JPH0656690A - 免疫キャリア及び増強性質を有するネイセリア・メニンギチジスの外膜のクラスｉｉタンパク質 - Google Patents
免疫キャリア及び増強性質を有するネイセリア・メニンギチジスの外膜のクラスｉｉタンパク質Info
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- JPH0656690A JPH0656690A JP3269964A JP26996491A JPH0656690A JP H0656690 A JPH0656690 A JP H0656690A JP 3269964 A JP3269964 A JP 3269964A JP 26996491 A JP26996491 A JP 26996491A JP H0656690 A JPH0656690 A JP H0656690A
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- A61K2039/55511—Organic adjuvants
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】 血清グループＢのネイセリア・メニンギチジ
スの外膜のクラスＩＩタンパク質を投与して抗原に対す
る免疫応答を増加させる方法。 【効果】 上記のネイセリア・メニンギチジスの外膜の
クラスIIタンパク質は免疫増強，サイトカイン［インタ
ーロイキン−２（Ｉｌ−２）］誘導及び分裂誘発性質の
みならず免疫学的キャリヤー性質をも有する。
スの外膜のクラスＩＩタンパク質を投与して抗原に対す
る免疫応答を増加させる方法。 【効果】 上記のネイセリア・メニンギチジスの外膜の
クラスIIタンパク質は免疫増強，サイトカイン［インタ
ーロイキン−２（Ｉｌ−２）］誘導及び分裂誘発性質の
みならず免疫学的キャリヤー性質をも有する。
Description
【０００１】ネイセリア・メニンギチジス(Neisseria m
eningitidis)の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）はヒ
ト用のワクチンにおいて免疫キャリアとして用いられ
る。ＯＭＰＣは様々なタンパク質及びリポ多糖（ＬＰＳ
又は内毒素）を含む膜脂質を含有したリポソームからな
る。
eningitidis)の外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）はヒ
ト用のワクチンにおいて免疫キャリアとして用いられ
る。ＯＭＰＣは様々なタンパク質及びリポ多糖（ＬＰＳ
又は内毒素）を含む膜脂質を含有したリポソームからな
る。
【０００２】ＯＭＰＣは免疫増強性質を有しており、抗
原がそれと化学的にカップリングした場合には抗原に対
する抗体応答が増加する。ＯＭＰＣはヘモフィラス・イ
ンフルエンザ(Haemophilus influenzae)のような感染源
に対するヒト幼児用ワクチンとして現在用いられ、ポリ
リボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ）がＯＭＰＣ
と共有結合した場合にＨ．インフルエンザのＰＲＰに対
するＩｇＧ及び記憶免疫応答を幼児で発現させることが
できる。
原がそれと化学的にカップリングした場合には抗原に対
する抗体応答が増加する。ＯＭＰＣはヘモフィラス・イ
ンフルエンザ(Haemophilus influenzae)のような感染源
に対するヒト幼児用ワクチンとして現在用いられ、ポリ
リボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ）がＯＭＰＣ
と共有結合した場合にＨ．インフルエンザのＰＲＰに対
するＩｇＧ及び記憶免疫応答を幼児で発現させることが
できる。
【０００３】ＯＭＰＣは様々なタンパク質及び脂質の混
合体であるが、ＯＭＰＣの成分がカップリングした抗原
に有益な免疫増強効果を付与することは知られていなか
った。しかしながら、ヒトワクチンでＯＭＰＣを用いた
場合における一部の潜在的に否定的な面としてＬＰＳ関
連反応がある。更にＯＭＰＣ−抗原複合体は抗原がＯＭ
ＰＣを構成するいずれのタンパク質部分とも複合化する
ため全く不均一であり、多価ワクチンの用量当たりの全
タンパク質含量は非常に高くなる。
合体であるが、ＯＭＰＣの成分がカップリングした抗原
に有益な免疫増強効果を付与することは知られていなか
った。しかしながら、ヒトワクチンでＯＭＰＣを用いた
場合における一部の潜在的に否定的な面としてＬＰＳ関
連反応がある。更にＯＭＰＣ−抗原複合体は抗原がＯＭ
ＰＣを構成するいずれのタンパク質部分とも複合化する
ため全く不均一であり、多価ワクチンの用量当たりの全
タンパク質含量は非常に高くなる。
【０００４】他のネイセリア・メニンギチジス外膜成分
なしにネイセリア・メニンギチジスの外膜から直接誘導
される主要免疫増強タンパク質（ＭＩＥＰ）である実質
上純粋なクラスIIタンパク質を提供することが本発明の
目的である。他のすべてのネイセリア・メニンギチジス
タンパク質を完全に含まずに組換え宿主細胞で産生され
るネイセリア・メニンギチジスの外膜の実質上純粋な組
換えＭＩＥＰを提供することが本発明のもう１つの目的
である。本発明の他の目的は、ネイセリア・メニンギチ
ジスの外膜から直接精製されたＭＩＥＰ又は組換え宿主
細胞で産生されたネイセリア・メニンギチジスの組換え
ＭＩＥＰのいずれかからなる抗原に対する免疫応答増強
用に有効な免疫キャリアタンパク質を提供することであ
る。本発明のもう１つの目的は、ネイセリア・メニンギ
チジスの外膜から直接精製されたＭＩＥＰ又は組換え宿
主細胞で産生されたネイセリア・メニンギチジスの組換
えＭＩＥＰのいずれかからなる免疫分裂誘発活性を有す
るタンパク質を提供することである。本発明のもう１つ
の目的は、ネイセリア・メニンギチジスの外膜から直接
精製されたＭＩＥＰ又は組換え宿主細胞で産生されたネ
イセリア・メニンギチジスの組換えＭＩＥＰのいずれか
からなるＩｌ−２のようなサイトカインの産生を誘導し
うる能力を有したタンパク質を提供することである。本
発明の他の目的は、組換えＭＩＥＰ又はネイセリア・メ
ニンギチジスの外膜から直接精製されたＭＩＥＰのいず
れかを含んだワクチン組成物を提供することである。こ
れらの及び他の目的は以下の記載から明らかであろう。
なしにネイセリア・メニンギチジスの外膜から直接誘導
される主要免疫増強タンパク質（ＭＩＥＰ）である実質
上純粋なクラスIIタンパク質を提供することが本発明の
目的である。他のすべてのネイセリア・メニンギチジス
タンパク質を完全に含まずに組換え宿主細胞で産生され
るネイセリア・メニンギチジスの外膜の実質上純粋な組
換えＭＩＥＰを提供することが本発明のもう１つの目的
である。本発明の他の目的は、ネイセリア・メニンギチ
ジスの外膜から直接精製されたＭＩＥＰ又は組換え宿主
細胞で産生されたネイセリア・メニンギチジスの組換え
ＭＩＥＰのいずれかからなる抗原に対する免疫応答増強
用に有効な免疫キャリアタンパク質を提供することであ
る。本発明のもう１つの目的は、ネイセリア・メニンギ
チジスの外膜から直接精製されたＭＩＥＰ又は組換え宿
主細胞で産生されたネイセリア・メニンギチジスの組換
えＭＩＥＰのいずれかからなる免疫分裂誘発活性を有す
るタンパク質を提供することである。本発明のもう１つ
の目的は、ネイセリア・メニンギチジスの外膜から直接
精製されたＭＩＥＰ又は組換え宿主細胞で産生されたネ
イセリア・メニンギチジスの組換えＭＩＥＰのいずれか
からなるＩｌ−２のようなサイトカインの産生を誘導し
うる能力を有したタンパク質を提供することである。本
発明の他の目的は、組換えＭＩＥＰ又はネイセリア・メ
ニンギチジスの外膜から直接精製されたＭＩＥＰのいず
れかを含んだワクチン組成物を提供することである。こ
れらの及び他の目的は以下の記載から明らかであろう。
【０００５】本発明は他の汚染Ｎ．メニンギチジス外膜
タンパク質及びＬＰＳのない実質上純粋な形におけるネ
イセリア・メニンギチジスの外膜のクラスII主要免疫増
強タンパク質（ＭＩＥＰ）に関する。本発明のＭＩＥＰ
は、ネイセリア・メニンギチジス細胞の外膜から直接精
製されたか又はネイセリア・メニンギチジスの組換えＭ
ＩＥＰ産生組換え宿主細胞から誘導されたかにかかわら
ず、免疫キャリア活性、サイトカイン（Ｉｌ−２）誘導
活性及び分裂誘発活性を有する。本発明のＭＩＥＰは、
抗原とカップリングした場合に、カップリング抗原に対
する抗体応答が増加されるか又はＩｇＧクラスの免疫グ
ロブリンが産生されるのを保証するＴ依存性抗原に抗原
が変換されるという点で免疫増強することができる。本
発明のＭＩＥＰとカップリングされる抗原としては、ウ
イルスタンパク質、細菌タンパク質及び多糖類、合成ペ
プチド、他の免疫抗原並びに弱又は非免疫抗原がある。
タンパク質及びＬＰＳのない実質上純粋な形におけるネ
イセリア・メニンギチジスの外膜のクラスII主要免疫増
強タンパク質（ＭＩＥＰ）に関する。本発明のＭＩＥＰ
は、ネイセリア・メニンギチジス細胞の外膜から直接精
製されたか又はネイセリア・メニンギチジスの組換えＭ
ＩＥＰ産生組換え宿主細胞から誘導されたかにかかわら
ず、免疫キャリア活性、サイトカイン（Ｉｌ−２）誘導
活性及び分裂誘発活性を有する。本発明のＭＩＥＰは、
抗原とカップリングした場合に、カップリング抗原に対
する抗体応答が増加されるか又はＩｇＧクラスの免疫グ
ロブリンが産生されるのを保証するＴ依存性抗原に抗原
が変換されるという点で免疫増強することができる。本
発明のＭＩＥＰとカップリングされる抗原としては、ウ
イルスタンパク質、細菌タンパク質及び多糖類、合成ペ
プチド、他の免疫抗原並びに弱又は非免疫抗原がある。
【０００６】ＩｇＭクラス抗体のみからなり記憶を含ま
ない免疫応答を自ら発現するある物質は、免疫グロブリ
ン産生のためＴリンパ球を補助する抗原性部分への化学
的カップリングによりＩｇＭ及びＩｇＧ抗体並びに記憶
を発現する完全な免疫抗原に変換されうることが知られ
ている。この免疫現象は“キャリア効果”と称され、弱
又は非免疫原性部分及び強抗原性物質は各々“ハプテ
ン”及び“キャリア”と称される。
ない免疫応答を自ら発現するある物質は、免疫グロブリ
ン産生のためＴリンパ球を補助する抗原性部分への化学
的カップリングによりＩｇＭ及びＩｇＧ抗体並びに記憶
を発現する完全な免疫抗原に変換されうることが知られ
ている。この免疫現象は“キャリア効果”と称され、弱
又は非免疫原性部分及び強抗原性物質は各々“ハプテ
ン”及び“キャリア”と称される。
【０００７】ハプテン−キャリア又は多糖−キャリア複
合体を動物に注射するとＢリンパ球により抗体を形成す
るが、その一部はハプテンに特異的でそれと結合し、他
はキャリアに特異的でそれと結合する。キャリア効果の
もう１つの面は、ハプテン−キャリア複合体との後にお
ける接触でハプテンに対する強い抗体応答が生じること
である。これは記憶又は追憶応答と称される。
合体を動物に注射するとＢリンパ球により抗体を形成す
るが、その一部はハプテンに特異的でそれと結合し、他
はキャリアに特異的でそれと結合する。キャリア効果の
もう１つの面は、ハプテン−キャリア複合体との後にお
ける接触でハプテンに対する強い抗体応答が生じること
である。これは記憶又は追憶応答と称される。
【０００８】キャリア効果には“ヘルパーＴリンパ球”
と称されるあるＴリンパ球で媒介される機能を含む。キ
ャリア分子は抗ハプテンＩｇＧクラス抗体産生Ｂリンパ
球の形成及び記憶応答を一部補助するためヘルパーＴリ
ンパ球を刺激する。
と称されるあるＴリンパ球で媒介される機能を含む。キ
ャリア分子は抗ハプテンＩｇＧクラス抗体産生Ｂリンパ
球の形成及び記憶応答を一部補助するためヘルパーＴリ
ンパ球を刺激する。
【０００９】ヘルパーＴリンパ球は“Ｔ非依存性”抗原
と称される他の抗原ではなく“Ｔ依存性”抗原と称され
るあるタイプの抗原に特異的な抗体のＢリンパ球による
産生に通常関与している。キャリア分子はＴ非依存性の
弱い又は非免疫原性ハプテンをＴ依存性の強い抗原分子
に変換することができる。更に、記憶応答はハプテン−
キャリア複合体に対する後の接触に追随し、Ｔ非依存性
抗原ではなくＴ依存性抗原に特徴的なＩｇＧから主にな
る。
と称される他の抗原ではなく“Ｔ依存性”抗原と称され
るあるタイプの抗原に特異的な抗体のＢリンパ球による
産生に通常関与している。キャリア分子はＴ非依存性の
弱い又は非免疫原性ハプテンをＴ依存性の強い抗原分子
に変換することができる。更に、記憶応答はハプテン−
キャリア複合体に対する後の接触に追随し、Ｔ非依存性
抗原ではなくＴ依存性抗原に特徴的なＩｇＧから主にな
る。
【００１０】キャリア分子の利用可能性はＴ非依存性抗
原との使用に限定されず、Ｔ依存性抗原とも用いること
ができる。Ｔ依存性抗原に対する抗体応答は、抗原自体
が抗体応答を発現しうる場合であっても抗原をキャリア
とカップリングさせることで高められる。
原との使用に限定されず、Ｔ依存性抗原とも用いること
ができる。Ｔ依存性抗原に対する抗体応答は、抗原自体
が抗体応答を発現しうる場合であっても抗原をキャリア
とカップリングさせることで高められる。
【００１１】他のある分子は一般的に全免疫系を刺激し
うる能力を有している。これらの分子は“分裂誘発因
子”と称され、それには植物タンパク質及び細菌産物が
ある。分裂誘発因子はＴ及び／又はＢリンパ球を増殖さ
せ、食作用増加、感染耐性増加、腫瘍免疫増加及び抗体
産生増加を含めて多くの面の免疫応答を広く高めること
ができる。
うる能力を有している。これらの分子は“分裂誘発因
子”と称され、それには植物タンパク質及び細菌産物が
ある。分裂誘発因子はＴ及び／又はＢリンパ球を増殖さ
