抗タンパク 質力価引き出したことを示す。 これが証明するように、ＣＤＡＰ法を使用して有効なワクチン構築物を調製す ることができる。また、それは有効な複合体を容易に製造できることを示す。実施例５ ＣＤＡＰを使用して製造した生物学的に活性な多価タンパク質複合体 ＣＤＡＰを使用してタンパク質を多糖に直接カップリングして製造した複合体 が多価生成物（これは関係する出願に記載されている ように増強された免疫原性を有する）を生ずることができること、およびこの方 法が生物学的活性を保存するために十分に温和であることができることを証明す るために、モノクローナル抗体とデキストランとの種々の複合体を製造した。こ れらの実験において、Ｂリンパ球上の膜ＩｇＤと架橋しそして増殖を誘発する抗 ＩｇＤ抗体とともにモノクローナル抗体Ｈδ^a／１を使用した（Ｂｒｕｎｓｗｉ ｃｋ ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４０：３３ ６４（１９８８））。Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．が記載するように、高 分子量ポリマー、例えば、２０００ｋＤａのデキストランへのＨδ^a／１の多数 のコピーの結合（Ｈδ^a／１−ＡＥＣＭデキストラン）は１０００倍低い濃度に おいてＢ細胞の増殖を誘発し、そして未結合Ｈδ^a／１より高いレベルの増殖を 誘発した。Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．簡単な、わかりやすいが、多工程 の、多くの日数を要する手順を複合体の製造に必要とした。アミノエチルカルボ キシメチルデキストラン（ＡＥＣＭデキストラン）をまずＢｒｕｎｓｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．に記載されているように製造し、次いでヘテロライゲーション化学 を使用してＨδ^a／１を炭水化物にカップリングした。 下記のようにしてＣＤＡＰを使用する直接的結合およびスペーサーとＣＤＡＰ とを使用する間接的結合の双方により、Ｈδ^a／１−デキストランを製造した。 直接的結合：０．３ｍｌの生理食塩水中の３．２ｍｇのＴ２０００デキストラ ン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の撹拌溶液に、１５μｌのＣＤＡＰを添加した（アセ トニトリル中の１００ｍｇ／ｍｌの貯蔵液から）。３０秒後、撹拌しながら１５ μｌの０．２ＭのＴＥＡを添加した。さらに２分後、おだやかに撹拌しながら６ ｍｇのＨδ^a／１（３６２μｌの０．０５Ｍのホウ酸ナトリウムおよび０．０７ ５ＭのＮａＣｌ中の）を添加した。１５分後、１００μｌの１．０Ｍのグリシン 、ｐＨ５．０の添加により反応混合物をクエンチし、生理食塩水と平衡化させた Ｓ４００ＳＦゲル濾過カラム（１×５９ｃｍ）上に通した。カラムの溶離を第９ 図に示す。空隙体積のピークをプールし、ミレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）ＧＶフィ ルターで滅菌した。この生成物をＨδ^a／１−（ＣＤＡＰ）−デキストランと呼 ぶ。この手順はほぼ３時間を要した。 スペーサー：デキストランを前述したようにＣＤＡＰで活性化した（３ｍｌの 生理食塩水および２５μｌのＣＤＡＰ中の３１．５ｍｇのＴ２０００デキストラ ン、次いで２５μｌのＴＥＡ、１モルのＣＤＡＰ／０．０６モルのグルコースモ ノマー）。３ｍｌの０．１Ｍのホウ酸ナトリウム中の０．５モルの１，６−ジア ミノヘキサンを添加した。この溶液を水中に完全に透析し、次いでＳ４００ＨＲ ゲル濾過カラム上で分画した。空隙体積をプールし、濃縮した。このアミノ−デ キストランは１４７アミノ基／２０００ｋＤａのデキストランを有することが決 定された。この生成物をＮＨ₂−（ＣＤＡＰ）−デキストランと呼ぶ。透析を含 めて、これは２日の手順であった。対照的に、ＡＥＣＭ−デキストランはＢｒｕ ｎｓｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．の方法を使用して製造するのに通常約１週を要する 。 Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．に記載されているヘテロライゲーション技 術を使用して、Ｈδ^a／１をＡＥＣＭ−デキストランおよびＮＨ₂−（ＣＤＡＰ） −デキストランに結合した。これらの複合体を、それぞれ、Ｈδ^a／１−ＡＥＣ Ｍ−デキストランおよびＨδ^a／１−ＮＨ₂−（ＣＤＡＰ）−デキストランと呼ぶ 。ＡＣＥＭ−デキストランを使用する結合は２日の手順であった。 １０，０００細胞／ウェルを使用するＢ細胞の増殖アッセイをＢ ｒｕｎｓｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．に記載されているように実施した。表８はそれ らのアッセイの結果を提供し、計数／分／ウェルとしてＢ細胞の中へのトリチウ ム化チミジンの取込みを詳しく示す。 Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．において反復されているように、Ｈδ^a／ １単独はこれらの濃度において取込みを引き起こさなかった。１０〜１００μｇ ／ｍｌのＨδ^a／１における最大の取込みはほぼ３０００ｃｐｍである。 このデータが示すように、スペーサーを使用するか、または使用 しないで、ＣＤＡＰを使用して製造された複合体は、増殖を誘発するそれらの能 力において、Ｈδ^a／１−ＡＥＣＭデキストランに本質的に等しい。多価抗体の みが低い投与量において高いレベルの増殖を誘発するので、すべての複合体は多 価でなくてはならない。したがって、ＣＤＡＰを使用する直接的結合は抗体の生 物学的活性に影響を与えなかった。直接的結合手順は、スペーサーを使用して製 造した複合体よりも製造が顕著に速かった。さらに、スペーサーの添加およびＣ ＤＡＰを使用する結合はＡＥＣＭデキストランを製造よりも非常に速かった。 したがって、この実験は（１）ＣＤＡＰを使用する多価構築物の高い収率および （２）複合体、特に直接的複合体の製造の容易さおよび速度を示す。ＣＤＡＰお よび２官能性試薬を使用する結合は４８時間以下を要し、そして直接的結合は３ 時間以下を要した。実施例６ 特記しない限り、これらの実験におけるプロトコールは一般に下記の通りであ った。トリエチルアミン（ＴＥＡ）、アセトニトリル、硫酸（Ｈ₂ＳＯ₄）、レゾ ルシノール、ヘキサンジアミン、ホウ酸ナトリウム、およびＨＥＰＥＳをアルド リッヒ（Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手し、そしてそれらは試薬等級またはそれより すぐれていた。Ｎ−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボ レート（ＣＤＡＰ）をシグマ（Ｓｉｇｍａ）またはリサーチ・オーガニックス（ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）（オハイオ州クレブランド）から購入し た。トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＳＳ）をコッダック・ケミカルス（Ｋ ｏｄａｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から入手した。