DE69628418T2

DE69628418T2 - Herstellung von immunogenen konstrukten unter verwendung von löslichen kohlehydraten, die durch organische cyanylierungs-reagenzien aktiviert wurden

Info

Publication number: DE69628418T2
Application number: DE69628418T
Authority: DE
Inventors: Andrew Silver Spring Lees
Original assignee: Henry M Jackson Foundation for Advancedment of Military Medicine Inc
Current assignee: Henry M Jackson Foundation for Advancedment of Military Medicine Inc
Priority date: 1995-03-22
Filing date: 1996-03-22
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2016-03-23
Also published as: WO1996029094A1; ES2200059T3; EP0814833B1; CA2215933C; AU712981B2; JP2008101022A; AU5259196A; DE69628418D1; JPH11502820A; NZ304715A; ATE241384T1; EP0814833A1; CA2215933A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Verschiedene Agenzien wie beispielsweise Tetanus-Toxoid können von Haus aus die Immunantwort auslösen und können in Impfstoffen ohne Modifikation verabreicht werden. Andere wichtige Agenzien sind gleichwohl nicht-immunogen, und müssen in immunogene Moleküle oder Konstrukte konvertiert werden, bevor sie die Immunantwort induzieren können.
Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf vorteilhafte Vertahren zur Herstellung von immunogenen Konstrukten. Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf die erhaltenen immunogenen Konstrukte und Impfstoffe, die daraus hergestellt werden und auf die Verwendung solcher immunogener Konstrukte.
Noch spezifischer bezieht sich die Erfindung auf Verfahren zur Aktivierung von Kohlenwasserstoff-enthaltenden Antigenen zur Verwendung in der Herstellung von immunogenen Konstrukten. Immunogene Konstrukte werden sehr vorteilhaft durch die Aktivierung eines kohlenwasserstoffhaltigen Restes mit einem organischen cyanylierenden Agent, wie beispielsweise 1-Cyano-4-(dimethylamino)-pyridintetrafluoroborat (CDAP) hergestellt.
Eine Vielzahl von cyanylierenden Reagenzien ist per se bekannt, z. B. als Reagenzien zur Aktivierung von unlöslichen Partikeln zur Herstellung von Gelen für die Affinitätschromatografie. Siehe Wilcheck et al., Affinity Chromatography. Meth. Enzymol., 104C: 3–55. Wakelsman et al., J. C. S. Chem. Comm., 1976: 21 (1976), welche berichten, dass CDAP ein mildes Reagenz ist, das zur Modifizierung von Cystein-Gruppen von Proteinen verwendet werden kann. Kohn et al., Anal. Biochem, 115: 375 (1981) verglich CDAP, N-Cyanotriethyl-ammonium-tetrafluoroborat (CTEA), und p-Nitrophenylcyanat (pNPC) als aktivierende Agenzien für Agarose, einem unlöslichen Polysaccharidharz. Andere Forscher haben CDAP verwendet, um andere Arten an unlöslichen Partikeln, wie beispielsweise Sepharose und Glycerin-kontrolliertes porenhaltiges Glas zu aktivieren. Siehe beispielsweise Carpenter et al., Journal of Chromatography, 573: 132–135 (1992).
Das US-Patent Nr. 3,788,948 von Kagedal et al. beschreibt allgemein ein Vertahren, das organische Cyanatverbindungen verwendet, um organische Verbindungen enthaltend eine primäre oder sekundäre Aminogruppe an Polymere zu binden, die ein oder mehrere Hydroxyl- und/oder primäre und/oder sekundäre Aminogruppen besitzen, z. B. um wasserlösliche Enzyme an wasserunlösliche Polymere zu binden. Kagedal et al. beschreibt ein Vertahren unter Verwendung bestimmter organischer Cyanatverbindungen wie beispielsweise p-NPC, das Vorteile gegenüber Bromcyan besitzt.
Ähnlicherweise berichten Andersson et al., International Journal of Cancer, 47: 439–444 (1991) von der Verwendung von CDAP, um ein lösliches Polysaccharid vor der Konjugation mit Protein zu aktivieren. Sie konjugierten epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) direkt an 40 kDa Dextran mit niedrigmolekularem Gewicht, welches mit Cyanat aktiviert wurde, und verwendeten hohe Verhältnisse von Dextran zu EGF von ungefähr 50 : 1 (Gewicht/Gewicht), um Dextran-EGF-Konjugate herzustellen und studierten die Bindung dieses Konjugats an kultivierte Zellen.
Kagedal et al. und Andersson et al. beschäftigten sich gleichwohl nicht mit immunogenen Konstrukten. Es wurde tatsächlich berichtet, dass Konjugate von Proteinen an Dextrane mit niedrigem molekularen Gewicht sehr schwach oder nichtimmunogen sind. T. E. Wileman, J. Pharm. Pharmacology, 38: 264 (1985).
Der Grad der Immunogenität ist selbstverständlicherweise eine wichtige Eigenschaft immunogener Konstrukte zum Zweck der Impfung. Das Vertahren der Impfung verwendet die angeborene Fähigkeit des Körpers, sich selbst gegen eindringende Agenzien durch die Immunisierung des Körpers mit Antigenen zu schützen, die die Krankheit nicht verursachen werden, jedoch die Bildung von Antikörpern, Zellen oder anderen Faktoren stimulieren, die gegen die Erkrankung schützen. Beispielsweise werden tote Organismen gegen bakterielle Erkrankungen, wie beispielsweise Typhusfieber und Keuchhusten, injiziert. Toxoide werden injiziert, um gegen Tetanus und Diphtherie zu schützen, und abgeschwächte Organismen werden injiziert, um gegen virale Erkrankungen, wie beispielsweise Poliomyelitis und Masern, zu schützen.
Es ist gleichwohl nicht immer möglich, eine Antikörperbildung allein durch Injektion des fremden Agenz zu stimulieren. Die Impfstoffpräparation muss immunogen sein, was bedeutet, dass sie fähig sein muss, eine Immunantwort zu induzieren. Die Immunantwort ist eine komplexe Serie von Reaktionen, die im Allgemeinen wie folgt beschrieben werden kann:
(i) das Antigen betritt den Körper und trifft auf Antigen-tragende Zellen, die das Antigen verarbeiten und Fragmente des Antigens auf ihrer Oberfläche zurückbehalten; (ii) die verbliebenen Antigenfragmente auf den Antigen-tragenden Zellen werden durch T-Zellen erkannt, die Hilfe für B-Zellen bereitstellen; und (iii) die B-Zellen werden stimuliert, zu proliferieren und sich in Antikörper-bildende Zellen zu teilen, die Antikörper gegen das Antigen sekretieren.
Es wurde gezeigt, dass Antikörper gegen die meisten bakteriellen Polysaccharide einen Schutz gegen Infektionen mit eingekapselten Bakterien bereitstellen. Die Unfähigkeit von Neugeborenen und Säuglingen energische Antworten auf T-Zell-unabhängige (TI)-Antigene zu erzeugen, wie beispielsweise Polysaccharide, resultierte in ihrer extremen Empfänglichkeit für lebensbedrohende Infektionen mit diesen Organismen. Diese geschwächte Immunantwort auf TI-Antigene kann durch Konjugation von T-Zell-Epitopen an die Polysaccharide ausgeräumt werden, wodurch diese in T-Zell-abhängige (TD)-Antigene konvertiert werden.
Es gibt zwei Konjugationsverfahren, die im Allgemeinen zur Herstellung von immunogenen Polysaccharidenkonstrukten verwendet werden: (1) direkte Konjugation von Kohlenwasserstoffen und Protein; und (2) indirekte Konjugation von Kohlenwasserstoffen und Protein über einen bifunktionellen Linker oder ein Spacer-Reagenz. Im Allgemeinen benötigen beiderseits die direkte und die indirekte Konjugation eine chemische Aktivierung des Kohlenwasserstoffrestes vor dessen Derivatisierung.
Die chemische Aktivierung bezieht sich auf die Konjugation einer funktionellen Gruppe zu einer Form, die weitere chemische Reaktionen eingehen kann, z. B. die Addition einer funktionellen Gruppe oder eines großen Restes, wie beispielsweise einem Protein. Derivatisierung ist die Addition einer funktionellen chemischen Gruppe(n) oder einer Spacerreagenz(-ien) an ein Protein.
Leider sind Fachleute einer Reihe von Problemen bei der Bildung von immunogenen Konstrukten über Konjugation unter Verwendung von Aktivierungsverfahren begegnet. Beispielsweise war die Herstellung von Konjugatimpfstoffen eine ungeheuere Herausforderung, teilweise aufgrund der Schwierigkeit bei der Aktivierung der Polysaccharide und der Konjugation des Proteins unter Bedingungen, die nicht zu ihrem Abbau oder zur Zerstörung ihrer immunogen Epitope führt. Bei der Herstellung immunogenen Konstrukte sollte das verwendete Vertahren ausreichend sanft sein, um wichtige antigene Regionen, z. B. Epitope, auf den Molekülen zu erhalten. Es ist daher wünschenswert, die Integrität der Struktur zu erhalten und Epitope in diesen Verbindungen zu bewahren. Leider sind die Herstellungsschritte, die gegenwärtig im Stand der Technik verwendet werden, häufig nicht sanft und können native Kohlenwasserstoffe und/oder Proteinstrukturen zerstören.
Weiterhin erfordern viele der bekannten Techniken zur Modifizierung von Kohlenwasserstoffen wassertreie Bedingungen. Leider sind gleichwohl Kohlenwasserstoffe häufig in organischen Lösungsmitteln unlöslich. Marburg et al., J. Amer. Chem. Soc., 108: 5282 (1986).
Daher sind viele von diesen für die Verwendung mit wasserbasierten Antigenen ungeeignet, obwohl es eine große Menge chemischer Literatur gibt, die die Modifikation von Kohlenwasserstoffen beschreibt. Ein Ansatz war die Modifikation von Polysacchariden, um ihre Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln zu steigern. Beispielsweise waren Marburg et al. durch Ersetzen der Kohlenwasserstoffe auf bestimmten sauren Polysacchariden mit dem hydrophoben Tetrabutylammoniumgegen-lon fähig, Polysaccharide in organischen Lösungsmitteln zu lösen und Hydroxyle mit Carbonyldiimidazolen zu aktivieren, einem Reagenz, welches in trockenen Lösungsmitteln verwendet werden muss. Dieses Verfahren wird mit Polysacchariden wie beispielsweise Haemophilus influenzae PRP und Pneumococcus-Polysacchariden Typ 6B und 19F verwendet. Das Koppeln von Protein kann ebenfalls durch reduktive Aminierung erreicht werden, entweder unter Verwendung des Aldehyds, das am reduzierenden Ende des Polysaccharids gefunden wird oder desjenigen, das durch Oxidation des Kohlenwasserstoffs erzeugt wird. Beiden Ansätzen sind von sich aus Grenzen gesetzt und daher ist das Koppeln von Polysacchariden mit hohem molekularem Gewicht über das reduzierende Ende gewöhnlicherweise langsam und ineffizient und Oxidation führt oft zur Spaltung der Polysaccharide oder beeinträchtigt andererseits das Antigen.
Bestimmte Kohlenwasserstoffe enthalten Gruppen, wie beispielsweise Amino- oder Carboxylgruppen, die vor der Konjugation einfacher aktiviert und derivatisiert werden können. Beispielsweise können die Aminogruppen in Pseudomonas Fisher Typ 1 leicht mit lodoacetylgruppen derivatisiert werden und an ein thioliertes Protein gebunden werden. Die Carboxylgruppen in Kohlenwasserstoffen, wie beispielsweise Pneumonococcus-Typ III können leicht mit wasserlöslichen Carbodiimiden aktiviert werden, wie beispielsweise EDC, und können dann direkt an Protein gekoppelt werden. Gleichwohl ist diese Gruppe an Kohlenwasserstoffen leider limitiert.
Andere Kohlenwasserstoffe besitzen Aldehydgruppen an den begrenzenden reduzierenden Enden, die für die Derivatisierung von Konjugation ausgenutzt werden können. Es ist ebenfalls möglich, Aldehydgruppen mit oxidierenden Reagenzien, wie beispielsweise Natriumperiodat, zu erzeugen. Aldehydgruppen können mit Aminogruppen oder mit einem bifunktionellen Linkerreagenz an Protein kondensiert werden. Diese Kondensationsreaktion, insbesondere diejenige mit dem terminalen reduzierenden Ende eines Polysaccharids mit hohem molekularen Gewicht geschieht häufig langsam und ineffizient. Dies wird weiter verschlechtert, wenn Kohlenwasserstoffaldehyde direkt an Proteine konjugiert werden. Daher sind bei der Verwendung dieses Vertahrens die Ausbeuten häufig sehr gering. Weiterhin kann Natriumperiodat Kohlenwasserstoffe in kleinere Fragmente aufbrechen und/oder Epitope auseinanderreißen, was unerwünscht sein kann.
Die meisten Kohlenwasserstoffe müssen vor der Konjugation aktiviert werden und Bromcyan ist häufig das Aktivierungsagenz der Wahl. Siehe beispielsweise Chu et al., Inf. & Imm., 40: 245 (1983), und Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens", Conjugate Vaccines, J. M. Cruse & R. E. Lewis (Hrsg.), Bd. 10, 48–114 (1989). Die ersten lizenzierten Konjugatimpfstoffe wurden mit CNBr zur Aktivierung von HIB PRP hergestellt, welches anschließend mit Adipindihydrazid derivatisiert wurde und an Tetanus-Toxoid unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimids gekoppelt wurde.
Kurz zusammengefasst wird bei dem CNBr-Aktivierungsvertahren Bromcyan mit dem Kohlenwasserstoff bei einem hohen pH, typischerweise einem pH von 10 bis 12 umgesetzt. Bei diesem hohen pH werden mit den Hydroxylgruppen des Kohlenwasserstoffs Cyanatester gebildet. Diese werden wiederum mit einem bifunktionellen Reagenz umgesetzt, gewöhnlicherweise einem Diamin oder einem Dihydrazid. Diese derivatisierten Kohlenwasserstofte können anschließend über die bifunktionelle Gruppe konjugiert werden. In bestimmten begrenzten Fällen können die Cyanatester ebenfalls direkt mit dem Protein umgesetzt werden.
Dieser hohe pH ist notwendig, um die Hydroxylgruppe zu ionisieren, da die Reaktion den nukleophilen Angriff des Hydroxylions auf das Cyanation (CN^–) erfordert. Im Ergebnis erzeugt Bromcyan viele Nebenreaktionen, von denen einige nukleophile Antigene an die Polysaccharide addieren. M. Wilcheck et al., Affinity Chromatography. Meth. Enzymol., 104C: 3–55. Noch wichtiger ist, dass viele Kohlenwasserstoffe oder Reste, wie beispielsweise HIB PRP und Pn6 durch die hohen pH-Bedingungen hydrolysiert oder beschädigt werden können, die notwendig sind, um die Bromcyan-Aktivierung durchzuführen.
Ein anderes Problem mit dem CNBr-Aktivierungsvertahren ist, dass die gebildeten Cyanatester bei hohem pH instabil sind und schnell hydrolysieren, was die Ausbeute an derivatisierten Kohlenwasserstoffen reduziert und damit die Gesamtausbeute von Kohlenwasserstoffen, die an Protein konjugiert sind. Viele andere nicht produktive Nebenreaktionen, wie beispielsweise solche, die Carbamate und lineare Imidocarbonate erzeugen, werden durch die hohen pH-Bedingungen gefördert. Kohn et al., Anal. Biochem, 115: 375 (1981). Weiterhin ist Bromcyan selbst höchst instabil und hydrolysiert bei hohem pH spontan, was die Gesamtausbeute weiter reduziert.
Weiter ist die Bromcyan-Aktivierung schwierig durchzuführen und unzuverlässig. Bromcyan ist hochtoxisch und möglicherweise explosiv. Äußerste Vorsicht muss aufgewendet werden, wenn mit großen Mengen gearbeitet wird, wie sie in der Herstellung verwendet werden. Alle Operationen müssen in einem geeigneten Abzug durchgeführt werden. Es ist Fachleuten ebenfalls bekannt, dass die Aktivierung nicht leicht reproduzierbar ist, da einige Chargen an Bromcyan gut und einige schlecht funktionieren. Bromcyan ist ebenfalls in Wasser schlecht löslich, was es schwierig macht, die Menge an löslichen Bromcyan zu kontrollieren, die für die Reaktion mit dem Kohlenwasserstoff vertügbar ist. Selbst die Verwendung der gleichen Charge an Bromcyan und offensichtlich identische Reaktionsbedingungen führen nicht immer zu identischen Ergebnissen.
Zusätzlich zu diesen Nachteilen ist es sehr schwierig, den Grad der Kohlenwasserstoffaktivierung zu kontrollieren, der durch die Verwendung von Bromcyan erreicht wird. Es ist ebenfalls sehr schwierig, einen hohen Anteil an Kohlenwasserstoffaktivierung unter Verwendung dieses Verfahrens zu erhalten. Die Steigerung der Menge an vorhandenem Bromcyan ist ineffektiv und führt nur zu vermehrten Nebenreaktionen ohne einen Anstieg der Aktivierung. Kohn et al., Applied Biochem. and Biotech., 9: 285 (1984).
Daher besitzt die Bromcyan-Aktivierung, obwohl sie sich häufig als ein sehr nützliches Reagenz erwiesen hat, eine Reihe an Begrenzungen. Beispielsweise benötigt Bromcyan einen hohen pH (10–12), um die Hydroxyle ausreichend nukleophil zu machen, um mit dem Cyanation zu reagieren. Gleichwohl ist weder CNBr noch das Cyanatester-Zwischenprodukt bei einem hohen pH stabil und konsequenterweise hydrolysiert entweder der größte Anteil des Reagenz oder geht nicht-produktive oder unerwünschte Nebenreaktionen ein. Daher ist die Effektivität der Polysaccharid-Aktivierung gering. Weiterhin kann der für die Aktivierung benötigte hohe pH viele pH-sensitive Polysaccharide hydrolysieren oder beschädigen. Zusätzlich ist CNBr toxisch und es ist schwierig, damit in kleinen Mengen zu arbeiten.
Wie oben beschrieben leiden im Weiteren andere Konjugationsverfahren an verschiedenen Nachteilen. Obwohl Polysaccharide, wie beispielsweise Cryptococcus neoformans und Pneumococcus Polysaccharid Typ 3 und VI-Antigen Carboxylgruppen besitzen, die mit Carbodiimiden in der Vorbereitung für das Koppeln an ein Protein aktiviert werden können, und obwohl Polysaccharide, wie beispielsweise Pseudomonas Fisher Typ 111 Aminogruppen besitzen, die bequem verwendet werden können, bilden diese Antigene eine relativ begrenzte Gruppe aller Polysaccharide. Es werden daher andere Ansätze benötigt, um den Großteil der Polysaccharide zu aktivieren oder zu funktionalisieren.
Eine vorgeschlagene Lösung ist das Verfahren der reduktiven Aminierung, wobei eine begrenzte Anzahl reaktiver Aldehyde erzeugt und an Amine gekoppelt wird. Siehe P. Anderson, Infection. Immun., 39, 233–238 (1983). Eine andere Lösung ist die Heteroligation, z. B. das Vertahren mit Hilfe von bigenerischen Spacern von Marburg et al., der eine Thiol-Ether-Verknüpfung verwendete, was eine einzelne Aminosäure durch Hydrolyse erzeugte. Siehe Marburg et al., J. Amer. Chem. Soc., 108, 5282 (1986). Dieses Verfahren erfordert gleichwohl, dass das Polysaccharid in trockenen organischen Lösungsmitteln löslich ist.
Die begrenzte Derivatisierung des Proteins durch Zugabe einer begrenzten Anzahl von Spacergruppen, wie beispielsweise Hexandiamin oder Adipindihydrazid, wurde ebenfalls vorgeschlagen. Diese können dann beispielsweise über das Bromcyan-Vertahren zugegeben werden. In diesen Vertahren werden Proteincarboxyle mit Carbodümiden aktiviert und mit den Aminen oder Hydraziden umgesetzt. Dieses Vertahren erzeugt gleichwohl eine ausgeprägte Quervernetzung von Protein und Polysaccharid und eine Polymerisation des Proteins.
WO 95/08348 (Lees et al.) ist eine frühere Anmeldung der gegenwärtigen Erfinder und bezieht sich auf immunogene Konstrukte. Das Vertahren zur Herstellung von immunogenen Konstrukten in WO 95/08348 beschreibt nicht die Derivatisierung eines zweiten Restes.
WO 93/15760 (Mond et al.) ist ebenfalls eine frühere Anmeldung der gegenwärtigen Erfinder und beschreibt die Aktivierung eines ersten Restes mit Thiol-reaktiven Reagenzien, wie beispielsweise Maleimid und Iodacetat in einem ersten Verfahrensschritt (Seite 18, erster vollständiger Absatz, Beispiel 10, Seite 44–46).
EP 0428486 (Handley et al.) bezieht sich auf die Herstellung von wasserlöslichen Polymyxin-Polymer-Konjugaten, wobei das Polymer ein Polysaccharid ist, wie beispielsweise Dextran. Das Konjugat in EP 0428486 wird durch Aktivierung des Dextrans mit 1-Cyano-4-(dimethylamino)-pyridin-tetrafluoroborat (CDAP) vor dem Koppeln des Dextrans an das Polymyxin aktiviert. EP 0428486 umfasst nicht das Derivatisieren des zweiten Restes (Polymyxin) mit Thiol- oder Hydrazid-nukleophilen Gruppen mit einem zweiten Verfahrensschritt.
US 3,788,948 beschreibt die Herstellung von einem wasserlöslichen Peroxidasederivat durch das Koppeln eines Kohlenwasserstoffrestes an die Peroxidase zur Verwendung in diagnostischen Reagenzien (Spalte 1, Zeilen 8–15). Das Koppeln wird durch die Oxidierung der Peroxidase mit z.B. Periodsäure durchgeführt sowie durch das Reagieren des erhaltenen oxidierten Enzyms mit einem Polymer, wie beispielsweise einem Polysaccharid.
Daher gibt es im Stand der Technik einen Bedart für ein Vertahren zur Herstellung von immunogenen Konstrukten, das sanft ist, die Integrität der Struktur der Kohlenwasserstoffe und Proteine aufrechterhält, die Epitope in den Verbindungen bewahrt, einfach durchzuführen ist, zuverlässig ist und leicht im Maßstab vergrößert werden kann und mit einer großen Anzahl an Polysacchariden funktioniert.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Ausführungsform der Erfindung ist es, ein sanftes Verfahren zur Herstellung von immunogenen Konstrukten zu erhalten. Eine andere Ausführungsform ist es, zu einem Verfahren zur Erzeugung von immunogenen Konstrukten zu gelangen, das die Integrität der Struktur der Kohlenwasserstoffe und Proteine aufrechterhält, und die Epitope in den Verbindungen bewahrt. Eine weitere Ausführungsform ist es, ein Verfahren zur Herstellung von immunogenen Konstrukten zu erhalten, das einfach durchzuführen, zuverlässig und leicht reproduzierbar ist. Eine weitere Ausführungsform ist ein Vertahren zur Herstellung von immunogenen Konstrukten zu entwickeln, das mit einer Vielzahl von Polysacchariden verwendet werden kann. Eine weiterere Ausführungsform ist, ein bequemes Vertahren zur Herstellung von löslichen Konjugatimpfstoffen zu erhalten. Eine weitere Ausführungsform ist es, ein Verfahren zu erhalten, das leicht im Maßstab vergrößert werden kann. Diese und andere Ausführungsformen und Vorteile der Erfindung werden aus der unten gezeigten detaillierten Beschreibung offensichtlich sein.
Die vorliegende Erfindung gelangt zu den obengenannten Ausführungsformen und räumt dabei die Probleme und Nachteile bekannter Vertahren zur Herstellung von immunogenen Konstrukten durch ein Konjugationsverfahren aus, das ein Kohlenwasserstoffaktivierungsverfahren verwendet, das sicher, einfach, nicht teuer und sanft zu Kohlenwasserstoffen ist. Weiterhin verwendet das Vertahren vorteilhafterweise eine homogene Reaktion.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Konstruktes, umfassend die Aktivierung von mindestens einem ersten Kohlenwasserstoff-enthaltenden Rest, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polysacchariden, Oligosacchariden, Disacchariden und Monosacchariden mit einem organischen cyanylierenden Reagenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1-Cyano-4-(dimethylamino)-pyridin-tetrafluoroborat, N-Cyanotriethyl-ammoniumtetrafluoroborat und p-Nitrophenylcyanat, um einen aktivierten Kohlenwasserstoff zu bilden, weiterhin Derivatisierung eines zweiten Restes, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Peptiden und Haptenen mit einem Thiol oder Hydrazid als nukleophiler Gruppe, und Koppeln des genannten aktivierten Kohlenwasserstoffes direkt oder indirekt an den derivatisierten zweiten Rest, um ein immunogenes Konstrukt zu bilden, das fähig ist, eine Immunantwort zu stimulieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das organische cyanylierende Reagenz 1-Cyano-4-(dimethylamino)-pyridin-tetrafluoroborat. Noch bevorzugter sind die ersten und zweiten Reste in Wasser löslich. Ebenfalls bevorzugt ist eine Ausführungsform, wobei die genannte Aktivierung bei einem pH von 8 bis 10 durchgeführt wird, und das genannte Koppeln bei einem pH von 7 bis 9 durchgeführt wird. In einer anderen bevorzugen Ausführungsform wird die genannte Aktivierung in der Gegenwart von Triethylamin durchgeführt.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Vertahren wie oben beschrieben zur Verfügung, wobei das Koppeln indirekt durch kovalentes Binden des ersten Restes an ein bifunktionelles oder heterofunktionelles Spacherreagenz durchgeführt wird, und durch kovalentes Binden des derivatisierten zweiten Restes an das Spacerreagenz. Noch bevorzugter ist eine Ausführungsform, wobei das genannte Spacerreagenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ethylendiamin, 1,6-Hexandiamin, Adipindihydrazid, Cystamin, Glyzin und Lysin.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren wie üben beschrieben zur Verfügung, wobei der erste Rest ein Polysaccharid und der zweite Rest ein Protein ist. Noch bevorzugter ist das Polysaccharid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dextran, Polysaccharid aus Pneumococcus, Polysaccharid aus Haemophilus influenza, Polysaccharid aus Streptococcus Gruppe A, Polysaccharid aus Streptococcus Gruppe B, und Polysaccharid aus N. meningitidis.
Ebenfalls bevorzugt ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei der erste Rest ein wasserlösliches virales oder bakterielles Polysaccharid ist. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei der zweite Rest ein wasserlösliches Protein ist.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren wie oben beschrieben zur Verfügung, wobei der zweite Rest ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus bovinem Serumalbumin, Pertussis-Toxoid, Tetanus-Toxoid, einem aus Malaria abgeleiteten Peptid, einem Antikörper, einem Toxoid und einem Lipoprotein.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei das immunogene Konstrukt ein Konjugat ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus PT-Pn, PT-PRP, IT-Pn, Antikörper-Dextran, und Peptid-TT-Pn.
Eine ebenfalls bevorzugte Ausführungsform ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei die genannte nukleophile Gruppe eine Hydrazidgruppe ist.
Eine ebenfalls bevorzugte Ausführungsform ist ein Verfahren wie oben beschrieben, wobei das genannte Koppeln bei einem pH von weniger als etwa 8 durchgeführt wird.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung nutzt vorteilhafterweise ein organisches cyanylierendes Reagenz, am stärksten bevorzugt 1-Cyano-4-(dimethylamino)-pyridin tetrafluoroborat (CDAP), um Kohlenwasserstoff-enthaltende Reste zu aktivieren. Durch Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein Konjugat eines Polysaccharids modifiziert, was es ermöglicht, das Protein zurückzugewinnen. Weiterhin kann ein Konjugat aus wasserlöslichen und/oder Tensid-löslichen Resten leicht gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung das direkte Konjugierendes aktivierten Kohlenwasserstoff-enthaltenden Restes an einen zweiten Rest, beispielsweise einem wasserlöslichen Protein. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Vertahren das kovalente Binden eines funktionellen (bifunktionellen oder heterofunktionellen) Reagenz an den aktivierten Kohlenwasserstoff-enthaltenden Rest, und weiterhin das Reagieren des funktionellen Reagenz mit dem zweiten Rest, z.B. einem T-abhängigen Antigen, um ein konjugiertes immunogenes Konstrukt zu bilden, wobei die Kohlenwasserstoff-enthaltenden Reste und TD-Reste durch den Spacer oder Linker verknüpft werden, die durch das funktionelle Reagenz gebildet werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das immunogene Konstrukt ein Zweifachträgerkonstrukt. Beispielhafte primäre Träger für ein solches Konstrukt schließen Pneumococcus Typ 14 (Pn14) und DNA-Polymere mit ein.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung das Konjugieren des aktivierten Kohlenwasserstoff-enthaltenden Restes an einen zweiten Rest, beispielsweise einem Protein, das derivatisiert wurde, um ein Nukleophil zu bilden, welches einen niedrigen pKa besitzt. Beispielhafte Nukleophile für eine solche Derivatisierung schließen Hydrazine und Thiole mit ein.
Die Erfindung ist vorteilhafterweise auf eine große Anzahl löslicher Kohlenwasserstoffenthaltender Reste anwendbar, welche nach Aktivierung mit CDAP entweder direkt an ein Protein konjugiert werden können oder indirekt über einen Spacer oder einen Linker an ein Protein konjugiert werden können. Die Erfindung versetzt andere in die Lage, effektivere immunogene Konstrukte effektiver und weniger kostenintensiv herzustellen als immunogene Konstrukte, die über bekannte Vertahren hergestellt werden.