せ、食作用増加、感染耐性増加、腫瘍免疫増加及び抗体
産生増加を含めて多くの面の免疫応答を広く高めること
ができる。
【００１２】あるＴヘルパーリンパ球によるＩｌ−２の
産生で他のリンパ球の増殖及び活性を促進させることが
できる。Ｔヘルパー細胞によるＩｌ−２産生はＴ細胞が
ある物質又は抗原産生細胞による抗原で活性化された場
合に誘導できる。Ｉｌ−２の効果としては格別限定され
ないが、Ｔ細胞の増殖進行並びにＢ細胞の増殖及び分化
がある。多くの感染病原体は、病原体及びその副産物に
結合して殺し無害化するか又は殺すかもしくは無害化す
る保護抗体を自ら発現しうる。これらの疾患からの回復
で、感染源の高抗原性成分に対する保護抗体により長期
持続性免疫を通常獲得する。
産生で他のリンパ球の増殖及び活性を促進させることが
できる。Ｔヘルパー細胞によるＩｌ−２産生はＴ細胞が
ある物質又は抗原産生細胞による抗原で活性化された場
合に誘導できる。Ｉｌ−２の効果としては格別限定され
ないが、Ｔ細胞の増殖進行並びにＢ細胞の増殖及び分化
がある。多くの感染病原体は、病原体及びその副産物に
結合して殺し無害化するか又は殺すかもしくは無害化す
る保護抗体を自ら発現しうる。これらの疾患からの回復
で、感染源の高抗原性成分に対する保護抗体により長期
持続性免疫を通常獲得する。
【００１３】保護抗体はヒト及び他の多くの動物の自然
防御メカニズムの一部であり、血中並びに他の組織及び
体液中に存在する。疾患をおこさずに感染源及び／又は
それらの副産物に対する保護抗体を発現させることがほ
とんどのワクチンの第一機能である。
防御メカニズムの一部であり、血中並びに他の組織及び
体液中に存在する。疾患をおこさずに感染源及び／又は
それらの副産物に対する保護抗体を発現させることがほ
とんどのワクチンの第一機能である。
【００１４】Ｎ．メニンギチジスからのＯＭＰＣは、Ｏ
ＭＰＣが細菌多糖類を含めたＴ細胞非依存性抗原と化学
的にカップリングする場合にヒトにおいて抗体応答を誘
導させるため好結果で用いられた。ＯＭＰＣはいくつか
の細菌外膜タンパク質及び細菌脂質を含んでいる。加え
て、ＯＭＰＣはリポソーム三次元構造を有する。
ＭＰＣが細菌多糖類を含めたＴ細胞非依存性抗原と化学
的にカップリングする場合にヒトにおいて抗体応答を誘
導させるため好結果で用いられた。ＯＭＰＣはいくつか
の細菌外膜タンパク質及び細菌脂質を含んでいる。加え
て、ＯＭＰＣはリポソーム三次元構造を有する。
【００１５】免疫キャリアとしてのＯＭＰＣの効力は１
種以上の細菌膜タンパク質、細菌脂質、リポソーム三次
元構造又は細菌タンパク質、脂質及びリポソーム構造の
組合せに依存していると考えられた。本出願人らは、タ
ンパク質の１種ＭＩＥＰがＯＭＰＣベシクルの免疫キャ
リア及び免疫増強性質を有し、他のＮ．メニンギチジス
膜タンパク質及びリポ多糖類を含まない精製された形で
有効であることを発見した。
種以上の細菌膜タンパク質、細菌脂質、リポソーム三次
元構造又は細菌タンパク質、脂質及びリポソーム構造の
組合せに依存していると考えられた。本出願人らは、タ
ンパク質の１種ＭＩＥＰがＯＭＰＣベシクルの免疫キャ
リア及び免疫増強性質を有し、他のＮ．メニンギチジス
膜タンパク質及びリポ多糖類を含まない精製された形で
有効であることを発見した。
【００１６】本出願人らは、ＭＩＥＰが細菌多糖と化学
的にカップリングした場合に多糖に対する抗体応答を誘
導するのに際してＯＭＰＣと同様に機能することも発見
した。本出願人らはＭＩＥＰがＮ．メニンギチジスの外
膜のクラスIIタンパク質であることも更に発見した。
Ｎ．メニンギチジスのクラスIIタンパク質はポーリンタ
ンパク質である〔ムラカミ、Ｋ．ら、１９８９年、イン
フェクション・アンド・イムニティ(Infection and Imm
unity)、第５７巻、第２３１８−２３頁〕。ポーリン類
はすべてのグラス陰性細菌の外膜でみられる。本発明は
Ｎ．メニンギチジスのＭＩＥＰで例示されるが、免疫キ
ャリア及び免疫増強活性を有するのであればいかなるグ
ラム陰性細菌からのいかなる外膜タンパク質でも本発明
に包含されることは当業者にとり容易に明らかである。
グラム陰性細菌の例としては格別限定されず、ネイセリ
ア、エシェリヒア(Escherichia) 、シュードモナス(Pse
udomonas) 、ヘモフィラス(Hemophilus)、サルモネラ(S
almonella)、シゲラ(Shigella)、ボルデテラ(Bordetell
a)、クレブシエラ(Klebsiella)、セラチア(Serratia)、
エルシニア(Yersinia)、ブブリオ(Vibrio)及びエンテロ
バクター(Enterobacter)属の種がある。
的にカップリングした場合に多糖に対する抗体応答を誘
導するのに際してＯＭＰＣと同様に機能することも発見
した。本出願人らはＭＩＥＰがＮ．メニンギチジスの外
膜のクラスIIタンパク質であることも更に発見した。
Ｎ．メニンギチジスのクラスIIタンパク質はポーリンタ
ンパク質である〔ムラカミ、Ｋ．ら、１９８９年、イン
フェクション・アンド・イムニティ(Infection and Imm
unity)、第５７巻、第２３１８−２３頁〕。ポーリン類
はすべてのグラス陰性細菌の外膜でみられる。本発明は
Ｎ．メニンギチジスのＭＩＥＰで例示されるが、免疫キ
ャリア及び免疫増強活性を有するのであればいかなるグ
ラム陰性細菌からのいかなる外膜タンパク質でも本発明
に包含されることは当業者にとり容易に明らかである。
グラム陰性細菌の例としては格別限定されず、ネイセリ
ア、エシェリヒア(Escherichia) 、シュードモナス(Pse
udomonas) 、ヘモフィラス(Hemophilus)、サルモネラ(S
almonella)、シゲラ(Shigella)、ボルデテラ(Bordetell
a)、クレブシエラ(Klebsiella)、セラチア(Serratia)、
エルシニア(Yersinia)、ブブリオ(Vibrio)及びエンテロ
バクター(Enterobacter)属の種がある。
【００１７】ＭＩＥＰは高い抗原性、弱い抗原性及び非
抗原性の物質に対する抗体応答を増強するために用いら
れる。ここで相互的に用いられる“抗原”及び“抗原物
質”という用語には、細菌、ウイルス又は他の源の１種
以上の非生存、免疫原性、弱免疫原性、非免疫原性又は
脱感作（抗アレルギー性）物質を含む。抗原成分は乾燥
粉末、水性溶液又は水性懸濁液のような水相及びそれら
の混合物を含めたその他からなり、非生存、免疫原性、
弱免疫原性、非免疫原性又は脱感作物質を含有してい
る。
抗原性の物質に対する抗体応答を増強するために用いら
れる。ここで相互的に用いられる“抗原”及び“抗原物
質”という用語には、細菌、ウイルス又は他の源の１種
以上の非生存、免疫原性、弱免疫原性、非免疫原性又は
脱感作（抗アレルギー性）物質を含む。抗原成分は乾燥
粉末、水性溶液又は水性懸濁液のような水相及びそれら
の混合物を含めたその他からなり、非生存、免疫原性、
弱免疫原性、非免疫原性又は脱感作物質を含有してい
る。
【００１８】水相は非経口上許容される液体中に抗原物
質を含んでいることが都合よい。例えば、水相は生物が
生育された平衡塩溶液、生理塩溶液、リン酸緩衝液、組
織培養液又は他の媒体中に抗原が溶解されたワクチンの
形であってもよい。水相は保存剤及び／又はワクチン製
剤で慣用的に配合される物質を含有してもよい。ＭＩＥ
Ｐ複合抗原を含有したアジュバントエマルジョンは当業
界で周知の技術を用いて製造される。
質を含んでいることが都合よい。例えば、水相は生物が
生育された平衡塩溶液、生理塩溶液、リン酸緩衝液、組
織培養液又は他の媒体中に抗原が溶解されたワクチンの
形であってもよい。水相は保存剤及び／又はワクチン製
剤で慣用的に配合される物質を含有してもよい。ＭＩＥ
Ｐ複合抗原を含有したアジュバントエマルジョンは当業
界で周知の技術を用いて製造される。
【００１９】抗原は格別限定されないが細菌、ウイル
ス、哺乳動物細胞及び他の真核細胞（寄生虫を含む）、
真菌、リケッチアから誘導される抗原を含めて精製又は
部分的精製された抗原の形でもよい。抗原は格別限定さ
れず花粉、ちり、ふけ又はそれらの抽出物を含めたアレ
ルゲンでもよい。あるいは抗原は格別限定されず有害昆
虫又はは虫類から誘導される毒物又は毒液を含めた毒物
又は毒液の形でもよい。抗原は合成ペプチド、更に大き
なポリペプチドの断片でも又は細菌、哺乳動物細胞、真
菌、ウイルス、リケッチア、アレルゲン、毒物もしくは
毒液から誘導される分子もしくは成分のいずれかのサブ
部分の形であってもよい。すべてのケースにおいて、抗
原はそれらの毒性又は有害性質が減少又は破壊され、適
切な宿主に導入された場合に特定のタンパク質、ペプチ
ド、微生物、抽出物又は抗原、毒物、毒液の製造に用い
られる微生物の産物に対する抗体の産生により能動免疫
を誘導するかあるいはアレルゲンのケースでは特定のア
レルゲンによるアレルギー症状を軽減する上で役立つ形
をしている。
ス、哺乳動物細胞及び他の真核細胞（寄生虫を含む）、
真菌、リケッチアから誘導される抗原を含めて精製又は
部分的精製された抗原の形でもよい。抗原は格別限定さ
れず花粉、ちり、ふけ又はそれらの抽出物を含めたアレ
ルゲンでもよい。あるいは抗原は格別限定されず有害昆
虫又はは虫類から誘導される毒物又は毒液を含めた毒物
又は毒液の形でもよい。抗原は合成ペプチド、更に大き
なポリペプチドの断片でも又は細菌、哺乳動物細胞、真
菌、ウイルス、リケッチア、アレルゲン、毒物もしくは
毒液から誘導される分子もしくは成分のいずれかのサブ
部分の形であってもよい。すべてのケースにおいて、抗
原はそれらの毒性又は有害性質が減少又は破壊され、適
切な宿主に導入された場合に特定のタンパク質、ペプチ
ド、微生物、抽出物又は抗原、毒物、毒液の製造に用い
られる微生物の産物に対する抗体の産生により能動免疫
を誘導するかあるいはアレルゲンのケースでは特定のア
レルゲンによるアレルギー症状を軽減する上で役立つ形
をしている。
【００２０】抗原は単独でも又は組合せて用いてもよ
く、例えば多数細菌抗原、多数ウイルス抗原、多数マイ
コプラズマ抗原、多数リケッチア抗原、多数細菌もしく
はウイルストキソイド、多数アレルゲン、多数タンパク
質、多数ペプチド又は前記産物のいずれかの組合せがＭ
ＩＥＰと複合化できる。
く、例えば多数細菌抗原、多数ウイルス抗原、多数マイ
コプラズマ抗原、多数リケッチア抗原、多数細菌もしく
はウイルストキソイド、多数アレルゲン、多数タンパク
質、多数ペプチド又は前記産物のいずれかの組合せがＭ
ＩＥＰと複合化できる。
【００２１】特に重要な抗原は、格別限定されずＢ．パ
ーツシス(B.pertussis) 、レプトスピラ・ポモナ(Lepto
spira pomona) 及びイクテロヘモラギア(icterohaemorr
hagiae) 、Ｓ．パラチフィ(S.paratyphi) Ａ及びＢ、
Ｃ．ジフテリア(C.diphtheriae) 、Ｃ．テタニ(C.tetan
i)、Ｃ．ボツリナム(C.botulinum) 、Ｃ．パーフリンゲ
ンス(C.perfringens) 、Ｃ．フェセリ(C.feseri)並びに
他のガス壊疽細菌Ｂ．アントラシス(B.anthracis) 、
Ｙ．ペスチス(Y.pestis)、Ｐ．マルトシダ(P.multocid
a) 、Ｖ．チョレラ(V.cholerae)、ネセリア・メニンギ
チジス、Ｎ．ゴノレア(N.gonorrheae)、ヘモフィラス・
インフルエンザ、トレポネマ・パリダム(Treponema pal
lidum)等を含めた細菌；格別限定されず腫瘍細胞、ウイ
ルス感染細胞、遺伝子工学処理細胞、培養細胞又は組織
抽出物中で増殖された細胞等を含めた哺乳動物細胞；格
別限定されずヒト向Ｔリンパ球性ウイルス（多数タイ
プ）、ヒト免疫不全ウイルス（多数の変異体及びタイ
プ）、ポリオウイルス（多数タイプ）、ヒトパピローマ
ウイルス（多数タイプ）、アデノウイルス（多数タイ
プ）、パラインフルエンザウイルス（多数タイプ）、麻
疹、耳下腺炎、呼吸シンシチウムウイルス、インフルエ
ンザウイルス（様々なタイプ）、輸送熱ウイルス（ＳＦ
4）、西部及び東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、日本Ｂ脳脊
髄炎、ロシア春−夏脳脊髄炎、ブタコレラウイルス、ニ
ューカッスル病ウイルス、鶏痘、狂犬病、ネコ及びイヌ
ジステンパー等のウイルスを含めたウイルス；格別限定
されず発疹チフス及び発疹熱又は斑点熱群の他のものを
含めたリケッチア；様々なクモ及びヘビ毒液又は格別限
定されずブタクサ、ハウスダスト、花粉抽出物、草花粉
等のものを含めたいずれか公知のアレルゲンから誘導さ
れる。
ーツシス(B.pertussis) 、レプトスピラ・ポモナ(Lepto
spira pomona) 及びイクテロヘモラギア(icterohaemorr
hagiae) 、Ｓ．パラチフィ(S.paratyphi) Ａ及びＢ、
Ｃ．ジフテリア(C.diphtheriae) 、Ｃ．テタニ(C.tetan
i)、Ｃ．ボツリナム(C.botulinum) 、Ｃ．パーフリンゲ
ンス(C.perfringens) 、Ｃ．フェセリ(C.feseri)並びに
他のガス壊疽細菌Ｂ．アントラシス(B.anthracis) 、
Ｙ．ペスチス(Y.pestis)、Ｐ．マルトシダ(P.multocid
a) 、Ｖ．チョレラ(V.cholerae)、ネセリア・メニンギ
チジス、Ｎ．ゴノレア(N.gonorrheae)、ヘモフィラス・
インフルエンザ、トレポネマ・パリダム(Treponema pal
lidum)等を含めた細菌；格別限定されず腫瘍細胞、ウイ
ルス感染細胞、遺伝子工学処理細胞、培養細胞又は組織
抽出物中で増殖された細胞等を含めた哺乳動物細胞；格
別限定されずヒト向Ｔリンパ球性ウイルス（多数タイ