ミレックス（Ｍｉｌｌｅｘ）フ ィルターをミリポア・コーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）か ら入手した。 デキストランＴ２０００をファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から入手した 。肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型多糖をＡＴＴＣ（マリイランド 州ロックビレ）から入手した。アミノエチルカルバミルデキストランをＢｒｕｎ ｓｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．に記載されているようにして製造した。低エンドトキ シンのコーヘン（Ｃｏｈｅｎ）画分ＶＢＳＡ（Ｓｉｇｍａカタログ＃Ａ９３０６ ）から２．６ｃｍ×９７ｃｍのＳ１００ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（生 理食塩水＋アジドと平衡化した）上のゲル濾過により、モノマーのＢＳＡ（ウシ 血清アルブミン）を調製した。この生成物は、分析用ＨＰＬＣにより、０．５％ より少ない二量体および０．１％より少ない高分子量の質量の物質を有すること が示された。ＢＳＡをＨＰＬＣで周期的にチェックしてそのモノマー状態を確実 した。ＢＳＡについて４４，０００Ｍ^-1の吸光係数を使用した。 多糖をＣＤＡＰを下記のようにして活性化した。ＣＤＡＰをアセトニトリル中 で１００ｍｇ／ｍｌにおいて調製し、−２０℃において１カ月まで貯蔵した。Ｃ ＤＡＰを水中の多糖の撹拌溶液にピペットでゆっくり入れ、３０秒後、使用した ＣＤＡＰの体積に等しい体積の０．２モルのＴＥＡを添加した。２．５分におい て、１／５体積の０．１Ｍのホウ酸ナトリウム中の０．５Ｍのヘキサンジアミン （ｐＨ９．３）を添加した。反応を４℃において一夜進行させた。反応生成物を 生理食塩水中で平衡化させたＰ６ＤＧまたはＰ６カートリッジ（ＢｉｏＲａｄ） 上で脱塩し、次いで生理食塩水中にさらに透析した。いくつかの試料をセントリ コン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）３０装置（Ａｍｉｃｏｎ）ｄｅ濃縮し、再び脱塩し て遊離ジアミンの除去を確実にした。この一般的手順の変法を下記に示す。第一 級アミンについてＴＮＢＳアッセイを使用して、ヘキサンジアミンを使用する誘 導化の程度を測定した。１１，０００Ｍ^-1吸光係数を 使用して３６６ｎｍにおいて吸収を測定した。ジアミンの代わりにエタノールア ミンで誘導化された、ＣＤＡＰ活性化デキストランは、このアッセイにおいてＴ ＮＢＳ陰性であることが見出された。Ｍｏｎｓｉｇｎｙ ｅｔ ａｌ．、に記載 されているように、多糖濃度を測定した。特記しない限り、結果をアミンのモル 数／１００ｋＤａの多糖として表す。 Ｌｅｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｖａｃｃｉｎｅ、１２（３）：１１６０、１９９４ に記載されているように、チオ−エーテル結合を介するアミノ−デキストランへ のタンパク質の結合を実施した。アミンを使用する活性化について前述したよう に、ポリマーをＣＤＡＰで活性化することによって、タンパク質を多糖に直接結 合した。ＣＤＡＰを導入した後２．５分において、タンパク質（０．１５モルの ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５中の１０ｍｇ／ｍｌ）をおだやかに撹拌する溶液に急速 に添加した。生理食塩水と平衡化させたＳ３００ＨＲまたはＳ４００ＨＲカラム （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上のゲル濾過の少なくとも１時間前に、ほぼ１／５体積 の０．７５モルのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５中の０．５モルのエタノールアミンで 反応をクエンチした。標準としてＢＳＡを使用してブラッドフォード法（Ｂｉｏ Ｒａｄ試薬）により、空隙体積からのピーク管をタンパク質についてアッセイし た。標準としてデキストランを使用してＭｏｎｓｉｇｎｙ ｅｔ ａｌ．の方法 により、多糖濃度を測定した。特記しない限り、結果（下記において説明する） をタンパク質のｍｇ／ｍｇ多糖として表す。ＣＤＡＰを使用する多糖の活性化： 従来報告された方法よりも急速、温和、好都合、そして安全である条件下に、 多糖のＣＤＡＰ活性化を使用して複合体を製造できるかどうかを決定するために 、実験を実施した。プロトタイプの多糖 として、高分子量デキストラン（Ｔ２０００デキストラン、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ）を種々の実験条件下にＣＤＡＰで活性化した。 １００ｍｇ／ｍｌの貯蔵液から、ある体積のＣＤＡＰを水中のＴ２０００デキ ストランの溶液の中にピペットでゆっくり入れた（第４図に示すように１．６ｍ ｇ／ｍｌ、または第１０図に示すように１０ｍｇ／ｍｌ）。３０秒において、Ｃ ＤＡＰの体積に等しい体積の０．２モルのＴＥＡを添加し、そして１２０秒後、 大きい体積のホウ酸ナトリウム中のヘキサンジアミン（ｐＨ９．３）を急速に添 加した。Ｐ６ＤＧカラム上で脱塩し、次いで完全に透析して未結合試薬を除去し た後、高いレベルの多糖が見出された（第４図および第１０図参照）。この同一 手順後、しかしＣＤＡＰ、デキストラン、またはデキストランのそれぞれの非存 在において、ＴＮＢＳアッセイによりアミンを検出することができた。さらに、 ヘキサンジアミンの代わりにモノアミン（エタノールアミン）と反応させたＣＤ ＡＰ活性化デキストランはＴＮＢＳ陰性であった。すべての低分子量物質を確実 に除去するために、誘導化多糖を限外濾過により濃縮し、Ｐ６ＤＧカラム上で第 ２回目の脱塩を行った。アミン比はこの手順後において未変化であった。 誘導化の程度は、第４図および第１０図参照に示すように、ＣＤＡＰの量−− 多糖上に置換したアミノ基の絶対数の増加に導くＣＤＡＰ／デキストランの比に 依存した。誘導化の程度は、同一のＣＤＡＰ／デキストランのモル比についての 多糖の濃度に依存した。したがって、１．６ｍｇ／ｍｌのデキストランにおいて 、効率はＣＤＡＰの１モル当たり置換したアミンのモル数に基づいて０．７〜２ ．４％であったが、１０ｍｇ／ｍｌのデキストランにおいてＣＤＡＰの１モル当 たり０．２モル程度に多くのアミンが置換された（２０％の効率）。 この２分子反応の効率を改良するために、固定量のＣＤＡＰを使用して、多糖 濃度を１から５０ｍｇ／ｍｌに増加した（第１１図参照）。使用した最高の多糖 濃度において、使用したＣＤＡＰの１モル当たり０．４モルより多いアミノ基が 添加された。ＣＤＡＰ活性化で到達された置換の高いレベルと対照的に、ＣＮＢ ｒ活性は通常抗体１〜２％の最大効率を生ずる。 ＴＥＡの非存在において、ジアミンによる誘導化は顕著に減少した。第三級ア ミン、例えば、ＴＥＡの存在がＣＤＡＰによる可溶性多糖の活性化に必須である かどうかを決定するために、ＴＥＡを使用する活性化の効率を無機緩衝剤または ＮａＯＨを使用する効率と比較した。 １００μｌのＣＤＡＰ溶液（アセトニトリル中の１００ｍｇ／ｍｌ）を、室温 において、２ｍｌのＴ２０００デキストラン（水中の１０ｍｇ／ｍｌ）の撹拌溶 液にゆっくり添加した。３０秒後、１ＮのＮａＯＨをゆっくり添加してｐＨ約９ を維持した。