JP2008101022A - 有機シアン化試薬により活性化された可溶性炭水化物を使用する免疫原性構築物の製造 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、少なくとも1つの第1炭水化物含有成分をCDAPで活性化して活性化された炭水化物を形成し、そして前記活性化された炭水化物を第2成分に直接的または間接的にカップリングすることによって免疫原性構築物を製造する方法に関する。好ましくは、第1成分は多糖でありそして第2成分はタンパク質である。免疫原性構築物は、この方法により、第1成分および第2成分の直接または間接の結合により製造される。
【選択図】なし
Description
これは1995年3月22日提出の米国特許出願第08/408,717号の一部継続出願であり、後者は1993年9月22日提出の米国特許出願第08/124,491号の一部継続出願である。
本発明は、米国政府の目的のために、特許所有権者に特許使用料を払わないで製造し、実施許諾し、そして使用されることができる。
ある種の物質、例えば、破傷風トキソイドは免疫応答を固有に誘発することができ、そして修飾せずにワクチンで投与することができる。しかしながら、他の重要な物質は免疫原性ではなく、そして免疫原性の分子または構築物に変換された後、免疫応答を誘発することができる。
本発明の目的は、免疫原性構築物を製造する温和な方法を達成することである。他の目的は、炭水化物およびタンパク質の構造の完全性を維持しかつ化合物中のエピトープを保存する免疫原性構築物を作る方法を達成ことである。追加の目的は、実施が容易であり、信頼性があり、そして容易に再現可能である免疫原性構築物を製造する方法を達成することである。他の目的は、種々の多糖とともに使用できる免疫原性構築物を製造する方法を開発することである。追加の目的は、可溶性複合ワクチンを製造する好都合な方法を得ることである。他の目的は、容易に大規模化される方法を達成することである。本発明のこれらおよび他の目的は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。
有機シアン化試薬(これは一般に式R−CNまたは{R+ −CN}X- で表すことができ、ここでRは有機成分であり、そしてXは対イオンである)を使用する炭水化物の活性化についての一般化スキームは、第1図に示されている。第2図は、タンパク質への活性化された炭水化物の結合を図解する。
チャート
ジフテリアワクチン
破傷風(サブユニット)ワクチン
破傷風ワクチン
インフルエンザ菌(H.influenzae)b型(リン酸ポリリボース)
肺炎連鎖球菌(S.pneumoniae)、すべての血清型
大腸菌(E.coli)、エンドトキシンまたはJ5抗原(LPS、脂質A、およびゲンタビオース)
大腸菌(E.coli)、O多糖(血清型特異的)
クレブシエラ(Klebsiella)、多糖(血清型特異的)
黄色ブドウ球菌(S.aureus)、5および8型(血清型特異的および普通の防御抗原)
表皮ブドウ球菌(S.epidermidis)、血清型多糖I、II、およびIII(および普通の防御抗原)
髄膜炎菌(N.meningitidis)、血清型特異的または
ポリオワクチン
おたふくかぜ、麻疹、風疹のワクチン
RSウイルス
狂犬病
A、B、C型肝炎、およびその他
ヒト免疫不全ウイルスIおよびII(GP120、GP41、GP160、p24、およびその他)
単純ヘルペス1および2型
CMV(サイトメガロウイルス)
EBV(エプスタイン−バールウイルス)
水痘/帯状ヘルペス
マラリア
結核
カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、他のカンジダニューモシティス・カリニ(Pneumocystis carinii)
マイコプラズマ
インフルエンザウイルスAおよびB
アデノウイルス
グループAストレプトコッカス(streptococcus)
グループBストレプトコッカス(streptococcus)、
緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)(血清型特異的)
ライノウイルス
パラインフルエンザエ、1、2、および3型
コロナウイルス
サルモネラ(Salmonella)
シゲラ[赤痢菌](Shigella)
ロタウイルス
エンテロウイルス