プ）、ヒト免疫不全ウイルス（多数の変異体及びタイ
プ）、ポリオウイルス（多数タイプ）、ヒトパピローマ
ウイルス（多数タイプ）、アデノウイルス（多数タイ
プ）、パラインフルエンザウイルス（多数タイプ）、麻
疹、耳下腺炎、呼吸シンシチウムウイルス、インフルエ
ンザウイルス（様々なタイプ）、輸送熱ウイルス（ＳＦ
4）、西部及び東部ウマ脳脊髄炎ウイルス、日本Ｂ脳脊
髄炎、ロシア春−夏脳脊髄炎、ブタコレラウイルス、ニ
ューカッスル病ウイルス、鶏痘、狂犬病、ネコ及びイヌ
ジステンパー等のウイルスを含めたウイルス；格別限定
されず発疹チフス及び発疹熱又は斑点熱群の他のものを
含めたリケッチア；様々なクモ及びヘビ毒液又は格別限
定されずブタクサ、ハウスダスト、花粉抽出物、草花粉
等のものを含めたいずれか公知のアレルゲンから誘導さ
れる。
【００２２】本発明の多糖類は酸基があるいかなる細菌
多糖類であってもよく、いずれか特定のタイプに限定さ
れない。このような細菌多糖類の例としてはストレプト
コッカス・ニューモニア(Streptococcus pneamoniae)
（肺炎双球菌）タイプ６Ａ、６Ｂ、１０Ａ、１１Ａ、１
８Ｃ、１９Ａ、１９ｆ、２０、２２Ｆ及び２３Ｆ多糖
類；グループＢストレプトコッカスタイプＩａ、Ｉｂ、
II及びIII ；ヘモフィラス・インフルエンザ血清タイプ
ｂ多糖；ネイセリア・メニンギチジス血清グループＡ、
Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、Ｗ１３５及び２９Ｅ多糖類；並びに大
腸菌Ｋ１、Ｋ１２、Ｋ１３、Ｋ９２及びＫ１００多糖類
がある。しかしながら、特に好ましい多糖類はローゼン
バーグら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー、第２３６巻、第２８４５−２８４９頁、１９６
１年[Rosenberg et al.,J.Biol.Chem., ２３６，２８４
５−２８４９（１９６１）〕及びザメンホフ(Zamenhof)
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第２０３巻、第６９５−７０４頁、１９５３年で記
載されるようなＨ．インフルエンザ血清タイプｂ多糖
類；ロビンス(Robbins) ら、インフェクション・アンド
・イムニティ、第２６巻、第３号、第１１１６−１１２
２頁（１９７９年１２月）で記載されるようなスタフィ
ロコッカス・ニューモニア（肺炎双球菌）タイプ６Ｂ又
はタイプ６Ａ多糖類；Ｃ．Ｊ．リーら、レビューズ・オ
ブ・インフェクションス・ディジーゼス、第３巻、第２
号、第３２３−３３１頁、１９８１年[C.J.Lee et al.,
Reviews of Infectious Diseases, ３，No. ２，３２３
−３３１（１９８１）〕で記載されるような肺炎双球菌
タイプ１９Ｆ多糖類；並びにＯ．ラームら、アドバ・カ
ルボヒド・ケミ・アンド・バイオケミ、第３３巻、第２
９５−３２１頁、Ｒ．Ｓ．Tipsonら編集、アカデミック
・プレス、１９７６年（O.Larm et al.,Adv.Carbohyd.C
hem.and Biochem., ３３，２９５−３２１,R.S.Tipson
et al.,ed.,Academic Press,１９７６）で記載されるよ
うな肺炎双球菌タイプ２３Ｆ多糖類からなる群より選択
される莢膜多糖類である。
多糖類であってもよく、いずれか特定のタイプに限定さ
れない。このような細菌多糖類の例としてはストレプト
コッカス・ニューモニア(Streptococcus pneamoniae)
（肺炎双球菌）タイプ６Ａ、６Ｂ、１０Ａ、１１Ａ、１
８Ｃ、１９Ａ、１９ｆ、２０、２２Ｆ及び２３Ｆ多糖
類；グループＢストレプトコッカスタイプＩａ、Ｉｂ、
II及びIII ；ヘモフィラス・インフルエンザ血清タイプ
ｂ多糖；ネイセリア・メニンギチジス血清グループＡ、
Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、Ｗ１３５及び２９Ｅ多糖類；並びに大
腸菌Ｋ１、Ｋ１２、Ｋ１３、Ｋ９２及びＫ１００多糖類
がある。しかしながら、特に好ましい多糖類はローゼン
バーグら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー、第２３６巻、第２８４５−２８４９頁、１９６
１年[Rosenberg et al.,J.Biol.Chem., ２３６，２８４
５−２８４９（１９６１）〕及びザメンホフ(Zamenhof)
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第２０３巻、第６９５−７０４頁、１９５３年で記
載されるようなＨ．インフルエンザ血清タイプｂ多糖
類；ロビンス(Robbins) ら、インフェクション・アンド
・イムニティ、第２６巻、第３号、第１１１６−１１２
２頁（１９７９年１２月）で記載されるようなスタフィ
ロコッカス・ニューモニア（肺炎双球菌）タイプ６Ｂ又
はタイプ６Ａ多糖類；Ｃ．Ｊ．リーら、レビューズ・オ
ブ・インフェクションス・ディジーゼス、第３巻、第２
号、第３２３−３３１頁、１９８１年[C.J.Lee et al.,
Reviews of Infectious Diseases, ３，No. ２，３２３
−３３１（１９８１）〕で記載されるような肺炎双球菌
タイプ１９Ｆ多糖類；並びにＯ．ラームら、アドバ・カ
ルボヒド・ケミ・アンド・バイオケミ、第３３巻、第２
９５−３２１頁、Ｒ．Ｓ．Tipsonら編集、アカデミック
・プレス、１９７６年（O.Larm et al.,Adv.Carbohyd.C
hem.and Biochem., ３３，２９５−３２１,R.S.Tipson
et al.,ed.,Academic Press,１９７６）で記載されるよ
うな肺炎双球菌タイプ２３Ｆ多糖類からなる群より選択
される莢膜多糖類である。
【００２３】ＭＩＥＰは米国特許第４，４５９，２８６
号及び米国特許第４，８３０，８５２号明細書で記載さ
れたような常法に従い増殖されたＮ．メニンギチジスの
培養物から得られるＯＭＰＣから精製できる。ＯＭＰＣ
精製は米国特許第４，２７１，１４７号、第４，４５
９，２８６号及び第４，８３０，８５２号明細書で記載
された方法に従い行うことができる。
号及び米国特許第４，８３０，８５２号明細書で記載さ
れたような常法に従い増殖されたＮ．メニンギチジスの
培養物から得られるＯＭＰＣから精製できる。ＯＭＰＣ
精製は米国特許第４，２７１，１４７号、第４，４５
９，２８６号及び第４，８３０，８５２号明細書で記載
された方法に従い行うことができる。
【００２４】ＭＩＥＰはＭＩＥＰについてコードする組
換えＤＮＡの発現により組換えＤＮＡ工学処理宿主細胞
からも得ることができる。ＭＩＥＰについてコードする
ＤＮＡはＮ．メニンギチジス細胞から得ても（ムラカ
ミ、Ｋ．ら、１９８９年、インフェクション・アンド・
イムニティ、第５７巻、第２３１８頁）又はそのＤＮＡ
は標準ＤＮＡ合成技術を用いて合成製造してもよい。Ｍ
ＩＥＰについてコードするＤＮＡは格別限定されないが
組換えＭＩＥＰを産生する細菌、酵母、昆虫、哺乳動物
又は他の動物細胞を含めた組換え宿主細胞で発現させる
ことができる。ＭＩＥＰを得るために本発明で好ましい
方法はＯＭＰＣからのＭＩＥＰの精製及びＮ．メニンギ
チジスから誘導されるＭＩＥＰコードＤＮＡの組換えＤ
ＮＡ発現である。
換えＤＮＡの発現により組換えＤＮＡ工学処理宿主細胞
からも得ることができる。ＭＩＥＰについてコードする
ＤＮＡはＮ．メニンギチジス細胞から得ても（ムラカ
ミ、Ｋ．ら、１９８９年、インフェクション・アンド・
イムニティ、第５７巻、第２３１８頁）又はそのＤＮＡ
は標準ＤＮＡ合成技術を用いて合成製造してもよい。Ｍ
ＩＥＰについてコードするＤＮＡは格別限定されないが
組換えＭＩＥＰを産生する細菌、酵母、昆虫、哺乳動物
又は他の動物細胞を含めた組換え宿主細胞で発現させる
ことができる。ＭＩＥＰを得るために本発明で好ましい
方法はＯＭＰＣからのＭＩＥＰの精製及びＮ．メニンギ
チジスから誘導されるＭＩＥＰコードＤＮＡの組換えＤ
ＮＡ発現である。
【００２５】精製されたＭＩＥＰはベシクルのドデシル
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶解しかる後ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によってＯＭＰＣ
ベシクルから製造された。ＭＩＥＰはゲルから溶出さ
れ、高pH緩衝液に対して透析され、濃縮された。ポリア
クリルアミドゲル電気泳動の標準的方法はＯＭＰＣベシ
クルからＭＩＥＰを精製するために利用できる。このよ
うな方法は分子クローニング：実験マニュアル、サムブ
ルック、Ｊ．ら、１９８９年、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク[Molec
ular Cloning:A Laboratory Manual,Sambrook,J.et a
l., （１９８９）,Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss,New York]及び分子生物学における現在のプロトコー
ル、１９８７年、オースベル、Ｆ．Ｍ．ら編集、ウィリ
ー・アンド・サンズ、ニューヨーク[Current Protocols
In Molecular Biology （１９８７）,Ausubel F.M.et
al.,editors,Wiley and Sons,New York]で記載されてい
る。
硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶解しかる後ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によってＯＭＰＣ
ベシクルから製造された。ＭＩＥＰはゲルから溶出さ
れ、高pH緩衝液に対して透析され、濃縮された。ポリア
クリルアミドゲル電気泳動の標準的方法はＯＭＰＣベシ
クルからＭＩＥＰを精製するために利用できる。このよ
うな方法は分子クローニング：実験マニュアル、サムブ
ルック、Ｊ．ら、１９８９年、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク[Molec
ular Cloning:A Laboratory Manual,Sambrook,J.et a
l., （１９８９）,Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss,New York]及び分子生物学における現在のプロトコー
ル、１９８７年、オースベル、Ｆ．Ｍ．ら編集、ウィリ
ー・アンド・サンズ、ニューヨーク[Current Protocols
In Molecular Biology （１９８７）,Ausubel F.M.et
al.,editors,Wiley and Sons,New York]で記載されてい
る。
【００２６】ＳＤＳポリアクリルアミドゲルからタンパ
ク質を溶出させる標準的方法はハンカピラー、Ｍ．Ｗ．
及びルジャン、Ｅ．，１９８６年、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によるマイクログラム量のタンパク質の精
製、タンパク質微量特徴化方法（Ｊ．シビリー編集）、
フマンナ・プレス、クリフトン、ニュージャージー州[H
unkapiller,M.W.and Lujan,E. （１９８６）,Purificat
ion Of Microgram Quantities Of Proteins By Polyacr
ylamide Gel Electrophoresis,in Methods ofProtein M
icrocharacterization(J.Shively editor)Humanna Pres
s,Clifton,N.J.]及び分子生物学における現在のプロト
コール、１９８７年、オースベル、Ｆ．Ｍ．ら編集、ウ
ィリー・アンド・サンズ、ニューヨークで記載されてい
る。
ク質を溶出させる標準的方法はハンカピラー、Ｍ．Ｗ．
及びルジャン、Ｅ．，１９８６年、ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によるマイクログラム量のタンパク質の精
製、タンパク質微量特徴化方法（Ｊ．シビリー編集）、
フマンナ・プレス、クリフトン、ニュージャージー州[H
unkapiller,M.W.and Lujan,E. （１９８６）,Purificat
ion Of Microgram Quantities Of Proteins By Polyacr
ylamide Gel Electrophoresis,in Methods ofProtein M
icrocharacterization(J.Shively editor)Humanna Pres
s,Clifton,N.J.]及び分子生物学における現在のプロト
コール、１９８７年、オースベル、Ｆ．Ｍ．ら編集、ウ
ィリー・アンド・サンズ、ニューヨークで記載されてい
る。
【００２７】この方法で製造されたＭＩＥＰは細菌、ウ
イルス、哺乳動物細胞、リケッチア、アレルゲン、毒物
又は毒液、真菌、ペプチド、タンパク質、多糖類から誘
導される抗原又は他のいずれかの抗原との複合化に容易
に適合する。
イルス、哺乳動物細胞、リケッチア、アレルゲン、毒物
又は毒液、真菌、ペプチド、タンパク質、多糖類から誘
導される抗原又は他のいずれかの抗原との複合化に容易
に適合する。
【００２８】組換えＭＩＥＰは細菌、例えば大腸菌又は
酵母、例えばＳ．セレビシアエにおいてＭＩＥＰについ