１．５分後、０．５ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、中の１ｍｌのＢ ＳＡ、２０ｍｇ／ｍｌを添加した。反応を４℃において１８時間進行させた後、 １００μｌの０．７５ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、中の０．５Ｍのエタノール アミンの添加により反応をクエンチした。分析のために、３００μｌの生成物を 生理食塩水およびアジドと平衡化させた１ｃｍ×５０ｃｍのＳ４００ＨＲゲル濾 過カラム上でゲル濾過した。空隙体積のピーク管をバイオラド（ＢｉｏＲａｄ） アッセイによりタンパク質について、そしてレゾルシノールアッセイにより多糖 についてアッセイし、デキストランの１ｍｇ当たり０．４５ｍｇのＢＳＡを有す ることが見出された。 下記表９に示すように、種々の緩衝剤を使用して誘導化が生じた。事実、１Ｎ のＮａＯＨを注意して添加してｐＨを約９に上昇させ て、すぐれたレベルの置換が得られた。 デキストランでは、８〜１０のｐＨ範囲にわたって誘導化のレベルの有意な差 は存在しなかったが、他の多糖は活性化ｐＨにいっそう依存することが見出され た（下記を参照）。前述したように、ＴＥＡを省略しかつｐＨ上昇させない場合 、デキストランはなお活性化されるが、非常に低い程度に誘導化される。したが って、ＣＤＡＰ活性化またはカップリングはＴＥＡの存在に依存しないか、また は反応混合物が十分にアルカリ性であるように、適当な手段を使用するｐＨを上 昇させることができる。 表１０はＣＤＡＰを使用する活性化の反応速度を示す。この実験において、１ ００μｌのＣＤＡＰ（１００ｍｇ／ｍｌアセトニトリル）を１ｍｌのデキストラ ン（２０ｍｇ／ｍｌ）に３０秒において添加し、１ｍｌの０．１Ｍのホウ酸ナト リウム、ｐＨ８．８、を添加し、２分後、０．７５ＭのＨＥＰＥＳ中の０．５ｍ ｌのヘキサンジアミンを添加した。アリコートを示した時間において生理食塩水 と平衡化させたＰ６カートリッジ上で脱塩し、次いで分析前に完全に透析した。 多糖およびＣＤＡＰの高い濃度において、溶液はゲル化した。したがって、１０ 〜２０ｍｇ／ｍｌの多糖溶液を使用して 作業することはいっそう好都合である。 表１０に示すように、誘導化反応は急速であり、１５分以内に本質的完結する 。３または２４時間において、誘導化の程度の増加は認められなかった。 再現性肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型多糖（Ｐｎ１４）をＣＤ ＡＰで活性化し、ヘキサンジアミンで誘導化した。１ｍｌのＰｎ１４の撹拌溶液 （水中の１０ｍｇ／ｍｌ）に、３０μｌのＣＤＡＰ（アセトニトリル中の１００ ｍｇ／ｍｌ）（０．３ｍｇのＣＤＡＰ／ｍｇのＰｎ１４）を添加した。３０秒後 、３０μｌのＴＥＡ（水中の０．２Ｍ）を添加した。２分後、０．５ｍｌのヘキ サンジアミン（０．７５ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、中の０．５Ｍ）を添加し た。１．５時間後、生成物をＰ６カートリッジで脱塩し、限外濾過により濃縮し 、再び脱塩し、次いでＴＮＢＳでアミンについて、そしてレゾルシノール／硫酸 でＰｎ１４についてアッセイした。表１１に示すように、１年にわたって実施さ れた３回の実験において、検出されたアミンのモル数／使用したＣＤＡＰの１モ ルに基づいて１３〜１５％の効率が得られた。 上記表中の結果は、フリーザー中のＣＤＡＰ試薬の安定性、再現性、および高 い効率を示す。比較すると、ＣＮＢｒ溶液は安定ではなく、ＣＮＢｒ活性化法は 再現することが困難であり、そして約２％の効率を有する。ＣＤＡＰ活性化多糖へのタンパク質の直接的結合： アミンによる誘導化のように、多糖に対するタンパク質の結合の程度は多糖の 活性化に使用されたＣＤＡＰの量に依存した。第１２図に示すように、１０ｍｇ ／ｍｌのデキストランの濃度において、ＣＤＡＰ／デキストランの比は生成物の ＢＳＡ／デキストランの比とともに直線的に増加した。タンパク質および／また は多糖の濃度が増加した場合、より低いＣＤＡＰ／デキストラン比においてさえ 同様なＢＳＡ／デキストラン比をまた観察することができた。 対照反応をデキストランの非存在において実施し、そしてゲル濾過により分析 すると、ＣＤＡＰそれ自体は凝集しないか、またはＢＳＡ（タンパク質）を重合 させなかった。ＣＤＡＰ処理試料（０．５ｍｌの水＋２５μｌのアセトニトリル 中の１００ｍｇ／ｍｌのＣＤＡＰ＋５０μｌの０．２ＭのＴＥＡ＋０．５ｍｌの ０．５ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、中の１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）および対照 試料（０．５７５ｍｌの水＋０．５ｍｌの０．５ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、 中の１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（モノマー））を調製した。これらの試料を一夜反 応させ、１００ｍｌのＨＥＰＥＳ中の０．５Ｍのエタノールアミンでクエンチし た。１時間クエンチした後 、試料を生理食塩水およびアジド中のＳ４００のｌｃｍ×５０ｃｍのカラム上で ０．７５ｍｌ／分において展開させた。カラム上のＯＤ２８０を合計し、ＢＳＡ ピークに先行する管上のＯＤ２８０の合計に分割した。ＣＤＡＰ処理試料は０． ６％のポリマーのＢＳＡを示し、そして対照試料は０．７％のポリマーのＢＳＡ を示した。したがって、高分子量タンパク質は自己重合または凝集のためではな い。 そのうえ、通常の条件下に、ＣＤＡＰは多糖を架橋しない。これは下記のＨＰ ＬＣ実験により確証された。この実験において、７０ｋＤａのデキストランを活 性化させ、次いでエタノールアミンと反応させ、そしてゲル濾過カラム上で展開 させた。詳しくは、２．５ｍｇのＴ７０デキストラン（１０ｍｇ／ｍｌ）を２０ μｌのＣＤＡＰ（１００ｍｇ／ｍｌ）と一緒にした。３０秒後、２０または６０ μｌの０．２ＭのＴＥＡを添加し、２分において、１００μｌの０．７５ＭのＨ ＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、中の０．５Ｍのエタノールアミンを添加した。１時間後 、試料を０．２ＭのＮａＣｌ中のＧ４０００ＰＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈａａｓ）また はＳＥＣ３０００（Ｂｅｃｋｍａｎ）上で展開させ、屈折率により検出した（各 カラムの空隙体積は約５分であり、塩を約１０分において溶離した）。高分子量 へのシフトの証拠は観察されなかった。 下記の比較実験が示すように、ＣＤＡＰが多糖を架橋するのを防止するために 、極端な条件は回避すべきである。１ｍｌのＴ２０００デキストラン（１００ｍ ｇ／ｍｌ水）を１７６μｌのＣＤＡＰ（１００ｍｇ／ｍｌ）と一緒にした。３０ 秒後、１７６μｌの０．２ＭのＴＥＡを添加し、これは２分以内にゲルを生じた 。 最適活性化時間を決定しかつＣＤＡＰ活性化多糖の安定性を検査するために、 ＣＤＡＰおよびＴＥＡを添加した後５〜３００秒にお いてタンパク質（ＢＳＡ）を添加し、そして生成物のＢＳＡ／デキストラン比を 測定した。第１３図に示す結果が示唆するように、最適活性化時間は約２分であ り、そして活性化された多糖はこの期間にわたって安定である。