CN1017867B - 制备共价修饰的中性细菌多糖及其与免疫原性蛋白连接的稳定共价结合物的方法 - Google Patents

制备共价修饰的中性细菌多糖及其与免疫原性蛋白连接的稳定共价结合物的方法

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Abstract

共价修饰的细菌多糖；这些多糖与免疫原细胞或其它蛋白质通过一双类间隔基联结而成的共价结合物。这些结合物是细菌疫苗的有用成份；以及制备这些多糖的和结合物的方法。

Description

本发明是关于共价-修饰的中性细菌多糖，尤其是关于肺炎球菌14型多糖和类似的多糖，以及这些多糖与免疫原细菌膜或其它蛋白质通过一个双属间隔基连接的共价结合物。双属间隔基能证明共价的存在并有利于纯化和浓缩生物学上需要的各种物质。这些结合物是细菌疫苗的有用成份。本发明亦与制备这些多糖和结合物的方法有关。
纯化的细菌荚膜多糖已被用于制备抗同族细菌的疫苗，但是免疫的结果总是没有所希望的那样令人满意，尤其是对幼儿和免疫系统未成熟或缺乏的人。如肺炎双球菌14型荚膜多糖就不能引起婴儿的免疫应答，从而使这种多糖本身在预防由肺炎双球菌14型引起的严重儿科疾病方面是无效的，如可参见Douglas    et    al.，J.Infect.Deseases，148，131-137（1983）和Laurence    et    al.，Am.J.Diseases    of    Children，137，846-850（1983）。使多糖与蛋白质相结合，常可增加这些多糖的免疫原性，可参见Schnearson    et    al.，Infection    and    Immunity，45，No.3，582-591（1984）（讨论6A型肺炎双球菌的结合）。
然而，必须仔细选择与这些多糖结合的蛋白质。某些蛋白质（例如百日咳抗原）并不是对婴儿的免疫系统有特异性的刺激素。尽管这些蛋白质在一定程度上能增强对多糖抗原的免疫应答，但不幸的是这种非特异性激活作用导致一些所不希望的生物学效应[即反应原性]。正如W.F.Goebel和O.T.Avery在1929年[J.Exptl.Medicine    50，521-531（1929）]中首次报导的那样，通过使这些多糖与适当的蛋白质“结合”，对于婴儿可获得好得多的对这些多糖抗原的特异性免疫应答的 增强效果。
亦须仔细考虑使多糖和蛋白质相结合的方法。如果象所认为的那样，免疫增强的实现是多糖决定簇和蛋白质“载体”决定簇的分子接近的结果，那么这两种部位在生物系统中应是不易分开的。由于许多多糖的多阴离子特性和“载体”蛋白质的多阳离子特性而生成的非共价复合物也许能刺激免疫应答，但这些复台物在化学上是不稳定的，因此所产生的免疫应答看来是非T细胞依赖的。相反，多糖和蛋白质的共价结合物具有大得多的化学稳定性，而且能显示出T细胞依赖的免疫应答。
多糖-蛋白质共价结合物在文献中已有记述，但由于共价性的唯一可测数量一直是体内活性，因此共价键的确切性质尚未被证明或定量分析。而且，文献中公开的方法重复性很差。在Schneerson    et    al.J.Expel    med.，152，361（1980）和Infection    and    Immunity，40，245（1983）中有这样的记述：使流感嗜血杆菌b型和肺炎双球菌6A型多糖与溴化氰反应，然后与己二酰肼反应，再用破伤风类毒素或血蓝蛋白质“偶合”。肺炎球菌19F型多糖与牛血清蛋白可通过由这些多糖的还原性端基和该蛋白质的侧链胺基（即赖氨酸）形成亚胺（西夫碱），然后用氰基硼氢化钠还原这些亚胺而直接偶合[Lin    et    al.，Immunology，46，333（1982）]。
此外，在K.K.Nixdorff    et.al.，Immunology    29，87（1975）中有这样的记述：将与重氮化的芳香胺键联的多糖偶联到蛋白质的酪氨酸上。而在S.B.Suenson和A.A.Lindberg，J.Immunolog.methods，25，323（1979）中有这样的记述：将与芳香胺键联的多糖转变成异硫氰酸盐，然后将后者连接到蛋白质赖氨酸的侧链氨基酸上。然而，在上述各种情况中，所得到的结合物只是被它的凝胶渗透色谱性质所鉴定。在另一个例子中[见S.Nutani    et    al.，Infection    and    Immunity    36，971（1982）]，多糖、出芽短梗孢糖被氰尿酰氯活化，然后与破伤 风类毒素反应。在这种情况下，结合物被电泳鉴定，但只表明它与原料是不同的。
在上述的所有情况中，都只能通过聚集分子量的推断来证明共价存在，但这样就把共价性与分子配合物中带电荷和不带电荷的大分子片之间固有的相互作用混淆起来了，这是由于这些配合物也能给出一种聚集分子量。
在1984年5月10日提交的共同未决专利申请U.S.S.N608，738（通过引用该文献将其合并于本文中）中，已有共价修饰的多阴离子多糖和蛋白质的记述，其中也有关于这些多糖与免疫原细菌膜或其它蛋白质通过双属间隔基连接而成的共价结合物，制备这些结合物的方法以及证明多糖和蛋白质之间是共价连接的方法的记述。应用这篇文献的方法，现在生产在化学上稳定的多糖-蛋白质结合物是可能的。这些结合物能显示T细胞依赖性。为了诱发对于某些细菌，尤其是对于所用的多糖的同族细菌的保护血清抗体，这些结合物作为疫苗成份也是有用的。不过，这种方法只能用于共价修饰的多阴离子多糖，还不能用于在有机溶剂或盐溶液中不溶或半溶的难处理的多糖。
因此，本发明的目的之一是建立一种在制备化学上稳定的多糖-蛋白质结合物的过程中使中性多糖增溶溶解和对这些中性多糖进行共价修饰的方法。本发明的目的之二是将化学稳定的结合物中的中性多糖决定簇和蛋白质“载体”决定簇结合起来，使这两种部位的分子接近能在生物体中维持，这是为了能将这些结合物用做单价或多价疫苗中的成份。这些疫苗的用途是诱发对某种细菌，尤其是对所用多糖的同族细菌的保护血清抗体。本发明的目的之三是研究出一种将这些结合物用在作抗-例如-脑膜炎和中耳炎用的免疫学上有效的各种疫苗中的治疗方法。
本发明与下列物质有关：共价修饰中性细菌多糖、化学上稳定的这种中性多糖与共价修饰的免疫膜蛋白质的结合物、病毒蛋白质亚单位、合成的多肽、细菌类毒素或其它合适的免疫蛋白质。这些蛋白质的结合物是免 疫细菌疫苗的有用成份。本发明的多糖-蛋白质结合物是通过含有一个共价硫醚基团的双属间隔基偶联的，此处双属间隔基是连有大分子（例如中性多糖和蛋白质）的原子链，此类间隔基的一部分连有一个修饰的大分子（例如共价修饰的中性多糖），而它的另一部分连有其它的修饰大分子（例如官能蛋白质）。
在本发明方法中，中性多糖通过一步或多步反应被共价官能化，产生一个带有一些侧链亲电中心或带有侧硫醇基的多糖。最好是先在含有或不含有含水肼的水中加热而将中性多糖裂解，将水除去，裂解的多糖在与双亲核试剂反应前，被用双官能团活化剂转变为衍生物。然后使被亲核试剂官能化的中性多糖或是与一试剂反应产生侧链亲电部位，或是与一试剂反应产生侧链硫醇基团。通过选择合适的双亲核试剂，即，能与被活化的中性多糖反应并产生一个共价修饰的含有侧链亲电部位或侧硫醇基团的多糖的双亲核试剂，或者选择合适的亲核试剂，可以避免被亲核试剂官能化的中性多糖进一步官能化。