トラコーマクラミジア(Chlamydia trachomatis)およびニューミニエ(pneumoniae)(TWAR)クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)
スペーサーを使用する炭水化物含有成分の誘導化
材料:
CDAP、ピリジン、ヘキサンジアミン、ホウ酸ナトリウム、HEPES、およびトリエチルアミン(TEA)をアルドリッヒ(Aldrich)(ウィスコンシン州ミルウォーキー)から購入した。炭水化物含有成分、T2000デキストラン(平均分子量2000kDaを有する)は、ファーマシア(Pharmacia)(ニュージャージイ州パルシパニイ)から入手した。
トリニトロベンゼンスルホネート(TNBS)および11,000m-1の吸光係数を366nmにおいて使用して、アミノ基を測定した。Franci et al.、J.Imm. Methods、86:155(1986)。M.Monsigny et al.、Anal.Chem.、175:525(1988)の方法により、標準としてT2000デキストランを使用して、炭水化物をアッセイした。
下記の実施例により、本発明の誘導化反応において使用する化合物の重要性を証明する。最終の複合体中のアミノ基は炭水化物に共有結合されており、そしてアミノ基の存在は人工物または最終生成物の中への試薬の「キャリオーバー」のためではないことを、結果は示す。実施した実験について、試薬の省略または置換は表2に示す通りであった。
この実験は、炭水化物を誘導化してアミノ基を高い比および低い比で導入するためにCDAPを使用できることを証明する。デキストランT2000をモデルの炭水化物として使用した。デキストランはグルコースモノマーから構成されたポリマーである。
CDAPを使用する結合反応はタンパク質濃度を推定するために通常使用される波長280nmにおいて多少の吸収を引き起こしたので、放射性標識化タンパク質をデキストランに直接結合させた。タンパク質の収率および回収を決定した。
PT−Pn14複合体の製造
これらの実験の目的は下記の通りである:(1)低分子量の形態から高分子量の形態へのタンパク質の転換が炭水化物へのタンパク質の直接的結合の結果であることを証明すること;(2)1つの特定の組の条件下に、タンパク質の結合に必要なシアン化試薬の最小量を決定すること;および(3)臨床的に関係する複合体を本発明の方法を使用して製造できることを証明すること。
各管は氷上において250μgのPn14(50μl)を含有した。時間ゼロにおいて、表に示す種々の量のCDAPを添加し、30秒後、25μlのTEAを添加した。2分後、1mlのPTを添加した。約1時間後、100μlのグリシン溶液を添加した。
この系列において、Pn14多糖の代わりに150μlの10mg/mlのモノマーのグルコースの溶液を使用した。実施例1に類似する条件を使用したが、ただしホウ酸塩の代わりにPTをHEPES(pH7.5、0.075M)中で調製した。また、25μlのTEAの代わりに20μlを使用した。これらの条件は下記のものを生じた:
形態%
1 PTのみ、CDAPまたはTEAなし <20%
2 CDAP、TEA(グルコースなし);+PT 約0
3 グルコース、CDAP、TEA;+PT 約0
ヘキサンジアミンで誘導化されたPn14を下記のようにして調製した。10μlのCDAP(アセトニトリル中の100mg/ml)を添加した(193モルのCDAP/100kDaの多糖)。30秒後、;20μlのTEA(0.2M)を添加した。合計2.5分後、300μlの0.1Mのホウ酸ナトリウム(pH9.1)中の0.5Mのヘキサンジアミンを添加した。1時間後、この溶液を水中に透析し、濾過し、P6DG(BioRad)カラム上で生理食塩水中に脱塩した。空隙体積をプールし、セントリコン(Centricon)30装置(Amicon)で濃縮した。それは33アミノ基/100kDaのPn14多糖を有することが決定された。
CTEAを使用するPn14へのタンパク質の直接的結合:
Kohn et al.Anal.Biochem.115:375(1981)に記載されているように、CTEAは副反応がCDAPより少ないという利点を提供し、より純粋な生成物に導く。その欠点は、それが湿分感受性であり、閉じた容器中で秤量しなくてはならず、そして貯蔵液として生ずる調製できないということである。