タンパク質を１ 時間において添加する場合、反応の収率は約１／３だけ減少する。 ＣＤＡＰと多糖との水性混合物は、第１４図において反映されるように、安定 であることが見出された。６０μｌのＣＤＡＰ（１００ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌの 水に添加し、このＣＤＡＰ溶液の１００μｌのアリコートを１００μｌの多糖（ デキストラン、２０ｍｇ／ｍｌ）と第１４図に示すように１０〜３００秒の期間 にわたる種々の時間において一緒にし、次いで１５μｌのＴＥＡ溶液（０．２Ｍ ）と一緒にした。ＴＥＡと一緒にした後２分において、１００μｌのＢＳＡ（３ ０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。 添加時間の全体の範囲にわたって最終のタンパク質／多糖比において有意差は 見出せなかった。第１４図に示す結果は、酸性溶液中のＣＤＡＰの安定性、およ びＣＤＡＰの水溶液が酸性となるという観察と一致する。したがって、試薬溶液 を同じ日に使用する場合、有機溶媒の代わりに水を使用することができる。また 、ＣＤＡＰを固体として多糖溶液に添加することができる。少量のＣＤＡＰを使 用して作業するとき、固体状試薬を使用して作業するより溶液を使用して作業す ることは好都合であることがわかった。さらに、ＣＤＡＰのアセトニトリル溶液 の急速添加は時には多糖を沈澱させることがあるが、ＣＤＡＰの水溶液を使用す る場合、沈澱を回避することができる。ＣＤＡＰの水性貯蔵液を７５ｍｇ／ｍｌ までの濃度において調製することができる。 第１５図は、多糖へのタンパク質の結合が比較的急速であり、３時間以内に、 ８０％の最大結合が達成されたことを示す。タンパク 質濃度、多糖濃度、および／またはＣＤＡＰ濃度を増加することによって、なお いっそう急速なカップリングを達成できるであろう。 第１６図に示すように、多糖の活性化の間の反応溶液のｐＨはＣＤＡＰによる 多糖の活性化における他の重要なパラメーターである。活性化工程の間のｐＨが ７．０から８．３に増加するにつれて、カップリング効率の顕著な増加により反 映されるように、多糖の活性化が増加した。ｐＨが７．０から８．３に増加する につれて、複合体のＢＳＡ／デキストラン比は４倍に増加した。８．３より高い ｐＨにおいて、この比はほとんど増加しないか、またはまったく増加しなかった 。ＣＤＡＰ活性化のｐＨ依存性は、ＴＥＡの非存在において前に観察された低い 誘導化レベルを説明する。なぜなら、ＣＤＡＰ水溶液のｐＨは最初にほぼ中性で あり、そしていっそう酸性となるからである。 アミンによる多糖の誘導化について前述したように、タンパク質の直接的結合 のための多糖の活性化の間において、第三級アミン緩衝剤は不必要である。した がって、多糖へのタンパク質の直接的結合は、例えば、活性化工程の間において ｐＨを上昇させるためにｐＨスタットまたは自動滴定装置を使用して、実施する ことができる。これはワクチン複合体の製造において好都合であることがある。 第１７図は、活性化多糖へのタンパク質のカップリングの間の反応溶液のｐＨ がタンパク質とＣＤＡＰとの直接的結合における重要なパラメーターであること を示す。第１７図に結果を報告した実験において、広い範囲のｐＨ値にわたって 、かつ低いタンパク質／多糖比において、いくつかの緩衝剤を試験した。プロト コールは下記の通りであった。 ４ｍｌのＴ２０００デキストラン（水中の１０ｍｇ／ｍｌ）に、１３３μｌの ＣＤＡＰ溶液（新しく調製したアセトニトリル中の１ ００ｍｇ／ｍｌ）を添加した（０．３３ｍｇのＣＤＡＰ／ｍｇのｄｅｘ）。３０ 秒後、２６６μｌのＴＥＡ（０．２Ｍの貯蔵液から）を添加し、そしてｐＨを９ ．６の最大に到達させた。２．５分後、６０μｌの１ＭのＮａＡｃ（酢酸ナトリ ウム）を使用してｐＨを５．０に調節した。２００μｌのＢＳＡ（１５ｍｇ／ｍ ｌ）（０．８ｍｇのＢＳＡ／ｍｇのｄｅｘ）および１００μｌの緩衝液（１Ｍの ＮａＡｃ、ｐＨ４．７、５．７；０．５ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．９４、７．４ ３、８．１５；０．１ＭのＮａＰＯ₄、ｐＨ８．０、８．６７；５０ｍＭのホウ 酸ナトリウム、ｐＨ９．０、９．６）（イオン強度についてコントロールしなか った）を含有する管に、４００μｌの活性化デキストランを移した。移してから １時間後、管の３５０μｌの溶液を１００μｌの新しく調製した０．７５ＭのＨ ＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中の０．５Ｍのエタノールアミンと一緒にした。２０時 間後、１００μｌのエタノールアミンを残りの溶液に添加した。反応を少なくと も２時間クエンチし、生理食塩水＋アジドと平衡化させたＳ３００ＨＲまたはＳ ４００ＨＲカラム上に生成物を展開させた。ピーク空隙体積をバイオラド（Ｂｉ ｏＲａｄ）アッセイによりＢＳＡについて、そしてレゾルシノールアッセイによ り多糖についてアッセイした。 第１７図に示すように、タンパク質の大部分は７．４程度に低いｐＨにおいて 多糖にカップリングし、６．９程度に低いｐＨにおいて実質的な量がカップリン グし、そして５．７程度に低いｐＨにおいてさえ少量であるが、有意な量がカッ プリングした。この実験の条件について、約８のｐＨは最適であるように思われ た。結果はカップリング工程のｐＨが重要であることを示すが、カップリングを 広いｐＨ範囲にわたって実施できることを示す。しかしながら、ｐＨ５において カップリング反応は非常に非効率的であるので、クェ ンチングはｐＨ約７〜８において実施すべきである。 タンパク質／多糖比、多糖濃度、および／またはＣＤＡＰの使用量を増加する ことによって、低いｐＨにおいてさえカップリングの量を増加することができる 。例えば、より多い試薬またはより多いタンパク質を使用することによって、ｐ Ｈ７においてさえ収率を高くすることができる。したがって、多糖を活性化する ためにＣＤＡＰを使用して、ほぼ中性のｐＨにおいて、タンパク質の直接的カッ プリングを達成することができる。 第１７図は、リン酸塩がまたカップリング反応に対して阻害的であることを示 し、これはイオンの相互作用のためであるか、またはリン酸塩がわずかに求核性 であるためであろう。しかしながら、カップリングの間のＣＤＡＰの量およびｐ Ｈを増加すると、結合比／収率は増加するであろう。ＣＤＡＰの活性化の間にリ ン酸塩が存在する場合、ジアミンの添加は禁止される。 下記の実験により示されるように、ＰＲＰおよびＰｎ６のリン酸塩は阻害を引 き起こすことがある。２０μｌのＣＤＡＰ（アセトニトリル中の１００ｍｇ／ｍ ｌ）を、２ｍｇのＰｎ６（肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）６型、リン酸 ポリリビトール多糖）（水中の１０ｍｇ／ｍｌ）の撹拌溶液に添加した。３０秒 後、緩衝液（１００μｌの０．１Ｍのホウ酸ナトリウムまたは４０μｌの０．２ ＭのＴＥＡ）を添加した。２分後、１００μｌの０．５ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ８ 、中のＢＳＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。４℃において一夜インキュベート した後、反応を１００μｌの０．７５ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、中の０．