Da CDAP und die Reaktionsbedingungen so mild sind, ist weiterhin das Risiko der Zerstörung der Kohlenwasserstoffstruktur und daher die Zerstörung der natürlich vorkommenden Epitope stark vermindert. Weiterhin besitzt das Verfahren die unten in Tabelle 1 zusammengefassten Vorteile im Vergleich mit den gegenwärtig verwendeten Verfahren unter der Verwendung von Bromcyan. Tabelle 1 Vergleich der Kohlenwasserstoffaktivierung in Synthese von Konjugaten

CNBr	CDAP
Hoher pH (10–12)	Fast neutraler oder milder basischer pH (z. B. 7–9)
Zerstört viele CHO-Epitope	Keine oder geringe Änderung von CHO-Epitopen
Hohe Toxizität (Abzug benötigt)	Niedrige Toxizität
Gefährlich in großen Mengen	Sicher in großen Mengen
Mit kleinen Mengen schwierig zu arbeiten	Mit kleinen Mengen einfach zu arbeiten
Niedrige Ausbeuten	Hohe Ausbeuten
Vielfältige Nebenreaktionen	Minimale oder keine Nebenreaktionen
Lässt nicht leicht eine direkte Konjugation an Protein zu	Erlaubt direkte Konjugation an das Protein und ermöglicht die Wiedergewinnung von nicht-konjugiertem Protein
Batch-to-batch Variation	Reproduzierbar