てコードするゲノムＮ．メニンギチジスＤＮＡの発現に
より製造できる。ＭＩＥＰについてコードするゲノムＤ
ＮＡを得るため、ゲノムＤＮＡはＮ．メニンギチジスか
ら抽出され、マニアティス、Ｔ．ら、１９７８年、セル
(Cell)、第１５巻、第６８７頁の技術に従い高分子量Ｄ
ＮＡのランダム断片化によるか又はスミシーズら、１９
７８年、サイエンス、第２０２巻、第１２４８頁[Smith
ies,et al.（１９７８）,Science, ２０２，pp. １２４
８〕の方法による制限エンドヌクレアーゼでの開裂によ
ってクローニング用に調製される。次いでゲノムＤＮＡ
は適切なクローニングベクター、例えばラムダファージ
に組込まれる（サムブルック、Ｊ．ら、１９８９年、分
子クローニング：実験マニュアル、コールド・スプリン
グ・ハーバー・プレス、ニューヨーク参照）。一方、ポ
リメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術〔パーキン・エルマー
(Perkin Elmer)〕はゲノムＤＮＡにおいて特定のＤＮＡ
配列を増幅させるために用いることができる〔ロウクス
ら、１９８９年、バイオテクニクス、第８巻、第４８頁
(Roux et al., １９８９，Biotechniques,８，pp．４
８）〕。ＰＣＲ処理ではゲノムＤＮＡにおいて特定のＤ
ＮＡ配列とハイブリッド形成しうるＤＮＡオリゴヌクレ
オチドを要する。Ｎ．メニンギチジスゲノムＤＮＡ中の
ＭＩＥＰ ＤＮＡとハイブリッド形成しうるＤＮＡオリ
ゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は、ＭＩＥＰのアミノ酸配
列から又はＮ．メニンギチジスのクラスII主要膜タンパ
ク質に関して決定されたＤＮＡ配列を参照して決定する
ことができる（ムラカミ、Ｋ．ら、１９８９年、インフ
ェクション・アンド・イムニティ、第５７巻、第２３１
８頁）。
酵母、例えばＳ．セレビシアエにおいてＭＩＥＰについ
てコードするゲノムＮ．メニンギチジスＤＮＡの発現に
より製造できる。ＭＩＥＰについてコードするゲノムＤ
ＮＡを得るため、ゲノムＤＮＡはＮ．メニンギチジスか
ら抽出され、マニアティス、Ｔ．ら、１９７８年、セル
(Cell)、第１５巻、第６８７頁の技術に従い高分子量Ｄ
ＮＡのランダム断片化によるか又はスミシーズら、１９
７８年、サイエンス、第２０２巻、第１２４８頁[Smith
ies,et al.（１９７８）,Science, ２０２，pp. １２４
８〕の方法による制限エンドヌクレアーゼでの開裂によ
ってクローニング用に調製される。次いでゲノムＤＮＡ
は適切なクローニングベクター、例えばラムダファージ
に組込まれる（サムブルック、Ｊ．ら、１９８９年、分
子クローニング：実験マニュアル、コールド・スプリン
グ・ハーバー・プレス、ニューヨーク参照）。一方、ポ
リメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術〔パーキン・エルマー
(Perkin Elmer)〕はゲノムＤＮＡにおいて特定のＤＮＡ
配列を増幅させるために用いることができる〔ロウクス
ら、１９８９年、バイオテクニクス、第８巻、第４８頁
(Roux et al., １９８９，Biotechniques,８，pp．４
８）〕。ＰＣＲ処理ではゲノムＤＮＡにおいて特定のＤ
ＮＡ配列とハイブリッド形成しうるＤＮＡオリゴヌクレ
オチドを要する。Ｎ．メニンギチジスゲノムＤＮＡ中の
ＭＩＥＰ ＤＮＡとハイブリッド形成しうるＤＮＡオリ
ゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は、ＭＩＥＰのアミノ酸配
列から又はＮ．メニンギチジスのクラスII主要膜タンパ
ク質に関して決定されたＤＮＡ配列を参照して決定する
ことができる（ムラカミ、Ｋ．ら、１９８９年、インフ
ェクション・アンド・イムニティ、第５７巻、第２３１
８頁）。
【００２９】組換えＭＩＥＰはＭＩＥＰに特異的なモノ
クローナル又はポリクローナル抗体で作製されるアフィ
ニティカラムの使用により他の細胞タンパク質から分離
できる。これらのアフィニティカラムは、抗体がアガロ
ースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようにＮ−
ヒドロキシスクシンイミドエステルで前活性化されたゲ
ル支持体アフィゲル−１０(Affigel−１０）〔バイオラ
ッド(Biorad)〕に抗体を加えることで作製される。次い
で抗体はスペーサーアームでアミド結合を介してゲルに
カップリングされる。次いで残りの活性化エステルが１
ＭエタノールアミンＨＣｌ（pH８）で消失される。カラ
ムは非複合化抗体又は外来タンパク質を除去するため水
しかる後０．２３ＭグリシンＨＣｌ（pH２．６）で洗浄
される。次いでカラムはリン酸緩衝液（pH７．３）で平
衡化され、ＭＩＥＰを含有した細胞培養上澄又は細胞抽
出物がカラムに徐々に通される。次いでカラムは光学密
度（Ａ280 ）がバックグラウンドに低下するまでリン酸
緩衝液で洗浄され、しかる後タンパク質が０．２３Ｍグ
リシンＨＣｌ（pH２．６）で溶出される。次いでタンパ
ク質はリン酸緩衝液に対して透析される。
クローナル又はポリクローナル抗体で作製されるアフィ
ニティカラムの使用により他の細胞タンパク質から分離
できる。これらのアフィニティカラムは、抗体がアガロ
ースゲルビーズ支持体と共有結合を形成するようにＮ−
ヒドロキシスクシンイミドエステルで前活性化されたゲ
ル支持体アフィゲル−１０(Affigel−１０）〔バイオラ
ッド(Biorad)〕に抗体を加えることで作製される。次い
で抗体はスペーサーアームでアミド結合を介してゲルに
カップリングされる。次いで残りの活性化エステルが１
ＭエタノールアミンＨＣｌ（pH８）で消失される。カラ
ムは非複合化抗体又は外来タンパク質を除去するため水
しかる後０．２３ＭグリシンＨＣｌ（pH２．６）で洗浄
される。次いでカラムはリン酸緩衝液（pH７．３）で平
衡化され、ＭＩＥＰを含有した細胞培養上澄又は細胞抽
出物がカラムに徐々に通される。次いでカラムは光学密
度（Ａ280 ）がバックグラウンドに低下するまでリン酸
緩衝液で洗浄され、しかる後タンパク質が０．２３Ｍグ
リシンＨＣｌ（pH２．６）で溶出される。次いでタンパ
ク質はリン酸緩衝液に対して透析される。
【００３０】本発明の複合体はいかなる安定な多糖−Ｍ
ＩＥＰ複合体でも又は合成ペプチド抗体を含めていかな
る他の抗原−ＭＩＥＰ複合体であってもよい。合成ペプ
チドは細菌、リケッチア、ウイルス（ヒト免疫不全ウイ
ルスを含む）、哺乳動物細胞又は寄生虫を含めた他の真
核細胞、毒物もしくは毒液又はアレルゲンからの抗原決
定基を含めていかなる抗原の抗原決定基も１以上有して
いてよい。抗原−ＭＩＥＰ複合体は多糖及びＭＩＥＰと
加水分解不安定性共有結合を形成するチオエーテル基及
び一級アミンを含めた二属スペーサーでカップリングさ
れる。しかしながら本発明で好ましい複合体は式Ｐｓ−
Ａ−Ｅ−Ｓ−Ｂ−Ｐｒｏ又はＰｓ−Ａ’−Ｓ−Ｅ’−
Ｂ’−Ｐｒｏで示される複合体であり、その場合にＰｓ
は多糖又は他のいずれかの抗原を表す；Ｐｒｏは細菌タ
ンパク質ＭＩＥＰを表す；Ａ−Ｅ−Ｓ−Ｂ及びＡ’−Ｓ
−Ｅ’−Ｂ’は加水分解安定性共有チオエーテル結合を
含みかつ高分子Ｐｒｏ及びＰｓと（加水分解不安定性エ
ステル又はアミド結合のような）共有結合を形成する二
属スペーサーを構成している。スペーサーＡ−Ｅ−Ｓ−
Ｂにおいて、Ｓはイオウである；Ｅはチオール基と反応
せしめられた親チオ基の変換産物であり、
ＩＥＰ複合体でも又は合成ペプチド抗体を含めていかな
る他の抗原−ＭＩＥＰ複合体であってもよい。合成ペプ
チドは細菌、リケッチア、ウイルス（ヒト免疫不全ウイ
ルスを含む）、哺乳動物細胞又は寄生虫を含めた他の真
核細胞、毒物もしくは毒液又はアレルゲンからの抗原決
定基を含めていかなる抗原の抗原決定基も１以上有して
いてよい。抗原−ＭＩＥＰ複合体は多糖及びＭＩＥＰと
加水分解不安定性共有結合を形成するチオエーテル基及
び一級アミンを含めた二属スペーサーでカップリングさ
れる。しかしながら本発明で好ましい複合体は式Ｐｓ−
Ａ−Ｅ−Ｓ−Ｂ−Ｐｒｏ又はＰｓ−Ａ’−Ｓ−Ｅ’−
Ｂ’−Ｐｒｏで示される複合体であり、その場合にＰｓ
は多糖又は他のいずれかの抗原を表す；Ｐｒｏは細菌タ
ンパク質ＭＩＥＰを表す；Ａ−Ｅ−Ｓ−Ｂ及びＡ’−Ｓ
−Ｅ’−Ｂ’は加水分解安定性共有チオエーテル結合を
含みかつ高分子Ｐｒｏ及びＰｓと（加水分解不安定性エ
ステル又はアミド結合のような）共有結合を形成する二
属スペーサーを構成している。スペーサーＡ−Ｅ−Ｓ−
Ｂにおいて、Ｓはイオウである；Ｅはチオール基と反応
せしめられた親チオ基の変換産物であり、
【化１】 （上記式中ＲはＨ又はＣＨ3 である；ｐは１〜３であ
る）で示される；Ａは
る）で示される；Ａは
【化２】 である〔上記式中ＷはＯ又はＮＨである；ｍは０〜４で
ある；ｎは０〜３である；ＹはＣＨ2 、Ｏ、Ｓ、ＮＲ’
又はＣＨＣＯ2 Ｈである（Ｒ’はＨ又はＣ1 −Ｃ2 アル
キルである）；但しＹがＣＨ2 である場合ｍ及びｎの双
方は共にゼロとならず、ＹがＯ又はＳである場合ｍは２
以上、ｎは２以上である〕；Ｂは−（ＣＨ2 ）p ＣＨ
（Ｚ）（ＣＨ2 ）q Ｄ−である（上記式中ｑは０〜２で
ある；ＺはＮＨ2 、ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＯＯＨ又は
Ｈである；Ｒ’及びｐは前記と同義である；ＤはＣ＝
Ｏ、ＮＲ’又はＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ2 ）2 Ｃ（＝
Ｏ）である）。次にスペーサーＡ’−Ｓ−Ｅ’−Ｂ’に
おいて、Ｓはイオウである；Ａ’は−Ｃ（＝Ｗ）ＮＨ
（ＣＨ2 ）a Ｒ''−である〔式中ａは１〜４である；
Ｒ''はＣＨ2 又はＮＨＣ（＝Ｏ）Ｃ（−Ｙ’）（ＣＨ
2 ）p （Ｙ’はＮＨ2 又はＮＨＣＯＲ’である）であ
る；Ｗ、ｐ及びＲ’は前記と同義である〕；Ｅ’はチオ
ール基と反応せしめられた親チオ基の変換産物であって
−Ｃ（−Ｒ）Ｈ−（Ｒは前記と同義である）で示され、
Ｂ’は−Ｃ（＝Ｏ）−であるか；又はＥ’は
ある；ｎは０〜３である；ＹはＣＨ2 、Ｏ、Ｓ、ＮＲ’
又はＣＨＣＯ2 Ｈである（Ｒ’はＨ又はＣ1 −Ｃ2 アル
キルである）；但しＹがＣＨ2 である場合ｍ及びｎの双
方は共にゼロとならず、ＹがＯ又はＳである場合ｍは２
以上、ｎは２以上である〕；Ｂは−（ＣＨ2 ）p ＣＨ
（Ｚ）（ＣＨ2 ）q Ｄ−である（上記式中ｑは０〜２で
ある；ＺはＮＨ2 、ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ’、ＣＯＯＨ又は
Ｈである；Ｒ’及びｐは前記と同義である；ＤはＣ＝
Ｏ、ＮＲ’又はＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ2 ）2 Ｃ（＝
Ｏ）である）。次にスペーサーＡ’−Ｓ−Ｅ’−Ｂ’に
おいて、Ｓはイオウである；Ａ’は−Ｃ（＝Ｗ）ＮＨ
（ＣＨ2 ）a Ｒ''−である〔式中ａは１〜４である；
Ｒ''はＣＨ2 又はＮＨＣ（＝Ｏ）Ｃ（−Ｙ’）（ＣＨ
2 ）p （Ｙ’はＮＨ2 又はＮＨＣＯＲ’である）であ
る；Ｗ、ｐ及びＲ’は前記と同義である〕；Ｅ’はチオ
ール基と反応せしめられた親チオ基の変換産物であって
−Ｃ（−Ｒ）Ｈ−（Ｒは前記と同義である）で示され、
Ｂ’は−Ｃ（＝Ｏ）−であるか；又はＥ’は
【化３】 であり、Ｂ’は−（ＣＨ2 ）p Ｃ（＝Ｏ）−（ｐは１〜
３である）である。更に二属スペーサーＡ−Ｅ−Ｓ−Ｂ
及びＡ’−Ｓ−Ｅ’−Ｂ’のうちＥ−Ｓ−Ｂ及びＡ’−
Ｓ−Ｅ’成分は決定可能かつ定量可能であり、この同一
性は共有結合修正多糖から派生するチオエーテルイオウ
の側鎖を官能化タンパク質から派生するスペーサーの側
鎖と結合させる複合体結合の共有原子価を反映してい
る。
３である）である。更に二属スペーサーＡ−Ｅ−Ｓ−Ｂ
及びＡ’−Ｓ−Ｅ’−Ｂ’のうちＥ−Ｓ−Ｂ及びＡ’−
Ｓ−Ｅ’成分は決定可能かつ定量可能であり、この同一
性は共有結合修正多糖から派生するチオエーテルイオウ
の側鎖を官能化タンパク質から派生するスペーサーの側
鎖と結合させる複合体結合の共有原子価を反映してい
る。
【００３１】本発明による複合体Ｐｓ−Ａ−Ｅ−Ｓ−Ｂ
−Ｐｒｏは成分が特に二酸化炭素、１，４−ブタンジア
ミン及びＳ−カルボキシメチル−Ｎ−アセチルホモシス
テイン；二酸化炭素、１，５−ペンタンジアミン及びＳ
−カルボキシメチル−Ｎ−アセチルホモシステイン；二
酸化炭素、３−オキサ−１，５−ペンタンジアミン及び
Ｓ−カルボキシメチル−Ｎ−アセチルホモシステイン；
二酸化炭素、１，４−ブタンジアミン及びＳ−カルボキ
シメチル−Ｎ−アセチルシステイン；二酸化炭素、１，
３−プロパンジアミン及びＳ−カルボキシメチル−Ｎ−
ベンゾイルホモシステイン；二酸化炭素、３−アザ−
１，５−ペンタンジアミン及びＳ−カルボキシメチル−
Ｎ−アセチルシステイン；並びに二酸化炭素、１，２−
エタンジアミン、グリシン及びＳ−（スクシン−２−イ
ル）−Ｎ−アセチルホモシステインの誘導体であるスペ
ーサーを含んでいてもよい。本発明による複合体Ｐｓ−
Ａ’−Ｓ−Ｅ’−Ｂ’−Ｐｒｏは成分が特に二酸化炭素
及びＳ−カルボキシメチルシステアミン；二酸化炭素及
びＳ−（α−カルボキシエチル）システアミン；二酸化
炭素及びＳ−カルボキシメチルホモシステアミン；二酸
化炭素、Ｓ−（スクシン−２−イル）システアミン及び
グリシン；並びに二酸化炭素及びＳ−カルボキシメチル
システインの誘導体であるスペーサーを含んでいてもよ
い。
−Ｐｒｏは成分が特に二酸化炭素、１，４−ブタンジア
ミン及びＳ−カルボキシメチル−Ｎ−アセチルホモシス