５ Ｍのエタノールアミンでクエンチし、次いで生理食塩水＋０．０２％のアジドと 平衡化させたＳ４００ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でゲル濾過した。ピ ーク空隙体積の管をタンパク質および多糖についてアッセイした。 比較の目的で、試験４において、デキストランを同一方法において誘導化した。 結果を下記表１２に報告する。 Ｐｎ６およびＴＥＡ緩衝液（試験１）について、収率は非常に低かった。ｐＨ をホウ酸ナトリウムで増加させると（試験２および３）、収率は増加した。同一 条件はデキストランについて非常に高い収率を与える（例えば、試験４参照）。 したがって、リン酸塩に基づく多糖、例えば、Ｐｎ６は、すぐれた収率で複合体 を製造するためには、ｐＨおよび／またはＣＤＡＰ比の調節を必要とする。 次の実験は、ＣＤＡＰ活性化により形成されたイソ尿素結合が安定でありかつ 耐久性であることを示す。この実験において、ε−ＴＮＰ−リジンをＣＤＡＰを 介して誘導化にカップリングさせた。試料１〜５は下記のようにして調製した： １： ４００μｌのＴＮＰ／ＣＤＡＰ／ｄｅｘ＋１００μｌの生理食塩水（対 照） ２： ４００μｌのＴＮＰ／ＣＤＡＰ／ｄｅｘ＋１００μｌの２ＭのＮａＣｌ ３： ４００μｌのＴＮＰ／ＣＤＡＰ／ｄｅｘ＋１００μｌの９ＭのＧｕＨＣ ｌ ４： ４００μｌのＴＮＰ／ＣＤＡＰ／ｄｅｘ＋１００μｌの生理食塩水（３ ７℃においてインキュベーター中で反応させた） ５： ４００μｌのＴＮＰ／ＣＤＡＰ／ｄｅｘ＋１００μｌの生理食塩水（対 照） 試料４（これは示すように反応させた）を除外して、試料を暗所で一夜反応させ た。次いで試料を１０ｍＭのホウ酸ナトリウム中でＰ６カートリッジ上で１．０ ｍｌ／分において脱塩した。画分をＯＤ３６６において読み、そして空隙画分の ピーク管をアッセイした。 結果を下記表１３に示す。 各試料について、ＴＮＰ／デキストラン比は未変化であり、イソ尿素結合が試 験条件下に安定であることを示した。複合体の生物学的活性 多糖のＣＤＡＰ活性化が抗体の応答を誘発するその能力に有害効果を有するか どうかを決定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるその生物学的活性を試験し た。ＢＳＡをＣＤＡＰ活性化肺炎球菌（ Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型多糖に直接的に結合するか、またはヘキサン ジアミンで活性化された肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型多糖にカ ップリングし、次いでヨードアセチル化し、チオール化タンパク質と反応させた （Ｌｅｅｓ ｅｔ ａｌ．）。各複合体はＢＳＡのｍｇ／Ｐｎ１４のｍｇのある 比を有した。同系交配ＤＢＡ／２マウスをアジュバントの非存在において５０μ ｇのＢＳＡで、遊離または多糖複合体として、皮下免疫化した。血清を１４およ び２８日後に集め、抗ＢＳＡおよび抗Ｐｎ１４抗体力価をＥＬＩＳＡにより測定 した。 未結合ＢＳＡまたは未結合Ｐｎ１４のいずれも検出可能な一次応答を刺激しな かった。対照的に、ＢＳＡ−Ｐｎ１４複合体は、タンパク質がスペーサーを使用 する間接的結合により、または直接的結合によりカップリングされているかにか かわらず、タンパク質および多糖の双方の成分に対して有意な抗体の応答を誘発 した。スペーサーまたはＣＤＡＰ活性化デキストランへの直接的カップリングを 使用して調製されたＢＳＡ−デキストランで免疫化されたマウスは、複合体を他 の化学的方法で調製したとき得られた力価に匹敵する力価を与えた。そのうえ、 ＣＤＡＰ活性化を使用して調製されたＴＴ−ＰＲＰ複合体は、複合体で免疫化さ れたラットにおいて、ＣＮＢｒ活性化を使用して調製されたＴＴ−ＰＲＰ複合体 で免疫化されたラットにおいて示された応答に匹敵する抗ＰＲＰ応答を示した。 さらに、ＣＤＡＰ活性化Ｐｎ１４に直接的に結合された破傷風トキソイドは、高 い抗破傷風抗体および抗Ｐｎ１４抗体の応答を有した；オプソニンアッセイはこ れらの抗体が保護的であることを示した。実施例７ ＣＤＡＰ活性化多糖へのヒドラジド誘導化タンパク質のカップリン グ（アミノ基上で誘導化されたタンパク質） ＢＳＡ上の制限された数のアミンを下記のようにしてヒドラジドで誘導化した 。２０ｍｇのＢＳＡ（７５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ５、中の２４ｍｇ／ｍｌ）を ２０倍モル過剰のＳＰＤＰ（Ｐｒｏｃｈｅｍ）と反応させた。８時間後、２００ μｌの１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）を添加し、次いで２５μｌの１ＭのＤＴ Ｔを添加してチオールを脱保護した。この溶液を直列の２つのＰ−６カートリッ ジ（１０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．１ＭのＮａＣｌおよび２ｍＭのＥＤＴＡ（ ｐ５）と平衡化させた）上で脱塩し、そして空隙体積のタンパク質をセントリコ ン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）３０装置で１．０５ｍｌの体積に濃縮した。エルマン （Ｅｌｌｍａｎ）試薬を使用して、３．２遊離チオール／ＢＳＡが存在すること が測定された。５ｍｇのチオール−ＢＳＡを貯蔵し、そして残部を５０μｌの１ ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ６）の添加によりｐＨ６とした。１００μｌのジメチルホ ルムアミド中の０．１ＭのＥ−マレイミドカプロン酸ヒドラジド−ＨＣｌ（マレ イミド−ヒドラジドヘテロ官能性試薬；ＥＭＣＨ、Ｐｒｏｃｈｅｍ、イリノイ州 ロックフォード）を添加した。一夜反応させた後、タンパク質を脱塩し、再び濃 縮した。タンパク質濃度を吸収から測定した。ＴＮＢＳアッセイを使用して、遊 離ヒドラジド基の存在を証明した（例えば、５４０ｎｍにおける吸収が存在し、 自然タンパク質において存在しなかった）。 わずかに４．２チオール／ＢＳＡが存在したので、最終生成物は理論的にその 数以下の遊離ヒドラジドを含有できた。ＢＳＡは合計６０アミノ基を有する；し たがって、ＢＳＡは最小に修飾された。この物質をＢＳＡ−Ｓ−Ｈｚと表示した 。 ＢＳＡ−Ｓ−ＨｚまたはモノマーのＢＳＡ（比較；Ｓ１００ＨＲカラム上のゲ ル濾過により調製された）を、下記のようにして、Ｃ ＤＡＰ活性化デキストランと反応させた。１５μｌのＣＤＡＰ（アセトニトリル 中の１００ｍｇ／ｍｌ）を添加することによって、４００μｌのＴ２０００デキ ストラン（Ｈ₂Ｏ中の１０ｍｇ／ｍｌ）を活性し、次いで３０秒後、３０μｌの ０．２ＭのＴＥＡを添加した。２．５分後、２００μｌの１Ｍの酢酸ナトリウム （ｐＨ５）を添加して、反応混合物のｐＨを５にした。次いで３００μｌのＣＤ ＡＰ活性化デキストランを２ｍｇのＢＳＡ−Ｓ−ＨｚまたはモノマーのＢＳＡに 添加した（１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液中の２２．３ｍｇ／ｍｌにおいて９ ０μｌ）。最終ｐＨは５．１であった。一夜反応させた後、試料を０．７５Ｍの ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中の０．