与中性多糖的共价修饰无关，通过一或两个步骤，使合适的细菌“载体”蛋白质与能产生侧链硫醇基团的试剂或与能产生侧链亲电中心的试剂反应。再使经过适当共价修饰的中性多糖与蛋白质反应，形成共价的多糖-蛋白质结合物。然后除去未结合的大分子和过剩的试剂将产物纯化，以便能根据以结合物形式存在的共价连接的多糖的量来决定免疫原性剂量。
由此可以制备单价或多价免疫原性疫苗，此疫苗含有有效免疫量的下述成份：本发明的多糖-蛋白质结合物，或本发明的多糖-蛋白质结合物与其它共价多糖-蛋白质结合物（如1984年5月10日提交的专利申请U.S.S.N.608，738中记述的那些结合物），或与其它免疫原物质或它们的衍生物的混合物。
本发明的共价修饰多糖可以是任何中性（即非阴离子/非阳离子）多糖的改良变体，它们并不限于任何特殊类型。这些中性细菌荚膜多糖的例 子有肺炎双球菌多糖14型、7F型和37型，在L.Kenne    and    B.Lindberg    in    The    polysaccharides，Vol.Ⅱ，PP.287-363，Acade-mic    press（1983）和A.S.Chaudri    et    al.，Carbohydrate    Re-search，25，161-172（1972）中有关于这些多糖的记述。
本发明采用的蛋白质必须是安全的和确有免疫作用的，但并不限制于任何特殊类型。合适的蛋白质包括细菌膜蛋白质;各种植物蛋白质，例如麻仁球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂;病毒蛋白亚单位，如甲型或乙型肝炎、gD疱疹或gC疱疹、爱波斯坦-巴雷（Epstein-Barr）或水豆带状疱疹亚单位;合成多肽;白喉类毒素;或破伤风类毒素;但最好是脑膜炎双球菌（脑炎球菌）B血清型外膜蛋白质，这种蛋白质是T细胞刺激素。这些血清型蛋白质的一个例子在Heltiny    et    al.，“Serotype    De-terminant    proteins    of    neisseria    meningitids”Actapath.micro-biolscamd    Sect.C，89，69-78，1981，和Frasch    et    al.，J.Bact.，127，973-981（1976）中已有介绍。
此外，本发明的结合物可以是任何稳定的多糖-蛋白质结合物，它们是通过一个双属间隔基偶联的，此双属间隔基含有一硫醚基团和烷基酰胺，它与中性多糖和蛋白质形成水解不稳定的共价键。然而，本发明的较好结合物可以用下面的式子来表达：Ps-A-E-S-B-Pro或者Ps-A′-S-E′-B′-Pro，这里Ps代表一个非阴离子多糖;Pro代表一个免疫原蛋白质;而A-E-S-B和A′-S-E′-B′构成双属间隔基，此间隔基含有水解稳定的共价硫醚键，它与大分子、Pro和Ps形成共价键（例如水解不稳定的酯或酰胺键）。在间隔基A-E-S-B中，S是硫;E是已经与硫醇基团反应的一个亲硫基团的转换产物，并能用
Figure 85108890_IMG10
来表示，这里R是H或CH3，p是1到3;A是
Figure 85108890_IMG11
，式中W是O或NH，m是0到4，n是0到3，而Y是CH2、O、S、NR′或CHCO2H，NR′中的R′是H或者是C1-或C2-烷基，如果Y是CH2，那么m和n两者都不能等于0，如果Y是O或者S，那么m大于1，n也大于1;B是 ，式中q是0到2，Z是NH2、
Figure 85108890_IMG13
、COOH或者H，这里的R′和p和上面规定的相同，而D是
Figure 85108890_IMG14
。在间隔基A′-S-E′-B′中，S是硫，A′是 此式中a是1到4， R″是CH2或 ，此处Y′是NH2或者NHCOR′，W、P和R′与上面规定的相同，而E′是已经与硫醇基团反应的一个亲硫基团的转换产物，并能用 来表示，式中的R与上面的规定相同，而B′是
Figure 85108890_IMG18
，或者E′是
Figure 85108890_IMG19
，而B′是 ，式中的p等于1到3。此外，在双属间隔基A-E-S-B和A′-S-E′-B中，E-S-B和A′-S-E′成份是可以测定和可以定量化的，这种鉴定能反映将硫醚硫的一侧和间隔基的一侧连接起来的结合物键的共价性，这里提到的硫醚硫是由共价修饰的非阴离子多糖产生的，这里提到的间隔基是由被官能化的蛋白质产生的。
在本发明的方法中，多糖可以通过下面的步骤来实行共价修饰：a）通过在一个有含水肼或没有含水肼的水中加热多糖将其裂解，再通过低压冻干法除去水并在真空中用P2O5干燥;然后，b）在一无水、极性、对质子有惰性的溶剂中用一双官能团的试剂将多糖活化;c）用一个双亲核试剂与这个活化的多糖反应;如果必要，最后再进行下面的处理：d）通过以下 两个反应中的任一个使这个多糖官能化：（ⅰ）与一个产生亲电（如亲硫醇基）部位的试剂反应;（ⅱ）与一个产生硫醇基团的试剂反应。所用蛋白质则相应地进行反应（ⅰ）与一个产生硫醇基团的试剂反应，或反应（ⅱ）与一个产生亲硫醇基团部位的试剂反应，然后使共价修饰的多糖和官能化的蛋白质一起反应，形成稳定的共价连接的结合物，最后的混合物通过除去未反应的多糖和蛋白质来纯化。
本发明的方法还包括对亲核试剂或双亲核试剂的选择，这些亲核试剂将与活化的多糖反应形成一个含侧链亲电部位或侧链硫醇基团的共价修饰的多糖，这样就不需要在共价修饰多糖与共价修饰蛋白质反应之前，进一步将双亲核试剂改性的多糖官能化。同样，将蛋白质的部分官能化为两种形式的任一种可以通过一步以上的反应来完成，视这些反应步骤中所用的反应物而定。
在将多糖共价修饰的第一步中，必须使这种固态、几乎不溶的多糖溶解。
由于本发明的中性多糖在有机溶剂或盐溶液中不溶，在水中只能有限地溶解，又由于在水溶液中多糖的亲核醇羟基在化学上无法与水分子的羟基争夺亲电试剂，所以必须将多糖予以改性，成为较易溶解的形式，然后将其溶解在非水（无羟基的）溶剂中。合适的溶剂包括二甲基甲酰胺、二甲亚砜、二甲基乙酰胺、甲酰胺、N、N′-二甲基咪唑酮和其它类似的极性、对质子有惰性的溶剂，最好是二甲基甲酰胺。
在1984年5月10日提交的申请U.S.S.N.608，738中指出，首先把带有酸基的细菌多糖转变成一种合适的盐的形式，就可以将其溶解在无羟基的有机溶剂中。与此相反，本申请者可以通过在含有或不含有5-15%含水肼的蒸馏水中将这些非多阴离子的中性多糖在70～100℃加热30秒钟到10分钟，使一个完整的、不这样处理就在很大程度上不溶的中性多糖溶解。这样虽已将该多糖裂解，但仍保留了中性多糖作免疫疫苗用的活性， 只是把该多糖变成了一种有用的形式。