テイン；二酸化炭素、１，５−ペンタンジアミン及びＳ
−カルボキシメチル−Ｎ−アセチルホモシステイン；二
酸化炭素、３−オキサ−１，５−ペンタンジアミン及び
Ｓ−カルボキシメチル−Ｎ−アセチルホモシステイン；
二酸化炭素、１，４−ブタンジアミン及びＳ−カルボキ
シメチル−Ｎ−アセチルシステイン；二酸化炭素、１，
３−プロパンジアミン及びＳ−カルボキシメチル−Ｎ−
ベンゾイルホモシステイン；二酸化炭素、３−アザ−
１，５−ペンタンジアミン及びＳ−カルボキシメチル−
Ｎ−アセチルシステイン；並びに二酸化炭素、１，２−
エタンジアミン、グリシン及びＳ−（スクシン−２−イ
ル）−Ｎ−アセチルホモシステインの誘導体であるスペ
ーサーを含んでいてもよい。本発明による複合体Ｐｓ−
Ａ’−Ｓ−Ｅ’−Ｂ’−Ｐｒｏは成分が特に二酸化炭素
及びＳ−カルボキシメチルシステアミン；二酸化炭素及
びＳ−（α−カルボキシエチル）システアミン；二酸化
炭素及びＳ−カルボキシメチルホモシステアミン；二酸
化炭素、Ｓ−（スクシン−２−イル）システアミン及び
グリシン；並びに二酸化炭素及びＳ−カルボキシメチル
システインの誘導体であるスペーサーを含んでいてもよ
い。
【００３２】本発明のプロセスにおいて、多糖は（ａ）
それを非ヒドロキシル有機溶媒に溶解し、しかる後
（ｂ）それを二官能性試薬で活性化し、（ｃ）この活性
化された多糖をビス親核剤と反応させ、最後に必要であ
れば更に（ｄ）この修正された多糖を（ｉ）親電子（例
えば親チオール）部位形成試薬又は（ii）チオール基形
成試薬との反応で官能化することにより共有結合修正さ
れる。逆に、タンパク質は（ｉ）チオール基形成試薬又
は（ii）親チオール部位形成試薬と反応せしめられ、し
かる後共有結合修正多糖及び官能化タンパク質が安定な
共有結合複合体を形成させるため互いに反応され、最終
混合物が未反応多糖及びタンパク質を除去するため精製
される。
それを非ヒドロキシル有機溶媒に溶解し、しかる後
（ｂ）それを二官能性試薬で活性化し、（ｃ）この活性
化された多糖をビス親核剤と反応させ、最後に必要であ
れば更に（ｄ）この修正された多糖を（ｉ）親電子（例
えば親チオール）部位形成試薬又は（ii）チオール基形
成試薬との反応で官能化することにより共有結合修正さ
れる。逆に、タンパク質は（ｉ）チオール基形成試薬又
は（ii）親チオール部位形成試薬と反応せしめられ、し
かる後共有結合修正多糖及び官能化タンパク質が安定な
共有結合複合体を形成させるため互いに反応され、最終
混合物が未反応多糖及びタンパク質を除去するため精製
される。
【００３３】本発明のプロセスでは側鎖親電子部位又は
側鎖チオール基のある共有結合修正多糖を形成するため
活性化多糖と反応する親核又はビス親核剤の選択を含ん
でおり、それによって共有結合修正多糖を共有結合修正
タンパク質と反応させる前に更にビス親核修正多糖を官
能化する必要性を解消している。しかもいずれかの部分
形へのタンパク質の官能化は２以上のステップにおいて
これらのステップでの反応剤の選択に応じて行ってよ
い。
側鎖チオール基のある共有結合修正多糖を形成するため
活性化多糖と反応する親核又はビス親核剤の選択を含ん
でおり、それによって共有結合修正多糖を共有結合修正
タンパク質と反応させる前に更にビス親核修正多糖を官
能化する必要性を解消している。しかもいずれかの部分
形へのタンパク質の官能化は２以上のステップにおいて
これらのステップでの反応剤の選択に応じて行ってよ
い。
【００３４】多糖を共有結合修正する第一ステップにお
いて、固体多糖は溶解されねばならない。多糖の親核ア
ルコール性ヒドロキシル基は水性溶液中で水のヒドロキ
シルと親電子試薬に関し化学的に競合してはならないた
め、多糖は非水性（非ヒドロキシル）溶媒に溶解される
べきである。適切な溶媒としてはジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ホ
ルムアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルイミダゾリジノン及び
他の類似の極性非プロトン溶媒、好ましくはジメチルホ
ルムアミドがある。
いて、固体多糖は溶解されねばならない。多糖の親核ア
ルコール性ヒドロキシル基は水性溶液中で水のヒドロキ
シルと親電子試薬に関し化学的に競合してはならないた
め、多糖は非水性（非ヒドロキシル）溶媒に溶解される
べきである。適切な溶媒としてはジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、ホ
ルムアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルイミダゾリジノン及び
他の類似の極性非プロトン溶媒、好ましくはジメチルホ
ルムアミドがある。
【００３５】これらの溶媒の使用に加えて、リン酸モノ
及びジエステルのような酸水素を有する多糖類（例え
ば、リボース・リビトールホスフェートポリマーである
Ｈ．インフルエンザタイプｂの莢膜多糖類）を適切な塩
形に変換して、多糖類を前記溶媒に容易に可溶化させ
る。これらの高分子中における酸性水素はトリもしくは
テトラ（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルアンモニウム、１−アザ
ビシクロ〔２．２．２〕オクタン、１，８−ジアザビシ
クロ〔５．４．０〕ウンデカ−７−エン又は同様の陽イ
オン、特にトリもしくはテトラ（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル
アンモニウムのような大疎水性陽イオンで置き換えても
よく、得られたリン酸化多糖類のトリもしくはテトラア
ルキルアンモニウム又は同様の塩は約１７〜５０℃で前
記溶媒に溶解するが、その際１分間〜１時間攪拌され
る。
及びジエステルのような酸水素を有する多糖類（例え
ば、リボース・リビトールホスフェートポリマーである
Ｈ．インフルエンザタイプｂの莢膜多糖類）を適切な塩
形に変換して、多糖類を前記溶媒に容易に可溶化させ
る。これらの高分子中における酸性水素はトリもしくは
テトラ（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキルアンモニウム、１−アザ
ビシクロ〔２．２．２〕オクタン、１，８−ジアザビシ
クロ〔５．４．０〕ウンデカ−７−エン又は同様の陽イ
オン、特にトリもしくはテトラ（Ｃ1 −Ｃ5 ）アルキル
アンモニウムのような大疎水性陽イオンで置き換えても
よく、得られたリン酸化多糖類のトリもしくはテトラア
ルキルアンモニウム又は同様の塩は約１７〜５０℃で前
記溶媒に溶解するが、その際１分間〜１時間攪拌され
る。
【００３６】部分的に加水分解されたＨ．インフルエン
ザ血清タイプＢ多糖はテトラブチルアンモニウム塩に変
換され、しかる後ジメチルスルホキシドに溶解されたが
〔エガンら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル
・ソサエティ、第１０４巻、第２８９８頁、１９８２年
(Egan et al.,J.Amer.Chem.Soc.,１０４，２８９８，１
９８２）〕、但しこの生成物はもはや抗原性でなく、し
たがってワクチン製造上無用である。逆に、本出願人ら
は多糖をテトラアルキルアンモニウム形で強酸陽イオン
交換樹脂に通すか又は好ましくは前記操作で多糖をテト
ラアルキルアンモニウムヒドロキシドで慎重に中和する
ことにより完全な未加水分解多糖の溶解を行うが、これ
によって免疫原性ワクチン用として多糖の存在能を保存
している。
ザ血清タイプＢ多糖はテトラブチルアンモニウム塩に変
換され、しかる後ジメチルスルホキシドに溶解されたが
〔エガンら、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル
・ソサエティ、第１０４巻、第２８９８頁、１９８２年
(Egan et al.,J.Amer.Chem.Soc.,１０４，２８９８，１
９８２）〕、但しこの生成物はもはや抗原性でなく、し
たがってワクチン製造上無用である。逆に、本出願人ら
は多糖をテトラアルキルアンモニウム形で強酸陽イオン
交換樹脂に通すか又は好ましくは前記操作で多糖をテト
ラアルキルアンモニウムヒドロキシドで慎重に中和する
ことにより完全な未加水分解多糖の溶解を行うが、これ
によって免疫原性ワクチン用として多糖の存在能を保存
している。
【００３７】次のステップは結合が望まれる単位の官能
化に普通又は実際上用いられる試薬と十分に反応性であ
るヒドロキシル基以外の多糖類上における官能基を欠い
た多糖類に共有結合させるために他の重要な物理化学的
制限を克服することに関する。活性化多糖を形成するた
め多糖の活性化、親核官能化多糖を形成するためビス親
核剤との反応及び親電子部位又はチオール基いずれかの
形成試薬での官能化はすべて複合化のため製造上多糖を
共有結合修正して多糖に官能基を形成させることに関す
る。
化に普通又は実際上用いられる試薬と十分に反応性であ
るヒドロキシル基以外の多糖類上における官能基を欠い
た多糖類に共有結合させるために他の重要な物理化学的
制限を克服することに関する。活性化多糖を形成するた
め多糖の活性化、親核官能化多糖を形成するためビス親
核剤との反応及び親電子部位又はチオール基いずれかの
形成試薬での官能化はすべて複合化のため製造上多糖を
共有結合修正して多糖に官能基を形成させることに関す
る。
【００３８】次のステップにおいて、可溶化された多糖
は活性剤対多糖の重要な重量比１：５〜１：１２範囲内
で１０分間〜１時間にわたり攪拌下約０〜５０℃で二官
能性試薬との反応により活性化される。従来、この活性
化は多糖と臭化シアンとの反応で行われた。しかしなが
ら、ビシナルジオール用の“傾向”を有する臭化シアン
で活性化された誘導体はリン酸緩衝液に対する透析中に
一時的安定性を示しただけである。したがって、臭化シ
アンによる活性化は本発明でなお可能であるが、この試
薬は多糖類の活性化にほとんど利用されず、好ましくな
い。代わりに多糖を活性化するために好ましい二官能性
試薬としてはカルボン酸誘導体Ｒ2 −Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ3
があり、その場合にＲ2 及びＲ3 は各々独立してイミダ
ゾリルのようなアゾリル；ハライド；又はｐ−ニトロフ
ェニルもしくはポリハロフェニルのようなフェニルエス
テルである。
は活性剤対多糖の重要な重量比１：５〜１：１２範囲内
で１０分間〜１時間にわたり攪拌下約０〜５０℃で二官
能性試薬との反応により活性化される。従来、この活性
化は多糖と臭化シアンとの反応で行われた。しかしなが
ら、ビシナルジオール用の“傾向”を有する臭化シアン
で活性化された誘導体はリン酸緩衝液に対する透析中に
一時的安定性を示しただけである。したがって、臭化シ
アンによる活性化は本発明でなお可能であるが、この試
薬は多糖類の活性化にほとんど利用されず、好ましくな
い。代わりに多糖を活性化するために好ましい二官能性
試薬としてはカルボン酸誘導体Ｒ2 −Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ3
があり、その場合にＲ2 及びＲ3 は各々独立してイミダ
ゾリルのようなアゾリル；ハライド；又はｐ−ニトロフ
ェニルもしくはポリハロフェニルのようなフェニルエス
テルである。
【００３９】特に好ましい試薬カルボニルジイミダゾー
ルはヒドロキシル基と反応して多糖のイミダゾリルウレ
タンを形成し、例えばニトロフェニルクロロホルメート
を含めたアリールクロロホルメートは多糖の混合カーボ
ネートを生じる。各ケースにおいて、得られた活性化多
糖はアミンのような親核試薬に対して非常に感受性であ
り、そのため各ウレタン類に変換される。
ルはヒドロキシル基と反応して多糖のイミダゾリルウレ
タンを形成し、例えばニトロフェニルクロロホルメート
を含めたアリールクロロホルメートは多糖の混合カーボ
ネートを生じる。各ケースにおいて、得られた活性化多
糖はアミンのような親核試薬に対して非常に感受性であ
り、そのため各ウレタン類に変換される。
【００４０】次の段階において、活性化された多糖はア
ミン、特にジアミン類、例えばＨ2Ｎ（ＣＨ2 ）m Ｙ
（ＣＨ2 ）n −ＮＨ2 〔ｍは０〜４である；ｎは０〜３
である；ＹはＣＨ2 、Ｏ、Ｓ、ＮＲ’、ＣＨＣＯ2 Ｈで
ある（Ｒ’はＨ又はＣ1 −Ｃ2アルキルである）；但し
ＹがＣＨ2 である場合ｍ及びｎの双方は共にゼロとなら
ず、ＹがＯ又はＳである場合ｍは２以上、ｎは２以上で
ある〕のような親核試薬と大過剰のアミン（即ち、例え
ば用いられる活性剤に対して５０〜１００倍モル過剰の
アミン）存在下で反応せしめられる。反応液は氷浴中で
１５分間〜１時間保たれ、しかる後約１７〜４０℃で１
５分間〜１時間保たれる。
ミン、特にジアミン類、例えばＨ2Ｎ（ＣＨ2 ）m Ｙ
（ＣＨ2 ）n −ＮＨ2 〔ｍは０〜４である；ｎは０〜３
である；ＹはＣＨ2 、Ｏ、Ｓ、ＮＲ’、ＣＨＣＯ2 Ｈで
ある（Ｒ’はＨ又はＣ1 −Ｃ2アルキルである）；但し
ＹがＣＨ2 である場合ｍ及びｎの双方は共にゼロとなら
ず、ＹがＯ又はＳである場合ｍは２以上、ｎは２以上で
ある〕のような親核試薬と大過剰のアミン（即ち、例え
ば用いられる活性剤に対して５０〜１００倍モル過剰の
アミン）存在下で反応せしめられる。反応液は氷浴中で
１５分間〜１時間保たれ、しかる後約１７〜４０℃で１
５分間〜１時間保たれる。
【００４１】活性化された多糖はジアミン、例えば１，
４−ブタンジアミンと反応した場合に側鎖アミンのある
ウレタン形の多糖を生じるが、その後でこれは更にアシ
ル化によって官能化してもよい。混合カーボネート類も
ジアミン類と容易に反応して、側鎖アミン基を生じる。