1mlのPn14(生理食塩水中の5mg/ml)を0℃に保持する。CTEA(入手先、Aldrich Chemical、ウイスコンシン州ミルウォーキー)を乾燥窒素下に貯蔵する。1mgのCTEAを閉じた秤量容器中で秤量し、冷却し、激しく混合したPn14に添加する。直ちに20μlをTEA(水中の0.2M)に混合しながら添加する。1時間後、この溶液を生理食塩水中に完全に透析し、滅菌濾過する。187モルのCTEA/100kDaのPn14の比を使用するので、ほぼ18アミン/100kDaのPn14を有する複合体が生成する。
インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)多糖(PRP)への百日咳トキソイドの直接的結合
平均分子量350kDaのPRPを、マサチュセッツ・パブリック・ヘルス・バイロジカル・ラボラトリー(Massachusetts Public Health Biological Laboratory)から入手した。百日咳トキソイドを同一源から入手した。15μlのCDAP(100mg/ml)を氷上の100μl(2mg)のPRPに添加した。30秒後、30μlのTEAを添加した。これは319モルのCDAP/100kDのPRPを表した。さらに2分後、0.75mlの百日咳トキソイド(1.1mg)を添加した。40分後、200μlの1Mのグリシン(pH5.0)を添加して反応をクエンチした。さらに1時間後、この溶液を生理食塩水と平衡化させたS400SFゲル濾過カラム上に通過させた(第7図参照)。空隙体積をプールし、滅菌濾過した。生成物は1.1のPT/100kDaのPRPを有すると決定され、全体の収率は68%であった。
CDAP化学を使用して製造されたワクチンとして有効な免疫原性構築物CDAPおよび2官能性試薬を使用する結合
簡単に述べると、配偶子特異的タンパク質pfs25からのマラリア誘導ペプチド、p28(CNIGKPNVQDDQNK)を破傷風トキソイド(TT)に結合した。p28はマラリア伝達ブロッキング抗体を誘導することが示された。次いでCDAPを使用してp28−TTを肺炎球菌(Pneumococcal)14型(Pn14)多糖に結合した。
Pn14(入手先、American Tissue Type Collection、ATTC)は高分子量を有した(約106 ダルトン)。p28−TTを下記のようにしてPn14に直接的に結合した。CDAP(アセトニトリル中の100mg/mlの貯蔵液から10μl)をPn14(150μlの生理食塩水中の1.1mg)。30秒後、20μlのトリエチルアミン(0.5M)を添加した。2分後、0.55mg(0.8mlの生理食塩水中の)のp28−TTを添加し、そして1時間後、反応を200μlの1.0Mのグリシン(pH5)でさらに1時間クエンチした。次いで生理食塩水と平衡化させたS400SFゲル濾過カラム上に複合体を通し、複合体を含有する空隙体積をプールした。第9図は、p28−TTの事実上すべてが空隙体積の中に複合体の形態で見出されたことを示す。
5匹のDBA/2マウスのグループを生理食塩水中の10μgのp28−TTまたは(p28−TT)−Pn14複合体で静脈内免疫化し、3週後に採血し、そして血清をELISA(酵素結合イムノアッセイ)により組換えpfs25タンパク質に対する活性についてアッセイした。ペプチドp28をpfs25から誘導化する。マウスの他の組をアジュバントの明礬(Imject、Pierce Chemical Co.、イリノイ州ロックフォード)で沈降させた同一抗原で免疫化した。
関係する出願と一致して、表7は高分子量の複合体のみがすぐれた抗タンパク質力価引き出したことを示す。
CDAPを使用して製造した生物学的に活性な多価タンパク質複合体
CDAPを使用してタンパク質を多糖に直接カップリングして製造した複合体が多価生成物(これは関係する出願に記載されているように増強された免疫原性を有する)を生ずることができること、およびこの方法が生物学的活性を保存するために十分に温和であることができることを証明するために、モノクローナル抗体とデキストランとの種々の複合体を製造した。これらの実験において、Bリンパ球上の膜IgDと架橋しそして増殖を誘発する抗IgD抗体とともにモノクローナル抗体Hδa /1を使用した(Brunswick et al.Journal of Immunol.140:3364(1988))。Brunswick et al.が記載するように、高分子量ポリマー、例えば、2000kDaのデキストランへのHδa /1の多数のコピーの結合(Hδa /1−AECMデキストラン)は1000倍低い濃度においてB細胞の増殖を誘発し、そして未結合Hδa /1より高いレベルの増殖を誘発した。Brunswick et al.簡単な、わかりやすいが、多工程の、多くの日数を要する手順を複合体の製造に必要とした。アミノエチルカルボキシメチルデキストラン(AECMデキストラン)をまずBrunswick et al.に記載されているように製造し、次いでヘテロライゲーション化学を使用してHδa /1を炭水化物にカップリングした。