Weitere Vorteile bei der Verwendung von CDAP sind, dass es im Voraus hergestellt und in einer Lösung für mehrere Monate aufbewahrt werden kann, und dass die Konzentration des aktiven Reagenz leicht durch seine Absorption bei 301 nm bestimmt werden kann (Kohn et al., Anal. Biochem., 115: 375 (1981)). Dies ermöglicht es, die Konzentration des Reagenz zu standardisieren und die Kohlenwasserstoffderivatisierung reproduzierbarer zu gestalten, was für dessen Verwendung in Impfstoffherstellungen wichtig ist.
Andere Vorteile der Erfindung schließen das selektive oder präferenzielle Koppeln von Kohlenwasserstoffen und Proteinen durch Kontrolle des pHs mit ein. Da viele der gewöhnlichen nukleophilen Gruppen, die in Proteinen und Peptiden gefunden werden, relativ hohe pKa-Werte besitzen, ist es möglich, selektiv Gruppen, die niedrige pKas bei einem niedrigen pH besitzen an aktivierte Kohlenwasserstoffe in der Gegenwart von diesen anderen Gruppen zu konjugieren.
Selektives oder präferzielles Koppeln bei niedrigem pH besitzt eine Reihe von weiteren Vorteilen. Aktivierte Kohlenwasserstoffe sind bei einem niedrigen pH stabiler, was in geringerer Hydrolyse resultiert. Weiterhin sind bei einem niedrigen pH Hydroxylgruppen von Kohlenwasserstoften weniger nukleophil (reaktiv), was die Bildung von cyclischen Intermediaten und Inter- und Intraketten-Quervernetzung mit dem Cyanatester minimiert. Weniger Hydrolyse und weniger Nebenreaktionen steigern die Effektivität der gesamten Kopplungsreaktion, was weniger Reagenz für die Aktivierung des Kohlenwasserstoffes und damit weniger Modifizierung erfordert und daher die Antigeniät und Immunogeniät steigert.
Weiterhin können Proteine leicht mit einer begrenzten Anzahl an Nukleophilen derivatisiert werden, die niedrige pKa' s besitzen und daher minimal modifiziert sind. Das Koppeln des derivatisierten Proteins an einen aktivierten Kohlenwasserstoff bei einem niedrigen pH reduziert die Anzahl der Protein-Polysaccharid-Verknüpfungen aufgrund der niedrigen Anzahl an reaktiven Gruppen auf dem derivatisierten Protein bei einem niedrigen pH.
Weiterhin besitzt die Derivatisierung des Protein mit Hydrazid weitere Vorteile, einschließlich der Vereinfachung der Charakterisierung des Hydrazin-Intermediats (z. B. TNBS, radioaktive Proben, etc.). Dies erlaubt eine schnelle Bestimmung des Grades der Derivatisierung vor der Kopplung, wie auch des Grades zu dem Antigeniät und Immunogeniät modifiziert wurden, was eine bessere Qualitätskontrolle bereitstellt und Gelegenheiten, die Derivatisierung zu optimieren. Weiterhin kann durch Bestimmung der Anzahl an freien Hydraziden vor und nach der Kopplung die Anzahl an Protein-Polysaccharid-Verknüpfungen bestimmt werden. Zusätzlich kann die Qualitätskontrolle verbessert werden, da Anstiege in der Anzahl an freien Hydraziden beobachtet werden können, was andeutet, dass die Bindungen im Konjugat hydrolysieren.
Weitere Vorteile schließen die große Anzahl an bekannten Verfahren zur Einführung von Hydrazinen in Proteine mit ein, einschließlich der selektiven Modifikation von Carboxylgruppen oder Amingruppen. Dieses Vertahren kann daher insbesondere vorteilhaft für das Koppeln von Toxoiden sein, die relativ wenige Amine besitzen und im Allgemeinen schlecht koppeln. Weiterhin ist das Reaktionsprodukt von Hydraziden und Cyanatestern bei einem physiologischen pH ungeladen, während das Reaktionsprodukt von Aminen und Cyanatestern geladen ist.
Die oben erwähnten Vorteile treffen beiderseits auf die direkte Konjugation von Proteinen an Kohlenwasserstoffe und auf die indirekte Konjugation über einen Spacer zu. Weitere Gegenstände und Vorteile der Erfindung werden aus der detaillierten Beschreibung und den Figuren offensichtlich.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 beschreibt ein Beispiel eines allgemeinen Schemas für die Aktivierung von Kohlenwasserstoff unter Verwendung organischer cyanylierungder Reagenzien.
2 beschreibt ein beispielhaftes Schema für die Konjugation eines aktivierten Kohlenwasserstoffs an ein Protein, mittels direkter Konjugation, wie am linken unteren Rand gezeigt, und indirekter Konjugation unter Verwendung eines funktionellen Reagenz, wie am rechten unteren Rand gezeigt.
3 zeigt ein Modell eines immunogenen Konstruktes.
4 beschreibt die Inkorporation von NHz-Gruppen in Dextran gegen die Mole von CDAP, die pro Mol an Dextran bei 10 mg/ml Dextran zugegeben wurden.
5 beschreibt das Elutionsprofil eines ³H-BSA-Dextran-Konjugats von einer S400SF-Gelfiltrationssäule.
6 beschreibt die OD280-Absorption eines immunogenen Konstruktes, das gemäß dem erfindungsgemäßen Vertahren hergestellt wurde, und von einer S400SF-Gelfiltrationssäule eluiert wurde.
7 beschreibt das Elutionsprofil von Hδ^a/1-(CDAP)-Dextran von einer S400SF-Gelfiltrationssäule.
8 beschreibt OD280- und OD430-Werte von Säulenproben, die von einer S400SF-Gelfiltrationssäule, geladen mit Hδ^a/NH₂-(CDAP)-Dextran, eluiert wurden.
9 beschreibt die Immunreaktivität von immunogenen Konstrukten, die unter Verwendung erfindungsgemäßer Verfahren hergestellt wurden.
10 zeigt die Ergebnisse der Derivatisierung von Dextran (dex) mit Hexandiamin mit CDAP (NH₂/100 kDa dex gegen mg CDAP/mg dex) bei 1,6 mg/ml Dextran.
11 ist ein Graph der Effektivität der CDAP-Aktivierung gegen die Polysaccharidkonzentration.
12 beschreibt die direkte Konjugation von BSA an Dextran für verschiedene CDAP : Polysaccharidverhältnisse für die CDAP-Aktivierung.
13 ist ein Plot der BSA/Dextran-Verhältnisse gegen die Zeit der Zugabe von Protein zu CDAP-aktiviertem Dextran.
14 zeigt die Stabilität von CDAP in Wasser.
15 beschreibt die Kinetiken der Kopplung von Protein an CDAP-aktiviertes Polysaccharid.
16 zeigt den Effekt des pHs auf die CDAP-Aktivierung.
17 ist ein Säulendiagramm, welches den Effekt des pHs und verschiedener Puffer auf die Kopplung von BSA an CDAP-aktiviertes Dextran zeigt.
Genaue Beschreibung und bevorzugte Ausführungsformen
Ein allgemeines Schema für die Aktivierung von Kohlenwasserstoffen unter Verwendung organischer cyanylierender Reagenzien (die im Allgemeinen durch die Formel R-CN oder {R⁺-CN}X^– repräsentiert werden, wobei R ein organischer Rest ist und X ein Gegenion) ist in 1 gezeigt. 2 beschreibt die Konjugation eines aktivierten Kohlenwasserstoffs an Protein.
Wie hier verwendet, bezieht sich "immungenes Konstrukt" auf ein Gebilde, das die Immunantwort stimulieren kann. Das immungene Konstrukt umfasst mindestens einen ersten Rest, der an mindestens einen zweiten Rest konjugiert ist. Wie hier verwendet, ist ein "Rest" jede Substanz, die verwendet werden kann, um das Immunsystem entweder durch sich selbst oder aufgrund einer Kopplung stimulieren kann und ausgewählt ist aus Resten einschließlich Kohlenwasserstoffen, Proteinen und Glycoproteinen, Peptiden, anderen Antigenen, Haptenen, und Kombinationen und Derivaten davon. Haptene beziehen sich auf kleine Moleküle, wie beispielsweise Chemikalien, Staub und Allergene, die durch sich selbst nicht in der Lage sind, eine Antikörperantwort hervorzurufen, jedoch dies können, wenn sie an einen Träger gekoppelt sind, wie z. B. TNP. Ein Antigen ist jedes Molekül, das unter den richtigen Umständen die Bildung von Antikörpern induzieren kann. Diese Haptene und Antigene können von Bakterien, Rickettsiae, Pilzen, Viren, Parasiten, Medikamenten oder Chemikalien abgeleitet sein, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Sie können beispielsweise kleine Moleküle, wie beispielsweise Peptide, Oligosaccharide (z. B. die Polyriboxyl-Ribitol-Phoshatoligomere von H. influenzae), DNA-Oligomere, Lipide, Toxoide, Endotoxin, etc. mit einschließen. Bevorzugte Reste sind in Wasser löslich oder in Tensid gelöst.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erste Rest ein Kohlenwasserstoffenthaltender Rest. Wie hier verwendet, bedeutet "Kohlenwasserstoff" jedes lösliche Monosaccharid, Disaccharid, Oligosaccharid oder Polysaccharid. Vorzugsweise ist der erste Rest ein Polysaccharid, noch bevorzugter ein wasserlösliches Polysaccharid.
Bevorzugte Polysaccharide schließen solche mit ein, die in der unten gezeigten Tabelle beispielhafter Impfstoffe aufgeführt sind.
Der Kohlenwasserstoff-enthaltende Rest kommt vorzugsweise natürlich vor, ist ein semisynthetisches, oder ein vollständig synthetisches Molekül mit großem molekularem Gewicht. In einer bevorzugten Ausführungsform ist mindestens ein Kohlenwasserstoffenthaltender Rest ausgewählt aus E. coli-Polysacchariden, S. aureus-Polysacchariden, Dextran, Carboxymethylcellulose, Agarose, Pneumococcus-Polysacchariden (Pn), Ficoll, Crypfococcus neoformans, Haemophilus influenzae PRP, P. aeroginosa, S. pneumoniae, Lipopolysacchariden, Streptococcus Gruppe A und B, N. meningitidis, und Kombinationen davon.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Kohlenwasserstoff-enthaltende Rest ein Dextran. Wie hier verwendet, bezieht sich "Dextran" (dex) auf ein Polysaccharid, das aus einem einzelnen Zucker zusammengesetzt ist, der aus jeder Art von Quelle erhalten werden kann (z. B. Pharmacia). Ein weiterer bevorzugter Kohlenwasserstoff-enthaltender Rest ist Ficoll, welches ein inertes, semisynthetisches, nichtionisiertes Polymer mit hohem Molekulargewicht ist.
Der Kohlenwasserstoff-enthaltende Rest wird durch Verwendung eines organischen cyanylierenden Reagenz aktiviert. Bevorzugte organische cyanylierende Reagenzien sind 1-Cyano-4-(dimethylamino)-pyridin-tetrafluoroborat (CDAP), N-Cyanotriethylammonium-tetrafluoroborat (CTEA) und p-Nitrophenylcyanat (pNPC). Von diesen Reagenzien ist CDAP das am stärksten bevorzugte. Es können andere organische Komplexe mit der Cyanatgruppe verwendet werden, optional mit einer Vielzahl an Gegenionen. Insbesonders bevorzugte organische cyanylierende Reagenzien sind solche mit nicht-nukleophilen Gegenionen, wie beispielsweise Tetrafluoroborat.
Nach Aktivierung mit Hilfe des organischen cyanylierenden Reagenz wird der erste Rest an den zweiten Rest konjugiert. Vorzugsweise ist der zweite Rest ein Protein, der aus viralen, bakteriellen, parasitären und tierischen Proteinen und Proteinen aus Pilzen ausgewählt sein kann. Besonders bevorzugte zweite Reste schließen Lipoproteine, bovines Serumalbumin (BSA), Tetanus-Toxoide (TT), Pertussis-Toxoid (PT), Diphtherie- Toxoid (DT), Heat-Shock-Protein, T-Zell-Superantigene und bakterielle Proteine der äußeren Membran mit ein, die alle von biochemischen oder von pharmazeutischen Vertriebsunternehmen bezogen werden können oder mit Hilfe von Standardvertahren hergestellt werden können (siehe beispielsweise J. M. Cruse & R. E. Lewis, (Hrsg.), Conjugate Vaccines in Contributions to Microbiolopy and Immunology, Bd. 10 (1989). Andere geeignete Proteine können aus solchen ausgewählt werden, welche im Stand der Technik bekannt sind.
Andere bevorzugte Ausführungsformen des zweiten Restes sind Albumin, ein Toxoid, ein Peptid, ein T-Zell- oder B-Zelladjuvanz, oder jede andere Verbindung, die fähig ist, T-Zelthilfe zu aktivieren oder zu rekrutieren. Der zweite Rest kann ein T-abhängiges Antigen sein, wie in 3 dargestellt.
Die zweiten Reste der Erfindung sind in der Lage, mindestens an einen Kohlenwasserstoff-enthaltenden Rest konjugiert zu werden. Die zweiten Reste können entweder funktionelle Gruppen enthalten, die mit dem Kohlenwasserstoff-enthaltenden Rest reagieren können oder sie können chemisch manipuliert werden, um in der Lage zu sein, mit dem Kohlenwasserstoff-enthaltenden Rest zu reagieren.
In einer besonderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der zweite Rest derivatisiert, um ein Nukleophil zu bilden, das einen ausreichend niedrigen pKa für eine selektive Kopplung besitzt. Wie hier verwendet, beabsichtigt der Term "ausreichend niedriger pKa" auszudrücken, dass der pKa des Nukleophils in einer ausreichenden Größenordnung niedriger ist als die pKa-Werte anderer reaktiver Gruppen (z. B. Alpha- und Epsilonamine) im Protein oder Peptid, so dass das Nukleophil unprotoniert ist, wenn es bei dem pH umgesetzt wird, der für die Kopplung ausgewählt wurde, jedoch die anderen reaktiven Gruppen protoniert sind. Mit anderen Worten wird die nukleophile Gruppe so ausgewählt, dass sie bei einem bestimmten pH (d.h. unprotoniert) mit anderen Gruppen in Protein oder Peptid reagieren wird, die weniger umsetzungsfreudig sind (z.B. im Wesentlichen protoniert). Der geeignete pH für die Kopplung wird daher neben anderen Faktoren auf der Basis des besonderen verwndeten Nukleophils ausgewählt. Vorzugsweise ist der ausgewählt pH niedriger als etwa B. Illustrative Beispiele geeigneter Nukleophile schließen Hydrazide und Thiole mit ein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist eine funktionelle Gruppe eines Proteins oder Peptids derivatisiert, um ein Hydrazid zu bilden. Hydrazide können zu Proteinen oder Peptiden gemäß jeder der Vertahren zugegeben werden, die im Stand der Technik bekannt sind.
Beispielsweise können eine oder mehrere Carboxylgruppen auf einem Polypeptid mit einem Carbodiimid, wie beispielsweise EDAC, in der Gegenwart einer hohen Konzentration eines Bishydrazids, wie beispielsweise Adipinhydrazid, aktiviert werden. Nebenreaktionen können durch die Zugabe von Methylimidazol und/oder NHS unterdrückt werden. Der Grad der Derivatisierung kann durch das molare Verhältnis von Carbodiimid zu Polypeptid kontrolliert werden.
In ähnlicher Weise können Amine auf einem Protein unter Verwendung von Traut'schem Reagenz, SPDP oder SATA (gefolgt von Entschützung) thioliert werden und anschließend mit einem heterobifunktionellen Reagenz, wie beispielsweise EMCH (einem bifunktionellen Reagenz, welches ein thiolreaktives Maleimid und ein Hydrazid enthält) umgesetyt werden. Der Grad der Derivatisierung wird durch die anfängliche Thiolierung kontrolliert. Alternativ kann das Protein mit einer thiolreaktiven Gruppe (elektrophiles Reagenz, wie beispielsweise Maleimid oder Iodoacetyl) unter Verwendung von Standardtechniken zur Heteroligation derivatisiert werden und anschließend mit einem Thiolhydrazid umgesetzt werden. Amine können ebenfalls mit einer Anzahl an Reagenzien umgesetzt werden, die vicinale Hydroxygruppen enthalten. Das erhaltene Produkt kann dann mit Natriumperiodat gespalten und mit einem Bishydrazid umgesetzt werden.
Glycosylierte Proteine, wie beispielsweise Antikörper, können unter Verwendung eines geeigneten Reagenz, wie beispielsweise Natriumperiodat, bei pH 5 oxidiert werden. Das oxidierte Produkt kann anschließend mit einem Bishydrazid umgesetzt werden, um das gewünschte Derivat zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zu bilden.
Nukleophile, wie beispielsweise Hydrazide und Thiole, können in Proteine, Peptide, Oligonucleotide und viele Arzneimittel während ihrer Synthese inkorporiert werden. Hydrazide können ebenfalls durch Anbringen eines Cysteinrestes an der gewünschten Position und durch anschließende Umsetzung mit EMCH zugegeben werden. In ähnlicher Weise können Hydrazide zunächst durch Synthese eines Peptids zugegeben werden, das an der gewünschten Stelle eine α-Haloketongruppe enthält. Diese Gruppe kann anschließend zu einem Hydrazid durch Umsetzung mit Thiolhydrazid konvertiert werden. Siehe B. Ivanov et al., Bioconjugate Chemistry, 6, 269 (1995).
Nach der Aktivierung wird der erste Rest an den zweiten Rest konjugiert. Vielzählige Kopien des spezifischen zweiten Restes wie auch einer Variation von zweiten Resten können an den Kohlenwasserstoff-enthaltenden Rest konjugiert werden. Das Koppeln multipler Kopien des zweiten Rests an den ersten Rest verstärkt die Antikörperbildung zum zweiten Rest.
Das erfindungsgemäße Vertahren ermöglicht es jemandem, in vorteilhafter Weise die physikalischen und chemischen Eigenschaften des immunogenen Konstruktes zu kontrollieren. In Übereinstimmung mit der Erfindung kann der Fachmann in vorteilhafter Weise: die Ladung an den ersten und zweiten Resten modifizieren (ein Vorteil in Anbetracht der Tatsache, dass kationisierte Proteine stärker immunogen sein können); die Größe des Konstrukts durch Variieren der Größe der Kohlenwasserstoffenthaltenden Restes kontrollieren; den Grad des Quervernetzens der Inter- und Intra-Ketten-Konstrukte auswählen (um Variationen in der Größe und der dreidimensionalen Matrix zu erhalten); die Anzahl an Kopien des zweiten Restes zu kontrollieren, der an Kohlenwasserstoff-enthaltende Reste konjugiert ist; und auf ausgewählte Zellpopulationen abzielen (wie beispielsweise auf Makrophagen, um die Antigenpräsentation zu steigern). Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens", Conjugate Vaccines, J. M. Cruse & R. E. Lewis (Hrsg.), Bd. 10, 48–114 (1989).
Die Immunantwort auf das Konstrukt gemäß der Erfindung kann weiterhin durch die Zugabe von Immunmodulatoren und/oder zellgerichteten Resten verstärkt werden. Diese Gruppen schließen beispielsweise (1) detoxifizierte Lipopolysaccharide oder Derivative, (2) Muramyldipeptide, (3) Kohlenwasserstoffe, Lipide und Peptide, die mit Zelloberflächen-Determinanten interagieren können, um das Konstrukt zu immunologisch verwandten Zellen zu leiten, (4) Interleukine, (5) Antikörper und (6) DNA-Oligomere mit ein.
Daher können in alternativen Ausführungsformen dritte Reste an einen oder mehrere der ersten und/oder zweiten Reste unter Verwendung von Techniken wie beispielsweise der hier beschriebenen CDAP-Aktivierung oder anderen bekannten Techniken konjugiert werden. Bestimmte Techniken, um verschiedene Reste entweder an die ersten oder die zweiten Reste zu konjugieren, sind Fachleuten gut bekannt, z.B. das Miteinbeziehen der Kopplung durch vertügbare funktionelle Gruppen (wie beispielsweise Amide, Carboxyl, Thiol und Aldehydgruppen). Siehe S. S. Wong, Chemistry of Protein Coniugate and Crosslinking CRC Press (1991), und Brenkeley et al., "Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates With Dyes, Haptens and Cross-Linking Agents", Bioconjugate Chemistry, 3 : 1 (Jan. 1992). Monofunktionelle Reagenzien können daher als dritte Reste verwendet werden, z.B. um die Ladung zu modifizieren, die Hydrophobizität zu ändern, das Konstrukt zu markieren, etc.
Im Vertahren der Erfindung wird der Kohlenwasserstoff-enthaltende Rest durch Verwendung eines organischen cyanylierenden Reagenzes aktiviert. Das organische cyanylierende Reagenz ist vorzugsweise CDAP, welches die Elektrophilie des Cyanats steigert und, wenn es mit den Kohlenwasserstoff-enthaltenden Resten umgesetzt wurde, eine Cyanogruppe auf die Hydroxylgruppen des Kohlenwasserstoffs überträgt, und es damit für eine weitere Reaktion vorbereitet, z. B. direkte oder indirekte Konjugation an Protein. Die Aktivierungsreaktion kann bei neutralem pH oder unter milden basischen Bedingungen (z. B. ein pH von etwa 8 bis etwa 10) durchgeführt werden, was die Stabilität und Integrität des Polysaccharids und des aktiven Intermediats verbessert.
CDAP ist vorteilhaft, da es hoch stabil und relativ sicher ist. CDAP ist ein wasserlösliches organisches cyanylierendes Reagenz, in welchem die Elektrophilie der Cyanogruppe gesteigert ist, und es vorteilhafterweise erlaubt, die Cyanylierungsreaktion unter milden Bedingungen durchzuführen. Weiterhin kann CDAP verwendet werden, um eine große Anzahl an Polysacchariden zu aktivieren, welche anschließend mit Diaminen oder Dihydraziden funktionalisiert werden können. Der hohe Grad an Aktivierung und die milden Bedingungen der CDAP-Cyanylierungsreaktion erlauben das direkte Konjugieren von Proteinen an Polysacchariden in einer Eintopfreaktion, wobei die Herstellung von Konjugatimpfstoffen vereinfacht wird, die Antikörperreaktionen beiderseits auf die Polysaccharid- und die Proteinkomponenten induzieren, sogar in der Abwesenheit eines Spacermoleküls. Die Einfachheit der Verwendung von CDAP erleichtert die Herstellung von Protein-Polysaccharid-Konjugatimpfstoffen bei einer Vielzahl von Bedingungen, was es möglich macht, die wichtigen Parameter der Immunogeniät von Konjugatimpfstoffen zu studieren. Weiterhin können CDAP-aktivierte Polysaccharide verwendet werden, um eine Vielzahl anderer nützlicher immunologischer Reagenzien herzustellen, z. B. biotinylierte Polysaccharide und Antikörper-gebundene Dextrane, wie beispielsweise Hδ^a/1.