一方、活性化された多糖は側鎖親電子部位のある共有結
合修正多糖を得るためジアミノアルカンのモノハロアセ
トアミド、例えば４−ブロモアセトアミドブチルアミン
〔Ｗ．Ｂ．ローソンら、ホッペ・セイラーズ・ツァイシ
ュリフト・フュール・フィジオロジッシェ・ケミー、第
３４９巻、第２５１頁、１９６８年(W.B.Lawson et a
l.,Hoppe Seyler's Z.Physiol.Chem.,３４９，２５１，
１９６８）参照〕のような求核剤と反応させてもよい。
あるいは活性化された多糖は側鎖チオール基のある多糖
を得るためシステアミン（アミノエタンチオール）又は
システインのようなアミノチオールと反応させてもよい
が、その誘導体の例はペプチド合成業界で周知である。
双方のケースにおいて、追加の官能化は共有結合修正多
糖を修正細菌“キャリア”タンパク質とカップリングさ
せる前に不要である。
４−ブタンジアミンと反応した場合に側鎖アミンのある
ウレタン形の多糖を生じるが、その後でこれは更にアシ
ル化によって官能化してもよい。混合カーボネート類も
ジアミン類と容易に反応して、側鎖アミン基を生じる。
一方、活性化された多糖は側鎖親電子部位のある共有結
合修正多糖を得るためジアミノアルカンのモノハロアセ
トアミド、例えば４−ブロモアセトアミドブチルアミン
〔Ｗ．Ｂ．ローソンら、ホッペ・セイラーズ・ツァイシ
ュリフト・フュール・フィジオロジッシェ・ケミー、第
３４９巻、第２５１頁、１９６８年(W.B.Lawson et a
l.,Hoppe Seyler's Z.Physiol.Chem.,３４９，２５１，
１９６８）参照〕のような求核剤と反応させてもよい。
あるいは活性化された多糖は側鎖チオール基のある多糖
を得るためシステアミン（アミノエタンチオール）又は
システインのようなアミノチオールと反応させてもよい
が、その誘導体の例はペプチド合成業界で周知である。
双方のケースにおいて、追加の官能化は共有結合修正多
糖を修正細菌“キャリア”タンパク質とカップリングさ
せる前に不要である。
【００４２】多糖を製造する最終ステップにおいて、必
要であれば更に多糖の官能化は親核官能化多糖を親電子
（即ち、親チオ）部位を形成する試薬又はチオール基を
形成する試薬と反応させる形をとってもよい。
要であれば更に多糖の官能化は親核官能化多糖を親電子
（即ち、親チオ）部位を形成する試薬又はチオール基を
形成する試薬と反応させる形をとってもよい。
【００４３】親電子部位を形成する上で使用上適した試
薬としては、例えばＸ’Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ（−Ｒ）Ｘ（Ｒ
はＨ又はＣＨ3 である；ＸはＣｌ、Ｂｒ又はＩである；
Ｘ’はニトロフェノキシ、ジニトロフェノキシ、ペンタ
クロロフェノキシ、ペンタフルオロフェノキシ、ハライ
ド、Ｏ−（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル）又はアジ
ドである）のようなα−ハロアセチル又はα−ハロプロ
ピオニル誘導体にアシル化する試薬、特にクロロ酢酸又
はα−ブロモプロピオン酸があり、反応はpH８〜１１
（必要であれば塩基の添加でこの範囲内に維持され
る）、温度約０〜３５℃で１０分間〜１時間行われる。
アミノ誘導化多糖は、チオ置換をうけやすい適切に官能
化された多糖類を得るため、下記マレイミド基：
薬としては、例えばＸ’Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ（−Ｒ）Ｘ（Ｒ
はＨ又はＣＨ3 である；ＸはＣｌ、Ｂｒ又はＩである；
Ｘ’はニトロフェノキシ、ジニトロフェノキシ、ペンタ
クロロフェノキシ、ペンタフルオロフェノキシ、ハライ
ド、Ｏ−（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル）又はアジ
ドである）のようなα−ハロアセチル又はα−ハロプロ
ピオニル誘導体にアシル化する試薬、特にクロロ酢酸又
はα−ブロモプロピオン酸があり、反応はpH８〜１１
（必要であれば塩基の添加でこの範囲内に維持され
る）、温度約０〜３５℃で１０分間〜１時間行われる。
アミノ誘導化多糖は、チオ置換をうけやすい適切に官能
化された多糖類を得るため、下記マレイミド基：
【化４】 （上記式中ｐは１〜３である）を形成する活性化マレイ
ミドアミノ酸〔Ｏ．ケラーら、ヘルベチカ・キミカ・ア
クタ、第５８巻、第５３１頁、１９７５年(O.Keller et
al.,Helv.Chim.Acta,５８，５３１，１９７５）参
照〕、ｐ−ニトロフェニルブロモアセテートのような２
−ハロアセチル化剤又はα−ハロケトンカルボン酸誘導
体、例えば
ミドアミノ酸〔Ｏ．ケラーら、ヘルベチカ・キミカ・ア
クタ、第５８巻、第５３１頁、１９７５年(O.Keller et
al.,Helv.Chim.Acta,５８，５３１，１９７５）参
照〕、ｐ−ニトロフェニルブロモアセテートのような２
−ハロアセチル化剤又はα−ハロケトンカルボン酸誘導
体、例えば
【化５】 〔ベル(Ber.)、第６７巻、第１２０４頁、１９３４年〕
でアシル化してもよい。チオール基を形成する上で使用
に適した試薬としては、例えばチオラクトン類、例えば
でアシル化してもよい。チオール基を形成する上で使用
に適した試薬としては、例えばチオラクトン類、例えば
【化６】 （上記式中Ｒ4 はＣ1 −Ｃ4 アルキル又はＣ6 Ｈ5 （−
ＮＨＣＯＲ5 ）もしくはＣ10Ｈ13のような単もしくは二
環式アリールである；ｐは１〜３である；Ｒ5 はＣ1 −
Ｃ4 アルキル又はＣ6 Ｈ5 である）、−Ｏ3 ＳＳＣＨ2
（ＣＨ2 ）m ＣＨ−ＣＯＸ’（ｍは０〜４である；Ｘ’
は前記と同義である）のようなアシル化剤しかる後ＨＳ
ＣＨ2 ＣＨ2 ＯＨとの処理；又はＣ2 Ｈ5 −Ｓ−Ｓ−Ｃ
Ｈ2 （ＣＨ2 ）m ＣＨ（ＮＨＣＯＲ5 ）ＣＯＸ’（ｍ、
Ｒ5 及びＸ’は前記と同義である）しかる後ジチオスレ
イトールとの処理がある。このような反応は窒素雰囲気
下、約０〜３５℃、pH８〜１１（必要であれば塩基の添
加でpHをこの範囲内に保つ）で１〜２４時間行われる。
例えば、アミノ誘導化多糖は適切な官能化多糖を得るた
め
ＮＨＣＯＲ5 ）もしくはＣ10Ｈ13のような単もしくは二
環式アリールである；ｐは１〜３である；Ｒ5 はＣ1 −
Ｃ4 アルキル又はＣ6 Ｈ5 である）、−Ｏ3 ＳＳＣＨ2
（ＣＨ2 ）m ＣＨ−ＣＯＸ’（ｍは０〜４である；Ｘ’
は前記と同義である）のようなアシル化剤しかる後ＨＳ
ＣＨ2 ＣＨ2 ＯＨとの処理；又はＣ2 Ｈ5 −Ｓ−Ｓ−Ｃ
Ｈ2 （ＣＨ2 ）m ＣＨ（ＮＨＣＯＲ5 ）ＣＯＸ’（ｍ、
Ｒ5 及びＸ’は前記と同義である）しかる後ジチオスレ
イトールとの処理がある。このような反応は窒素雰囲気
下、約０〜３５℃、pH８〜１１（必要であれば塩基の添
加でpHをこの範囲内に保つ）で１〜２４時間行われる。
例えば、アミノ誘導化多糖は適切な官能化多糖を得るた
め
【化７】 と反応させてもよい。
【００４４】これらのステップにより、Ｐｓ−Ａ−Ｅ*
−又はＰｓ−Ａ’−ＳＨ−形の共有結合修正多糖類（上
記式中Ｅ* は−ＣＣＨＸ又は
−又はＰｓ−Ａ’−ＳＨ−形の共有結合修正多糖類（上
記式中Ｅ* は−ＣＣＨＸ又は
【化８】 であり、Ａ、Ａ’、Ｒ、Ｘ及びｐは前記と同義である）
が製造される。
が製造される。
【００４５】タンパク質を多糖とカップリングさせるた
めの別の官能化には、チオール基を形成する１種以上の
試薬とタンパク質との反応又は親電子（即ち親チオ）中
心を形成する１種以上の試薬とタンパク質との反応があ
る。親電子官能化多糖との複合化製造において、タンパ
ク質はで前記された多糖類にチオール基を形成するため
に用いられるアシル化試薬のようなチオール基を形成す
る１種以上の試薬と１又は２ステップで反応せしめられ
る。チオール化されたタンパク質はチオール化タンパク
質を得るためアタッシら、バイオキミカ・エド・バイオ
フィジカ・アクタ、第６７０巻、第３００頁、１９８１
年[Atassi etal.,Biochem.et Biophys.Acta, ６７０，
３００（１９８１）〕で示されるようなカルボキシ活性
化タンパク質をアミノチオール類でアミノ化することで
製造してもよい。本プロセスステップの好ましい態様で
は等重量の反応剤を用いて約０〜３５℃、pH８〜１１で
５分間〜２時間にわたりタンパク質の側鎖アミノ基（即
ちリシル基）をＮ−アセチルホモシステインチオラクト
ンで直接アシル化する。Ｅ’Ｂ’が
めの別の官能化には、チオール基を形成する１種以上の
試薬とタンパク質との反応又は親電子（即ち親チオ）中
心を形成する１種以上の試薬とタンパク質との反応があ
る。親電子官能化多糖との複合化製造において、タンパ
ク質はで前記された多糖類にチオール基を形成するため
に用いられるアシル化試薬のようなチオール基を形成す
る１種以上の試薬と１又は２ステップで反応せしめられ
る。チオール化されたタンパク質はチオール化タンパク
質を得るためアタッシら、バイオキミカ・エド・バイオ
フィジカ・アクタ、第６７０巻、第３００頁、１９８１
年[Atassi etal.,Biochem.et Biophys.Acta, ６７０，
３００（１９８１）〕で示されるようなカルボキシ活性
化タンパク質をアミノチオール類でアミノ化することで
製造してもよい。本プロセスステップの好ましい態様で
は等重量の反応剤を用いて約０〜３５℃、pH８〜１１で
５分間〜２時間にわたりタンパク質の側鎖アミノ基（即
ちリシル基）をＮ−アセチルホモシステインチオラクト
ンで直接アシル化する。Ｅ’Ｂ’が
【化９】 である場合、官能化タンパク質の製造条件及び方法は活
性化マレイミド酸との反応で相手の多糖を製造する前記
の場合のとおりである。
性化マレイミド酸との反応で相手の多糖を製造する前記
の場合のとおりである。
【００４６】側鎖チオール基のある共有結合修正細菌多
糖との複合化製造において、タンパク質は例えばＨＣＨ
2 Ｃ（＝Ｏ）−Ｘ’、及びＸＣＨ（ＣＨ3 ）−Ｃ（＝
Ｏ）Ｘ’（Ｘ及びＸ’は前記と同義である）及び
糖との複合化製造において、タンパク質は例えばＨＣＨ
2 Ｃ（＝Ｏ）−Ｘ’、及びＸＣＨ（ＣＨ3 ）−Ｃ（＝
Ｏ）Ｘ’（Ｘ及びＸ’は前記と同義である）及び
【化１０】 （Ｘ’は前記と同義である）を含めたアシル化剤のよう
な親電子中心形成試薬でアシル化される。親電子中心の
ある適切なタンパク質としては、例えば活性化マレイミ
ド酸、例えば
な親電子中心形成試薬でアシル化される。親電子中心の
ある適切なタンパク質としては、例えば活性化マレイミ
ド酸、例えば
【化１１】 のような試薬との側鎖リシルアミノ基のアシル化又はジ
アミン類のモノハロアセチル誘導体とのカルボキシ活性
化タンパク質の反応によって製造されるタンパク質もあ
る。双方の製造反応において、温度は５分間〜１時間に
わたり０〜３５℃であり、pHは８〜１１である。
アミン類のモノハロアセチル誘導体とのカルボキシ活性
化タンパク質の反応によって製造されるタンパク質もあ
る。双方の製造反応において、温度は５分間〜１時間に
わたり０〜３５℃であり、pHは８〜１１である。
【００４７】複合体の形成は、共有結合複合体を得るた
め窒素雰囲気下pH７〜９、約１７〜４０℃で６〜２４時
間にわたり適切な等重量比で側鎖親電子中心を有するい
ずれかの共有結合修正多糖類を側鎖チオール基を有する
細菌タンパク質ＭＩＥＰと反応させるという単純な問題
である。このような反応の例としては、４−ブロモアセ
トアミドブチルアミンと反応した活性化多糖が複合体を
形成するためＮ−アセチルホモシステインチオラクトン
と反応したタンパク質と反応せしめられる：
め窒素雰囲気下pH７〜９、約１７〜４０℃で６〜２４時
間にわたり適切な等重量比で側鎖親電子中心を有するい
ずれかの共有結合修正多糖類を側鎖チオール基を有する
細菌タンパク質ＭＩＥＰと反応させるという単純な問題
である。このような反応の例としては、４−ブロモアセ
トアミドブチルアミンと反応した活性化多糖が複合体を
形成するためＮ−アセチルホモシステインチオラクトン
と反応したタンパク質と反応せしめられる：
【化１２】 及び活性化マレイミド酸と反応したアミノ誘導化多糖が
複合体を形成するためアミノチオールでアミノ化された
カルボキシ活性化タンパク質と反応せしめられる：
複合体を形成するためアミノチオールでアミノ化された
カルボキシ活性化タンパク質と反応せしめられる：
【化１３】 （上記式中Ｙ''はＣ2 −Ｃ8 アルキル基である）があ
る。
る。
【００４８】同様に、側鎖チオール基のあるいずれかの
共有結合修正多糖類が共有結合複合体を得るため側鎖親
電子中心を有する細菌タンパク質ＭＩＥＰと反応せしめ
られてもよい。このような反応の例は：
共有結合修正多糖類が共有結合複合体を得るため側鎖親
電子中心を有する細菌タンパク質ＭＩＥＰと反応せしめ
られてもよい。このような反応の例は：
【化１４】 であって、その場合にアミノチオールと反応した活性化
多糖が複合体を形成するためジアミンのモノハロアセチ
ル誘導体と反応したカルボキシ活性化タンパク質と反応
せしめられる。
多糖が複合体を形成するためジアミンのモノハロアセチ
ル誘導体と反応したカルボキシ活性化タンパク質と反応
せしめられる。
【００４９】ハロアセチル基の過剰親電子活性が除かれ
る必要がある場合には、複合体とｎ−アセチルシステア
ミンのような低分子量チオールとの反応がこの目的を果
たす。この試薬ｎ−アセチルシステアミンの使用は用い
られたハロアセチル部分に関する確認も可能にするが、
その理由は形成されたＳ−カルボキシメチルシステアミ
ンがスパックマン(Spackman)、ムーア(Moore) 及びステ
イン(Stein) の方法で特有に検出されるからである。
る必要がある場合には、複合体とｎ−アセチルシステア