特記しない限り、これらの実験におけるプロトコールは一般に下記の通りであった。トリエチルアミン(TEA)、アセトニトリル、硫酸(H2 SO4 )、レゾルシノール、ヘキサンジアミン、ホウ酸ナトリウム、およびHEPESをアルドリッヒ(Aldrich)から入手し、そしてそれらは試薬等級またはそれよりすぐれていた。N−シアノ−4−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート(CDAP)をシグマ(Sigma)またはリサーチ・オーガニックス(Research Organics)(オハイオ州クレブランド)から購入した。トリニトロベンゼンスルホン酸(TNSS)をコッダック・ケミカルス(Kodak Chemicals)から入手した。ミレックス(Millex)フィルターをミリポア・コーポレーション(Millipore Corp.)から入手した。
従来報告された方法よりも急速、温和、好都合、そして安全である条件下に、多糖のCDAP活性化を使用して複合体を製造できるかどうかを決定するために、実験を実施した。プロトタイプの多糖として、高分子量デキストラン(T2000デキストラン、Pharmacia)を種々の実験条件下にCDAPで活性化した。
アミンによる誘導化のように、多糖に対するタンパク質の結合の程度は多糖の活性化に使用されたCDAPの量に依存した。第12図に示すように、10mg/mlのデキストランの濃度において、CDAP/デキストランの比は生成物のBSA/デキストランの比とともに直線的に増加した。タンパク質および/または多糖の濃度が増加した場合、より低いCDAP/デキストラン比においてさえ同様なBSA/デキストラン比をまた観察することができた。
1: 400μlのTNP/CDAP/dex+100μlの生理食塩水(対照)
2: 400μlのTNP/CDAP/dex+100μlの2MのNaCl
3: 400μlのTNP/CDAP/dex+100μlの9MのGuHCl
4: 400μlのTNP/CDAP/dex+100μlの生理食塩水(37℃においてインキュベーター中で反応させた)
5: 400μlのTNP/CDAP/dex+100μlの生理食塩水(対照)
複合体の生物学的活性
多糖のCDAP活性化が抗体の応答を誘発するその能力に有害効果を有するかどうかを決定するために、in vitroにおけるその生物学的活性を試験した。BSAをCDAP活性化肺炎球菌(Pneumococcal)14型多糖に直接的に結合するか、またはヘキサンジアミンで活性化された肺炎球菌(Pneumococcal)14型多糖にカップリングし、次いでヨードアセチル化し、チオール化タンパク質と反応させた(Lees et al.)。各複合体はBSAのmg/Pn14のmgのある比を有した。同系交配DBA/2マウスをアジュバントの非存在において50μgのBSAで、遊離または多糖複合体として、皮下免疫化した。血清を14および28日後に集め、抗BSAおよび抗Pn14抗体力価をELISAにより測定した。
CDAP活性化多糖へのヒドラジド誘導化タンパク質のカップリング(アミノ基上で誘導化されたタンパク質)
BSA上の制限された数のアミンを下記のようにしてヒドラジドで誘導化した。20mgのBSA(75mMのHEPES、pH5、中の24mg/ml)を20倍モル過剰のSPDP(Prochem)と反応させた。8時間後、200μlの1Mの酢酸ナトリウム(pH5)を添加し、次いで25μlの1MのDTTを添加してチオールを脱保護した。この溶液を直列の2つのP−6カートリッジ(10mMの酢酸ナトリウム、0.1MのNaClおよび2mMのEDTA(p5)と平衡化させた)上で脱塩し、そして空隙体積のタンパク質をセントリコン(Centricon)30装置で1.05mlの体積に濃縮した。エルマン(Ellman)試薬を使用して、3.2遊離チオール/BSAが存在することが測定された。5mgのチオール−BSAを貯蔵し、そして残部を50μlの1MのHEPES(pH6)の添加によりpH6とした。100μlのジメチルホルムアミド中の0.1MのE−マレイミドカプロン酸ヒドラジド−HCl(マレイミド−ヒドラジドヘテロ官能性試薬;EMCH、Prochem、イリノイ州ロックフォード)を添加した。一夜反応させた後、タンパク質を脱塩し、再び濃縮した。タンパク質濃度を吸収から測定した。TNBSアッセイを使用して、遊離ヒドラジド基の存在を証明した(例えば、540nmにおける吸収が存在し、自然タンパク質において存在しなかった)。