后面的步骤旨在克服对于形成与多糖连接的共价键的其它有影响的物理-化学限制，这种限制是多糖上缺乏非羟基官能团，这些官能团具有与一般或实际上用于将需要与之键联的单元官能化的试剂反应的足够反应性。剩余的水（和羟基）通过冷冻干燥和在真空中用P2O5干燥除去。因此，为形成一个活化的多糖而进行的多糖活化，为了形成一个亲核试剂-官能化的多糖而与双亲核试剂反应，以及用能产生亲电部位或硫醇基团的试剂进行的官能化反应，都是为了对多糖进行共价修饰和在多糖上引入官能团，从而为偶合作准备。
下一步，解聚的多糖通过与一个双官能化试剂反应而被活化，反应在约0-50℃范围内进行，同时搅拌10分钟到1小时，活化试剂与多糖的严格重量比控制在1∶5到1∶12的范围内。根据本发明，用溴化氰活化是可能的，但这个试剂在多糖的活化中很少使用而且不是很好的。较好的活化多糖的双官能化试剂包括碳酸的衍生物，即
Figure 85108890_IMG21
[式中R2和R3可以各自独立地为吡咯基类（azolyl），如咪唑基]、碳酰囟类或者碳酸苯基酯类（如对硝基苯基酯或多囟代苯基酯）。
羰基二咪唑是特别好的试剂。它与多糖的羟基反应形成多糖的咪唑尿烷，而氯甲酸芳基酯（其中包括如氯甲酸硝基苯基酯）则反应产生混合的多糖碳酸酯。在各种情况中，产生的活化多糖对亲核试剂如胺类是很敏感的，因此能转换成相应的尿烷。
下一步是使活化的多糖与亲核试剂反应。这些亲核试剂有胺，尤其是二胺，例如：
Figure 85108890_IMG22
，式中m是0到4， n是0到3，而Y是CH2、O、S、NR′、CHCO2H，此处的R′是H或C1-或C2-烷基，在胺大大过量（即如，与所用的活化剂比，胺过量50-100倍克分子）的情况下，如果Y是CH2，那么m和n都不能等于0，而如果Y是O或S，那么m大于1而n也大于1。先在冰浴中反应15分钟到1小时，然后在17～40℃反应15分钟到1小时。
活化的多糖与二胺如1，4-丁二胺反应时产生带有侧链胺的尿烷形式的多糖，然后可通过酰化将此产物进一步官能团化。混合的碳酸酯也易与二胺反应生成侧链胺基。
活化的多糖也可以与如二氨基烷的单囟乙酰胺等亲核试剂反应，例如：4-溴乙酰氨基丁胺（见W.B.Lawson    et.al.，Hoppe    Seyler′s    Z.Physiol    Chem.，349，251（1968）），产生一个共价修饰的带有侧链亲电部位的多糖。或者，活化的多糖可以与氨基硫醇如胱胺（氨基乙硫醇）或半胱氨酸、在肽合成技术领域中人们熟知的衍生物的例子反应，产生一带侧链硫醇基团的多糖。在上面两种情况中，在将共价修饰多糖与修饰的细菌“载体”蛋白偶联之前，无需进行另外的官能化反应。
如果需要将多糖进一步官能化，那么制备多糖的最后一个步骤可以采取下面二种方式中的任一种：或是使亲核试剂官能化的多糖与一种试剂反应而产生亲电（即亲硫的）部位，或是让亲核试剂官能化的多糖与一种试剂反应而产生硫醇基团。
用来产生亲电部位的合适试剂包括下面的例子：（将反应物）酰化为α-囟乙酰或α-囟丙酰衍生物的试剂，如
Figure 85108890_IMG23
[式中R是H或CH3;X是Cl、Br或I;X′是硝基苯氧基、二硝基苯氧基、五氯苯氧基、五氟苯氧基、囟化物、O-（N-羟基琥珀酰亚氨基）或叠氮基]，尤其是氯乙酸或α-溴氯丙酸，反应是在PH等于8到11的范围内进 行（为了保持这个PH值范围，必要时可以添加碱）并在0-35℃温度下反应10分钟到1小时。为了制备适当官能化的、易于硫代的多糖，多糖的氨基衍生物可以被活化的马来酰亚氨基氨基酸（见O.Keller et al.，Helv.Chim.Acta.，58，531（1975））酰化而产生马来酰亚氨基团：
Figure 85108890_IMG24
，式中p是1到3;此多糖也可以被2-囟乙酰化试剂如溴乙酸对硝基苯基酯酰化，或被α-囟酮羧酸衍生物如（Ber.，67，1204，（1934））酰化。
用来产生硫醇基团的合适试剂的例子包括：酰化试剂，如硫代内酯类，例如
Figure 85108890_IMG26
式中R4是C1-C4烷基或者单环或双环芳基，例如C6H5或C10H13，而p是1到3;又如：
式中m是0到4，R5是C1-C4烷基或C6H5，X′与上面的规定相同，经此试剂处理后，再用HSCH2CH2OH处理;或如：
Figure 85108890_IMG28
，式中的m、R5和X′的意义与刚才规定的相同，然后再用二硫苏糖醇处理。这些反应在氮气中进行，反应温度在约0～35℃，PH控制在8～11（如果需要，可通过加碱使PH保持在此范围内），反应时间为1到24小时。例如：一种多糖的氨基衍生物可以与 反应，生成一适当官能化的多糖。
通过所有这些步骤，便制得Ps-A-Eγ-或Ps-A′-SH-形式的共价修饰的中性多糖，其中，Eγ是 ，而A、A′、R、X和p的意义与上面规定的相同。
对用来与多糖偶联的蛋白质的单独官能化处理涉及蛋白质与产生硫醇基团的一种或多种试剂之间的反应或蛋白质与产生亲电（即亲硫）中心的 一种或多种试剂之间的反应，这正如在1984年5月10日提交的申请U.S.S.N.608，738中所述。
就象上面第10-12页中所讨论的那样，为了制备亲电官能化的多糖的结合物，蛋白质要用一步或两步与一种或多种试剂反应产生硫醇基团，这些试剂有如用来在多糖上引入硫醇基团的酰化试剂。通过用氨基硫醇类把羧基活化的蛋白质（如在Atassi    et    al.，Biochem    et    Biophys.Acta，670，300（1981）中所介绍的那些蛋白质）胺化而生成硫醇化（thiolated）蛋白质的方法，也可以制备硫醇化的蛋白质。这一反应步骤的较好实施方法包括：将蛋白质的侧链氨基（即赖氨酰基）用N-乙酰高半胱氨酸硫代内酯在0℃到35℃、PH为8到11的条件下直接酰化，反应时间为5分钟到2小时，反应中使用等重量的反应剂。
当E′B′＝
Figure 85108890_IMG31
时，制备官能化蛋白质的条件和方法与前面第10～12页上所讨论的通过与活化的马来酰亚氨基酸反应来制备配对多糖的条件和方法相同。
为了与一个带侧链硫醇基团的共价修饰的细菌多糖结合，在制备时蛋白质被一个能产生亲电中心的试剂酰化，这样的酰化试剂包括如：
Figure 85108890_IMG32
，式中X和X′的意义和前面规定的相同;和，式中X′的意义与前面规定的相同。带有亲电中心的合适蛋白质还包括，例如：通过将侧链赖氨酰氨基用一种反应剂，如活化的马来酰亚氨基酸类，例如
Figure 85108890_IMG34
予以酰化而制备的那些蛋白质，或者通过使羧基活化的蛋白质与二胺的单囟乙酰基衍生物反应而制备的那些蛋白质。在这两个制备反应中，温度都是0-35℃，反应时间皆为5分钟到1小时，PH值都控制在8-11。
至此，结合物的形成不过是将任何带有侧链亲电中心的共价修饰的多糖与任何带有侧链硫醇基团的蛋白质以大至相等的重量比在PH值为7～9，温度为17～40℃，并在氮气中反应6～24小时而给出共价结合物的事情。这种反应的例子包括：
Figure 85108890_IMG35
此处，是使已经与4-溴乙酰氨基丁胺反应的活化多糖和一已经与N-乙酰高半胱氨酸硫代内酯反应的蛋白质反应，形成一结合物，以及
Figure 85108890_IMG36
（这里Y″是一个C2-C8烷基），此处是使一已经与活化的马来酰亚氨基酸反应的多糖氨基衍生物的和一已经用氨基硫醇胺化的羧基活化的蛋白质反应，形成一结合物。