Die Aktivierung wird vorzugsweise bei einem pH von etwa 6 bis etwa 10 durchgeführt, noch bevorzugter von etwa 9 bis etwa 10. Der pH kann durch eine Vielzahl von Vertahren angepasst werden (z. B. durch Verwendung eines Puffers, Zugabe von NaOH, etc.), um das bestimmte Konstrukt anzupassen, das hergestellt wird. Beispielsweise kann die Aktivierung in einer Vielzahl von Lösungsmitteln unter Verwendung von einer oder mehreren einer Anzahl an geeigneten nicht-nukleophilen Puffern durchgeführt werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Geeignete Lösungsmittel schließen Salzlösung, Wasser und einige organische Lösungsmittel mit ein. Beispiele von geeigneten nicht-nukleophilen Puffern schließen Triethylamin (TEA), 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsäure (HEPES), Phosphat, Carbonat und Borat mit ein. Vorzugsweise wird Triethylamin (TEA) als Puffer verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird CDAP in einer Stammlösung bei einer Konzentration von 100 mg/ml in trockenem Acetonitril aufgelöst oder bis zu 75 mg/ml in Wasser. In Abhängigkeit der Natur des verwendeten Kohlenwasserstoffenthaltenden Restes und des gewünschten Grades der Aktivierung können verschiedene Mengen an CDAP optimal sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Konzentration des Kohlenwasserstoffenthaltenden Restes von 1 bis 20 mg/ml, noch bevorzugter von 1 bis 15 mg/ml. Die Aktivierungsreaktion kann erfolgreich mit Konzentrationen an Kohlenwasserstoffenthaltendem Rest von bis zu etwa 100 mg/ml durchgeführt werden.
Vorzugsweise ist das Verhältnis von CDAP zu Kohlenwasserstoff-enthaltenden Rest für die direkte Konjugation von Protein etwa 100 : 1 bis etwa 500 : 1 Mol CDAP pro 100 kDa des Kohlenwasserstoff-enthaltenden Restes. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis von CDAP zu Kohlenwasserstoff-enthaltendem Rest für die indirekte Konjugation von Protein unter Verwendung eines Spacers von bis 10 : 1 zu 500 : 1 Mol CDAP pro 100 kDa an Kohlenwasserstoff-enthaltendem Rest. In Abhängigkeit der Natur der Reste und der verwendeten Bedingungen können verschiedene Verhältnisse der Reste optimal sein.
Nicht-reagiertes CDAP und Reaktionsnebenprodukte wie beispielsweise Dimethylaminopyridin können vor der Derivatisierung oder Kopplung an ein Protein unter Verwendung geeigneter Aufreinigungstechniken entfernt werden, vorzugsweise unter sauren Bedingungen, wie beispielsweise Dialyse, Ultrafiltration oder Absorption an geeigneten bioprozessierenden Beads, wie beispielsweise SM4-Beads (BioRad). Aufgereinigte aktivierte Polysaccharide können ebenfalls durch Fällung hergestellt werden, z. B. mittels kaltem Ethanol.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Kohlenwasserstoff-enthaltender Rest, der unter Verwendung von CDAP aktiviert wurde, direkt an den zweiten Rest konjugiert, um ein immunogenes Konstrukt zu erzeugen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Kohlenwasserstoff-enthaltende Rest, der aktiviert wurde, kovalent an ein geeignetes bifunktionelles oder heterofunktionelles Reagenz geknüpft. Beispiele solcher funktioneller Reagenzien schließen Ethylendiamin, 1,6-Hexandiamin, Adipindihydrazid, Cystamin, Lysin, Glutaminsäure, Thiolhydrazide und Thiolamine mit ein, die so wie benötigt in geeigneter Form geschützt sind. Siehe Wong et al., "Chemistry of Protein Conjugate and Crosslinking", CRC Press (1991). Der zweite Rest wird anschließend kovalent an das funktionelle Reagenz geknüpft, welches bereits kovalent an seinem anderen Ende an den Kohlenwasserstoff-enthaltenden Rest geknüpft wurde.
Ein bevorzugter pH-Bereich für die Kopplungsreaktion liegt bei etwa 7 bis etwa 9, noch bevorzugter bei etwa 7 bis etwa 8,5. Zur Konjugation eines Polysaccharides, wie beispielsweise Dextran, beträgt der pH vorzugsweise etwa 7,4 bis etwa B. Wenn der zweite Rest derivatisiert wird, um ein Nukleophil, wie beispielsweise ein Hydrazid, zu bilden, beträgt der pH für die Kopplungsreaktion vorzugsweise weniger als etwa 8, noch bevorzugter weniger als 7.
Ein Polysaccharid wird an ein Protein bei einem Verhältnis in einem Bereich von etwa 1 : 1 bis etwa 3 : 1, z. B. 1 : 1 unter Verwendung von CDAP in einer bevorzugten Ausführungsform konjugiert. Für optimale Ergebnisse werden hohe Polysaccharidkonzentrationen vermieden. Bevorzugte Konstrukte schließen Tetanus konjugiert an ein Pneumococcus-Polysaccharid und Tetanus konjugiert an Haemophilus influenzae-PRP mit ein. Andere bevorzugte Konjugate, die gemäß der Erfindung hergestellt wurden, schließen TT-PRP, Pn14-TT, Pn23-TT, von Malaria abgeleitetes Peptid-Pn14, DT-Pn14, Pn6-TT, Pn19-TT und Peptid-TT-Pn mit ein.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird Triethylamin (TEA) verwendet, um die Cyanylisierungsreaktion zu erleichtern, die über die Bildung eines intermediären Von-Braun-Komplexes erfolgen kann. TEA kann durch andere tertiäre Amine ersetzt werden, die fähig sind, einen Von-Braun-Komplex zu bilden. J. Von Braun, Chem. Ber., 33: 1438 (1900).
Für bestimmte Konjugationsreaktionen können Glyzin, Aminoethanol oder andere Amino-haltigen Reagenzien verwendet werden, um die Reaktion zu stoppen. Solche Stoppreagenzien können ebenfalls ein Mittel sein, um die Nettoladung des Konjugates zu modifizieren.
In einer anderen Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen, die aus einem immunogenen Konstrukt bestehen, zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten Medium oder Trägerhilfsstoff. Solche Impfstoffe werden eine effektive therapeutische Menge des immunogenen Konstruktes enthalten zusammen mit einer geeigneten Menge an Träger, so dass eine Form für eine geeignete Verabreichung an einen Patienten bereitgestellt wird. Dies Impfstoffe können Alaun oder andere Adjuvanzien enthalten.
Beispielhafte pharmazeutisch geeignete Medien oder Träger sind sterile Flüssigkeiten, wie beispielsweise Wasser und Öle, einschließlich solcher aus Petroleum, tierischen, vegetabilen oder synthetischen Ursprungs, wie beispielsweise Erdnussöl, Sojaöl, Mineralöl, Sesamöl oder Ähnliches. Eine Salzlösung ist ebenfalls ein bevorzugter Träger, falls die pharmazeutische Zusammensetzung intravenös verabreicht wird.
Wässrige Dextrose und Glycerzinlösungen können ebenfalls als flüssige Träger verwendet werden, insbesondere für injizierbare Lösungen. Geeignete pharmazeutische Träger werden in E. W. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, beschrieben, welche hier durch Referenz spezifisch mit eingeschlossen sind.
Die Impfstoffe, die in Übereinstimmung mit der Erfindung hergestellt werden können, schließen solche mit ein, die in der untengenannten Liste beschrieben sind, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein:
Tabelle
Diphtheria-Impfstoff
Pertussis (Untereinheit)-Impfstoff
Tetanus-Impfstoff
H. influenzae Typ b (Polyribosephosphat)
S. pneumoniae, alle Serotypen
E. coli, Endotoxin oder J5-Antigen (LPS, Lipid A und Gentabiose)
E. coli, O-Polysaccharide (serotypspezifisch)
Klebsiella, Polysaccharide (serotypspezifisch)
S. aureus, Typen 5 und 8 (serotypspezifisch und allgemein schützende Antigene)
S. epidermidis, Serotyppolysaccharide I, II und III (und allgemein schützende Antigene)
N. meningitidis, serotypspezifisch oder Proteinantigene
Polio-Impfstoff
Mumps-, Masern-, Röteln-Impfstoff
Respiratorisches syncytiales Virus
Tollwut
Hepatitis A, B, C und andere
Humanes Immunodefizienzv rus 1 und II (GP120, GP41, GP160, p24, andere)
Herpes simplex-Typen 1 und 2
CMV (Cytomegalovirus)
EBV (Epstein-Barr-Virus)
Vericella/Zoster
Malaria
Tuberkulose
Candida albicans, andere Candida
Pneumocystis carinii
Mycoplasma
Influenzae-Viren A und B
Adenovirus
Gruppe A-Streptococcus
Gruppe B-Streptococcus, Serotypen Ia, Ib, II und III
Pseudomonas aeroginosa (scerotypspezifisch)
Rhinovirus
Parainfluenzae, Typen 1, 2 und 3
Coronaviren
Salmonella
Shigella
Rotavirus
Enteroviren
Chlamydia trachomatis und pneumoniae (TWAR)
Cryptococcus neoformans
Der Begriff "Patient" bezieht sich auf jedes Subjekt, für das die Behandlung von Vorteil ist und schließt Säugetiere, insbesondere Menschen, Pferde, Kühe, Hunde und Katzen mit ein, wie auch andere Tiere, wie beispielsweise Hühner. Eine "immunstimulierende Menge" bezieht sich auf eine solche Menge an Impfstoff, die fähig ist, die Immunantwort eines Patienten für die Vorbeugung, Verbesserung oder Behandlung von Krankheiten zu stimulieren. Der Impfstoff der Erfindung kann über jede geeignete Route verabreicht werden, wird jedoch bevorzugter über intravenöse, intramuskuläre, intranasale oder subkutane Injektion verabreicht.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf ein Vertahren zur Herstellung eines immunotherapeutischen Agens gegen Infektionen, die durch Bakterien, Viren, Parasiten, Pilze oder Chemikalien verursacht werden, durch die Immunisierung eines Patienten mit dem oben beschriebenen Impfstoff auf eine Art und Weise, dass der Donor Antikörper direkt gegen den Impfstoff erzeugt. Antikörper können isoliert werden oder B-Zellen können erhalten werden, um später mit Myelomzellen fusioniert zu werden, um monoklonale Antikörper zu erzeugen. Das Herstellen monoklonaler Antikörper ist allgemein im Stand der Technik bekannt (siehe Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), spezifisch hier durch Referenz enthalten). Wie hier verwendet, bezieht sich "immuntherapeutisches Agens" auf eine Zusammensetzung von Antikörpern, die gegen spezifische Immunogene zur Verwendung bei einer passiven Behandlung von Patienten gerichtet sind. Ein Plasmadonor ist jedes Subjekt, welchem ein Impfstoff zur Herstellung von Antikörpern gegen das im Impfstoff enthaltene Immunogen injiziert wurde.
Beispiel 1
Derivatisierung eines Kohlenwasserstoff-enthaltenden Restes mit einem Spacer
Materialien:
CDAP, Pyridin, Hexandiamin, Natriumborat, HEPES und Triethylamin (TEA) werden von Aldrich (Milwaukee, Wisconsin) bezogen. Der Kohlenwasserstoff-enthaltende Rest, T2000 Dextran, mit einem durchschnittlichen molekularen Gewicht von 2000 kDa, wurde von Pharmacia bezogen (Piscataway, New Jersey).
Eine Stammlösung an CDAP in trockenem Acetonitril bei 100 mg/ml wurde bei –20°C aufbewahrt und während der Verwendung auf Eis gehalten. T2000 Dextran wurde bei 10,5 mg/ml in einer Salzlösung plus 0,02% Azid vorbereitet. Eine wässrige Triethylamin-Stammlösung mit 0,2 M wurde vorbereitet und während der Verwendung auf Eis gehalten.
Hexandiamin wurde mit 0,5 M in 0,1 M Natriumborat vorbereitet.
Die Bestimmung der Aminogruppe wurde unter Verwendung von Trinitrobenzensulfonat (TNBS) und mittels eines Extinktionskoeffizienten von 11100 m^–1 bei 366 nm durchgeführt. Franci et al., J. Imm. Methods., 86: 155 (1986).
Kohlenwasserstoff wurde mit Hilfe des Vertahrens von M. Monsigny et al., Anal. Chem., 175: 525 (1988) unter Verwendung von T2000 Dextran als Standard getestet:
Kontrollreaktionen:
Die folgenden Experimente zeigen die Wichtigkeit der in der Derivatisierungsreaktion der Erfindung verwendeten Bestandteile. Die Ergebnisse zeigen, dass die Aminogruppen im endgültigen Konjugat kovalent an den Kohlenwasserstoff geknüpft sind und ihre Anwesenheit nicht auf einem Artefakt oder auf einer "Mitnahme" an Reagenz in das Endprodukt beruht. Die Reaktionen wurden auf Eis durchgeführt. Für die durchgeführten Versuche wurden Reagenzien ausgelassen oder ersetzt, wie in Tabelle 2 angedeutet.
CDAP wurde im Vertahren unter Verwendung aller Reagenzien (Zeile 1 von Tabelle 2) zu einer gevortexten Lösung von 300 μl Dextran (3,1 mg) zugegeben und in den Eisbehälter zurückgestellt. Dreißig Sekunden später wurde das TEA zur gevortexten Lösung zugegeben. Zwei Minuten nach der Zugabe von CDAP wurden 200 μl des Diamins zugegeben und die Lösung für eine weitere Stunde auf Eis gehalten. Die Proben wurden über Nacht dialysiert, mit Millex GV-Filter filtriert und weiterhin auf einer 1 × 15 cm-P6DG-Säule (BioRad) entsalzt.
Wie in Tabelle 2 unten gezeigt, wurden die Aminogruppen optimal in Dextran in der Anwesenheit von Dextran, CDAP, TEA und Hexandiamin eingebaut. Die Daten in Tabelle 2 zeigen weiterhin, dass die detektierten Aminogruppen nicht auf einer Mitnahme an unreagierten Reagenzien in das Endprodukt beruhen. Obwohl diese Ergebnisse zeigen, dass TEA nicht zur Derivatisierung notwendig ist, zeigen sie eine geringere Derivatisierung, wenn TEA nicht vorhanden ist (vermutlich auf Grund eines niedrigen pHs, wie später diskutiert).
Tabelle 2
Derivatisierung von T2000 Dextran mit Hexan 1,6-Diamin:
Dieses Experiment zeigt, dass CDAP zur Derivatisierung von Kohlenwasserstoffen verwendet werden kann, um Aminogruppen bei beiderseits hohen und niedrigen Verhältnissen einzuführen. Dextran T2000 wurde als Modell-Kohlenwasserstoff vennrendet. Dextran ist ein Polymer, das aus Glycosemonomeren besteht.
Der erste Schritt in der Herstellung vieler Konjugatimpfstoffe ist die Zugabe eines Spacers (Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens", Conjugate Vaccines, J. M. Cruse & R. E. Lewis (Hrsg.), Bd. 10, S. 48–114 (1989)). Diese Serie an Experimenten, die in Tabelle 3 zusammengefasstist, betont die Leichtigkeit, mit der ein Spacer zu Polysacchariden zugegeben werden kann.
Tabelle 3
Das Experiment wurde bei zwei Temperaturen durchgeführt. In den in Zeilen 1–7 und 11 von Tabelle 3 zusammengefassten Läufen waren alle Reagenzien eiskalt und in den Zeilen 8–10 zusammengefassten Läufen befanden sich die Reagenzien bei Raumtemperatur. Die Vertahren und Reagenzien wurden verwendet, wie oben für das in Tabelle 2 zusammengefasste Experiment beschrieben, und die Mengen der Reagenzien wurden wie in Tabelle 3 angedeutet, zugegeben. In dem durch Zeile 11 dargestellten Lauf wurde Diamin in 0,15 M HEPES zugegeben. Die Reaktion war bei einem niedrigem pH geringfügig weniger effizient. In einer anderen Ausführungsform wurde Hexandiamin in 0,1 M Borat, pH 9, angesetzt.
Effektivität wird als die Anzahl von Molen an Spacergruppen definiert, die pro Mol an verwendeten CDAP eingebaut wurden, ausgedrückt in Prozent. Die letzte Spalte (% derivatisiert) ist die Prozentangabe der Glucosemonomer-Einheiten des Dextrans, die mit einem Spacer modifiziert wurden.
Die Ergebnisse sind weiterhin in 4 dargestellt, welches die Gesamtzahl an eingebauten Aminogruppen (z. B. die zugegebenen Spacerreagenzien) gegenüber den Molen an zugegebenem CDAP pro Molen Dextraneinheit zeigt. Wenn diese Daten in den NH₂-Einbau gegenüber den molen CDAP/Mol Dextran konvertiert werden, ist es offensichtlich, dass ein CDAP : Glucose-Verhältnis von weniger als eins für hohe Gehalte an NH₂-Einbau ausreichend ist. Daher ist eine minimale Modifikation von Dextran-Polysaccharid für hohe NH₂-Gruppeneinbauten notwendig.
Da eine unbestimmte Menge des aktiven Cyanatesters ohne Zugabe eines Spacers hydrolysiert wird, ist weiterhin das CDAP/Glucose-Verhältnis eine Überbestimmung des Grades der Modifikation des Polymers. Der aktuelle Grad der Modifikation ist daher geringer als das berechnete CDAP/Glucoseverhältnis.
Der Grad des Einbaus an Spacergruppen bei der geringsten getesteten Dosis an Reagenz (Linie 1), 3,1%, ist vergleichbar mit dem für die Synthese von Konjugatimpfstoffen verwendeten (Chu et al., Inf. & Imm., 40: 245 (1983); Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigens", Coniugate Vaccines, J. M. Cruse & R. E. Lewis (Hrsg.), Bd. 10, S. 48–114 (1989).
Die Tabelle und Figur zeigt die hohe Effektivität der CDAP-Reaktion bei der Zugabe von Spacerreagenzien. Eine weitere Optimierung der Reaktionsbedingungen kann die Effektivität steigern. Ebenfalls dargestellt ist der sehr hohe Gehalt des Einbaus an Spacergruppen in Polysaccharide, der auf Grund der Verwendung von CDAP möglich ist. Bei der größten Menge an zugegebenem CDAP (Zeile 7) wurde ungefähr 1 aus 5 der Glucoseeinheiten mit einem Spacer modifiziert (20%). Es ist nicht möglich, diesen Grad des Einbaus an Spacern mit Bromcyan zu erhalten (Kagedal & Akerstrom, Acta Chemica Scan., 25: 1855 (1971)).
Während der Reaktionen gab es keine offensichtliche Fällung an Dextran-Polysaccharid. Im Gegensatz dazu kann Aggregation und Fällung des Polysaccharids ein Problem beim Bromcyan-Vertahren werden (Kagedal & Akerstrom, Acta Chemica Scan., 25: 1855 (1971)).
Diese Reaktionen wurden in kleinen Volumina (< 1 ml) durchgeführt, was es erlaubt, viele Versuchsexperimente bequem durchzuführen. Dies ist bei der Optimierung eines Vertahrens wichtig, ohne wertvolle Kohlenwasserstofte und Proteine zu verschwenden. Eine Fachmann kann daher leichter, ausgehend von den beispielhaften Volumina der Reagenzien, wie auch ausgehend von anderen hier beschriebenen Informationen, die Erfindung unter der Verwendung von größeren gewünschten Mengen in jedem vergrößerten Maßstab für kommerzielle Verwendung praktizieren. Im Gegensatz dazu ist es schwierig, bequem mit sehr kleinen Mengen an Cyanobenbromid aufgrund seiner geringen Wasserlöslichkeit, seiner ungenauen Stärke und Toxizität zu arbeiten.
Weiterhin erscheint es, beim Vergleich der Zeilen 8–10 der Tabelle 3 mit Zeilen 1–7 und 11, dass der Grad des Einbaus von Aminogruppen in Dextran in etwa gleich war, wenn die Kopplungsreaktion bei 0°C oder bei Raumtemperatur durchgeführt wurde.
Demonstration der Effektivität der Konjugationsreaktion unter Verwendung von CDAP und Bestätigung der Konjugation unter Verwendung radioaktiv markierten Proteins:
Da die Konjugationsreaktion unter Verwendung von CDAP etwas Absorption bei 280 nm verursacht, der Wellenlänge, die üblicherweise verwendet wird, um Proteinkonzentrationen zu bestimmen, wurde radioaktiv markiertes Protein direkt an Dextran konjugiert. Dies erlaubte eine unabhängige Bestimmung der Proteinkonzentration ausgehend von seiner spezifischen Aktivität. Die Ausbeuten und die Rückgewinnung an Protein wurde bestimmt.
BSA wurde mit N-Hydroxysuccinimid (³H-2,3)-propionat (Amersham) leicht radioaktiv markiert, im Wesentlichen wie durch Brunswick et al., Journal of Immunol., 140: 3364 (1988) beschrieben. Radioaktiv markiertes BSA wurde erschöpfenderweise in PBS + 0,02% Azid dialysiert und einer Gelfiltrationschromatografie auf einer S100HR-Säule (Pharmacia) unterworfen, um Aggregate zu entfernen und durch Ultrafiltration unter Verwendung eines YM30-Filters (Amicon) aufkonzentriert. Die BSA-Konzentration betrug 21 mg/ml, was über seinen Extinktionskoeffizienten bei 280 nm bestimmt wurde (44.000 M^–1). Die spezifische Aktivität der Stammlösung, bestimmt durch Szintillationszählung der Flüssigkeit, betrug 5,48 × 10¹² cpm/Mol.
Andere Reagenzien waren wie folgt: T2000 Dextran (ungefähr 2000 kDa) (Pharmacia) wurde zu 10,5 mg/ml in Wasser gelöst. CDAP wurde mit 100 mg/ml in trockenem Acetonitril vorbereitet, Triethanolamin (TEA) wurde mit 0,2 M in Wasser vorbereitet. Glyzin (pH 5,0) wurde mit 1 M in Wasser hergestellt.
Protokoll: Die Reagenzien wurden auf Eis gehalten und alle Reaktionen wurden auf Eis durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde während jeder Zugabe gevortext. 25 μl an CDAP wurden zu 0,5 ml an Dextran (5,25 mg) zugegeben, und 30 Sekunden später wurden 25 μl TEA zugegeben. Nach einer Gesamtzeit von 2,5 Minuten wurden 5,25 mg an radioaktivem BSA zugegeben. 30 Minuten später wurde die Reaktion durch die Zugabe von 100 μl an Glyzinlösung gestoppt und über Nacht bei 4 °C stehen gelassen. Ein Aliquot von 0,6 ml wurde anschließend unter Verwendung einer Spin-X-Membran (COSTAR) filtriert. Ein Vergleich des radioaktiven Aliquots vor und nach der Filtration zeigte, dass im Wesentlichen 100% der Radioaktivität im Filtrat wiedergewonnen wurde. 500 μl des Filtrats wurden zu einer 1 × 57 cm S400SF-Gelfiltrationssäule (Pharmacia) zugegeben, die mit Salzlösung plus 0,02 % Azid äquilibriert wurde und bei 0,2 ml/min laufen gelassen wurde. Es wurden Fraktionen von 0,89 ml gesammelt und analysiert. Die Dextrankonzentrationen wurden das Vertahren von Monsigny et al. unter Verwendung einer Absorption von 480 nm bestimmt. Die Radioaktivität eines 50 μl-Aliquots, welches von jedem Röhrchen entnommen wurde, wurde durch Szintillationszählung der Flüssigkeit bestimmt und die ³H-BSA-Konzentration wurde unter Verwendung ihrer spezifischen Aktivität berechnet. Die Position von nichtkonjugiertem BSA in der Elution der Säule wurde, in einem unabhängigen Säulenlauf bestimmt.