BSA−S−HzまたはモノマーのBSA(比較;S100HRカラム上のゲル濾過により調製された)を、下記のようにして、CDAP活性化デキストランと反応させた。15μlのCDAP(アセトニトリル中の100mg/ml)を添加することによって、400μlのT2000デキストラン(H2 O中の10mg/ml)を活性し、次いで30秒後、30μlの0.2MのTEAを添加した。2.5分後、200μlの1Mの酢酸ナトリウム(pH5)を添加して、反応混合物のpHを5にした。次いで300μlのCDAP活性化デキストランを2mgのBSA−S−HzまたはモノマーのBSAに添加した(10mMの酢酸ナトリウム緩衝液中の22.3mg/mlにおいて90μl)。最終pHは5.1であった。一夜反応させた後、試料を0.75MのHEPES(pH7.5)中の0.5Mのエタノールアミンでクエンチし、次いでS300HRカラム(1×50cm、生理食塩水およびアジドと平衡化させた)上のゲル濾過により分画した。タンパク質および多糖の分析により、pH5において、BSA−S−Hzは0.51mgのBSA/mgのデキストランと複合体を生じたが、モノマーのBSAは結合生成物を生じないことが示された。
カルボキシル基上で誘導化されたDT:DTを下記のようにしてADHでカルボキシル基において誘導化した。0.5Mの1−メチルイミダゾール(pH6)中の6.95mgのDTに、0.5mlの同一緩衝液中の0.5Mのアジピン酸ジヒドラジド(ADH)を添加し、次いで混合しながら15mgの1−エチル−(3−ジメチルアミノプロピル)カーボジイミド塩酸塩(EDC)を添加した。一夜インキュベートした後、タンパク質を直列の2つのP−6カートリッジ(10mMの酢酸ナトリウム(pH5)と平衡化させた)上で脱塩し、セントリコン(Centricon)50装置で17.1mg/mlに濃縮した。TNBSアッセイはヒドラジドの存在を示した。この物質をDT/EDC/Hzと表示した。
5mgのCDAP(アセトニトリル中の100mg/ml)を5mgのPn14(水中の10mg/ml)に添加することによって、CDAP活性化多糖を調製した。30秒後、300μlの0.2MのTEAを添加した。2分後、100μlのNaAc、pH5、の添加により、pHを約5に低下させた。次いでCDAP活性化多糖を0.2MのADHまたはヘキサンジアミンに約pH5において添加した。一夜反応させた後、この溶液を酢酸塩緩衝液(pH)中で脱塩し、TNBSによりアミンまたはヒドラジドについてアッセイした。ヒドラジドを含有する溶液のみがTNBS陽性であった。この試料をセントリコン(Centricon)50装置で濃縮し、2回目にP6カートリッジ上で脱塩した。ヒドラジド/デキストラン比は未変化であり、未反応試薬のみが除去されたことを示した。ヘキサンジアミン試料がTNBS陽性であったという事実は、誘導化が起こらなかったことを示した。
CDAPを利用する本発明の方法は、あるものが高いpHに対して感受性である、種々の臨床的に関係する多糖を活性化するために使用できる再現性あるアプローチを提供する。活性化は急速であるので、高いpHにおける消費時間は最小である。この方法は、タンパク質および多糖の双方の成分に対する体液性抗体をマウスにおいてアジュバントの非存在においてさえ刺激できる、高度に免疫原性のタンパク質−多糖複合体を生産する。
Claims (30)
- 工程:
(a)少なくとも1つの第1炭水化物含有成分を有機シアン化試薬で活性化して活性化された炭水化物を形成し、そして
(b)前記活性化された炭水化物を第2成分に直接的または間接的にカップリングして、免疫応答を刺激することができる免疫原性構築物を形成する、
を含んでなる免疫原性構築物を製造する方法。 - 前記有機シアン化試薬が1−シアノ−4−(ジメチルアミノ)−ピリジニウムテトラフルオロボレート、N−シアノトリエチル−アンモニウムテトラフルオロボレート、またはp−ニトロフェニルシアネートである、請求項1に記載の方法。
- 前記有機シアン化試薬が1−シアノ−4−(ジメチルアミノ)−ピリジニウムテトラフルオロボレートである、請求項1に記載の方法。
- 前記第1成分および第2成分が水溶性である、請求項3に記載の方法。