同样，可以使任何带侧链硫醇基团的共价修饰多糖与任何有亲电中心的蛋白质反应，得到共价结合物。这种反应的一个例子是：
Figure 85108890_IMG37
，此处，是使一已经与氨基硫醇反应的活化多糖与一已经与二胺的单囟乙酰衍生物反应的羧基活化的蛋白质反应，形成一结合物。
然后，这些结合物在约10到20℃的温度下，以约100，000×G的加速度用一个固定角度的转子离心分离约2小时。或用其它各种纯化方法包括凝胶渗透、离子交换色谱、梯度离心分离或其它差示吸收色谱（differen-tial    absorption    Chromatography）来除去非共价结合的多糖和蛋白质。采用对双属间隔基所做的共价性分析（见下文）作为检测所需要的生物活性的方法。
申请者通过将结合物水解（最好用6N    HCl在110℃连续水解20小时），然后定量分析水解稳定的含有硫醚键的间隔基的氨基酸和蛋白质的氨基酸成份，完成了为证实结合物的共价性，从而证实其稳定性而做的结合物分析。如果需要，可以通过与所涉及的蛋白质的合适的氨基酸标准相比较来消除蛋白质中氨基酸的影响，这样，剩余的氨基酸值就反映了结合物的共价性，或者可以进行这样的设计：在分析中使在蛋白质的氨基酸标准之外的间隔基的氨基酸能表现出来。共价性分析对监测标记生物活性成份浓度提交的纯化程序也是有用的。在上面的例子中，通过Ps-A-E-S-B-Pro分子在肽键和其它水解不稳定键处的断裂，将
Figure 85108890_IMG38
水解可以使S-羧甲基高半胱氨酸 脱落将
Figure 85108890_IMG40
水解可以使氨基二羧酸
Figure 85108890_IMG41
脱落;将水解可以使S-羧甲基半胱氨H2NCH2CH2SCH2CO2H脱落。色谱法如斯贝克曼（Spackman）、摩尔（Moore）和斯坦恩（Stein）方法可以方便地运用，从而可以测定各氨基酸成份的比例。
本发明的一种或多种结合物可以用于哺乳类动物进行主动或被动性保护（active    or    passive    protection），以预防或治疗由同类微生物引起的菌血症。本发明较好的实施方法是，既可以将本发明的结合物与下述的其它结合物一起单独地用于单价或多价的疫苗：含有其它中性多糖如肺炎双球菌7F、14和37的结合物或含有多阴离子多糖如流感嗜血杆菌b型或肺炎双球菌6B、19F或23F型微生物的结合物，也可以将本发明的结合 物与未成结合物的多糖，如肺炎双球菌3型多糖一起用于上述疫苗。
主动保护作用可以这样达到：注射有效量（此量能产生可测出量的抗体，例如2～50μg）的以用于给药的每剂药中的各个结合物的结合形式存在的多糖或用于给药的每剂药中的非结合的多糖，注射从预先用一种或多种结合物进行过给药的动物身上得到的全抗血清，或者注射该抗血清的血球蛋白或其它含有抗体的组分，注射液中可以含有或不含一种药学上能接受的载体，如无菌盐溶液。通过色谱，用盐或醇盐析或者电泳的方法，这种血球蛋白可以由全抗血清中制得。被动保护作用可以通过标准单克隆抗体程序或使合适的哺乳类动物宿主免疫来达到。我们亦希望将一种佐剂（如明钒）的使用包括在本发明范围内。
本发明的一个较好实施方式是，将除了别的成份外，还含有本发明的结合物的单价或多价混合剂用于人，特别是不足月的婴儿和未成年人的主动免疫原性的预防接种。为了更稳定起见，在使用前也可以将这些结合物在乳糖（例如按50μg/ml肺炎球菌多糖：10mg/ml乳糖的比例）存在下冷冻干燥。
对于单次给药，比较好的用药量是每种用于给药的结合物或其衍生物的相当于25μg以结合物形式存在的多糖的量-这是对肺炎球菌多糖的结合物而言、25μg未结合的多糖以及按1984年10月提交的专利申请U.S.S.N.608，738中所述的，含有多阴离子多糖结合物的结合物剂量或其衍生物剂量。如果有必要，还可给予另外的1到2剂流感嗜血杆菌b型多糖的结合物或其衍生物，其用量相当于10μg以结合物形式存在的该多糖。
借助于以下实施例，可以进一步阐明本发明，这些例子只起解释本发明的作用，并不能限制其范围。
例一
肺炎双球菌14型荚膜多糖的制备
接种物及其繁殖
步骤A：工作菌种（working    seed）的制备
将一管肺炎双菌14型细菌接种物（从Pensylvania大学Robert    Austrian博士处得到）的冷冻干燥物悬浮到1毫升无菌牛心浸出汁中（溶于0.9升水中的25克的心脏浸出汁（Difco））并将此悬浮液分散在五个兔血琼脂（20克纯琼脂，25克心脏浸出汁，100毫升脱纤兔血，0.9升蒸馏水）平皿上，每个平皿中约有0.2毫升培养物。在37℃培养约18小时后，把平皿上的生长物重新悬浮在各个兔血琼脂平皿中（每个平皿中有5毫升牛心浸出汁）并进行混合。
将半毫升这种再次悬浮的生长物用来给6个装有液体血液培养基（90毫升牛心浸出汁和10毫升脱纤兔血）的烧瓶中的每一个接种，然后在无搅拌情况下，在37℃培养（incubate）约18小时。
步骤B：2升无隔板（non-baffled）锥形瓶
将两烧瓶A步骤中得到的肺炎双球菌14型工作菌种合并，在五个2升的无隔板锥形瓶内各接种20毫升这种菌种，瓶内盛有900毫升无菌肺炎球菌接种物培养基（见后）和100毫升25%的莆萄糖溶液。烧瓶内的PH值用加入12%的碳酸氢钠溶液的方法控制在6.0～7.0。在37℃培养7小时之后，（此时OD660值通常是2.90）把从4个烧瓶中收集的生长物混合在一起（混合物的OD660值是2.80，PH为6.8）。
肺炎球菌接种培养基
Figure 85108890_IMG43
大豆胨    20克
酵母提取物超滤液（1）    100毫升
NaCl试剂    5克
K2HPO42.5克
2%酚红    0.5毫升
蒸馏水    1升
Figure 85108890_IMG44
此溶液用压热器在121℃处理25分钟进行灭菌。
把各种盐和大豆胨溶解在少量热的无热原水中，然后再加少量热的无热原水使达到合适的最后体积。然后将发酵桶或烧瓶在121℃无菌处理25分钟，冷却后，将酵母提取超滤液（1）在接种前以无菌的方式加到烧瓶或发酵桶中。
（1）酵母提取物超滤液：把100克啤酒酵母提取物（Amber）溶解在1升蒸馏水中，并用一个Amicon    DC-30的空心纤维HIO×50柱超滤，除去分子量为50，000的分子。收集滤液并使其通过一个0.22微米的膜，得一无菌产品。
步骤C：70升菌种发酵桶
把步骤B的混合产物接种到一个70升的装有肺炎球菌菌种培养基（如下文所述）的发酵桶中，其起始PH为6.8。
发酵过程在37℃保温进行，用100转/分的转速搅拌，并通过光密度（O.D.）、葡萄糖试验和PH测定进行监测，直到O.D.达到3.25（大约4小时后）为止。
肺炎球菌菌种的完全培养基
大豆胨    800克
酵母提取物超滤液（1）    4升
K2HPO4试剂 100克
NaCl试剂    200克
25%葡萄糖溶液（2）    4升
Ucon    B625防泡剂    14毫升
蒸馏水    31.8升