Wie in 5 gezeigt wurde, befindet sich ein großer Anteil des BSA, dargestellt durch die cpm-Werte, in einer Form mit hohem molekularen Gewicht, welches an einer mit dem Dextran identischen Position läuft, dargestellt durch OD480. Es gibt dort einen kleinen verbleibenden BSA-Peak, der nicht-konjugiertes Protein repräsentiert. Die Tabelle 4 enthält die Aufreinigungsdaten. Tabelle 4

Vollständig wiedergewonnenenes Protein	3,0 mg
Auf die Säule aufgetragenes Protein	2,9 mg
Wiedergewinnung	103%
Protein in Form mit hohem molekularem Gewicht (Röhrchen 15–23)	> 2,0 mg (68%)
Verhältnis von BSA zu DEXTRAN für 2000 kDa-Dextran	26

Die Säule trennte das Dextran-BSA-Konjugat nicht sauber von nicht-konjugiertem Protein ab. Dies ist nicht unüblich, da Polymere mit hohem molekularem Gewicht häufig ein Tailing in Gelfiltrationssäulen verursachen. Da das T2000-Dextran nicht fraktioniert war, enthält es weiterhin ein Spektrum an Größen. Um die Mengen an konjugiertem BSA in der Region zu bestimmen, in der sich freies und gebundenes BSA überlappen, wurde ein konstantes Verhältnis gebundenen BSAs zu Dextran angenommen. Vollständig konjugiertes BSA, berecnet durch Multiplizieren des BSA : Dextran-Verhältnisses und der gesamten molaren Menge an Dextran, wurde mit 2,55 mg bestimmt. Dies deutet an, dass 87% des Proteins in die Konjugatform konvertiert wurden.
Tabelle 5
Die Ergebnisse dieses BSA-Dextran-Experimentes sind in Tabelle 5 (Zeile 1) zusammen mit drei anderen Versuchen unter Verwendung verschiedener Mengen an CDAP und TEA (Zeilen 2–4) zusammengefasst. Die Menge an TEA und die Menge an CDAP verhelfen beiderseits dazu, hohe Protein- zu Polysaccharid-Verhältnisse über die direkte Konjugation zu erhalten. Die optimalen Mengen der Reagenzien können leicht bestimmt werden, da das Vertahren bequemes Experimentieren mit kleinen Mengen erlaubt.
Es sollte betont werden, dass die direkte Konjugationsreaktion das nicht-konjugierte Protein nicht modifiziert, im Gegensatz zu den Carbodiimid- oder Heteroligations-Kopplungsvertahren, noch verwendet es drastische Bedingungen. Daher kann man das nicht-konjugierte Protein für die weitere Verwendung wiedergewinnen. Da viele Proteinantigene wertvoll sind, ist dies ein großer Vorteil des direkten Konjugationsverfahrens.
Beispiel 2A
Herstellung von PT-Pn14-Konjugaten
Der Zweck dieser Experimente ist es: (1) zu zeigen, dass die Transformation des Proteins von einer Form mit niedrigem molekularen Gewicht zu einer Form mit hohem molekularen Gewicht ein Ergebnis der direkten Konjugation des Proteins an den Kohlenwasserstoff ist; (2) unter einem bestimmten Satz an Bedingungen die minimale Menge an cyanylierendem Reagenz zu bestimmen, die benötigt wird, um das Protein zu konjugieren; (3) zu zeigen, dass klinisch relevante Konjugate unter Vennrendung des Vertahrens der Erfindung hergestellt werden können.
0,289 mg/ml Pertussis-Toxoid (PT) (von Mass. Public Health Biol. Labs, Boston, MA) wurde in 0,5 M NaCl, 0,02 M Natriumphosphat, pH 8,8, gelöst. Ein Zehntel ml von 0,1 M Natriumborat, pH 9,1 oder 0,75 M HEPES, pH 7,5, wurden pro Milliliter an PT zugegeben. Pneumococcus-Typ 14 (Pn14) (ATTC-Charge 83909) wurde zu 5 mg/ml in 0,15 M Salzlösung mit 0,02% Azid gelöst. Triethylamin (TEA) wurde mit 0,2 M in Wasser gelöst. 100 mg/ml bzw. 10 mg/ml CDAP wurde in Acetonitril gelöst (hergestellt und bei –20°C) gelagert. Glyzin wurde mit 1,0 M, pH 5,0, hergestellt. Aminoethanol oder andere Aminoreagenzien können durch Glyzin/HCl ersetzt werden.
Experiment 1 – Synthese von nützlichen Impfstoffkonstrukten mit Hilfe direkter Konjugation: PT-Pn14
Jedes Röhrchen enthielt 250 μg von Pn14 (50 μl) auf Eis. Zum Zeitpunkt Null wurden verschiedene Mengen an CDAP wie in der Tabelle angedeutet, zugegeben, und 30 Sekunden später wurden 25 μl an TEA zugegeben. Zwei Minuten später wurde 1 ml an PT zugegeben. Nach etwa 1 Stunde wurden 100 μl an Glyzinlösung zugegeben.
Die Proben wurden bei 4 °C über Nacht stehen gelassen. Am nächsten Tag wurden sie mit Hilfe eines Costar 0,45 Mikron Spinfilters filtriert und auf einer HPLC TSK-Gelfiltrationssäule in 0,2 M KCl laufen gelassen. Die Prozent-HMW stellen die Fläche des Peaks des Konjugats mit hohem molekularem Gewicht bei OD280 gegen den Peak bei OD280 dar, der nicht-konjugierte Reste andeutet. Er wird durch (Prozentfläche frei von Volumenpeak)/(% Fläche frei von Volumenpeak-% Fläche des Peaks von nichtkonjugierten Resten) definiert. Die Prozentflächen, die aus den HPLC-Läufen gewonnen wurden, sind wie folgt:
Tabelle 6 Direkte Konjugation von Pertussis-Toxoid an Pn14
Da die PT-Kontrolle einen HMW von 22% besitzt, gibt es möglicherweise eine kleine Menge an Aggregation von PT, die durch die Reaktionsbedingungen verursacht wird. Dieser Datensatz deutet ebenfalls an, dass das Variieren des Verhältnisses von CDAP zu Polysaccharid (Ps) es möglich ist, das Verhältnis von Protein zu Kohlenwasserstoff im endgültigen Konjugat zu konjugieren.
Experiment 2 – Konjugation eines Monosaccharids an PT
In dieser Serie wurden 150 μl einer Lösung von 10 mg/ml Glucose, welches monomer ist, anstelle des Pn14-Polysaccharids eingesetzt. Es wurden Bedingungen verwendet, die denen in Experiment 1 ähnlich sind, außer dass PT in HEPES (pH 7,5, M 0,075)-Puffer anstelle von Borat vorbereitet wurde. Es wurden ebenfalls 20 μl anstelle von 25 μl TEA verwendet. Diese Bedingungen ergaben folgende Werte:
Die Nummern 2 und 3 deuten an, dass CDAP das Pertussis-Toxoid selbst nicht polymerisiert und dass aufgrund dessen die Konversion von PT zu einer Form mit einem hohen molekularen Gewicht an seiner Kopplung an das Polysaccharid mit hohem molekularen Gewicht liegt und nicht an der Polymerisation des Proteins. Aus dem HPLC-Lauf ist es offensichtlich, dass Glucose an PT konjugiert wurde, da es einen leichten Anstieg im molekularen Gewicht von PT gab.
Experiment 3 – Synthese von nützlichen Impfstoffkonstrukten über einen Spacer: PT-Pn14
Pn14, derivatisiert mit Hexandiamin wurde wie folgt hergestellt. Zehn μl CDAP (100 mg/ml in Acetonitril) wurden zugegeben (193 Mol CDAP pro 100 kDa an Polysaccharid). Dreißig Sekunden später wurden 20 μl an TEA (0,2 M) zugegeben.
Nachdem eine Gesamtzeit von 2,5 Minuten verstrichen war, wurden 300 μl an 0,5 M Hexandiamin in 0,1 M Natriumborat (pH 9,1) zugegeben. Nach einer Stunde wurde die Lösung in Wasser dialysiert, filtriert und in Salzlösung auf einer P6DG (BioRad)-Säule entsalzt. Das Leervolumen wurde gesammelt und mit Hilfe einer Centricon 30-Vorrichtung (Amicon) konzentriert. Es wurde bestimmt, dass es 33 Aminogruppen pro 100 kDa an Pn14-Polysaccharid besitzt.
Pertussis-Toxoid wurde an Amino-Pn14 unter Verwendung einer Heteroligations-Chemie (Brunswick et al.) konjugiert. Fünfzig μl an 0,75 M HEPES-Puffer (pH 7,5) wurden zu 0,44 ml des Amino-Pn14 gegeben. Es wurde mit 10 μl 0,1 M Iodoacetylpropionat N-Hydroxy-succinimid (SIAP) iodacetyliert. Pertussis-Toxoid wurde mit einem 20-fachen molaren Überschuss an SATA (Calbiochem, La Jolla, CA) thioliert. Jedes davon wurde in Salzlösung entsalzt, gemischt, und 1/9 Volumen an Puffer, enthaltend 0,75 M HEPES, 10 mM EDTA und 0,5 M Hydroxylamin, wurden zugegeben. Das Endvolumen betrug 1,1 ml. Nach einer Inkubation über Nacht wurde die Lösung auf 0,2 mM in Mercaptoethanol für eine Stunde und anschließend auf 10 mM in Iodacetamid für 10 Minuten eingestellt, gefolgt von einer Fraktionierung auf einer S400SF-Gelfiltrationssäule (Pharmacia) (siehe 6). Der Peak des Leervolumens wurde gesammelt und durch Druckfiltration auf einer PM10-Membran (Amicon) konzentriert. Ungefähr 50% des Pertussis-Toxoids wurden in Konjugatform wiedergewonnen. Das finale Konjugat enthielt 0,7 Mol PT pro 100 kDa an Pn14-Polysaccharid. Die Proteinkonzentration im Konjugat wurde mit Hilfe des Bradfordassays (BioRad) unter Verwendung von PT als Standard bestimmt. Die Polysaccharidkonzentration wurde mit Hilfe des Verfahrens von Monsigny et al. unter Verwendung von Pn14 als Standard bestimmt.
Beispiel 2B
Direkte Konjugation eines Proteins an Pn14 unter Verwendung von CTEA: CTEA bietet den Vorteil von weniger Nebenreaktionen als CDAP und führt zu reineren Produkten, wie bei Kohn et al., Anal. Biochem., 115: 375 (1981) beschrieben. Der Nachteil ist, dass es feuchtigkeitssensitiv ist, in einem geschlossenen Gefäß ausgewogen werden muss, und nicht einfach als Stammlösung hergestellt werden kann.
Ein ml an Pneumococcus Typ 14-Polysaccharid (Pn14) (5 mg/ml in Salzlösung) wird bei 0 °C gehalten. CTEA (erhältlich von Aldrich Chemical, Milwaukee, WI) wird unter trockenem Stickstof aufbewahrt. Zwei mg CTEA werden in einem geschlossenen Wiegegefäß ausgewogen und zum gekühlten, kräftig gemischten Pn14 zugegeben. Zwanzig μl an TEA (0,2 M in Wasser) werden sofort während des Mischens zugegeben. Sechzig Sekunden später werden 5 mg an Pertussis-Toxoid (1,5 mg/ml) zur gerührten Lösung zugegeben. Eine halbe Stunde später wird die Reaktion mit 200 μl 1 M Glyzin (pH 5,0) gestoppt. Nach einer weiteren Stunde wird die Lösung filtriert und über eine S400SF-Gelfiltrationssäule gegeben, die mit Salzlösung äquilibriert wurde. Der Peak des Leervolumens wird gesammelt und steril filtriert. Ein 1 : 1-Konjugat wird hergestellt.
Zugabe von Spacerreagenz zu Pneumococcus Typ 14-Polysaccharid unter Verwendung von CTEA: Ein ml an Pn14 (5 mg/ml in Salzlösung) wird bei 0°C aufbewahrt. CTEA (erhältlich von Aldrich Chemical, Milwaukee, WI) wird unter trockenem Stickstoff aufbewahrt. Ein mg CTEA wird in einem geschlossenen Wiegegefäß ausgewogen und zum gekühlten, kräftig gemischten Pn14 zugegeben. Unverzüglich werden 20 μl zu TEA (0,2 M in Wasser) während des Mischens zugegeben. Sechzig Sekunden später werden 300 μl 0,5 M Hexandiamin in 0,1 M Borat (pH 9) während des Mischens zugegeben. Nach einer Stunde wird die Lösung erschöpfenderweise in Salzlösung dialysiert und steril filtriert. Da ein Verhältnis von 187 Mol CTEA pro 100 kDa Pn14 verwendet wird, wird ein Konjugat mit ungefähr 18 Aminen pro 100 kDa an Pn14 hergestellt.
Beispiel 3
Direkte Konjugation von Pertussis-Toxoid an Haemophilus Influenzae-Polysaccharid (PRP) PRP mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht (MW) von 350 kDa wurde vom Massachusetts Public Nealth Biological Laboratory bezogen. Pertussis-Toxoid stammte aus der gleichen Quelle. Fünfzehn μl an CDAP (100 mg/ml) wurden zu 100 μl (2 mg) an PRP auf Eis zugegeben. Dreißig Sekunden später wurden 30 μl an TEA zugegeben. Dies entspricht 319 Mol an CDAP pro 100 kDa an PRP. Nach weiteren zwei Minuten wurden 0,75 ml Pertussis-Toxoid (1,1 mg) zugegeben. Vierzig Minuten später wurden 200 μl an 1 M Glyzin (pH 5,0) zum Abstoppen der Reaktion zugegeben. Nach einer weiteren Stunden wurde die Lösung über eine S400SF-Gelfiltrationssäule gegeben, die mit Salzlösung äquilibriert wurde (siehe 7). Das Leervolumen wurde gesammelt und steril filtriert. Es wurde bestimmt, dass das Produkt 1,1 PT pro 100 kDa an PRP mit einer Gesamtausbeute an 68% besitzt.
Der gemäß Chu et al., Inf. & Imm., 40: 245 (1983) hergestellte Impfstoff verwendete 377 Mol Bromcyan pro 100 kDa an PRP und wies Verhältnisse von 1,4 bis 2,1 PT pro 100 kDa an PRP mit Ausbeuten von weniger als 50% auf. Das direkte Konjugationsverfahren der Erfindung erzielte daher ähnliche Konjugate mit weniger Arbeitsaufwand, höheren Ausbeuten und ohne die Verwendung eines toxischen Reagenz.
Da viele veröffentlichten Protokolle zur Herstellung von PRP-Konjugaten mit dem mit einem Spacer derivatisierten PRP beginnen (Chu et al., Schneerson et al., J. Exp. Med., 152: 361 (1980); Dick & Beurret, "Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate Antigen", Coniuaate Vaccines, J. M. Cruse & R. E. Lewis (Hrsg.), Bd. 10, S. 48–114 (1989)), wurde CTAP ebenfalls verwendet, um zu PRP einen Spacer zuzugeben. Die verwendeten Bedingungen waren so wie oben beschrieben, jedoch wurden 100 μl 0,1 M Hexandiamin in 0,1 M Borat anstelle des Pertussis-Toxoids zugegeben. Das Produkt wurde in Salzlösung dialysiert. Es wurde bestimmt, dass es 102 Aminogruppen pro 100 kDa an PRP aufweist. Da dies ein höheres Verhältnis ist als in veröffentlichten Vertahren verwendet, hätte sogar weniger CDAP verwendet werden können.
Beispiel 4
Immunogene Konstrukte, die als Impfstoffe nützlich sind und mittels CDAP-Chemie hergestellt wurden
Konjugation unter Verwendung von CDAP und einem bifunktionellen Reagenz:
Kurz beschrieben, wurde ein von Malaria abgeleitetes Peptid, p28 (CNIGKPNVQDDQNK), aus dem Gameten-spezifischen Protein pfs25 an Tetanus-Toxoid (TT) konjugiert. Es wurde gezeigt, dass p28 die Transmission von Malaria blockierende Antikörper induziert. CDAP wurde anschließend verwendet, um p28-TT an Pneumococcus-Typ 14 (Pn14)-Polysaccharid zu koppeln.
Ein von der FDA zugelassenes Tetanus-Toxoid wurde über Nacht in HEPES-Puffer dialysiert und mit einem 30-fachen molaren Überschuss des iodacetylierenden Agens (SIAP) umgesetzt. Nach 3 Stunden wurden die Reagenzien mittels Ultrafiltration unter Verwendung einer Macrosep 30 (Filtron Technology) entfernt und in frischem HEPES-Puffer, 0,15 M, pH 7,5, gewaschen.
Tritiummarkiertes p28 wurde als ein Feststoff zum derivatisierten TT zugegeben, während es sanft gemischt wurde. Nach einer Übernachtreaktion bei 4°C wurde die Mischung mit 0,2 mM Mercaptoethanol behandelt, um jegliche verbleibenden aktiven Gruppen zu blockieren und anschließend auf einer mit HEPES-Puffer äquilibrierten P6DG-Säule entsalzt. Ausgehend von der spezifischen Aktivität des Peptids wurde bestimmt, dass das Produkt 20 Mol p28-Peptide/Mol an TT enthält. Das Konjugat wurde in Salzlösung dialysiert und steril filtriert.
Direkte Konjugation unter Verwendung von CDAP: Pn14 (von American Tissue Type collection, ATTC, erhalten) besitzt ein hohes Molekulargewicht (ca. 10⁶ Daltons). P28-TT wurde direkt an Pn14 wie folgt konjugiert. CDAP (10 μl aus einer 100 mg/ml Stammlösung in Acetonitril) wurde zu Pn14 zugegeben (1,1 mg in 150 μl Salzlösung). Dreißig Sekunden später wurden 20 μl Triethylamin (0,2 M) zugegeben. Zwei Minuten später wurden 0,55 mg (in 0,8 ml Salzlösung) p28-TT zugegeben, und weitere Stunde später wurde die Reaktion für eine weitere Stunde mit 200 μl 1,0 M Glyzin (pH 5) gestoppt. Das Konjugat wurde anschließend über eine S400SF-Gelfiltrationssäule gegeben, die mit Salzlösung äquilibriert wurde und das Leervolumen, das das Konjugat enthält, wurde gesammelt. Die 9 deutet an, dass praktisch das gesamte p28-TT im Leervolumen in konjugierter Form gefunden wurde.
Immunoreaktivität von immunogenen Konstrukten:
Gruppen von 5 DBA/2 Mäusen wurden i.v. mit 10 μg p28-TT oder (p28-TT)-Pn14-Konjugat in Salzlösung immunisiert, drei Wochen später ausgeblutet, und die Serien wurden mit ELISA (enzyme-linked immunoabsorbent assay) auf Reaktivität gegen rekombinantes pfs25-Protein untersucht. Peptid 28 ist von pfs25 abgeleitet. Ein anderer Satz von Mäusen wurde mit den gleichen Antigenen immunisiert, die mit dem Adjuvans Alum (Imject, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) gefällt wurden.
In Übereinstimmung mit den betreffenden Anwendungen zeigt Tabelle 7, dass ausschließlich das Konjugat mit hohen molekularen Gewicht gute Antiproteintiter erzeugte.
Tabelle 7 Anti-pfs25 IgG1-Titer
Dies zeigt, dass das CDAP-Verfahren verwendet werden kann, um brauchbare Impfstoffkonstrukte herzustellen. Es zeigt ebenfalls die Einfachheit, mit der nützliche Konjugate hergestellt werden können.
Beispiel 5
Biologisch aktive multivalente Proteinkonstrukte, die unter Verwendung von CDAP hergestellt wurden
Um zu zeigen, dass die Konjugate, die unter Verwendung von CDAP zum direkten Koppeln der Proteine an Polysaccharide hergestellt wurden, ein multivalentes Produkt ergeben können (welches wie in den verwandten Anmeldungen gezeigt wird, gesteigerte Immunogeniät besitzt) und dass das Verfahren sanft genug sein kann, um die biologische Aktivität zu wahren, wurden verschiedene Konjugate eines monoklonalen Antikörpers mit Dextran hergestellt. Diese Experimente verwendeten monoklonale Antikörper Hδ^a/1 mit einem Anti-ID-Antikörper, der Membran IgD auf B-Lymphozyten quervernetzt und Proliferation induziert (Brunswick et al., Journal of Immunol., 140: 3364 (1988)). Wie durch Brunswick et al. beschrieben, induziert Konjugation von multiplen Kopien von Hδ^a/1 an einem Polymer mit hohem molekularen Gewicht, wie beispielsweise 2000 kDa-Dextran (Hδ^a/1-AECM-Dextran) B-Zellproliferation bei 1000-fach niedrigeren Konzentrationen und induzierte eine höhere Rate der Proliferation als nicht-konjugiertes Hδ^a/1. In Brunswick et al. wurde ein einfaches, geradliniges, aber vielstufiges, viele Tage in Anspruch nehmendes Verfahren benötigt, um das Konjugat herzustellen. Aminoethylcarboxymethyldextran (AECM-Dextran) wurde zunächst hergestellt, wie in Brunswick et al. beschrieben, und anschließend wurde Heteroligationschemie verwendet, um das Hδ^a/1 an den Kohlenwasserstoff zu koppeln.
Hδ^a/1-Dextran wurde beiderseits durch direkte Konjugation unter Verwendung von CDAP und durch indirekte Konjugation unter Verwendung eines Spacers und CDAP wie folgt hergestellt.
Direkte Konjugation: Zu einer gevortexten Lösung von 3,2 mg an T2000-Dextran (Pharmacia) in 0,3 ml Salzlösung wurden 15 μl an CDAP zugegeben (aus einer 100 mg/ml-Stammlösung in Acetonitril). Dreißig Sekunden später wurden 15 μl 0,2 M TEA während des Vortexens zugegeben. Nach weiteren 2 Minuten wurden 6 mg Hδ^a/1 (in 362 μl 0,05 M Natriumborat und 0,075 M NaCl) während sanften Vortexens zugegeben. Nach 15 Minuten wurde die Reaktionsmischung durch die Zugabe von 100 μl 1,0 M Glyzin, pH 5,0 gestoppt und über eine S400SF-Gelfiltrationssäule (1 × 59 cm) gegeben, die mit Salzlösung äquilibriert wurde. Die Elution der Säule wird in 19 gezeigt. Der Peak des Leervolumens wurde gesammelt und mit einem Millex GV-Filter sterilisiert. Das Produkt wird Hδ^a/1 (CDAP)-Dextran genannt. Dieses Vertahren nahm in etwa 3 Stunden in Anspruch.
Spacer: Dextran wurde mit CDAP wie oben beschrieben aktiviert (31,5 mg T2000-Dextran in 3 ml Salzlösung und 25 μl CDAP gefolgt von 25 μl TEA, 1 Mol CDAP/0,06 Mol Glucosemonomere). Drei ml einer 0,5 M 1,6-Diaminhexan in 0,1 M Natriumborat wurden zugegeben. Die Lösung wurde erschöpfenderweise in Wasser dialysiert und anschließend auf einer S400HR-Gelfiltrationssäule fraktioniert. Das Leervolumen wurde gesammelt und konzentriert. Es wurde bestimmt, dass dieses Aminodextran 147 Aminogruppen pro 2000 kDa-Dextran besitzt. Das Produkt wird NH₂(CDAP)-Dextran genannt. Einschließlich der Dialyse war dies ein Zwei-Tages-Vertahren. Im Gegensatz dazu nimmt es gewöhnlicherweise eine Woche in Anspruch, um AECM-Dextran unter Verwendung des Vertahrens von Brunswick-et al. herzustellen.
Hδ^a/1 wurde an AECM-Dextran und NH₂-(CDAP)-Dextran unter Verwendung der Heteroligations-Techniken konjugiert, wie sie in Brunswick et al. beschrieben wurden. Die Konjugate werden Hδ^a/1-AECM-Dextran bzw. Hδ^a/1-NH₂-(CDAP)-Dextran genannt. Die Konjugation unter Verwendung von ACEM-Dextran war ein Zwei-Tages-Vertahren.
Es wurden B-Zellproliferationsassays unter Verwendung von 10.000 Zellen/Vertiefung durchgeführt, wie durch Brunswick et al. beschrieben. Tabelle 8 stellt die Ergebnisse solcher Assays bereit, insbesondere unter Angabe des Einbaus an tritiiertem Thymindin in B-Zellen als Counts per min./Vertiefung.
Tabelle 8
Wie in Brunswick et al. berichtet wurde, verursacht Hδ^a/1 allein keinen Einbau bei den Konzentrationen. Ein maximaler Einbau bei 10–100 μg/ml Hδ^a/1 liegt bei etwa 3000 cpm.
Diese Daten deuten an, dass die unter Verwendung von CDAP hergestellten Konjugate mit oder ohne einen Spacer im Wesentlichen in ihren Fähigkeiten zu Hδ^a/1-AECM-Dextran äquivalent sind, Proliferation zu induzieren. Da nur multivalente Antikörper hohe Grade der Proliferation bei niedrigen Dosen induzieren, müssen alle Konjugate multivalent sein. Daher beeinflusst die direkte Konjugation mit CDAP nicht die biologische Aktivität des Antikörpers. Das direkte Konjugationsvertahren war bemerkenswert schneller für die Herstellung als Konjugate, die mittels eines Spacers hergestellt wurden. Weiterhin war die Zugabe des Spacers und die Konjugation unter Verwendung von CDAP viel schneller als die Herstellung von AECM-Dextran.
Dieses Experiment illustriert daher (1) die hohe Ausbeute eines multivalenten Konstruktes unter Verwendung von CDAP und (2) die Einfachheit und Schnelligkeit der Herstellung von Konjugaten, insbesondere von direkten Konjugaten. Konjugation unter Verwendung von CDAP und einem bifunktionellen Reagenz nahm weniger als 48 Stunden in Anspruch und die direkte Konjugation nahm weniger als drei Stunden in Anspruch.
Beispiel 6
Soweit nicht anders angegeben, war das Protokoll in diesen Experimenten im Allgemeinen wie folgt. Triethylamin (TEA), Acetonitril, Schwefelsäure (H₂SO₄), Resorcinol, Hexandiamin, Natriumborat und HEPES wurden von Aldrich bezogen und besaßen Reagenzqualität oder besser. N-Cycano-4-dimethylaminopyridintetrafluoroborat (CDAP) wurde von Sigma oder von Research Organics (Cleveland, Ohio) bezogen. Trinitrobenzensulfonsäure (TNBS) wurde von Kodak Chemicals bezogen. Millex-Filter wurden von Millipore Corp. bezogen.
Dextran T2000 wurde von Pharmacia bezogen. Pneumococcus-Typ 14-Polysaccharid wurde von ATTC (Rockville, Maryland) bezogen. Aminoethylcarbamyldextran wurde hergestellt, wie bei Brunswick et al. beschrieben. Monomeres BSA (bovines Serumalbumin) wurde aus der niedrigen Endotoxin-Cohen-Fraktion V BSA (Sigma Katalog #A9306) durch Gelfiltration auf einer 2,6 cm × 97 cm S100HR-Säule (Pharmacia) hergestellt, die mit Salzlösung plus Azid äquilibriert wurde. Es wurde mittels analytischer HPLC gezeigt, dass das Produkt weniger als 0,5% Dimer besitzt und weniger als 0,5% Material mit einer Masse an höherem Molekulargewicht. Das BSA wurde periodisch mittels HPLC geprüft, um seinen monomeren Status zu bestätigen. Für BSA wurde ein Extinktionskoeffizient von 44.000 M^–1 verwendet.
Polysaccharid wurde mit CDAP wie folgt aktiviert. CDAP wurde mit 100 mg/ml in Acetonitril bereitet und bei –20 °C bis zu einem Monat aufbewahrt. CDAP wurde langsam in eine gevortexte Lösung an Polysaccharid in Wasser pipettiert, und dreißig Sekunden später wurde ein Volumen von 0,2 M TEA zugegeben, das gleich zu dem Volumen an verwendetem CDAP war. Bei 2,5 Minuten wurde ein Fünftel des Volumens von 0,5 M Hexandiamin in 0,1 M Natriumborat (pH 9,3) zugegeben. Die Reaktion wurde über Nacht bei 4 °C fortgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde auf einer P6DG oder einer P6-Kartusche (BioRad) entsalzt, mit Salzlösung äquilibriert, und anschließend weiter in Salzlösung dialysiert. Einige Proben wurden unter Verwendung einer Centricon 30-Vorrichtung (Amicon) konzentriert, und erneut entsalzt, um sich der Entfernung von freien Diaminen zu vergewissern. Variationen dieses allgemeinen Vertahrens sind unten angegeben. Das Ausmaß der Derivatisierung mit Hexandiamin wurde unter Verwendung eines TNBS-Assays für primäre Amine bestimmt. Die Absorption wurde bei 366 nm unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 11.000 M^–1 (Franci et al.) bestimmt. CDAP-aktiviertes Dextran, welches unter Verwendung von Ethanolamin anstelle von Diamin derivatisiert wurde, wurde in diesem Assay als TNBS-negativ bestimmt. Es wurden Polysaccharidkonzentrationen bestimmt, wie durch Monsigny et al. beschrieben. Die Ergebnisse werden als Mol Amin pro 100 kDa an Polysaccharid ausgedrückt, soweit dies nicht anders angegeben wird.
Die Proteinkonjugation an Aminodextran über eine Thio-Ether-Verknüpfung wurde durchgeführt, wie durch Lees et al., Vaccine, 12(3): 1160, 1994, beschrieben. Das Protein wurde direkt an Polysaccharid durch Aktivierung des Polymers mit CDAP konjugiert, wie oben für die Derivatisierung mit Aminen beschrieben. Es wurde Protein (10 mg/ml in 0,15 M HEPES, pH 7,5) zu einer sanft gevortexten Lösung 2 1/2 Minuten nach der Zugabe von CDAP schnell zugesetzt. Die Reaktionen wurden mit ungefähr 1/5 Volumen 0,5 M Ethanolamin in 0,75 M HEPES, pH 7,5, für mindestens eine Stunde gestoppt, vor einer Gelfiltration auf einer S300HR- oder S400HR-Säule (Pharmacia), die mit Salzlösung äquilibriert wurde. Das Röhrchen mit dem Peak aus dem Leervolumen wurde auf Protein mit Hilfe des Bradford-Vertahrens (BioRad-Reagenz) unter Verwendung von BSA als Standard untersucht. Es wurden mit Hilfe des Vertahrens von Monsigny et al. unter Verwendung von Dextran Standard-Polysaccharid-Konzentrationen bestimmt. Die unten diskutierten Ergebnisse werden als mg Protein pro mg Polysaccharid ausgedrückt, soweit nichts weiter angegeben.
Aktivierung von Polysaccharid unter Verwendung von CDAP:
Es wurden Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob CDAP-Aktivierung von Polysacchariden verwendet werden kann, um Konjugatimpfstoffe unter Bedingungen herzustellen, die schneller sind, sanfter, bequemer und sicherer als die vorher berichteten Vertahren. Als ein Prototyp für Polysaccharide wurde Dextran mit hohem molekularem Gewicht (T2000-Dextran, Pharmacia) mit CDAP unter einer Vielzahl experimenteller Bedingungen aktiviert.
Ausgehend von einer 100 mg/ml-Stammlösung wurde ein Volumen an CDAP langsam in eine Lösung von T2000-Dextran in Wasser pipettiert (1,6 mg/ml, wie in 4 gezeigt, oder 10 mg/ml, wie in 10 gezeigt). Bei 30 Sekunden wurde ein Volumen von 0,2 M TEA entsprechend dem Volumen von CDAP zugesetzt und 120 Sekunden später wurde ein großer Überschuss an Hexandiamin in Natriumborat (pH 9,3) schnell zugesetzt. Nach Entsalzen auf einer P6DG-Säule, gefolgt von einer erschöpfenden Dialyse zur Entfernung nicht-konjugierter Reagenzien wurden hohe Gehalte an Polysacchariden gefunden (siehe 4 und 10). Während dieser Verfahrensweise gefolgt wurde, jedoch in der jeweiligen Abwesenheit von CDAP, dem Dextran oder dem Diamin, waren unter Verwendung des TNBS-Assays keine Amine detektierbar. Weiterhin war CDAP-aktiviertes Dextran, das mit einem Monoamin (Ethanolamin) anstelle des Hexandiamins umgesetzt wurde, TNBS-negativ. Um sich weiterhin zu versichern, dass alle Materialien mit niedrigem molekularem Gewicht entfernt wurden, wurden die derivatisierten Polysaccharide mittels Ultrafiltration konzentriert und ein zweites MaI auf einer P6DG-Säule entsalzt. Das Aminverhältnis blieb nach diesem Vertahren unverändert.
Der Grad der Derivatisierung war von der Menge an CDAP abhängig – Anstiege im Verhältnis von CDAP zu Dextran führten zu Anstiegen in der Gesamtzahl an Aminogruppen, die auf dem Polysaccharid substituiert wurden, wie in den 4 und 10 gezeigt. Das Ausmaß der Derivatisierung war abhängig von der Polysaccharidkonzentration bei dem gleichen molaren Verhältnis von CDAP zu Dextran. Daher befanden sich die Effektivitäten bei 1,6 mg/ml Dextran in einem Bereich von 0,7 bis 2,4 Prozent in Abhängigkeit der Mole an Aminen, die pro Mol an CDAP substituiert wurden, während bei 10 mg/ml Dextran soviel Mol an CDAP substituiert wurden, wie 0,2 Mol an Aminen entsprechen (20% Effektivität).
Um die Effektivität dieser bimolekularen Reaktion zu verbessern, wurde die Konzentration an Polysacchariden von 1 bis 50 mg/ml unter Verwendung einer festen Menge an CDAP (siehe 11) gesteigert. Bei der höchsten verwendeten Polysaccharidkonzentration wurden mehr als 0,4 Mol an Amin zu jedem verwendeten Mol an CDAP zugegeben. Im Gegensatz zu den mit Hilfe der CDAP-Aktivierung erhaltenen hohen Graden an Substitution führt die CNBr-Aktivierung gewöhnlicherweise zu maximale Effektivitäten von etwa 1 bis 2%.
In Abwesenheit von TEA wurde die Derivatisierung mit Diaminen deutlich reduziert. Um zu bestimmen, ob die Anwesenheit eines tertiären Amins, wie beispielsweise TEA, für die Aktivierung eines löslichen Polysaccharids mit CDAP essentiell ist, wurde die Effektivität der Aktivierung unter Verwendung von TEA mit der unter Verwendung eines anorganischen Puffers oder NaOH verglichen.
Einhundert μl einer CDAP-Lösung (100 mg/ml in Acetonitril) wurden langsam zu einer gerührten Lösung von 2 ml an T2000-Dextran (10 mg/ml in Wasser) bei Raumtemperatur zugegeben. Nach 30 Sekunden wurde langsam 1 N NaOH zugegeben, um den pH bei etwa 9 zu halten. Nach 1½ Minuten wurde 1 ml an BSA, 20 mg/ml in 0,5 M HEPES, pH 8,0, zugegeben. Nachdem man die Reaktion für achtzehn Stunden bei 4 °C weiter reagieren ließ, wurde sie durch Zugabe von 100 μl an 0,5 M Ethanolamin in 0,75 M HEPES, pH 7,5 gestoppt. Zur Analyse wurden 300 μl des Produkts auf eine 1 cm × 50 cm S400HR-Säule gelfiltriert, die mit Salzlösung und Azid äquilibriert wurde. Das Röhrchen des Leervolumens am Peak wurde auf Protein unter Verwendung des BioRad-Assays untersucht und auf Polysaccharid unter Verwendung des Resorcinolassays, und es wurde bestimmt, dass es 0,45 mg an BSA pro mg Dextran enthielt.
Wie unten in Tabelle 9 gezeigt, erfolgte die Derivatisierung mit einer Vielzahl an Puffern. Eine vorsichtige Zugabe von 1 N NaOH wurde tatsächlich vennrendet, um den pH auf etwa 9 zu steigern und einen guten Substitutionsgrad zu erzielen. Tabelle 9 Derivatisierung von Dextran mit Hexandiamin unter Verwendung verschiedener Puffer (entsalzt, dialysiert, konzentriert und entsalzt)