ミンのような低分子量チオールとの反応がこの目的を果
たす。この試薬ｎ−アセチルシステアミンの使用は用い
られたハロアセチル部分に関する確認も可能にするが、
その理由は形成されたＳ−カルボキシメチルシステアミ
ンがスパックマン(Spackman)、ムーア(Moore) 及びステ
イン(Stein) の方法で特有に検出されるからである。
【００５０】次いでこれらの複合体は望ましい生物活性
を追跡する方法として二属スペーサーに関する共有原子
価アッセイ（下記参照）を用いて非共有結合多糖及びタ
ンパク質を除去するため、約１〜２０℃で約２時間にわ
たり固定角ローターを用いて約１００，０００xgで遠心
されるか又はゲル浸透、イオン排除クロマトグラフィ
ー、勾配遠心もしくは他の異なる吸着クロマトグラフィ
ーを含めた他の様々な精製操作のいずれかに付される。
を追跡する方法として二属スペーサーに関する共有原子
価アッセイ（下記参照）を用いて非共有結合多糖及びタ
ンパク質を除去するため、約１〜２０℃で約２時間にわ
たり固定角ローターを用いて約１００，０００xgで遠心
されるか又はゲル浸透、イオン排除クロマトグラフィ
ー、勾配遠心もしくは他の異なる吸着クロマトグラフィ
ーを含めた他の様々な精製操作のいずれかに付される。
【００５１】更に試薬の分離はカラムでサイズ排除クロ
マトグラフィーにより行っても又は非常に大きな非可溶
性タンパク質の場合には分離は超遠心で行ってもよい。
マトグラフィーにより行っても又は非常に大きな非可溶
性タンパク質の場合には分離は超遠心で行ってもよい。
【００５２】共有原子価、ひいては複合体の安定性を確
認するための複合体の分析は、複合体を（好ましくは１
１０℃で２０時間６Ｎ ＨＣｌにより）加水分解し、し
かる後チオエーテル結合を含む加水分解安定性スペーサ
ーのアミノ酸及びタンパク質の構成アミノ酸に関して定
量分析することにより行われる。タンパク質のアミノ酸
の関与分は必要であれば関与タンパク質に関して適切な
アミノ酸標準との比較により除去されて、残りのアミノ
酸価が複合体の共有原子価を反映するか、又はスペーサ
ーのアミノ酸が分析時にタンパク質のアミノ酸標準以外
に出現するよう考えてもよい。共有原子価アッセイは生
物活性成分の濃度増加をマークする精製操作をモニター
する上でも有用である。上記例において、ペプチド結合
及び他の加水分解不安定性結合におけるＰｓ−Ａ−Ｅ−
Ｓ−Ｂ−Ｐｒｏ分子の開裂により、ＰｓＣ（＝Ｏ）ＮＨ
ＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ2 ＳＣＨ
2ＣＨ2 ＣＨ（−ＮＨＣＯＣＨ3 ）ＣＯＰｒｏの加水分
解ではＳ−カルボキシメチルホモシステインＨＯ2 ＣＣ
Ｈ2 ＳＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ（−ＮＨ2 ）ＣＯ2 Ｈを放出
し；
認するための複合体の分析は、複合体を（好ましくは１
１０℃で２０時間６Ｎ ＨＣｌにより）加水分解し、し
かる後チオエーテル結合を含む加水分解安定性スペーサ
ーのアミノ酸及びタンパク質の構成アミノ酸に関して定
量分析することにより行われる。タンパク質のアミノ酸
の関与分は必要であれば関与タンパク質に関して適切な
アミノ酸標準との比較により除去されて、残りのアミノ
酸価が複合体の共有原子価を反映するか、又はスペーサ
ーのアミノ酸が分析時にタンパク質のアミノ酸標準以外
に出現するよう考えてもよい。共有原子価アッセイは生
物活性成分の濃度増加をマークする精製操作をモニター
する上でも有用である。上記例において、ペプチド結合
及び他の加水分解不安定性結合におけるＰｓ−Ａ−Ｅ−
Ｓ−Ｂ−Ｐｒｏ分子の開裂により、ＰｓＣ（＝Ｏ）ＮＨ
ＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ2 ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ2 ＳＣＨ
2ＣＨ2 ＣＨ（−ＮＨＣＯＣＨ3 ）ＣＯＰｒｏの加水分
解ではＳ−カルボキシメチルホモシステインＨＯ2 ＣＣ
Ｈ2 ＳＣＨ2 ＣＨ2 ＣＨ（−ＮＨ2 ）ＣＯ2 Ｈを放出
し；
【化１５】 の加水分解ではアミノジカルボン酸ＨＯ2 ＣＣＨ2 ＣＨ
（−ＣＯ2 Ｈ）ＳＣＨ2ＣＨ2 ＮＨ2 を放出し；ＰｓＣ
（＝Ｏ）ＮＨＣＨ2 ＣＨ2 ＳＣＨ2 Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ
Ｈ2 ）4 ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ2 ＣＨ2 Ｃ（＝Ｏ）Ｐｒｏ
の加水分解ではＳ−カルボキシメチルシステアミンＨ2
ＮＣＨ2 ＣＨ2 ＳＣＨ2 ＣＯ2 Ｈを放出する。次いでス
パックマン、ムーア及びステインのようなクロマトグラ
フィー方法が好都合には適用され、アミノ酸成分の比率
が決定される。
（−ＣＯ2 Ｈ）ＳＣＨ2ＣＨ2 ＮＨ2 を放出し；ＰｓＣ
（＝Ｏ）ＮＨＣＨ2 ＣＨ2 ＳＣＨ2 Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ
Ｈ2 ）4 ＮＨＣ（＝Ｏ）ＣＨ2 ＣＨ2 Ｃ（＝Ｏ）Ｐｒｏ
の加水分解ではＳ−カルボキシメチルシステアミンＨ2
ＮＣＨ2 ＣＨ2 ＳＣＨ2 ＣＯ2 Ｈを放出する。次いでス
パックマン、ムーア及びステインのようなクロマトグラ
フィー方法が好都合には適用され、アミノ酸成分の比率
が決定される。
【００５３】最適のＩｇＧ抗体産生では対象の抗原と特
異性のあるＢ及びＴリンパ球の協調を要する。Ｔリンパ
球は多糖類を認識できないが、但しＴ細胞が認識できる
タンパク質と多糖が共有結合した場合には抗多糖ＩｇＧ
抗体応答を補助することができる。マウスにおいてこの
必要性は一次のみならず二次抗体応答に関しても存在
し、キャリア特異性であって、即ちＴヘルパー細胞が二
次免疫で用いられるキャリアタンパク質で即に感作され
た場合のみ二次抗体応答がおきる。したがって、ＰＲＰ
−タンパク質複合体に対して二次抗体応答を生じうるマ
ウスの能力はキャリアタンパク質に対して特異性のある
プライム化Ｔリンパ球の存在に依存している。
異性のあるＢ及びＴリンパ球の協調を要する。Ｔリンパ
球は多糖類を認識できないが、但しＴ細胞が認識できる
タンパク質と多糖が共有結合した場合には抗多糖ＩｇＧ
抗体応答を補助することができる。マウスにおいてこの
必要性は一次のみならず二次抗体応答に関しても存在
し、キャリア特異性であって、即ちＴヘルパー細胞が二
次免疫で用いられるキャリアタンパク質で即に感作され
た場合のみ二次抗体応答がおきる。したがって、ＰＲＰ
−タンパク質複合体に対して二次抗体応答を生じうるマ
ウスの能力はキャリアタンパク質に対して特異性のある
プライム化Ｔリンパ球の存在に依存している。
【００５４】抗ＰＲＰ抗体応答に関してキャリアプライ
ム化しうるＭＩＥＰの能力の立証は、異種キャリアのジ
フテリアトキソイド（ＤＴ）に共有結合されたＰＲＰで
養子プライム化されたマウスで行われた。養子移入は、
ＭＩＥＰ単独でプライム化されたリンパ球の投与がＰＲ
Ｐ−ＯＭＰＣに応答して抗ＰＲＰ抗体形成用に有効なヘ
ルパーＴ細胞活性を生じる上で十分であるか否かについ
て調べるために用いられた。匹敵しうる二次抗ＰＲＰ抗
体応答はＭＩＥＰ又はＯＭＰＣでプライム化されたリン
パ球が移入された場合にＰＲＰ−ＯＭＰＣで発現された
が、これはＯＭＰＣのＴ細胞認識がＭＩＥＰ部分に存在
することを示している。
ム化しうるＭＩＥＰの能力の立証は、異種キャリアのジ
フテリアトキソイド（ＤＴ）に共有結合されたＰＲＰで
養子プライム化されたマウスで行われた。養子移入は、
ＭＩＥＰ単独でプライム化されたリンパ球の投与がＰＲ
Ｐ−ＯＭＰＣに応答して抗ＰＲＰ抗体形成用に有効なヘ
ルパーＴ細胞活性を生じる上で十分であるか否かについ
て調べるために用いられた。匹敵しうる二次抗ＰＲＰ抗
体応答はＭＩＥＰ又はＯＭＰＣでプライム化されたリン
パ球が移入された場合にＰＲＰ−ＯＭＰＣで発現された
が、これはＯＭＰＣのＴ細胞認識がＭＩＥＰ部分に存在
することを示している。
【００５５】ＰＲＰ−ＭＩＥＰ複合体はマウス及び幼児
アカゲザルで免疫原性に関して試験された。これら動物
モデル双方における免疫応答は細菌多糖類のようなＴ非
依存性抗原に対して抗体応答を生じうるそれらの能力に
関してヒト幼児と不完全性を共有している。これらの動
物は様々な抗原に対するヒト幼児の免疫応答の評価用モ
デルとして普通用いられる。
アカゲザルで免疫原性に関して試験された。これら動物
モデル双方における免疫応答は細菌多糖類のようなＴ非
依存性抗原に対して抗体応答を生じうるそれらの能力に
関してヒト幼児と不完全性を共有している。これらの動
物は様々な抗原に対するヒト幼児の免疫応答の評価用モ
デルとして普通用いられる。
【００５６】本発明の１種以上の複合体ワクチンが細
菌、リケッチア、寄生虫及びウイルスを含めた感染源に
対する又は毒素もしくは毒物、アレルゲン及び哺乳動物
細胞もしくは他の真核細胞に対する予防又は治療的な能
動又は受動保護用に哺乳動物種で用いられる。能動保護
は測定可能量の抗体（例えば２〜５０μg ）を産生しう
る有効量の抗原（例えばＰＲＰ）を用量当たりで投与さ
れる各複合体のＭＩＥＰ複合体形として注入することに
より行われる。アジュバント（例えばミョウバン）の使
用も本発明の範囲内に属する。受動保護はＭＩＥＰ複合
体で予め投与された動物から得られた全抗血清又はその
抗血清のグロブリンもしくは他の抗体含有画分を無菌塩
水溶液のような薬学上許容されるキャリアと共に又はそ
れなしで注入することにより行われる。このようなグロ
ブリンはクロマトグラフィー、塩もしくはアルコール分
別又は電気泳動により全抗血清から得られる。受動保護
は標準モノクローナル抗体操作によるか又は適切な哺乳
動物宿主を免疫することにより行ってもよい。
菌、リケッチア、寄生虫及びウイルスを含めた感染源に
対する又は毒素もしくは毒物、アレルゲン及び哺乳動物
細胞もしくは他の真核細胞に対する予防又は治療的な能
動又は受動保護用に哺乳動物種で用いられる。能動保護
は測定可能量の抗体（例えば２〜５０μg ）を産生しう
る有効量の抗原（例えばＰＲＰ）を用量当たりで投与さ
れる各複合体のＭＩＥＰ複合体形として注入することに
より行われる。アジュバント（例えばミョウバン）の使
用も本発明の範囲内に属する。受動保護はＭＩＥＰ複合
体で予め投与された動物から得られた全抗血清又はその
抗血清のグロブリンもしくは他の抗体含有画分を無菌塩
水溶液のような薬学上許容されるキャリアと共に又はそ
れなしで注入することにより行われる。このようなグロ
ブリンはクロマトグラフィー、塩もしくはアルコール分
別又は電気泳動により全抗血清から得られる。受動保護
は標準モノクローナル抗体操作によるか又は適切な哺乳
動物宿主を免疫することにより行ってもよい。
【００５７】本発明の好ましい態様において、複合体は
ヒト、特に幼児及び小供、免疫無防備個体（例えば、無
脾人及び化学療法後の患者）並びに老人の能動免疫ワク
チン接種に用いられる。更に安定化のため、これらの複
合体は使用前にラクトース存在下（例えばＰＲＰ２０μ
g ／mlのラクトース４mg／ml）で凍結乾燥してもよい。
ヒト、特に幼児及び小供、免疫無防備個体（例えば、無
脾人及び化学療法後の患者）並びに老人の能動免疫ワク
チン接種に用いられる。更に安定化のため、これらの複
合体は使用前にラクトース存在下（例えばＰＲＰ２０μ
g ／mlのラクトース４mg／ml）で凍結乾燥してもよい。
【００５８】好ましい投与レベルは１回投与当たりＨ．
インフルエンザ血清タイプＢ多糖の複合体としてＭＩＥ
Ｐ複合体形でＰＲＰ約２〜２０μg に相当するように投
与される各ＭＩＥＰ複合体又はその誘導体の量である必
要であれば、複合体形としてＰＲＰ約２〜２０μg に相
当する量でＨ．インフルエンザ血清タイプＢ多糖のＭＩ
ＥＰ複合体又はその誘導体が更に１回又は２回投与され
てもよい。
インフルエンザ血清タイプＢ多糖の複合体としてＭＩＥ
Ｐ複合体形でＰＲＰ約２〜２０μg に相当するように投
与される各ＭＩＥＰ複合体又はその誘導体の量である必
要であれば、複合体形としてＰＲＰ約２〜２０μg に相
当する量でＨ．インフルエンザ血清タイプＢ多糖のＭＩ
ＥＰ複合体又はその誘導体が更に１回又は２回投与され
てもよい。
【００５９】本発明は下記実施例を参照して更に明確に
されるが、但しこれは説明のためであって、限定のため
ではない。 実施例１ネイセリア・メニンギチジスＢ１１血清タイプ２ ＯＭ
ＰＣの製造 Ａ．発酵 １．ネイセリア・メニンギチジスグループＢ１１ ネイセリア・メニンギチジスの凍結乾燥培養物を含有し
たチューブ〔ワシントン、Ｄ．Ｃ．のウォルター・リー
ド・アーミー・インスティチュート・オブ・リサーチ(W
alter Reed Army Institute of Research;ＷＲＡＩＲ）
のＭ．アーテンスタイン博士(Dr.M.Artenstein) から得
た〕を開封し、ユーゴンブロス(Eugonbroth)（ＢＢＬ）
を加えた。培養物をミュエラー・ヒントン(Mueller Hin
ton)寒天斜面上に画線状に塗布し、５％ＣＯ2 下３７℃
で３６時間インキュベートし、しかる後増殖物を１０％
スキムミルク培地〔ジフコ(Difco) 〕で回収し、一部を
−７０℃で凍結した。生物の同定はＷＲＡＩＲ製の特異
抗血清及びジフコ製のタイプ別血清との凝集により確認
した。
されるが、但しこれは説明のためであって、限定のため
ではない。 実施例１ネイセリア・メニンギチジスＢ１１血清タイプ２ ＯＭ
ＰＣの製造 Ａ．発酵 １．ネイセリア・メニンギチジスグループＢ１１ ネイセリア・メニンギチジスの凍結乾燥培養物を含有し