（2）将葡萄糖配成25%的用玻璃器皿蒸馏的蒸馏水（glass-distille water）的无菌溶液后，加到装有酵母提取物超滤液的70升发酵桶中。
步骤D：800升生产发酵桶
将大约40升步骤C的产物接种到装有530升的肺炎球菌生产培养基（其制备方法如下述）的800升发酵桶中。
发酵过程保持在37℃进行，以100转/分钟的转速搅拌，每隔约两小时检查光密度（O.D.）、葡萄糖和PH的值一次，直到光密度（O.D.）在两小时时间内保持基本不变为止，此时发酵过程即完成（通常，6小时后的最终光密度为5.2）。
肺炎球菌生产培养基
大豆胨    10.5公斤
酵母提取物超滤液（1）    52.5升
K2HPO4试剂 1.313公斤
NaCl试剂    2.625公斤
25%葡萄糖溶液（2）    58升
Ucon    B625防泡剂    95毫升
蒸馏水    418.5升
采集和灭活
通过将每批产物采集到一个装有8.2升液化苯酚的“杀屠桶”中进行灭活。
34和58%的乙醇沉淀
在20～26℃及搅拌的情况下，以3.6升/分钟的流速向640升经过灭活的培养物中加入213.3升95%的乙醇，然后，再以2升/分钟的流速加入117升95%的乙醇，最后的总体积为950升，乙醇的最终体积浓度为 35%。所得混合物在22℃继续搅拌4小时以保证分离完全，然后通过一组五个4英寸夏普勒斯离心机在15000转/分钟转速下收集清液（流速约为4升/分钟）。弃去不溶的片状沉淀物，在澄清的液体中以7.6升/分钟的流速加入559升95%的乙醇，使体系的乙醇浓度为58%。在21℃继续搅拌混合物5小时使沉淀完全。
第二次片状沉淀物的回收
用4英寸夏普勒斯离心机在15000转/分钟的转速下（流速约为4升/分钟）收集所生成的溶于34%乙醇而不溶于58%乙醇的沉淀物，并将含58%乙醇的上层清液弃去。所得到的粗产物是重为2.435公斤的湿糊状物。
24%的异丙醇沉淀
将2.435公斤的58%乙醇不溶物和1.621公斤由第二次以相似方法发酵所得到的产物合并。将得到的4.061公斤物料在Daymax分散器中于15～29℃与30升用玻璃器皿蒸馏的蒸馏水混合12分钟，直到悬浮液均匀为止。再添加大约66升蒸馏水到悬浮液中，并搅拌此混合物4小时。再在此混合液中加入24升5%的乙酸钠溶液，并加入冰乙酸将溶液的PH值调到6.5。
在15～29℃不断搅拌下以0.3升/分钟的流速加入37.9升异丙醇使此120升的溶液的异丙醇浓度为24%。继续搅拌4小时后，将混合物通过一个4英寸夏普勒斯离心机以15000转/分钟的转速（流速＝0.35升/分钟）离心分离5.75小时，并以200～400毫升/分钟的流速通过一个电核子K-超离心机（28000转/分），直到流出液变得清彻为止，将不溶片状沉淀物弃去。
39%的异丙醇沉淀物和糊状粗产物的收集
在搅拌下，以0.3升/分钟的流速向前一步骤制备的24%的异丙醇溶解清液中加入38.8升异丙醇，使体系异丙醇的浓度为39%。然后，搅拌此混合物（194升）3.25小时，再在两个4-英寸夏普勒斯离心机中以15000转/分的速度（流速为0.5升/分钟）离心分离约18小时以收集粒状粗多糖（2.006公斤）。
透析过滤
把离心分离的粒状物转移到一个内盛20升蒸馏水的Daymax混合器中混合30分钟，直到悬浮液均匀为止。然后用300升冷的由玻璃蒸馏器制得的蒸馏水稀释该悬浮液，在约23℃用10个HF26.5-45-XM50滤筒在Romicon超滤装置上进行透析过滤，直到电导恒定为止。把滞留物浓缩到最小体积，漂洗Romicon单元，将漂洗物加到滞留物中，这样其最后体积为86升。弃去超滤液。
溴化十六烷基三甲铵沉淀
把1.84公斤溴化十六烷基三甲铵溶解在6升蒸馏水中，然后在搅拌下用1个多小时将该溶液加到前步制备的86升滞留物中。再过4小时后，通过K超速离心机（28000转/分）在5℃离心分离8小时，收集沉淀的杂质（1.925公斤）），并收集上层清液。
异丙醇的分离
在搅拌下，用10多分钟将28.55公斤三结晶水乙酸钠加入到86升前步得到的上层清液中，用冰乙酸将溶液的PH调到6.6。在搅拌下以0.38升/分的流速加入45.1升异丙醇使上述溶液的异丙醇浓度达到28%。继续搅 拌4小时之后，将溶液送入K3超速离心机（28000转/分），从中可收集12克沉淀物并弃去。在搅拌下将38.9升异丙醇（最后浓度为42%）以0.3升/分的流速加到116升清液中，继续搅拌4小时后，将该溶液送入两个4英寸的夏普勒斯（Sharples）离心机中，以15000转/分的转速进行离心分离（流速各为1.3升/分），温度15～29℃，弃去流出液。
最后产物的研制和收集
将得到的多糖粒状物用3升无水乙醇在一个1加仑Waring掺和器中用30秒-开-30秒-停的方法进行研制，直到糊状物变成硬的白色粉末为止。将此粉末收集到装有聚四氟乙烯滤片的布氏瓷漏斗上，就在漏斗上，每次用1升无水乙醇洗四次，然后每次用2升丙酮洗二次。把产物从漏斗中转移到称重过的小盘中，在20～25℃真空干燥（约18小时）。该产物的最后产量是315.2克（干重）。其性质如下：
表1-1
肺炎球菌14型多糖的化学分析数据
分析项目    结果
水份（热重量分析）    6.3%
蛋白质    4.8%
核酸    0.6%
己糖胺    28.6%
氮    1.6%
磷    0.2%
分子大小    0.19-0.21
（KD    on    Sepharose    4B）
以上分析是用下列各方法完成的。：
1.水分-标准热失重分杆（到100℃的失重），使用TSG-1型Per-ken-Elmer式热天平进行。
2.蛋白质-Lowry法;见Lowry    et    al.，J.Biol    Chem.，193，265（1951）。
3.核酸-U.V.法;见Warburg    and    Christian，Biochem    Z.，310：384（1942）。
4.己糖胺-见Elson    and    Morgan，Bioclem.J.，27：1824（1933）。
5.氮-燃烧法，使用Perkin-Elmer    24D-CHN元素分析仪进行。
6.磷-钼酸盐法;见Chen    et.al.，Anal.Chem.28：1756（1956）。
例二
脑膜炎双球菌B11血清型2蛋白质的制备
A.发酵过程
1.脑膜炎双球菌B11组
打开盛有脑膜炎双球菌的冷冻干燥培养物（从华盛顿特区Walter Beed陆军研究所（WRAIR），M.Artenstein搏士处获得）的管子，向其中加入Eugon肉汤（Eugon broth）（BBL）。把培养物划线接种到巧克力琼脂平皿（BBL）上，并且在37℃用5%的CO2培养36小时，这时将生长物收集到10%的脱脂乳培养基（Difco）中，分装并在-70℃冻结。该微生物用WRAIR提供的特异性抗血清或由Difco公司提供的配型血清（typing serum）做凝聚试验，得到肯定鉴定。
将首次培养的培养物划线接种到巧克力琼脂平皿上，在37℃用5%CO2保温培养18小时，此时将培养物采集到10%的脱脂乳培养基中，分 装成1毫升的量并在-70℃下冷冻，通过用WRAIR提供的特异性抗血清和由Difco公司提供的配型血清做凝聚试验，此微生物再次得到肯定的鉴定。