Puffer NH₂/100 kDa dex

TEA (0,2 M) 29

Borat (pH 8,8) 40

Carbonat 20

NaOH 36
Bei Dextran gab es keine signifikanten Unterschiede in den Graden der Derivatisierung über einen pN-Bereich von 8 bis 10, obwohl gefunden wurde, dass andere Polysaccharide abhängiger von dem Aktivierungs-pH sind (siehe unten). Falls TEA ausgelassen wird und der pH nicht gesteigert wird, ist, wie oben bemerkt, das Dextran immer noch aktiviert, jedoch wird es zu einem viel geringeren Grad derivatisiert. Daher hängt die CDAP-Aktivierung oder Koppeln nicht von der Anwesenheit von TEA oder einem Pufer ab – jegliches geeignete Mittel kann verwendet werden, um den pH zu steigern, so dass die Reaktionsmischung ausreichend alkalisch ist.
Tabelle 10 zeigt die Reaktionskinetik der Aktivierung unter Vennrendung von CDAP. Im Experiment wurden 100 μl CDAP (100 mg/ml Acetonitril) zu 1 ml Dextran (20 mg/ml) bei 30 Sekunden zugegeben, 1 ml an 0,1 M Natriumborat, pH 8,8 wurden zugegeben und nach zwei Minuten wurden 0,5 ml Hexandiamin in 0,75 M HEPES zugegeben. Die Aliquots wurden zu den angegebenen Zeitpunkten auf einer P6-Kartusche entsalzt, die mit Salzlösung äquilibriert wurde, und anschließend erschöpfend in Salzlösung vor der Analyse dialysiert. Bei hohen Konzentrationen von Polysaccharid und CDAP gelierte die Lösung. Es ist daher angenehmer mit 10 bis 20 mg/ml Polysaccharidlösungen zu arbeiten. Tabelle 10 Kinetiken der Reaktion von CDAP-aktiviertem Dextran mit Hexandiamin