５Ｍのエタノールアミンでクエンチし、次い でＳ３００ＨＲカラム（１×５０ｃｍ、生理食塩水およびアジドと平衡化させた ）上のゲル濾過により分画した。タンパク質および多糖の分析により、ｐＨ５に おいて、ＢＳＡ−Ｓ−Ｈｚは０．５１ｍｇのＢＳＡ／ｍｇのデキストランと複合 体を生じたが、モノマーのＢＳＡは結合生成物を生じないことが示された。ＣＤＡＰ活性化肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型（Ｐｎ１４）への ヒドラジド誘導化ジフテリアトキソイド（ＤＴ）の結合 カルボキシル基上で誘導化されたＤＴ：ＤＴを下記のようにしてＡＤＨでカル ボキシル基において誘導化した。０．５Ｍの１−メチルイミダゾール（ｐＨ６） 中の６．９５ｍｇのＤＴに、０．５ｍｌの同一緩衝液中の０．５Ｍのアジピン酸 ジヒドラジド（ＡＤＨ）を添加し、次いで混合しながら１５ｍｇの１−エチル− （３−ジメチルアミノプロピル）カーボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を添加した。 一夜インキュベートした後、タンパク質を直列の２つのＰ−６カートリッジ（１ ０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）と平衡化させた） 上で脱塩し、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）５０装置で１７．１ｍｇ／ｍ ｌに濃縮した。ＴＮＢＳアッセイはヒドラジドの存在を示した。この物質をＤＴ ／ＥＤＣ／Ｈｚと表示した。 肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）１４型（入手先、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎ ｅ Ｂｅｅｃｈａｍ）を、Ｓ４００ＨＲカラム（２．６×１００ｃｍ、０．１Ｍ のリン酸カリウム、ｐＨ７．２、と平衡化させた）上のゲル濾過により分画した 。極端に高いおよび低い分子量の画分を分離し、中央カットを濃縮し、生理食塩 水中に透析した。この物質をＰｎ１４（Ｍ）と表示した。 ２５０μｌのＰｎ１４（Ｍ）（１０．１ｍｇ／ｍｌ）を１５μｌのＣＤＡＰ（ アセトニトリル中の１００ｍｇ／ｍｌ）の添加により活性化し、次いで３０秒後 、３０μｌの０．２ＭのＴＥＡを添加した。２．５分後、１５０μｌの１Ｍの酢 酸ナトリウム（ｐＨ５）を添加してｐＨを低下させ、次いで１５０μｌのＤＴ／ ＥＤＣ／Ｈｚ（２．５ｍｇ）を添加した。一夜反応させた後、反応混合物を１０ ０μｌの０．７５ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中の０．５Ｍのエタノールアミ ンでクエンチし、次いでＳ３００ＨＲカラム（１×５０ｃｍ、生理食塩水と平衡 化させた）上でゲル濾過した。分析はＤＴがカップリングしたことを示した。 アミノ基上で誘導化されたＤＴ：ＤＴをＢＳＡ−Ｓ−Ｈｚと同様な方法におい て誘導化した。５ｍｇのＤＴ（１３．９ｍｇ／ｍｌ）を２０倍モル過剰量のＳＰ ＤＰと反応させ、脱塩し、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）３０装置で濃縮 し、５０ｍＭのＤＴＴでｐＨ５において１時間処理し、次いで脱塩し、再び濃縮 した。エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）試薬を使用する分析は、遊離チオール基の存在 を示した。次いでチオール化トキソイドを大過剰のＥＭＣＨと反応させ、脱塩し 、再び濃縮した。ＴＮＢＳアッセイはヒドラジドの存 在を示した。この物質をＤＴ−Ｓ−Ｈｚと表示した。 ＤＴ−Ｓ−Ｈｚを下記のようにして大きさ分画Ｐｎ１４にカップリングさせた 。１．６ＭのＨＣｌ中の４ｍｇのＰｎ１４（Ｍ）を２０μｌのＣＤＡＰ（アセト ニトリル中の１００ｍｇ／ｍｌ）で活性化し、次いで３０秒後、４０μｌの０． ２ＭのＴＥＡを添加した。 ２．５分後、５０μｌの１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）を添加した。次いで３ ．９ｍｇのＤＴ−Ｓ−Ｈｚ（７７ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５中の）を添加し た；ｐＨメーターを使用して最終ｐＨが５．１であることが測定された。４℃に おいて一夜反応させた後、反応を１００μｌの０．７５ＭのＨＥＰＥＳ中の０． ５Ｍのエタノールアミンでクエンチし、次いでＳ４３００ＨＲカラム（１×５０ ｃｍ、生理食塩水およびアジドと平衡化させた）上でゲル濾過した。分析はＤＴ がカップリングしたことを示した。低いｐＨにおけるヒドラジドとアミンとの反応 ５ｍｇのＣＤＡＰ（アセトニトリル中の１００ｍｇ／ｍｌ）を５ｍｇのＰｎ１ ４（水中の１０ｍｇ／ｍｌ）に添加することによって、ＣＤＡＰ活性化多糖を調 製した。３０秒後、３００μｌの０．２ＭのＴＥＡを添加した。２分後、１００ μｌのＮａＡｃ、ｐＨ５、の添加により、ｐＨを約５に低下させた。次いでＣＤ ＡＰ活性化多糖を０．２ＭのＡＤＨまたはヘキサンジアミンに約ｐＨ５において 添加した。一夜反応させた後、この溶液を酢酸塩緩衝液（ｐＨ）中で脱塩し、Ｔ ＮＢＳによりアミンまたはヒドラジドについてアッセイした。ヒドラジドを含有 する溶液のみがＴＮＢＳ陽性であった。この試料をセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉ ｃｏｎ）５０装置で濃縮し、２回目にＰ６カートリッジ上で脱塩した。ヒドラジ ド／デキストラン比は未変化であり、未反応試薬のみが除去されたことを示した 。ヘキサンジアミン試料がＴＮＢＳ陽性であったという事実は、誘 導化が起こらなかったことを示した。 対照として、ＣＤＡＰ活性化デキストランをＡＤＨまたはヘキサンジアミンと ０．７５ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）中で反応させた。双方の試料はＴＮＢＳ 陽性であった。要約 ： ＣＤＡＰを利用する本発明の方法は、あるものが高いｐＨに対して感受性であ る、種々の臨床的に関係する多糖を活性化するために使用できる再現性あるアプ ローチを提供する。活性化は急速であるので、高いｐＨにおける消費時間は最小 である。この方法は、タンパク質および多糖の双方の成分に対する体液性抗体を マウスにおいてアジュバントの非存在においてさえ刺激できる、高度に免疫原性 のタンパク質−多糖複合体を生産する。 多糖の活性化の程度に深遠に影響を及ぼすことが見出された変数は、ＣＤＡＰ および多糖の濃度、およびｐＨである。結合のために好ましいｐＨは約６〜約９ 、より好ましくは約７．４〜約８．０であり、これは大部分の多糖が安定である 範囲である。他のｐＨ範囲、例えば、約７〜約１０の範囲は他の多糖についてい っそう適当である。 多糖および／またはＣＤＡＰの濃度を操作することによって、誘導化の効率は 、ＣＮＢｒを使用するとき見出された１〜２％に比較して、５０％に増加させる ことができる。さらに、多糖の１００ｋＤａ当たり５０より多いＮＨ₂基を有す る生成物は好ましい条件下に得ることができる。本発明の方法は、ＣＤＡＰを使 用して実験した従来の研究者らが記載したように、第三級アミンの存在に依存し ない。多糖の活性化は急速である。同様に、活性化された多糖へのタンパク質の 結合は急速である。 