将第二次培养的一管形瓶的培养物溶解并划线接种于10个哥伦比亚棉羊血琼脂平皿上（CBAB-BBL）。这些平皿在37℃用5%CO2培养18小时，此后，把生长物采集到100毫升10%的脱脂乳培养基中，分装成0.5毫升1份的量并在-70℃冷冻。通过特异抗血清凝集试验、糖酵解和革兰氏染色，此微生物得到了肯定的鉴定。
将一管形瓶的上述培养物融解，并用Mueller-Hinton肉汤稀释，然后将其划线接种到40个Mueller-Hinton琼脂平皿中。将这些平皿在37℃用6%CO2培养18小时，此后把生长物采集到17毫升10%的脱脂乳培养基中，以每管0.3毫升分装，在-70℃冷冻，此微生物体通过革兰氏染色、特异性抗血清凝集作用和氧化酶试验得到肯定的鉴定。
2.细胞糊状物的发酵和收集
a.接种物的扩大 使来自上述第四次培养得到的盛有脑膜炎双球菌B组、B11组的两个0.5毫升冻结管形瓶中的接种物生长。用四个Mueller-Hinton琼脂Blake瓶接种，约18小时后采集，采集物用做5升PH为7.29的Gotschlich氏酵母渗析液培养基的接种物。把相当于660毫微米波长的O.D.调节到0.065（Perkin Elmer）。使该微生物在37℃，在装在一个振摇器中的五个两升的锥形瓶（各盛有1升培养基;见下文）中生长。分别每隔45、75和120分钟检测一次O.D.。得到大约4升肉汤培养液，其O.D.660为0.81（Spectronic 20）。
取3毫升样品用于革兰氏染色，分几份分别在CBAB、Mueller、Hinton和酵母提取物右旋糖平皿中划线接种，以及进行凝集试验检查。所有反应都是满意的。
b.70升菌种发酵桶    将约3600毫升菌种培养物用来向一个盛有42.6升完全生产培养基（见下）的无菌的70升发酵桶接种。
70升发酵的条件包括在37℃，以185转/分转速转动，以10升/分的流速鼓入空气，控制PH恒定为7.0，发酵5.5小时。
在37℃将培养物涂在Mueller-Hinton琼脂平皿、酵母提取物右旋糖和兔血琼脂平皿（Merck）上，并用脑膜炎双球菌B族抗血清进行凝集作用的试验。这种在Mueller-Hinton琼脂平皿、酵母提取物右旋糖平皿和兔血琼脂平皿上的生长物是正常的，凝集反应是阳性的。对于这一批，5.5小时后在660毫微米时的最终O.D.值为0.840。
c.800升生产发酵桶
用大约46.2升的菌种培养物给一个无菌的盛有568.2升完全生产培养基（见后）的800升发酵桶接种。这批物料在37℃保温培养，以100转/分的转速搅拌并以60升/分流速鼓入空气，控制PH恒定在7.0。
这批物料在灭活前，把培养物在37℃涂在Mueller-Hinton琼脂平皿、酵母提取物右旋糖平皿和兔血琼脂平皿上，用脑膜炎双菌B组抗血清进行凝集作用的试验。在Mueller-Hinton琼脂平皿、酵母提取物右旋糖平皿和兔血琼脂平皿上的生长物是正常的，并且凝集反应是阳性的。对于此批物料，接种13小时后的最终光密度（O.D）为2.24。
3.比浊计瓶和70升及800升发酵桶用的完全培养基
A液的组成
L-谷氨酸    1.5克/升
NaCl    6.0克/升
无水Na2HPO42.5克/升
NH4Cl 1.25克/升
KCl    0.09克/升
L-半胱氨酸盐酸盐    0.02克/升
B液：（Gotschlich氏酵母渗析液）
把1280克Difco酵母提取物溶解在6.4升蒸馏水中。该溶液在2个装有三个HIOSM（滤器芯子）的Amicon DC-30中空纤维渗析装置中进行渗析。将此渗析液和384克MgSO4·7H2O及3200克右旋糖混在一起，在该渗析液中溶解，并加入蒸馏水使总体积达到15升。用NaOH调节PH值到7.4，通过微孔过滤（0.22微米）进行除菌处理，然后加到含有A组分的发酵桶中。
对于比浊计烧瓶：加入1升A液和25毫升B液，用氢氧化钠调节PH值到7.0～7.2。
对于70升发酵桶：加入41.8升A液和900毫升B液，其PH值用氢氧化钠调节到7.0～7.2。
对于800升发酵桶：加入553升A液和15.0升B液，用氢氧化钠调节PH值到7.0～7.2。
d.采集及灭活
发酵完成后，将酚（最后浓度为0.5%V/V）加到一个单独容器中，然后将细胞肉汤转移到该容器中。此物质在室温及缓慢搅拌下放置，直到培养物不再存活为止（大约24小时）。
e.离心分离
24小时之后，在4℃通过夏普勒斯（Sharples）离心机对614.4升灭活的培养液进行离心分离，加酚后的细胞糊状物的重量是3.875公斤。
B.分离
第一步：细菌细胞的洗涤
对于每次分离，都将上述0.5%酚灭活的糊状物取200克一等份悬浮在800毫升无菌蒸馏水中，并用磁力搅拌器搅拌成颗粒状物悬浮液，把这些悬浮的细胞在5℃、20，000g条件下经过60分钟做成片状沉淀物（Beckman    19Ti转子，14，500转/分）。
第二步：提取
将洗涤过的细胞悬浮在2000毫升0.1M三羟甲基氨基甲烷-0.01MEDTA的含有0.5%的脱氧胆酸钠的缓冲液（即TED缓冲液）中，其PH为8.5，并用一个固定在3档的Sorvall两夸脱全能混合器（Sorvall    2quart    omnimixer）混合60秒钟。把均匀悬浮液转移到16个500毫升锥形瓶中，并在一个56℃摇动的水浴中提取15分钟（在该温度下）。
在20，000g（加速度）、5℃条件下离心分离提取物60分钟（Beckman    19    Ti转子，14，500转/分）。倾倒出粘稠的上层清液（总体积为1980毫升），在4℃保存。
把提取的细胞片状沉淀物再次悬浮在2000毫升方才所述的TED缓冲液中。按上述方法将此悬浮液在56℃提取15分钟并离心分离，倾出清液（体积为2100毫升），在4℃保存。
第三步：用超滤法浓缩
合并第二步得到的各上层清液（总体积为4005毫升）。把两升此清液倒入一个与微孔膜（Millipore    Pellicon）过滤装置相连的两升的New    Branswick发酵器中，此装置上装有两张0.45微米微孔膜（表面积为1/2平方英尺）。在90分钟的整个浓缩过程中，提取清液一直在25℃放置在发酵容器中。样品在平均透过膜压为27.5磅/平方英寸的条件下被浓缩十倍。
第四步：血清型蛋白质的收集和洗涤
将第三步中得到的滞留物（205毫升）在160，000g、5℃条件下离心分离2小时，形成片状血清型蛋白质沉淀物（Backman    45，Ti转子，37000转/分）。倾出清液并弃去。
将所得蛋白质沉淀物称重（8.12克），然后以手工方法，用一根玻璃棒和Dounce均化器将其悬浮在TED缓冲液中（190毫升缓冲液;20毫升/克沉淀物）。在56℃将此悬浮液放在一个500毫升锥形瓶中，摇荡提 取15分钟。此后将悬浮液在5℃、160，000g条件下离心分离2小时（Be-ckman    45    Ti转子，37，000转/分）。将清液倾出并弃去（体积为190毫升）。该沉淀物在190毫升TED缓冲液中按上述方法进行第二次洗涤。
第五步：产物的回收