Reaktionszeit NH₂/100 kDa dex

15 Min. 42

1 Std. 46

3 Std. 47

24 Std. 48
Wie in Tabelle 10 gezeigt, war die Derivatisierungsreaktion schnell und innerhalb von 15 Minuten im Wesentlichen vollständig. Bei 3 oder 24 Stunden wurde kein Anstieg im Grad der Derivatisierung beobachtet.
Um die Reproduzierbarkeit zu testen, wurde Pneumococcus-Polysaccharid-Typ 14 (Pn14) mit CDAP aktiviert und mit Hexandiamin derivatisiert. Zu einer gerührten Lösung von 1 ml an Pn14 (10 mg/ml in Wasser) wurden 30 μl an CDAP (100 mg/ml in Acetonitril) (0,3 mg CDAP/mg Pn14) zugegeben. Nach 30 Sekunden wurden 30 μl an TEA (0,2 M in Wasser) zugegeben. Bei zwei Minuten wurden 0,5 ml an Hexandiamin (0,5 M in 0,75 M HEPES, pH 7,6) zugegeben. Bei 1 1/2 Stunden wurde das Produkt mittels einer P6-Kartusche entsalzt, mittels Ultrafiltration konzentriert und erneut entsalzt, und anschließend auf Amine mittels TNBS und auf Pn14 mittels Resorcinol/Schwefelsäure untersucht. Wie in Tabelle 11 gezeigt, wurden Effektivitäten von 13–15% in Abhängigkeit der Mole an Aminen, die pro Mol an verwendetem CDAP detektiert wurden, in drei Experimenten erhalten, die über einen Zeitraum von einem Jahr durchgeführt wurden.
Tabelle 11
Die oben aufgelisteten Ergebnisse deuten die Stabilität des CDAP-Reagenz im Kühlgerät, Reproduzierbarkeit und hohe Effizienz an. Im Vergleich dazu ist die CNBr-Lösung nicht stabil, und die CNBr-Aktivierungsprozedur ist schwierig zu reproduzieren und besitzt eine Effektivität von etwa 2%.
Direkte Konjugation von Protein an CDAP-aktiviertes Ps:
Wie bei der Derivatisierung von Aminen ist das Ausmaß der Proteinkonjugation an das Polysaccharid von der für die Aktivierung des Polysaccharids verwendeten Menge an CDAP abhängig. Wie in 12 gezeigt, stieg bei einer Konzentration von 10 mg/ml Dextran das Verhältnis CDAP : Dextran linear mit dem BSA : Dextran-Verhältnis des Produkts an. Ähnliche Verhältnisse von BSA : Dextran können selbst bei niedrigeren CDAP : Dextran-Verhältnissen beobachtet werden, falls die Protein und/oder die Polysaccharidkonzentrationen gesteigert werden.
In der Abwesenheit von Dextran wurden Kontrollreaktionen durchgeführt und mittels Gelfiltration analysiert, welche andeuteten, dass das CDAP von sich aus nicht aggregiert oder mit dem BSA (Protein) polymerisiert. Eine CDAP-behandelte Probe (0,5 ml Wasser + 25 μl CDAP @ 100 mg/ml in Acetonitril + 50 μl 0,2 M TEA + 0,5 ml BSA @ 10 mg/ml in 0,5 M HEPES, pH 8,0) und eine Kontrollprobe (0,575 ml Wasser + 0,5 ml BSA (monomer) @ 10 mg/ml in 0,5 M HEPES, pH 8,0) wurden hergestellt. Man ließ diese Proben über Nacht reagieren und stoppte sie mit 100 μl 0,5 M Ethanolamin in HEPES. Nach Stoppen für eine Stunde wurden die Proben auf einer S400-1 cm × 50 cm-Säule in Salzlösung und Azid bei 0,75 ml/Minute laufen gelassen. Die OD280-Werte über die Säule wurden summiert und in die Summe der OD280-Werte über die Röhrchen dividiert, die dem BSA-Peak vorausgehen. Die mit CDAP behandelte Probe zeigte 0,6% polymeres BSA, und die Kontrollprobe zeigte 0,7% polymeres BSA. Das Protein mit hohem molekularen Gewicht entsteht daher nicht aufgrund von Selbstpolymerisation oder Aggregation.
Weiterhin verursacht CDAP unter normalen Bedingungen keine Quervernetzung des Polysaccharids. Dies wurde durch das folgende HPLC-Experiment bestätigt, wobei 70 kDa Dextran aktiviert und anschließend mit Ethanolamin umgesetzt wurden, und auf einer Gelfiltrationssäule laufen gelassen wurden. Insbesonders wurden 2,5 mg T70-Dextran (10 mg/ml) mit 20 μl CDAP (100 mg/ml) kombiniert. Bei 30 Sekunden wurden 20 oder 60 μl an 0,2 M TEA zugegeben, und bei zwei Minuten wurden 100 μl an 0,5 M Ethanolamin in 0,75 M HEPES, pH 7,6, zugegeben. Nach einer Stunde wurden die Proben auf einem G4000 PWXL (Tosohaas) oder einem SEC3000 (Beckman) in 0,2 M NaCl laufen gelassen und über einen refraktiven Index detektiert (das Leervolumen für jede Säule betrug etwa 5 Minuten, das Eluieren von Salz etwa 10 Minuten). Es wurde kein Hinweis auf eine Verschiebung zu höheren molekularen Gewichten beobachtet.
Wie das folgende Vergleichsbeispiel zeigt, sollten extreme Bedingungen vermieden werden, um eine Quervernetzung von CDAP mit dem Polysaccharid zu vermeiden. Ein ml an T2000-Dextran (100 mg/ml Wasser) wurde mit 176 μl an CDAP (100 mg/ml) vereinigt. Nach dreißig Sekunden wurden 176 μl an 0,2 M TEA zugegeben, was in weniger als zwei Minuten zu einem Gel führte.
Um die optimale Aktivierungszeit zu bestimmen und die Stabilität des CDAP-aktivierten Polysaccharids zu untersuchen, wurde Protein (BSA) 5–300 Sekunden nach der Zugabe von CDAP und TEA zugegeben und das BSA : Dextran-Verhältnis des Produkts wurde bestimmt. Die in 13 gezeigten Ergebnisse legen nahe, dass die optimale Aktivierungszeit bei etwa 2 Minuten liegt und dass das aktivierte Polysaccharid über diesen Zeitraum stabil ist. Falls das Protein bei einer Stunde zugegeben wird, sinkt die Reaktion auf etwa ein Drittel der Ausbeute.
Es wurde gefunden, dass wässrige Mischungen aus CDAP und Polysacchariden stabil sind, wie in 14 dargestellt. Sechzig μl an CDAP (100 mg/ml) wurden zu 1 ml Wasser zugegeben, und 100 μl-Aliquots dieser CDAP-Lösung wurden mit 100 ml an Polysaccharid (Dextran, 20 mg/ml) bei verschiedenen Zeitpunkten über einen Zeitraum von 10–300 Sekunden vereinigt, wie in 14 gezeigt, gefolgt von einer Kombination mit 15 μl einer TEA-Lösung (0,2 M). Zwei Minuten nach dem Vereinigen mit dem TEA wurden 100 ml an BSA (30 mg/ml) zugegeben.
Es wurden keine signifikanten Unterschieden in den finalen Verhältnissen von Protein zu Polysaccharid über den gesamten Bereich des Zugabezeitraums gefunden. Die in 14 gezeigten Ergebnisse stimmen mit der Stabilität von CDAP in sauren Lösungen über ein und die Beobachtung, dass Lösungen von CDAP in Wasser sauer reagieren. Wasser kann daher an die Stelle des organischen Lösungsmittels treten, falls die Lösung die Reagenzlösung am selben Tag verwendet werden soll. Alternativ kann CDAP als ein Feststoff zur Lösung des Polysaccharids zugegeben werden. Beim Arbeiten mit kleinen Mengen an CDAP wurde festgestellt, dass es bequemer ist, mit Lösungen zu arbeiten, als mit dem festen Reagenz. Weiterhin kann in Fällen, wo die schnelle Zugabe einer Acetonitrillösung von CDAP manchmal zu einer Ausfällung des Polysaccharids führt, eine Ausfällung vermieden werden, falls eine wässrige Lösung an CDAP vennrendet wird. Wässrige Stammlösungen an CDAP können in Konzentrationen bis zu 75 mg/ml hergestellt werden.
15 zeigt, dass die Proteinkonjugation an das Polysaccharid relativ rasch stattfand, und innerhalb von drei Stunden 80% der maximalen Konjugation erreicht wurde. Es konnte sogar ein rasches Koppeln durch Steigerung der Proteinkonzentration, der Polysaccharidkonzentration, und/oder der CDAP-Konzentration erreicht werden.
Wie in 16 angedeutet, ist der pH der Reaktionslösung während der Polysaccharid-Aktivierung ein anderer wichtiger Parameter in der Polysaccharid-Aktivierung mit CDAP. So wie der pH während des Aktivierungsschrittes von 7 auf 8,3 gesteigert wurde, gab es einen Anstieg an Polysaccharid-Aktivierung, wie dies durch einen deutlichen Anstieg der Kopplungseffektivität wiedergespiegelt wird. Das BSA : Dextran-Verhältnis des Konjugats stieg um ein 4-faches an, als der pH von 7,0 auf 8,3 anstieg. Bei einem pH-Wert von höher als 8,3 gab es wenig oder keinen Anstieg im Verhältnis. Die pH-Abhängigkeit der CDAP-Aktivierung erklärt den geringen Grad der Derivatisierung, der kürzlich in der Abwesenheit von TEA beobachtet wurde, da der pH einer CDAP-Lösung in Wasser anfangs fast neutral ist und stärker sauer wird.
Wie früher in Bezug auf die Derivatisierung von Polysacchariden mit Aminen bemerkt, ist ein Puffer aus tertiärem Amin während der Aktivierung des Polysaccharides für die direkte Konjugation von Proteinen nicht notwendig. Die direkte Konjugation von Protein an Polysaccharide kann daher z. B. unter Verwendung eines pH-Stat oder eines automatischen Titrators zur Steigerung des pHs während des Aktivierungsschrittes durchgeführt werden. Dies kann bei der Herstellung von Impfstoffkonjugaten vorteilhaft sein.
17 zeigt, dass der pH der Reaktionslösung während des Koppelns des Proteins an das aktivierte Polysaccharid ein wichtiger Parameter für die direkte Konjugation von Protein mit CDAP ist. In dem Experiment, dessen Ergebnisse in 17 beschrieben werden, wurden verschiedene Puffer über einen weiten Bereich an pH-Werten und bei einem niedrigen Verhältnis von Protein zu Polysaccharid getestet. Das Protokoll sah wie folgt aus.
Zu vier ml an T2000-Dextran (10 mg/ml in Wasser) wurden 133 μl einer CDAP-Lösung (100 mg/ml in Acetonitril, frisch hergestellt) (0,33 mg CDAP/mg dex) zugegeben. Nach 30 Sekunden wurden 266 μl an TEA (aus einem 0,2 M-Stamm) zugegeben und der pH erreichte ein Maximum von 9,6. Nach 2 1/2 Minuten wurde der pH auf 5,0 unter Verwendung von 60 μl von 1 M NaAc (Natriumacetat) eingestellt. Vierhundert μl an aktiviertem Dextran wurden in Röhrchen transferiert, die 200 μl an BSA (15 mg/ml) (0,8 mg BSA/mg dex) und 100 μl eines Puffers (1 M NaAc, pH 4,7, 5,7; 0,5 M HEPES, pH 6,94, 7,43, 8,15; 0,1 M NaPO₄, pH 8,0, 8,67; 50 mM Natriumborat, pH 9,0, 9,6) (nicht auf Ionenstärke kontrolliert) enthalten. Eine Stunde nach dem Transfer wurden 350 μl der Lösung eines Röhrchens mit 100 μl an frisch hergestelltem 0,5 M Ethanolamin in 0,75 M HEPES (pH 7,5) vereinigt. Zwanzig Stunden später wurden 100 μl an Ethanolamin zur verbleibenden Lösung zugegeben. Die Reaktion wurde für mindestens zwei Stunden gestoppt und das Produkt wurde auf S300HR- oder S400HR-Säulen laufen gelassen, die mit Salzlösung plus Azid äquilibriert wurden. Das Röhrchen mit dem Peakleervolumen wurde auf BSA unter Verwendung des BioRad-Assays und auf Polysaccharid unter Verwendung des Resorcinol-Assays untersucht.
Wie in 17 gezeigt, wurde der Großteil des Proteins an das Polysaccharid bei einem pH gekoppelt, der so niedrig war wie etwa 7,4, eine wesentliche Menge wurde bei einem pH gekoppelt, der so niedrig war wie etwa 6,9, und eine kleine, jedoch wesentliche Menge wurde selbst bei einem pH gekoppelt, der so niedrig war wie etwa 5,7. Für die Bedingungen dieses Experimentes erschien ein pH von 8 optimal. Obwohl die Ergebnisse zeigen, dass der pH des Kopplungsschrittes wichtig ist, zeigen sie, dass das Koppeln über einen breiten pH-Bereich erfolgen kann. Da die Kopplungsreaktion bei einem pH von 5 so ineffizient ist, sollte das Stoppen gleichwohl bei einem pH von etwa 7 bis 8 geschehen.
Gesteigerte Mengen an Kopplungen können selbst bei einem niedrigen pH durch Steigern des Verhältnisses von Protein zu Polysaccharid, der Polysaccharidkonzentration, und/oder der Menge an verwendeten CDAP erhalten werden. Beispielsweise können durch die Verwendung von mehr Reagenz oder mehr Protein höhere Ausbeuten selbst bei einem pH von 7 erhalten werden. Die direkte Kopplung von Protein kann daher bei einem nahezu neutralen pH unter Vennrendung von CDAP zur Aktivierung des Polysaccharids erreicht werden.
17 deutet an, dass Phosphat ebenfalls inhibierend auf die Kopplungsreaktion wirken kann, was an der ionischen Interaktion oder dem leichten nukleophilen Charakter des Phosphats zurückgeführt werden kann. Die Steigerung der Menge an CDAP und des pHs während der Kopplung steigert gleichwohl das Verhältnis der Konjugation/die Ausbeute. Falls während der CDAP-Aktivierung Phosphat vorhanden ist, wird die Addition des Diamins inhibiert.
Phosphate von PRP und Pn6 können Inhibition verursachen, wie durch das folgende Experiment gezeigt. Zwanzig μl an CDAP (100 mg/ml in Acetonitril) wurden zu einer gevortexten Lösung von 2 mg Pn6 (Pneumococcus-Typ 6, einem Polyribitolphosphatpolysaccharid) (10 mg/ml in Wasser) zugegeben. Dreißig Sekunden später wurde Puffer (100 μl an 0,1 M Natriumborat oder 40 μl an 0,2 M TEA) zugegeben. Bei zwei Minuten wurden 100 μl an BSA (20 mg/ml) in 0,5 M HEPES, pH 8, zugegeben. Nach Inkubation über Nacht bei 4 °C wurde die Reaktion mit 100 μl an 0,5 M Ethanolamin in 0,75 M HEPES, pH 7,5, gestoppt, gefolgt von einer Gelfiltration auf einer S400HR-Säule (Pharmacia), die mit Salzlösung und 0,02% Azid äquilibriert wurde. Das Röhrchen des Peakleervolumens wurde auf Protein und Polysaccharid untersucht. Zu Vergleichszwecken wurde in Versuch 4 Dextran in der gleichen Weise derivatisiert. Die Ergebnisse werden in Tabelle 12 gezeigt.
Tabelle 12
Für Pn6 zusammen mit TEA-Puffer (Versuch 1) war die Ausbeute sehr gering. Als der pH mit Natriumborat gesteigert wurde (Versuche 2 und 3) stieg die Ausbeute an. Die gleichen Bedingungen ergaben viel höhere Ausbeuten für Dextran (siehe z. B. Versuch 4). Phosphat-basierte Polysaccharide, wie beispielsweise Pn6, benötigen daher eine Anpassung des pH und/oder des CDAP-Verhältnisses, um Konjugate in guten Ausbeuten herzustellen.
Das nächste Experiment zeigt, dass die durch die CDAP-Aktivierung gebildete Isohamstoffbindung stabil und robust ist. In diesem Experiment wurde ε-TNP-Lysin an Dextran über CDAP gekoppelt. Die Proben 1–5 wurden wie folgt erstellt:
1: 400 μl TNP/CDAP/dex + 100 μl Salzlösung (Kontrolle)
2: 400 μl TNP/CDAP/dex + 100 μl 2 M NaCl
3: 400 μl TNP/CDAP/dex + 100 μl 9 M GuHCl
4: 400 μl TNP/CDAP/dex + 100 μl Salzlösung (in Inkubator @ 37 °C umgesetzt)
5: 400 μl TNP/CDAP/dex + 100 μl Salzlösung (Kontrolle)
Man ließ die Proben über Nacht im Dunkeln reagieren, ausgenommen Probe 4, welche wie angedeutet umgesetzt wurde. Die Proben wurden anschließend auf einer P6-Kartusche in 10 mM Natriumborat bei 1,0 ml/Minute entsalzt. Die Fraktionen wurden bei OD366 ausgelesen und das Röhrchen des Peaks der Leertraktionen wurden untersucht. Die Ergebnisse werden unten in Tabelle 13 zur Verfügung gestellt.
Tabelle 13
Für jede Probe blieb das TNP : Dextran-Verhältnis unverändert, was andeutet, dass die Isoharnstoffbindung bei den Testbedingungen stabil war.
Biologische Aktivität von Konjugaten:
Um zu bestimmen, ob die CDAP-Aktivierung des Polysaccharids irgendwelche schädlichen Effekte auf seine Fähigkeit ausübt, Antikörperantworten zu induzieren, wurde seine biologische Aktivität in vitro getestet. BSA wurde entweder direkt an CDAPaktiviertes Pneumococcus-Polysaccharid Typ 14 konjugiert oder an Pneumococcus-Polysaccharid Typ 14 gekoppelt, das mit Hexandiamin derivatisiert wurde, gefolgt von einer lodacetylierung und einer Reaktion mit thioliertem Protein (Lees et al.). Jedes Konjugat wies ein Verhältnis von mg BSA/mg Pn14 auf. Inzucht-DBA/2-Mäuse wurden subkutan mit 50 μg BSA, entweder frei oder als ein Polysaccharidkonjugat in der Abwesenheit von Hilfsmitteln immunisiert. Die Seren wurden 14 und 28 Tage später gesammelt und Anti-BSA- und Anti-Pn14-Antikörpertiter wurden mittels ELISA bestimmt.
Weder nicht-konjugiertes BSA noch nicht-konjugiertes Pn14 stimulierten eine detektierbare primäre Antwort. Im Gegensatz dazu stimulierten die BSA-Pn14-Konjugate signifikante Antikörperantworten gegenüber beiderseits der Protein- und Polysaccharidkomponente ungeachtet davon, ob das Protein mittels indirekter Konjugation unter Verwendung eines Spacers oder mittels direkter Konjugation gekoppelt wurde. Mäuse, die mit BSA-Dextran immunisiert wurden, das unter Verwendung eines Spacers oder einer direkten Kopplung an CDAP-aktiviertes Dextran hergestellt wurden, ergaben Titer, die vergleichbar zu denjenigen waren, die erhalten wurden, wenn Konjugate unter Verwendung anderer chemischer Verfahren hergestellt wurden. Weiterhin zeigten TT-PRP-Konjugate, die unter Verwendung der CDAP-Aktivierung hergestellt wurden, in Ratten, die mit den Konjugaten immunisiert wurden, Anti-PRP-Antworten, die vergleichbar zu denjenigen waren, die in Ratten gezeigt wurden, die mit TT-PRP-Konjugaten immunisiert wurden, die unter Verwendung der CNBr-Aktivierung hergestellt wurden. Weiterhin zeigte Tetanus, das direkt an CDAPaktiviertes Pn14 konjugiert wurde, hohe Anti-Tetanus- und Anti-Pn14-Antikörperantworten; opsonische Assays deuteten an, dass diese Antikörper Schutz vermitteln.
Beispiel 7
Das Koppeln eines Hydrazid-derivatisierten Proteins an CDAP-aktiviertes Polysaccharid (Protein an den Aminogruppen derivatisiert).
Eine begrenzte Anzahl an Aminen auf BSA wurde mit Hydraziden wie folgt derivatisiert. 20 mg BSA (24 mg/ml in 75 mM HEPES, pH 5) wurde mit einem 20-fachen molaren Überschuss an SPDP (Prochem) umgesetzt. Nach 8 Stunden wurden 200 μl an 1 M Natriumacetat (pH 5) zugegeben, gefolgt von 25 μl an 1 M DTT, um das Thiol zu entschützen. Die Lösung wurde auf 2 P-6-Kartuschen in Reihe entsalzt, die mit 10 mM Natriumacetat, 0,1 M NaCl und 2 mM EDTA (pH 5) äquilibriert wurden, und das Proteinleervolumen wurde mit Hilfe einer Centricon 30-Vorrichtung auf ein Volumen von 1,05 ml konzentriert. Unter Verwendung von Ellman's Reagenz wurde bestimmt, dass 3,2 freie Thiole pro BSA vorhanden waren. 5 mg des Thiol-BSA wurden zurückbehalten und der verbleibende Rest durch Zugabe von 50 μl an 1 M HEPES (pH 6) auf pH 6 gebracht. 100 μl an 0,1 M E-Maleimidocaproinsäurehydrazid-HCl (Maleimid-Hydrazidheterofunktionelles Reagenz: EMCH, Prochem, Rockford, Illinois) in Dimethylformamid wurden zugegeben. Nach Reaktion über Nacht wurde das Protein entsalzt und erneut konzentriert. Die Proteinkonzentration wurde über die Absorption bestimmt. Um die Anwesenheit von freien Hydrazidgruppen zu zeigen, wurde ein TNBS-Assay verwendet (z. B. gab es dabei eine Absorption bei 540 nm, die im nativen Protein nicht vorhanden ist).
Da es dort nur 4,2 Thiole pro BSA gab, konnte das finale Produkt theoretisch nicht mehr als diese Anzahl an freien Hydraziden enthalten. BSA besitzt eine Gesamtanzahl an 60 Aminogruppen; das BSA wurde daher minimal modifiziert. Dieses Material wurde BSA-S-Nz genannt.
BSA-S-Hz oder monomeres BSA (zum Vergleich; hergestellt durch Gelfiltration auf einer S100HR-Säule) wurde mit CDAP-aktiviertem Dextran wie folgt umgesetzt. 400 μl an T2000-Dextran (10 mg/ml in H₂O) wurde durch die Zugabe von 15 μl CDAP (100 mg/ml in Acetonitril) aktiviert, 30 Sekunden später gefolgt von 30 μl 0,2 M TEA. Bei 2,5 Minuten wurden 200 μl 1 M Natriumacetat (pH 5) zugesetzt, um den pH der Reaktionsmischung auf 5 zu bringen. 300 μl des CDAP-aktivierten Dextrans wurden anschließend zu 2 mg an BSA-S-Hz oder monomerem BSA (90 μl bei 22,3 mg/ml in 10 mM Natriumacetatpuffer) zugegeben. Der finale pH betrug 5,1. Nach einer Übernachtreaktion wurden die Proben mit 0,5 M Ethanolamin in 0,75 M HEPES (pH 7,5) gestoppt und mit Hilfe einer Gelfiltration auf einer S300HR-Säule (1 × 50 cm, mit Salzlösung und Azid äquilibriert) fraktioniert. Die Protein- und Polysaccharidanalyse zeigte, dass bei pH 5 BSA-S-Hz ein Konjugat mit 0,51 mg BSA pro mg Dextran erzielt, während monomeres BSA keine konjugierten Produkte erzielte.
Konjugation von Diphteria-Toxoid (DT), das mit Hydrazid derivatisiert wurde, an CDAP-aktiviertes Pneumococcus-Typ 14 (Pn14).
DT derivatisiert auf Carboxylgruppen: DT wurde mit ADH auf Carboxylgruppen wie folgt derivatisiert. Zu 6,95 mg an DT in 0,5 M 1-Methylimidazol (pH 6) wurden 0,5 ml an 0,5 M Adipindihydrazid (ADH) im gleichen Puffer zugegeben, gefolgt von 15 mg an 1-Ethyl-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDC) unter Rühren. Nach Inkubation über Nacht wurde das Protein auf 2 P-6-Kartuschen in Reihe entsalzt, die und mit 10 mM Natriumacetatpuffer (pH 5) äquilibriert wurden und mit einer Centricon 50-Vorrichtung auf 17,1 mg/ml aufkonzentriert. Ein TNBS-Assay deutete die Anwesenheit von Hydraziden an. Dieses Material wurde DT/EDC/Hz genannt.
Pneumococcus-Typ 14 (erhalten von SmithKline Beecham) wurde über Gelfiltration auf einer S400HR-Säule (2,6 × 100 cm, mit 0,1 M Kaliumphosphat, pH 7,2, äquilibriert) fraktioniert. Die Fraktionen mit extrem hohem und niedrigem molekularen Gewicht wurden getrennt und der zentrale Schnitt aufkonzentriert und in Salzlösung dialysiert. Dieses Material wurde Pn14 (M) genannt.
250 μl an Pn14 (M) (10,1 mg/ml) wurde durch Zugabe von 15 μl an CDAP (100 mg/ml in Acetonitril) aktiviert, 30 Sekunden später gefolgt von 30 μl an 0,2 M TEA. Bei 2,5 Minuten wurden 150 μl an 1 M Natriumacetat (pH 5) zugegeben, um den pH zu reduzieren und anschließend wurden 150 μl an DT/EDC/Hz (2,5 mg) zugegeben. Nach einer Reaktion über Nacht wurde die Reaktionsmischung mit 100 μl an 0,5 M Ethanolamin in 0,75 M HEPES (pH 7,5) gestoppt, gefolgt von einer Gelfiltration auf einer S300HR-Säule (1 × 50 cm, mit Salzlösung äquilibriert). Die Analyse zeigte, dass DT gekoppelt hat.
DT derivatisiert auf Aminogruppen: DT wurde in ähnlicher Weise wie BSA-S-Hz derivatisiert. 5 mg an DT (13,9 mg/ml) wurde mit einem 20-fachen molaren Überschuss von SPDP umgesetzt, entsalzt, mit einer Centricon 30-Vorrichtung aufkonzentriert, mit 50 mM DTT bei pH 5 für 1 Stunde behandelt und anschließend entsalzt und erneut konzentriert. Die Analyse mit Ellman's Reagenz deutete die Anwesenheit von freien Thiolgruppen an. Das thiolierte Toxoid wurde anschließend mit einem großen Überschuss von EMCH umgesetzt, entsalzt und erneut konzentriert. Ein TNBS-Assay deutete die Anwesenheit von Hydraziden an. Dieses Material wurde DT-S-Hz genannt.
DT-S-Hz wurde an Pn14, das der Größe nach fraktioniert wurde, wie folgt gekoppelt. 4 mg an Pn14 (M) in 1,6 M NaCl wurde mit 20 μl CDAP (100 mg/ml in Acetonitril) aktiviert, 30 Sekunden später gefolgt von 40 μl 0,2 M TEA. Nach 2,5 Minuten wurden 50 μl an 1 M Natriumacetat (pH 5) zugegeben. 3,9 mg an DT-S-Hz (in 77 mM Natriumacetat, pH 5) wurden anschließend zugegeben; ein pH-Meter wurde verwendet, um zu bestimmen, dass der resultierende pH 5,1 betrug. Nach einer Reaktion über Nacht bei 4 °C wurde die Reaktion durch Zugabe von 100 μl an 0,5 M Ethanolamin in 0,75 M HEPES gestoppt, gefolgt von einer Gelfiltration auf einer S400HR-Säule (1 × 50 cm, mit Salzlösung und Azid äquilibriert). Die Analyse zeigte, dass DT gekoppelt hat.
Reaktion von Hydraziden gegen Amine bei niedrigem pH.
CDAP-aktiviertes Polysaccharid wurde durch Zugabe von 5 mg CDAP (100 mg/ml in Acetonitril) zu 5 mg an Pn14 (10 mg/ml in Wasser) hergestellt. 30 Sekunden später wurden 300 μl an 0,2 M TEA zugegeben. Bei 2 Minuten, 30 Sekunden wurde der pH auf etwa 5 durch Zugabe von 100 μl NaAc, pH 5, erniedrigt. Das CDAP-aktivierte Polysaccharid wurde anschließend zu entweder 0,2 M ADH oder Hexandiamin bei einem pH von etwa 5 zugegeben. Nach einer Reaktion über Nacht wurde die Lösung in Acetatpuffer (pH 5) entsalzt und auf Amine oder Hydrazide unter Verwendung von TNBS untersucht. Nur die Lösung, die Hydrazide enthielt, war TNBS-positiv. Diese Probe wurde auf einer Centricon 50-Vorrichtung aufkonzentriert und auf einer P6-Kartusche ein zweites Mal entsalzt. Das Verhältnis von Hydrazid zu Dextran war unverändert, was andeutete, dass ausschließlich nicht-reagierte Reagenzien entfernt wurden. Die Tatsache, dass die Hexandiamingruppe TNBS-negativ war, deutete an, dass keine Derivatisierung stattfand.
Als Kontrolle wurde CDAP-aktiviertes Dextran mit ADH oder Hexandiamin in 0,75 M HEPES (pH 7,5) umgesetzt. Beide Proben waren TNBS-positiv.
Zusammenfassung:
Das Verfahren der Erfindung unter Verwendung von CDAP stellt einen reproduzierbaren Ansatz dar, der verwendet werden kann, um verschiedene klinisch relevante Polysaccharide zu aktivieren, von denen einige sensitiv auf einen hohen pH reagieren. Die Aktivierung geschieht schnell, so dass die bei einem hohen pH aufgewendete Zeit minimiert wird. Das Verfahren stellt hochimmunogene Protein-Polysaccharid-Konjugate her, welche in Mäuse humorale Antikörper gegen beiderseits das Protein und die Polysaccharidkomponenten selbst in der Abwesenheit von Hilfsstoffen stimulieren können.
Die Variablen, von denen festgestellt wurden, dass sie den Grad der Polysaccharid-Aktivierung gründlich beeinflussen, sind die Konzentrationen an CDAP und Polysaccharid, sowie der pH. Ein bevorzugter pH für die Konjugation ist etwa 7 bis etwa 9, noch bevorzugter etwa 7,4 bis etwa 8,0, was einen Bereich darstellt, bei dem die meisten Polysaccharide stabil sind. Andere pH-Bereiche, z. B. ein Bereich von etwa 7 bis etwa 10, kann für andere Polysaccharide eher geeignet sein.
Durch Veränderung der Polysaccharid- und/oder CDAP-Konzentration kann die Effektivität der Derivatisierung bis auf 50% gesteigert werden, wie im Vergleich zu den 1–2%, die mit CNBr gefunden wurden. Weiterhin kann ein Produkt mit mehr als 50 NH₂-Gruppen pro 100 kDa an Polysaccharid unter den bevorzugten Bedingungen erreicht werden. Das Verfahren der Erfindung ist nicht von der Anwesenheit von tertiären Aminen abhängig und wurde durch frühere Experimentatoren mittels Experimentieren mit CDAP beschrieben. Die Aktivierung des Polysaccharids geschieht schnell. In ähnlicher Weise geschieht die Proteinkonjugation an das aktivierte Polysaccharid schnell.
Die Erfindung bietet die Vorteile der Reproduzierbarkeit, schneller Reaktivität, und vielleicht am meisten bemerkenswert, der Fähigkeit zur einfachen Veränderung der Verhältnisse von Protein zu Polysacchariden. Beispielsweise können Konjugate mit verschiedenen Verhältnissen von Protein zu Polysaccharid durch Veränderung der Konzentration von CDAP und/oder der Polysaccharidkonzentration und/oder der Proteinkonzentration erreicht werden. Dies kann einen Ansatz zur Verfügung stellen, nicht nur die Rolle des Verhältnisses von Protein : Polysaccharid bei der Beeinflussung der Größe der Antikörperantwort auf das Konjugat zu untersuchen, sondern ebenfalls die Rolle der dreidimensionalen Struktur bei einem gegebenen Verhältnis von Protein zu Polysaccharid.
Die Immunogeniät des Protein-Polysaccharid-Konjugates, das unter Verwendung von CDAP hergestellt wurde, ist signifikant größer als die Antwort, die durch jede der nichtkonjugierten Komponenten gezeigt wurde. Weiterhin ist der erzeugte Antikörper mit dem nicht-konjugierten Protein reaktiv und die Antwort kann durch Verwendung des nichtkonjugierten Proteins wie auch des konjugierten Proteins verstärkt werden. Dies legt nahe, dass jegliche chemische Änderung des Proteins während der Konjugation keinen schädlichen Effekt auf seine Fähigkeit ausübt, Antikörper mit einer Reaktivität auf das native Protein zu stimulieren, noch auf seine Fähigkeit, B-Zellen mit einer Reaktivität für das nicht-konjugierte Protein zu stimulieren.
Weiterhin können CDAP-aktivierte Polysaccharide in der Herstellung für die Konjugation von Anti-Ig-Antikörpern verwendet werden. Anti-Ig-Dextran-Konjugate induzieren eine etwa 100- bis 1000-fach größere Aktivierung von B-Zellen im Vergleich zu nichtkonjugiertem Ig. Anti-Ig-Dextrankonjugate, die unter Verwendung der direkten Konjugation an CDAP-aktiviertes Dextran hergestellt wurden, sind so effektive B-Zell stimulierende Reagenzien, wie die Konjugate, die unter Verwendung einer anderen Heteroligationskopplung an AECM-Dextran hergestellt wurden.
CDAP ist für die Herstellung einer Vielzahl von immunologischen Reagenzien nützlich wie beispielsweise biotinylierten Polysacchariden für ELISA und ELISA-Spot-Antigenen und TNP-Polysacchariden (z. B. TNP-dex, TNP Ficoll) für Modell Ti-2-Antigene.
Das erfindungsgemäße Verfahren, das CDAP verwendet, um immunogene Konstrukte wie beispielsweise Polysaccharid-basierte Konjugate herzustellen, bietet daher viele Vorteile für die gegenwärtig vertügbare Technologie zur Herstellung immunogener Konstrukte.