- 前記活性化工程(a)を8〜10のpHにおいて実施し、そして前記カップリング工程(b)を7〜9のpHにおいて実施する、請求項3に記載の方法。
- 前記活性化工程(a)をトリエチルアミンの存在において実施する、請求項3に記載の方法。
- 第1成分を2官能性またはヘテロ官能性のスペーサー試薬に共有結合的に結合し、かつ第2成分をスペーサー試薬に共有結合的に結合することによって工程(b)を間接的に実施する、請求項1に記載の方法。
- 前記スペーサー試薬がエチレンジアミン、1,6−ヘキサンジアミン、アジピン酸ジヒドラジド、シスタミン、グリシン、およびリジンから成る群より選択される、請求項7に記載の方法。
- 第1成分が多糖であり、そして第2成分がタンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 多糖がデキストラン、肺炎球菌(Pneumococcal)多糖、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)多糖、グループAストレプトコッカス(streptococcus)多糖、グループBストレプトコッカス(streptococcus)多糖、および髄膜炎菌(N.meningitidis)多糖から成る群より選択される、請求項9に記載の方法。
- 第1成分が水溶性のウイルスまたは細菌の多糖である、請求項1に記載の方法。
- 第2成分が水溶性タンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 第2成分がウシ血清アルブミン、百日咳トキソイド、破傷風トキソイド、マラリア誘導ペプチド、抗体、トキソイド、およびリポタンパク質から成る群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 免疫原性構築物がPT−Pn、PT−PRP、TT−Pn、抗体−デキストラン、およびペプチド−TT−Pnから成る群より選択される複合体である、請求項1に記載の方法。
- 十分に低いpKaを有する求核物質を形成するように第2成分を誘導化する、請求項1に記載の方法。
- 前記求核物質がヒドラジドである、請求項15に記載の方法。
- 前記カップリング工程(b)を約8より低いpHにおいて実施する、請求項16に記載の方法。
- 十分に低いpKaを有する求核物質を形成するように第2成分を誘導化する、請求項7に記載の方法。
- 前記求核物質がヒドラジドである、請求項18に記載の方法。
- 前記カップリング工程(b)を約8より低いpHにおいて実施する、請求項19に記載の方法。
- (a)(i)少なくとも1つの第1炭水化物含有成分を有機シアン化試薬で活性化し、そして(ii)前記活性化された炭水化物を第2成分に共有結合的に結合することを包含する工程により免疫原性構築物を調製し、そして
(b)前記免疫原性構築物を患者に投与する、
ことを含んでなる、免疫応答を発生させる方法。 - 前記有機シアン化試薬が1−シアノ−4−(ジメチルアミノ)−ピリジニウムテトラフルオロボレートである、請求項21に記載の方法。
- 前記活性化工程(a)をトリエチルアミンの存在において実施する、請求項22に記載の方法。
- 第1成分が多糖であり、そして第2成分が水溶性タンパク質である、請求項22に記載の方法。
- 多糖がデキストラン、肺炎球菌(Pneumococcal)多糖、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)多糖、グループAストレプトコッカス(streptococcus)多糖、グループBストレプトコッカス(streptococcus)多糖、および髄膜炎菌(N.meningitidis)多糖から成る群より選択される、請求項24に記載の方法。
- 第2成分がウシ血清アルブミン、百日咳トキソイド、破傷風トキソイド、マラリア誘導ペプチド、抗体、トキソイド、およびリポタンパク質から成る群より選択される、請求項22に記載の方法。
- 免疫原性構築物がPT−Pn、PT−PRP、TT−Pn、抗体−デキストラン、およびペプチド−TT−Pnから成る群より選択される複合体である、請求項22に記載の方法。
- 十分に低いpKaを有する求核物質を形成するように第2成分を誘導化する、請求項21に記載の方法。
- 前記求核物質がヒドラジドである、請求項28に記載の方法。
- 前記カップリング工程(b)を約8より低いpHにおいて実施する、請求項29記載の方法。
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