本発明は、再現性、急速な反応性、および多分最も顕著には、タ ンパク質／多糖比を容易に操作する能力という利点を提供する。例えば、ＣＤＡ Ｐの濃度および／または多糖濃度および／またはタンパク質濃度を変更すること によって、種々のタンパク質／多糖比を有する複合体を得ることができる。これ は複合体に対する抗体の応答の大きさに影響を及ぼすタンパク質／多糖比の役割 ばかりでなく、かつまた所定のタンパク質／多糖比における今日まで構造の役割 を研究するアプローチを提供するすることができる。 ＣＤＡＰを使用して製造されたタンパク質−多糖複合体の免疫原性は、未結合 成分のいずれかが示した応答より有意に大きい。さらに、生産される抗体は未結 合タンパク質と反応性であり、そして応答は未結合タンパク質ならびに結合した タンパク質を使用して促進することができる。これが示唆するように、結合の間 のタンパク質の化学的変更は、自然タンパク質に対する反応性を有する抗体を刺 激するその能力に対して有害作用を示さず、また、未結合タンパク質に対する反 応性を有するＢ細胞を刺激するその能力に対して有害作用を示さない。 さらに、ＣＤＡＰ活性化多糖は抗Ｉｇ抗体の結合のための調製において使用す ることができる。抗Ｉｇデキストラン複合体は、未結合Ｉｇに比較して、約１０ ０〜１００倍大きい活性化を誘発する。ＣＤＡＰ活性化デキストランへの直接的 結合を使用して製造された抗Ｉｇデキストラン複合体は、ＡＥＣＭデキストラン への他のヘテロライゲーションカップリングを使用して製造された複合体と同様 に有効なＢ細胞刺激試薬である。 ＣＤＡＰはＥＬＩＳＡのための種々の免疫学的試薬、例えば、ビオチニル化多 糖、およびモデルのＴｉ−２抗原のためのＥＬＩＳＡスポット抗原およびＴＮＰ −多糖（例えば、ＴＮＰ−ｄｅｘ、ＴＮＰフィコール）の製造に有用である。 したがって、免疫原性構築物、例えば、多糖に基づく複合体を製造するために ＣＤＡＰを使用する本発明の方法は、免疫原性構築物を製造する現在利用可能な 技術に多数の利点を提供する。本発明の範囲および精神から逸脱しないで本発明 の方法および態様において種々の変更が可能であることは当業者にとって明らか であろう。したがって、本発明は詳細な説明および図面により限定されず、添付 された請求の範囲により限定される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年４月１７日 【補正内容】 請求の範囲 １．工程： （ａ）多糖、オリゴ糖、および他の糖から成る群より選択される少なくとも１ つの第１炭水化物含有成分を、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニ ウムテトラフルオロボレート、Ｎ−シアノトリエチル−アンモニウムテトラフル オロボレート、またはｐ−ニトロフェニルシアネートから成る群より選択される 有機シアン化試薬で活性化して活性化された炭水化物を形成し、 （ｂ）タンパク質、ペプチド、およびハプテンから選択される第２成分をチオ ールまたはヒドラジドの求核基で誘導化し、そして （ｃ）前記活性化された炭水化物を前記誘導化第２成分に直接的または間接的 にカップリングして、免疫応答を刺激することができる免疫原性構築物を形成す る、 を含んでなる免疫原性構築物を製造する方法。 ２．前記有機シアン化試薬が１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニ ウムテトラフルオロボレートである、請求項１に記載の方法。 ３．前記第１成分および第２成分が水溶性である、請求項２に記載の方法。 ４．前記活性化を８〜１０のｐＨにおいて実施し、そして前記カップリング工 程（ｂ）を７〜９のｐＨにおいて実施する、請求項２に記載の方法。 ５．前記活性化をトリエチルアミンの存在において実施する、請求項２に記載 の方法。 ６．第１成分を２官能性またはヘテロ官能性のスペーサー試薬に共有結合的に 結合し、かつ誘導化第２成分をスペーサー試薬に共有結合的に結合することによ って、カップリングを間接的に実施する、請求項１に記載の方法。 ７．前記スペーサー試薬がエチレンジアミン、１，６−ヘキサンジアミン、ア ジピン酸ジヒドラジド、シスタミン、グリシン、およびリジンから成る群より選 択される、請求項６に記載の方法。 ８．第１成分が多糖であり、そして第２成分がタンパク質である、請求項１に 記載の方法。 ９．多糖がデキストラン、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）多糖、イン フルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）多糖、グルー プＡストレプトコッカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）多糖、グループＢスト レプトコッカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）多糖、および髄膜炎菌（Ｎ．ｍ ｅｎｌｎｇｉｔｉｄｉｓ）多糖から成る群より選択される、請求項８に記載の方 法。 10．第１成分が水溶性のウイルスまたは細菌の多糖である、請求項１に記載の 方法。 11．第２成分が水溶性タンパク質である、請求項１に記載の方法。 12．第２成分がウシ血清アルブミン、百日咳トキソイド、破傷風トキソイド、 マラリア誘導ペプチド、抗体、トキソイド、およびリポタンパク質から成る群よ り選択される、請求項１に記載の方法。 13．免疫原性構築物がＰＴ−Ｐｎ、ＰＴ−ＰＲＰ、ＴＴ−Ｐｎ、抗体−デキス トラン、およびペプチド−ＴＴ−Ｐｎから成る群より選択される複合体である、 請求項１に記載の方法。 14．前記求核物質がヒドラジド基である、請求項１に記載の方法。 15．前記カップリングを約８より低いｐＨにおいて実施する、請求項１に記載 の方法。 16．前記カップリングを約８より低いｐＨにおいて実施する、請求項６に記載 の方法。 17．患者に投与するとき、免疫応答を発生させる組成物であって、 （ａ）多糖、オリゴ糖、および他の糖から成る群より選択される少なくとも１ つの第１炭水化物含有成分を、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニ ウムテトラフルオロボレート、Ｎ−シアノトリエチル−アンモニウムテトラフル オロボレート、またはｐ−ニトロフェニルシアネートから成る群より選択される 有機シアン化試薬で活性化して活性化された炭水化物を形成し、 （ｂ）タンパク質、ペプチド、およびハプテンから選択される第２成分をチオ ールまたはヒドラジドの求核基で誘導化し、そして （ｃ）前記活性化された炭水化物を前記誘導化第２成分に直接的または間接的 にカップリングして、免疫応答を刺激することができる免疫原性構築物を形成す る、 ことによって製造された組成物。 18．前記有機シアン化試薬が１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニ ウムテトラフルオロボレートである、請求項１７に記載の方法。 19．前記活性化をトリエチルアミンの存在において実施する、請求項１８に記 載の組成物。 20．第１成分が多糖であり、そして第２成分が水溶性タンパク質である、請求 項１８に記載の組成物。 21．