Claims

Ein Vertahren zur Herstellung eines immunogenen Konstruktes umfassend: (a) Aktivierung von mindestens einem ersten Kohlenwasserstoff enthaltenden Rest ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polysacchariden, Oligosacchariden, Disacchariden und Monosacchariden mit einem organischen cyanylierenden Reagenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1-Cyano-4-(dimethylamino)-pyridin-tetrafluoroborat, Ncyanotriethyl-ammonium-tetrafluoroborat, und p-Nitrophenylcyanat, um einen aktivierten Kohlenwasserstoff zu bilden; (b) Derivatisieren eines zweiten Restes ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Peptiden, und Haptenen mit einem Thiol oder einem Hydrazid als nukleophiler Gruppe; und (c) Koppeln des genannten aktivierten Kohlenwasserstoffes direkt oder indirekt an den derivatisierten zweiten Rest, um ein immunogenes Konstrukt zu bilden das fähig ist, eine Immunantwort zu stimulieren.
Ein Vertahren gemäß Anspruch 1, wobei das genannte organische cyanylierende Reagenz 1-Cyano-4-(dimethylamino)-pyridin-tetrafluoroborat ist.
Ein Vertahren gemäß Anspruch 2, wobei die genannten ersten und zweiten Reste wasserlöslich sind.
Ein Vertahren gemäß Anspruch 2, wobei die genannte Aktivierung bei einem pH von 8 bis 10 durchgeführt wird und das Koppeln bei einem pH von 7 bis 9 durchgeführt wird.
Ein Vertahren gemäß Anspruch 2, wobei die genannte Aktivierung in der Anwesenheit von Triethylamin durchgeführt wird.
Ein Vertahren gemäß Anspruch 1, wobei das Koppeln indirekt durch das kovalente Verbinden des ersten Restes an ein bifunktionelles oder heterobifunktionelles Spacerreagenz, und durch das kovalente Verbinden des derivatisierten zweiten Restes an das Spacerreagenz bewirkt wird.
Ein Vertahren gemäß Anspruch 6, wobei das genannte Spacerreagenz aus der Gruppe ausgewählt wird bestehend aus Ethylendiamin, 1,6-Hexandiamin, Adipindihydrazid, Cystamin, Glyzin und Lysin.
Ein Vertahren gemäß Anspruch 1, wobei der erste Rest ein Polysaccharid und der zweite Rest ein Protein ist.
Ein Vertahren gemäß Anspruch 8, wobei das Polysaccharaid ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Dextran, Polysaccharid aus Pneumococcus, Polysaccharid aus Haemophilus influenza, Polysaccharid aus Streptococcus Gruppe A, Polysaccharid aus Streptococcus Gruppe B, und Polysaccharid aus N. meningitidis.
Ein Vertahren gemäß Anspruch 1, wobei der erste Rest ein wasserlösliches virales oder ein bakterielles Polysaccharid ist.
Ein Vertahren gemäß Anspruch 1, wobei der zweite Rest ein wasserlösliches Protein ist.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der zweite Rest ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus bovinem Serum Albumin, aus Pertussis Toxoid, aus Tetanus Toxoid, aus einem aus Malaria abgeleiteten Peptid, aus einem Antikörper, aus einem Toxoid, und aus einem Lipoprotein.
Ein Vertahren gemäß Anspruch 1, wobei das immunogene Konstrukt ein Konjugat ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus PT-Pn, PT-PRP, IT-Pn, Antikörper-Dextran und Peptid-TT-Pn.
Ein Vertahren gemäß Anspruch 1, wobei die genannte nukleophile Gruppe eine Hydrazidgruppe ist.
Ein Vertahren gemäß Anspruch 1, wobei das genannte Koppeln bei einem pH von weniger als etwa 8 durchgeführt wird.
Ein Vertahren gemäß Anspruch 6, wobei das genannte Koppeln bei einem pH von weniger als etwa 8 durchgeführt wird.
Ein Vertahren zur Herstellung eines Impfstoffes umfassend die Schritte des Herstellens eines immunogenen Konstruktes gemäß einem der Ansprüche 1–16 und das Kombinieren des erhaltenen Produktes mit einer geeigneten Menge an einem Träger, um so eine geeignete Verabreichungsform für den Patienten bereitzustellen.