把第四步得到的洗涤过的蛋白质沉淀物用一根玻璃棒和Dounce均化器悬浮在100毫升蒸馏水中以保证完全悬浮。此悬浮液的Lowry蛋白质值为17.0毫克/毫升。此时，取200毫克这种悬浮液保存作试验用。剩下的大部分悬浮液（91毫升）用102.4毫升玻璃器皿蒸馏的蒸馏水稀释到8.0毫克/毫升（Lowry蛋白质值）。将此含水悬浮液在12，000g条件下离心分离15分钟以清除其中的聚集体（Beckman    45    Ti转子，10，000转/分）。
将澄清产物用移液管小心地吸出来，避开松散的聚集体沉淀物，对产物（其体积为182.5毫升）做标记。将其等分，等分试样用于无菌和热原检验（无菌产物，无热原）。将产物在4℃作为无菌体保存，直到用于结合反应（此时要对其做分析进行定性）为止。产率为9.5毫克Lowry蛋白/克原始细胞糊状物。
表2-1
脑膜炎球菌B血清型2蛋白质溶液化学分析数据
化验项目    结果
蛋白质
Lowry    4.1毫克/毫升
核酸＊
RNA（Bial）    1.8%
DNA（二苯胺）    0.6%
中性糖＊
蒽酮    1.05
唾液酸＊    3.0%
分子量
SDS-PAGE    40，000d
（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）
＊以Lowry蛋白质为基础计算百分数
在以上的分析中采用了下列各方法：
1.蛋白质-分析方法和实例1所用的一样。
2.核酸-借助于苔黑粉（5-甲基间苯二酚）反应（Bial），观察到相当于有1.8%的RNA存在的显色现象，此百分率数据是以蛋白质的量为基础计算的。DNA的二苯胺试验表明其含量为0.6%，此百分率数据是以整个溶液中的蛋白质量为基础计算的。
3.中性糖-中性糖含量的以蛋白质为基础计算的百分率数据是采用蒽酮比色试验得到的（Scott    and    Meluin，Anal.Chem.，25    1656，1953）。
4.唾液酸-唾液酸的含量是采用苯二酚-盐酸法测定的（Svenner-holm，Biochem.iophys.，Acta    24，604，1957）
5.分子量-巯基乙醇变性蛋白质的分子量是根据十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的（Nature    227：680（1970）LKB    Appli    cation    Note    306）。
例三
在结合阶段用离心法制备肺炎双球菌14型多糖
-脑膜炎双球菌B血清型外膜蛋白质聚合物
Ⅰ.用含水肼裂解肺炎多糖14型
在一个100毫升的圆底烧瓶中注入24毫升水和1.92毫升97%的肼，然后在沸水中处理直到温度达到100℃（大约3分钟）。于此溶液中一次加入240毫克肺炎双球菌14型多糖（Pn14），快速搅拌所得溶液1.0分钟。然后将此烧瓶在冰浴中迅速冷却，将瓶中物质在Spectropor    2渗析管（分子量切割12，000-14000）中对32升水渗析5小时。然后在32升新鲜水中再次渗析16小时。将此渗析液转移到一个50毫升离心管中并在一分析用离心机中进行离心分离，除去泥状沉淀物。把上层清液冻干，得到163毫克裂解的Pn14。
Ⅱ.解聚Pn14的丁二胺衍生物的形成
把150毫克裂解的Pn14放入一干燥的50毫升圆底烧瓶中，用9毫升二甲亚砜（DMSO）覆盖，并用氮气保护。在54℃搅拌此混合物5分钟，然后在室温下搅拌5分钟。此时几乎所有的裂解的Pn14都已溶解。然后加入36毫克羰基二咪唑，搅拌溶液40分钟。在搅拌期间，准备一份1，4-丁二胺二盐酸盐溶液（300毫克/16毫升H2O，用2.5N NaOH调节PH到9.45）并用冰浴将其冷却。上述40分钟的搅拌完成后，把DMSO溶液加到冷却了的丁二胺溶液中，并在室温下搅拌4.5小时。然后将其对30升水渗析17.25小时，然后对新鲜的4升水渗析4小时。把所得渗析液 冻干，得到152毫克Pn14的丁二胺衍生物：Pn-Bu A2。KD＝0.70比浊度单位（rate nephelometry units）（为原料多糖的153%）;荧光测胺（fluorescamine）滴定度＝150毫微摩尔NH2/毫克。
Ⅲ.Pn14的1，4-丁二胺衍生物（Pn14-Bu A2）的溴乙酰化
把140毫克Pn14-Bu A2溶解在10毫升PH9.5的缓冲液中。在溶液中加入140毫克溴乙酸对硝基苯酯溶于1毫升乙腈所得的溶液。用塞子塞住瓶口并在4℃搅拌22.5小时。此后使其分别对4升水渗析6小时，再对4升新鲜的水渗析16小时，再第三次对4升水渗析7小时。然后冻干渗析液，得到139毫克Pn14-Bu A2的溴乙酰衍生物（Pn14-Bu A2-Br Ac）。
KD＝0.79比浊度单位＝原料多糖的120%
萤光测胺滴定度＝6毫微摩尔，（与Ⅱ.中所测数据的滴定度差△＝150-6），这意味着每毫克含溴乙酰基144毫微摩尔。
Ⅳ.Pn14-Bu A2-Br Ac与官能化的脑膜炎双球菌蛋白（NMP）的结合
所有的离心操作都在聚碳酸酯管中进行，并且，如果不另行说明，都在Beckman    Ti    75转子中，于4℃、43，000转/分的条件下离心分离2小时。
把由未官能化的蛋白质（10毫升，5.5毫克/毫升）经离心分离所得到的片状沉淀物用一个Dounce均化器再次悬浮在7毫升硫醇化（thiola-tion）混合物中，此混合物含有59毫克乙二胺四乙酸、11.2毫克二硫苏糖醇和PH＝11.3的硼酸钠缓冲液。重新悬浮之后，把混合物转移到一个离心管中，用血清用塞（serum stopper）盖上管口，并以氮气取代管中的空气。将此离心管转移到一个氮气箱中，在管内加入54毫克N-乙酰高半胱氨酸硫代内酯。盖上瓶盖并在氮气箱中陈化22小时，然后加入1M的KH2PO4（磷酸二氢钾）调节溶液PH至8.0。所得混合物经离心分 离后将片状沉淀物再悬浮于10毫升0.1M PO4的PH＝8.0的缓冲液中。然后，离心分离所得悬浮液，除去剩余的小分子物质。把第二次得到的片状沉淀物用一个Dounce均化器重新悬浮在8.5毫升PH8.0的缓冲液中。Ellman法检验表明硫醇（thiol）总量为6.4微摩尔。
向此重新悬浮的硫醇化的蛋白质（thiolated protein）中加入50毫克Pn14-Bu A-Br Ac，将所得溶液于室温下在氮气箱中陈化17小时。然后将其在4升水中渗析6小时。取此溶液一半转移到离心管中，于其中溶入4.0克Cs Cl。此离心管用水（10ml）充至管口，并在Ti 75转子中，在4℃、43，000转/分转速条件下离心分离20小时。所得氯化铯梯度密度离心液用Haake Buchler auto Densi Flow 2 C装置分离成各为1.3毫升的馏分。收集9个馏分，合并5、6、7号馏分并装入一离心管，加入3.5克氯化铯，混合物中加水充至管口，然后按上述条件离心分离24小时。再按上述方法对此离心液进行分级分离，合适的馏分由比浊度法检出，将馏分3和4对4升0.1M PO4缓冲液（PH＝7）渗析16小时，然后对4升水渗析4小时。所得渗析液用水稀释到10毫升。
结果：多糖    0.205毫克/毫升
蛋白质    0.550毫克/毫升
Spinco：S-羧甲基高半胱氨酸：0.020微摩尔