多糖がデキストラン、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）多糖、イン フルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）多糖、グルー プＡストレプトコッカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）多糖、グループＢスト レプトコッカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）多糖、および髄膜炎菌（Ｎ．ｍ ｅｎｉｎｇｌｔｉｄｉｓ）多糖から成る群より選択される、請求項２０に記載の 組成物。 22．第２成分がウシ血清アルブミン、百日咳トキソイド、破傷風トキソイド、 マラリア誘導ペプチド、抗体、トキソイド、およびリポタンパク質から成る群よ り選択される、請求項１８に記載の組成物。 23．免疫原性構築物がＰＴ−Ｐｎ、ＰＴ−ＰＲＰ、ＴＴ−Ｐｎ、抗体−デキス トラン、およびペプチド−ＴＴ−Ｐｎから成る群より選択される複合体である、 請求項１８に記載の組成物。 24．前記求核基がヒドラジド基である、請求項１７に記載の組成物。 25．前記カップリングを約８より低いｐＨにおいて実施する、請求項１７記載 の組成物。 26．被検者において免疫応答を誘導するための請求項１７に記載の組成物の使 用。 27．被検者において免疫応答を誘導するための請求項２０に記載の組成物の使 用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．工程： （ａ）少なくとも１つの第１炭水化物含有成分を有機シアン化試薬で活性化し て活性化された炭水化物を形成し、そして （ｂ）前記活性化された炭水化物を第２成分に直接的または間接的にカップリ ングして、免疫応答を刺激することができる免疫原性構築物を形成する、 を含んでなる免疫原性構築物を製造する方法。 ２．前記有機シアン化試薬が１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニ ウムテトラフルオロボレート、Ｎ−シアノトリエチル−アンモニウムテトラフル オロボレート、またはｐ−ニトロフェニルシアネートである、請求項１に記載の 方法。 ３．前記有機シアン化試薬が１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニ ウムテトラフルオロボレートである、請求項１に記載の方法。 ４．前記第１成分および第２成分が水溶性である、請求項３に記載の方法。 ５．前記活性化工程（ａ）を８〜１０のｐＨにおいて実施し、そして前記カッ プリング工程（ｂ）を７〜９のｐＨにおいて実施する、請求項３に記載の方法。 ６．前記活性化工程（ａ）をトリエチルアミンの存在において実施する、請求 項３に記載の方法。 ７．第１成分を２官能性またはヘテロ官能性のスペーサー試薬に共有結合的に 結合し、かつ第２成分をスペーサー試薬に共有結合的に結合することによって工 程（ｂ）を間接的に実施する、請求項１に記載の方法。 ８．前記スペーサー試薬がエチレンジアミン、１，６−ヘキサンジアミン、ア ジピン酸ジヒドラジド、シスタミン、グリシン、およびリジンから成る群より選 択される、請求項７に記載の方法。 ９．第１成分が多糖であり、そして第２成分がタンパク質である、請求項１に 記載の方法。 10．多糖がデキストラン、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）多糖、イン フルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）多糖、グルー プＡストレプトコッカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）多糖、グループＢスト レプトコッカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）多糖、および髄膜炎菌（Ｎ．ｍ ｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）多糖から成る群より選択される、請求項９に記載の方 法。 11．第１成分が水溶性のウイルスまたは細菌の多糖である、請求項１に記載の 方法。 12．第２成分が水溶性タンパク質である、請求項１に記載の方法。 13．第２成分がウシ血清アルブミン、百日咳トキソイド、破傷風トキソイド、 マラリア誘導ペプチド、抗体、トキソイド、およびリポタンパク質から成る群よ り選択される、請求項１に記載の方法。 14．免疫原性構築物がＰＴ−Ｐｎ、ＰＴ−ＰＲＰ、ＴＴ−Ｐｎ、抗体−デキス トラン、およびペプチド−ＴＴ−Ｐｎから成る群より選択される複合体である、 請求項１に記載の方法。 15．十分に低いｐＫａを有する求核物質を形成するように第２成分を誘導化す る、請求項１に記載の方法。 16．前記求核物質がヒドラジドである、請求項15に記載の方法。 17．前記カップリング工程（ｂ）を約８より低いｐＨにおいて実 施する、請求項16に記載の方法。 18．十分に低いｐＫａを有する求核物質を形成するように第２成分を誘導化す る、請求項７に記載の方法。 19．前記求核物質がヒドラジドである、請求項18に記載の方法。 20．前記カップリング工程（ｂ）を約８より低いｐＨにおいて実施する、請求 項19に記載の方法。 21．（ａ）（ｉ）少なくとも１つの第１炭水化物含有成分を有機シアン化試薬 で活性化し、そして（ｉｉ）前記活性化された炭水化物を第２成分に共有結合的 に結合することを包含する工程により免疫原性構築物を調製し、そして （ｂ）前記免疫原性構築物を患者に投与する、 ことを含んでなる、免疫応答を発生させる方法。 22．前記有機シアン化試薬が１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）−ピリジニ ウムテトラフルオロボレートである、請求項21に記載の方法。 23．前記活性化工程（ａ）をトリエチルアミンの存在において実施する、請求 項22に記載の方法。 24．第１成分が多糖であり、そして第２成分が水溶性タンパク質である、請求 項22に記載の方法。 25．多糖がデキストラン、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ）多糖、イン フルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）多糖、グルー プＡストレプトコッカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）多糖、グループＢスト レプトコッカス（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）多糖、および髄膜炎菌（Ｎ．ｍ ｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）多糖から成る群より選択される、請求項24に記載の方 法。 26．第２成分がウシ血清アルブミン、百日咳トキソイド、破傷風トキソイド、 マラリア誘導ペプチド、抗体、トキソイド、およびリポタンパク質から成る群よ り選択される、請求項22に記載の方法。 27．免疫原性構築物がＰＴ−Ｐｎ、ＰＴ−ＰＲＰ、ＴＴ−Ｐｎ、抗体−デキス トラン、およびペプチド−ＴＴ−Ｐｎから成る群より選択される複合体である、 請求項22に記載の方法。 28．十分に低いｐＫａを有する求核物質を形成するように第２成分を誘導化す る、請求項21に記載の方法。 29．前記求核物質がヒドラジドである、請求項28に記載の方法。 30．前記カップリング工程（ｂ）を約８より低いｐＨにおいて実施する、請求 項29記載の方法。