赖氨酸    0.156微摩尔
比率    0.128
例四
在结合阶段用柱色谱法制备肺炎双球菌14型多
糖-B血清型脑膜炎双球菌外膜蛋白质结合物
用实例三的步骤Ⅳ所述方法的变形方法把根据实例三第Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ步制备的肺炎球菌的14型多糖的溴乙酰化的1，4-丁二胺衍生物连接到根据实例二制备的蛋白质上。
Pn14-Bu    A-Br    Ac与脑膜炎
双球菌外膜蛋白质（NMP）的结合
把1.2毫升NMP溶液（12.4毫克/毫升）与0.4毫升含有饱和的Na BO3（PH11.00）和42毫克/毫升乙二胺四乙酸以及8毫克/毫升二硫苏糖醇的缓冲溶液一起装入离心管中。然后将此离心管用血清用塞封口，抽气并用氮气代替空气。在氮气箱中向管内加入10毫克N-乙酰高半胱氨酸硫代内酯。此溶液在室温下陈化17小时。两根交联葡聚糖凝胶（Sephadex G25）柱（PD/10）用PH＝8.0的磷酸盐（0.1M）缓冲液使之平衡。向此反应混合物中加入0.9毫升上述PH8的缓冲液，把整个溶液施加到第一根柱中。此柱用PH8缓冲液3.5毫升进行洗脱。将2.5毫升此洗脱液装到第二根柱子中，用3.5毫升PH＝8的缓冲液洗脱。此洗脱液由Ellman法检验总共有525毫微摩尔的硫醇（thiol）。往此洗脱液中加入13毫克Pn 14-Bu A2-Br Ac，并在氮气保护下陈化7小时。然后再次在4升水中渗析两次（5小时和16小时）。将少量样品冻干后用于氨基酸分析。结果为：0.0073微摩尔S-羧甲基高半胱氨酸;0.104微摩尔赖氨酸。此产物在100，000g离心分离，把得到的片状沉淀物重新悬浮在10毫升水中并再次离心分离。在10毫升水中再次悬浮，得到Pn 14-Bu A2-BrAc NMP结合物的溶液。
多糖∶蛋白质＝0.25
S-羧甲基高半胱氨酸∶赖氨酸＝0.07
例五
用肺炎球菌14型多糖-B血清型脑膜炎双球菌外膜
蛋白质结合物进行的在小鼠体内的抗体反应试验
将按实例四制备的肺炎双球菌14型多糖-B血清型脑膜炎双球菌外膜蛋白质结合物溶液用于进行小鼠体内免疫应答试验，其结果列于下表。
小鼠的血清抗体反应
剂量    小鼠    放射免疫试验滴度（GMT）
样品    微克（按多糖    毫微克抗体N/毫升
的量计）    种类
结合物    0.1    ICR/Ha小鼠    18046＊＊
幼鼠（出生7天）    22256
结合物    0.1＊    ICR/Ha小鼠    19024
结合物    0.5＊    ICR/Ha小鼠    74664
结合物    0.5＊    CBA/N小鼠    7066
多糖对照物    0.5    ICR/Ha小鼠幼鼠    49
＊方法：在第0、7、28天进行腹膜内注射;在第34～35天放血。
＊＊    由不同的两窝小鼠得到的血清试验结果。

Claims (11)

1、制备含有通过含有硫醚键的双属间隔基连结的中性细菌多糖和免疫原蛋白质的多糖蛋白质的多糖-蛋白质结合物的方法，包括：
(a)使选自肺炎双球菌7F型、14型和37型多糖的中性细菌多糖裂解并在一非水、极性、对质子有隋性的溶剂中将解聚的多糖增溶溶解；
(b)用一双官能试剂活化多糖；
(c)由一双亲核试剂与活化的多糖起反应；
(d)使已经同一双亲核试剂反应的活化多糖同一种产生亲电部位的试剂反应，从而形成具有侧链亲电部位的多糖；
(e)另外，使选自B血清型脑膜炎双球菌外膜蛋白质或麻仁球蛋白的免疫原性球蛋白与一产生硫醇基团的试剂反应，成一种具有侧链硫醇基团的蛋白质；
(f)使具有侧亲电部位的多糖与具有侧链硫醇基团的蛋白质反应，形成一通过共价硫醚键连结的多糖一蛋白质结合物；然后
(g)离心分离所得到的混合物以除去非共价连结的多糖和蛋白质。
2、根据权利要求1的方法，其中（f）中所说的多糖-蛋白质结合物是稳定的以共价连结的结合物，其中所说的双属间隔基可以由式A-E-S-B来表示，式中E是此处R是H或CH3;A是-
Figure 85108890_IMG2
（CH2）mY（CH2）nNH-;这里m是0～4，n是0～3，w是0或NH，Y是CH2、O、S、NR1或-CHCO2H，这里R1是H或C1-或C2-烷基;以至，当Y是CH2时，则m和n二者不等于0;当Y是O或S时，则m大于1，n也大于1;B是
Figure 85108890_IMG3
其中p是1～3，q是0～2，Z是NH2、
Figure 85108890_IMG4
，此处R1的意义和上述相同。
3、根据权利要求1的方法，其中双属间隔基可由式
Figure 85108890_IMG5
表示。
4、根据权利要求1的方法，其中中性细菌多糖选自肺炎双球菌7F型、14型和37型多糖。
5、根据权利要求1的方法，其中免疫原蛋白质是B血清型脑膜炎双球菌外膜蛋白质或麻仁球蛋白。
6、根据权利要求1的方法，其包括于（a）中，在含5-15%含水肼的蒸馏水中加热中性细菌多糖、除去残余的水和把多糖溶解在非水、极性、对质子有隋性的溶剂中，其中中性细菌多糖是肺炎双球菌14型多糖，免疫原蛋白质是一种B血清型脑膜炎双球菌外膜蛋白，而双属间隔基可由式
Figure 85108890_IMG6
表示。
7、根据权利要求1所述的方法，其中（a）在70～100℃加热多糖30秒到10分钟将多糖裂解通过冻干除水并用P2O5在真空中干燥，并在非水、极性、对质子有隋性的溶剂中增溶溶解解聚的多糖，非水、极性、对质子有隋性的溶剂是：二甲基甲酰胺、二甲亚砜、二甲基乙酰胺-甲酰胺或N，N′-二甲基咪唑啉酮。
（b）用双官能试剂活化多糖;
（c）使一种双亲核试剂与这种活化了的多糖反应。
（d）使已经与亲核试剂反应的活化多糖与一产生铡链亲电部位的试剂反应。
8、根据权利要求1的方法，其中多糖是通过在蒸馏水中加热该多糖，然后冻干除水并在真空中用P2O5干燥而裂解的，非水，极性、对质子有惰性的溶剂是二甲基甲酰胺。二甲亚砜、二甲基乙酰胺、甲酰胺或N，H′-二甲基咪唑啉酮;双官能试剂选自羧酸衍生物，式中R2和R3是吡咯基（azoly1）;碳酰卤类;或者碳酸苯基酯类;而双亲核试剂是式为H2H（CH2）mY（CH2）nNH2的二胺，其中m是0～4，n是0～3，Y是CH2、O、S、NR1、CHCOOH，这里R1是H或C1-或C2-烷基，如果Y是CH2，则m和n不能等于零，如Y是O或S，则m大于1，n大于1。
9、根据权利要求1的方法，其中非水极性非质子溶剂是二甲基甲酰胺，双官能试剂是羰基二咪唑，而双亲核试剂是1，4-丁二胺。
10、根据权利要求1的方法，其中产生侧链亲电部位的试剂是
Figure 85108890_IMG8
，式中X1是硝基苯氧基，二硝基苯氧基、五氯苯氧基、五氟苯氧基、卤化物（halide）、o-（N-羟基琥珀酰亚氨基）或叠氮基，R是H或CH3而X是Cl、Br或L;或是一活化的马来酰亚胺基酸;其中p是1～3，X1的含义同上所述。
11、根据权利要求1的方法，其中产生亲电部位的试剂是溴乙酸对硝基苯酯。
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