たチューブ〔ワシントン、Ｄ．Ｃ．のウォルター・リー
ド・アーミー・インスティチュート・オブ・リサーチ(W
alter Reed Army Institute of Research;ＷＲＡＩＲ）
のＭ．アーテンスタイン博士(Dr.M.Artenstein) から得
た〕を開封し、ユーゴンブロス(Eugonbroth)（ＢＢＬ）
を加えた。培養物をミュエラー・ヒントン(Mueller Hin
ton)寒天斜面上に画線状に塗布し、５％ＣＯ2 下３７℃
で３６時間インキュベートし、しかる後増殖物を１０％
スキムミルク培地〔ジフコ(Difco) 〕で回収し、一部を
−７０℃で凍結した。生物の同定はＷＲＡＩＲ製の特異
抗血清及びジフコ製のタイプ別血清との凝集により確認
した。
【００６０】第二継代培養物のバイアルを解凍し、１０
枚のコロンビアヒツジ血清(Columbis Sheep Blood)寒天
プレート（ＣＢＡＢ−ＢＢＬ）上に画線状に塗布した。
プレートを５％ＣＯ2 下３７℃で１８時間インキュベー
トし、しかる後増殖物を１０％スキムミルク培地１００
mlで回収し、等分に０．５ml量で取出し、−７０℃で凍
結した。生物は特異抗血清との凝集、糖発酵及びグラム
染色で陽性と確認された。
枚のコロンビアヒツジ血清(Columbis Sheep Blood)寒天
プレート（ＣＢＡＢ−ＢＢＬ）上に画線状に塗布した。
プレートを５％ＣＯ2 下３７℃で１８時間インキュベー
トし、しかる後増殖物を１０％スキムミルク培地１００
mlで回収し、等分に０．５ml量で取出し、−７０℃で凍
結した。生物は特異抗血清との凝集、糖発酵及びグラム
染色で陽性と確認された。
【００６１】この継代培養物のバイアルを解凍し、ミュ
エラー−ヒントンブロスで希釈し、４０枚のミュエラー
・ヒントン寒天プレート上に画線状に塗布した。プレー
トを６％ＣＯ2 下３７℃で１８時間インキュベートし、
しかる後培養物を１０％スキムミルク培地１７mlで回収
し、０．３ml量に分割し、−７０℃で凍結した。生物は
グラム染色、特異抗血清との凝集及びオキシダーゼ試験
で陽性と確認された。
エラー−ヒントンブロスで希釈し、４０枚のミュエラー
・ヒントン寒天プレート上に画線状に塗布した。プレー
トを６％ＣＯ2 下３７℃で１８時間インキュベートし、
しかる後培養物を１０％スキムミルク培地１７mlで回収
し、０．３ml量に分割し、−７０℃で凍結した。生物は
グラム染色、特異抗血清との凝集及びオキシダーゼ試験
で陽性と確認された。
【００６２】２．発酵及び細胞ペーストの回収 ａ．接種原産生−接種原を前記ネイセリア・メニンギチ
ジスグループＢ、Ｂ−１１（継代４）の１凍結バイアル
から増殖させた。１０個のミュエラー−ヒントン寒天斜
面に接種し、６つから約１８時間後に回収し、３つのpH
６．３５ゴットシュリッヒ(Gotschlich's)酵母透析物培
地の２５０mlフラスコ用に接種原として用いた。ＯＤ
660 を０．１８に調整し、ＯＤ660 が１〜１．８となる
までインキュベートした。この培養物１mlを用いて２リ
ットルの各々５つに接種した。エルレンマイヤーフラス
コ（各々培地１リットル）含有；下記参照）をシェーカ
ーにおいて３７℃、２００rpm でインキュベートした。
ＯＤは接種後１時間毎にモニターした。ブロス培養物４
リットルはＯＤ660 ＝１．２８で生じた。
ジスグループＢ、Ｂ−１１（継代４）の１凍結バイアル
から増殖させた。１０個のミュエラー−ヒントン寒天斜
面に接種し、６つから約１８時間後に回収し、３つのpH
６．３５ゴットシュリッヒ(Gotschlich's)酵母透析物培
地の２５０mlフラスコ用に接種原として用いた。ＯＤ
660 を０．１８に調整し、ＯＤ660 が１〜１．８となる
までインキュベートした。この培養物１mlを用いて２リ
ットルの各々５つに接種した。エルレンマイヤーフラス
コ（各々培地１リットル）含有；下記参照）をシェーカ
ーにおいて３７℃、２００rpm でインキュベートした。
ＯＤは接種後１時間毎にモニターした。ブロス培養物４
リットルはＯＤ660 ＝１．２８で生じた。
【００６３】７０リットル種発酵槽−種培養物約４リッ
トルを用いて完全産生培地約４０リットル含有の無菌７
０リットル発酵槽に接種した（下記参照）。７０リット
ル発酵用の条件は３７℃、１８５rpm 、１０リットル／
min 空気導入及び約pH７．０の一定pHコントロール下で
約２時間であった。このバッチに関して、最終ＯＤ66 0
は２時間後に０．７３２であった。
トルを用いて完全産生培地約４０リットル含有の無菌７
０リットル発酵槽に接種した（下記参照）。７０リット
ル発酵用の条件は３７℃、１８５rpm 、１０リットル／
min 空気導入及び約pH７．０の一定pHコントロール下で
約２時間であった。このバッチに関して、最終ＯＤ66 0
は２時間後に０．７３２であった。
【００６４】８００リットル産生発酵槽−種培養物約４
０リットルを用いて完全産生培地５６８．２リットル含
有の無菌８００リットル発酵槽に接種した（下記参
照）。バッチは３７℃、１００rpm 、６０リットル／mi
n 空気導入及びpH７．０の一定pHコントロール下で接種
した。このバッチに関して、最終ＯＤは接種の１３時間
後に５．５８であった。
０リットルを用いて完全産生培地５６８．２リットル含
有の無菌８００リットル発酵槽に接種した（下記参
照）。バッチは３７℃、１００rpm 、６０リットル／mi
n 空気導入及びpH７．０の一定pHコントロール下で接種
した。このバッチに関して、最終ＯＤは接種の１３時間
後に５．５８であった。
【００６５】３．エルレンマイヤーフラスコ並びに７０
及び８００リットル発酵槽用の完全培地 画分Ａ Ｌ−グルタミン酸 １．５ｇ／リットル ＮａＣｌ ６．０ｇ／リットル 無水Ｎａ2 ＨＰＯ4 ２．５ｇ／リットル ＮＨ4 Ｃｌ １．２５ｇ／リットル ＫＣｌ ０．０９ｇ／リットル Ｌ−システインＨＣｌ ０．０２ｇ／リットル 画分Ｂ（ゴットシュリッヒ酵母透析物）：
及び８００リットル発酵槽用の完全培地 画分Ａ Ｌ−グルタミン酸 １．５ｇ／リットル ＮａＣｌ ６．０ｇ／リットル 無水Ｎａ2 ＨＰＯ4 ２．５ｇ／リットル ＮＨ4 Ｃｌ １．２５ｇ／リットル ＫＣｌ ０．０９ｇ／リットル Ｌ−システインＨＣｌ ０．０２ｇ／リットル 画分Ｂ（ゴットシュリッヒ酵母透析物）：
【００６６】ジフコ酵母エキス１２８０ｇを蒸留水６．
４リットルに溶解した。溶液は３個のＨ１０ＳＭカート
リッジを装備した２つのアミコン（Ａmicon ）ＤＣ−３
０中空繊維透析ユニットで透析した。ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ ３８４ｇ及びデキストロース３２００ｇを透析物
に溶解し、全容量を蒸留水で１５リットルにした。pHを
ＮａＯＨで７．４に調整し、０．２２μフィルター通過
で滅菌し、画分Ａ含有発酵槽に移した。
４リットルに溶解した。溶液は３個のＨ１０ＳＭカート
リッジを装備した２つのアミコン（Ａmicon ）ＤＣ−３
０中空繊維透析ユニットで透析した。ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ ３８４ｇ及びデキストロース３２００ｇを透析物
に溶解し、全容量を蒸留水で１５リットルにした。pHを
ＮａＯＨで７．４に調整し、０．２２μフィルター通過
で滅菌し、画分Ａ含有発酵槽に移した。
【００６７】エルレンマイヤーフラスコの場合：画分Ａ
１リットル及び画分Ｂ２５mlを加え、pHをＮａＯＨで
７．０〜７．２に調整した。７０リットル発酵槽の場
合：画分Ａ４１．８リットル及び画分Ｂ９００mlを加
え、pHをＮａＯＨで７．０〜７．２に調整した。８００
リットル発酵槽の場合：画分Ａ５５３リットル及び画分
Ｂ１５．０リットルを加え、pHをＮａＯＨで７．１〜
７．２に調整した。
１リットル及び画分Ｂ２５mlを加え、pHをＮａＯＨで
７．０〜７．２に調整した。７０リットル発酵槽の場
合：画分Ａ４１．８リットル及び画分Ｂ９００mlを加
え、pHをＮａＯＨで７．０〜７．２に調整した。８００
リットル発酵槽の場合：画分Ａ５５３リットル及び画分
Ｂ１５．０リットルを加え、pHをＮａＯＨで７．１〜
７．２に調整した。
【００６８】ｄ．回収及び不活性化 発酵終了後フェノールを別の容器に加え、しかる後細胞
ブロスを移して、最終フェノール濃度約０．５％とし
た。物質を培養物がもはや生存しなくなるまで（約２４
時間）穏やかに攪拌しながら室温に保った。
ブロスを移して、最終フェノール濃度約０．５％とし
た。物質を培養物がもはや生存しなくなるまで（約２４
時間）穏やかに攪拌しながら室温に保った。
【０６９】ｅ．遠心 ４℃で約２４時間後、不活性化培養液６１４．４リット
ルをシャープルズ(Sharples)連続流遠心機で遠心した。
フェノール処理後における細胞ペーストの重量は３．８
７５kgであった。
ルをシャープルズ(Sharples)連続流遠心機で遠心した。
フェノール処理後における細胞ペーストの重量は３．８
７５kgであった。
【００７０】Ｂ．ＯＭＰＣ単離ステップ１ 濃縮及び透析濾過 フェノール不活性化培養物を約３０リットルに濃縮し、
０．２μ中空繊維フィルター（ＥＮＫＡ）を用いて無菌
蒸留水で透析濾過した。
０．２μ中空繊維フィルター（ＥＮＫＡ）を用いて無菌
蒸留水で透析濾過した。
【００７１】ステップ２ 抽出 等容量の２ｘＴＥＤ緩衝液（０．５％デオキシコール酸
ナトリウム含有pH８．５の０．１Ｍトリス０．０１Ｍ
ＥＤＴＡ緩衝液）を濃縮された透析濾過細胞に加えた。
懸濁液を攪拌下５６℃で３０分間ＯＭＰＣ抽出用の温度
調節タンクに移した。抽出物をシャープルズ連続流遠心
機において流速約８０ml/min、約４℃、約１８，０００
rpm で遠心した。次いで粘稠な上澄を集め、４℃で貯蔵
した。抽出された細胞ペレットを前記のようにＴＥＤ緩
衝液で再抽出した。上澄をプールし、４℃で貯蔵した。
ナトリウム含有pH８．５の０．１Ｍトリス０．０１Ｍ
ＥＤＴＡ緩衝液）を濃縮された透析濾過細胞に加えた。
懸濁液を攪拌下５６℃で３０分間ＯＭＰＣ抽出用の温度
調節タンクに移した。抽出物をシャープルズ連続流遠心
機において流速約８０ml/min、約４℃、約１８，０００
rpm で遠心した。次いで粘稠な上澄を集め、４℃で貯蔵
した。抽出された細胞ペレットを前記のようにＴＥＤ緩
衝液で再抽出した。上澄をプールし、４℃で貯蔵した。
【００７２】ステップ３ 超遠心による濃縮 プールされた抽出物をＡＧ−テック（ＡＧ−Tech）０．
１ミクロンポリスルホンフィルターに連結された温度調
節容器に移した。抽出物の温度を濃縮プロセス全体にお
いて容器中２５℃で保った。サンプルを１１〜２４psi
（約０．８〜１．７kg/cm2）の平均経膜圧の１０倍濃縮
した。
１ミクロンポリスルホンフィルターに連結された温度調
節容器に移した。抽出物の温度を濃縮プロセス全体にお
いて容器中２５℃で保った。サンプルを１１〜２４psi
（約０．８〜１．７kg/cm2）の平均経膜圧の１０倍濃縮
した。
【００７３】ステップ４ ＯＭＰＣの回収及び洗浄 ステップ３の貯留物を連続流遠心機において流速３００
〜５００ml/min、約７０℃、約１６０，０００ｘｇ（３
５，０００rpm)で遠心し、上澄を捨てた。ＯＭＰＣペレ
ットをＴＥＤ緩衝液（緩衝液１９０ml; ２０ml/gペレッ
ト）に懸濁し、ステップ２及びステップ４を２回繰返し
た（ステップ３省略）。
〜５００ml/min、約７０℃、約１６０，０００ｘｇ（３
５，０００rpm)で遠心し、上澄を捨てた。ＯＭＰＣペレ
ットをＴＥＤ緩衝液（緩衝液１９０ml; ２０ml/gペレッ
ト）に懸濁し、ステップ２及びステップ４を２回繰返し
た（ステップ３省略）。
【００７４】ステップ５ ＯＭＰＣ産物の回収 ステップ４の洗浄されたペレットを完全懸濁化の保証の
ためガラス棒及びドーンス(Dounce)ホモゲナイザーで蒸
留水１００mlに懸濁した。次いで水性ＯＭＰＣ懸濁液を
０．２２μフィルターに通してフィルター滅菌し、ＴＥ
Ｄ緩衝液を０．１μ中空繊維フィルターで無菌蒸留水に
対する透析濾過により水と交換した。
ためガラス棒及びドーンス(Dounce)ホモゲナイザーで蒸
留水１００mlに懸濁した。次いで水性ＯＭＰＣ懸濁液を
０．２２μフィルターに通してフィルター滅菌し、ＴＥ
Ｄ緩衝液を０．１μ中空繊維フィルターで無菌蒸留水に
対する透析濾過により水と交換した。
【００７５】実施例２Ｈ．インフルエンザタイプｂ莢膜多糖（ＰＲＰ）の製造 接種原及び種産生 段階Ａ：ヘモフィラス・インフルエンザタイプｂの凍結
乾燥チューブ〔ニューヨーク州立大学から受理したロス
(Ross)７６８から培養された）を無菌ヘモフィラス接種
原培地（下記参照）１mlに懸濁し、この懸濁液を９つの
チョコレート寒天斜面（ＢＢＬ）に塗布した。接種原培
地のpHを７．２±０．１（典型的値はpH７．２３であっ
た）に調整し、培地溶液を使用前に１２１℃で２５分間
オートクレーブ処理により滅菌した。キャンドルジャー
内において３７℃で２０時間のインキュベート後、各プ
レートの増殖物をヘモフィラス接種原培地１〜２mlに再
懸濁し、対の斜面をプールした。 ヘモフィラス接種原培地 ｇ／リットル 大豆ペプトン １０ ＮａＣｌ ５ ＮａＨ2 ＰＯ4 ３．１ Ｎａ2 ＨＰＯ4 １３．７ Ｋ2 ＨＰＯ4 ２．５ 蒸留水 所要量まで
乾燥チューブ〔ニューヨーク州立大学から受理したロス
(Ross)７６８から培養された）を無菌ヘモフィラス接種
原培地（下記参照）１mlに懸濁し、この懸濁液を９つの
チョコレート寒天斜面（ＢＢＬ）に塗布した。接種原培
地のpHを７．２±０．１（典型的値はpH７．２３であっ
た）に調整し、培地溶液を使用前に１２１℃で２５分間
オートクレーブ処理により滅菌した。キャンドルジャー
内において３７℃で２０時間のインキュベート後、各プ
レートの増殖物をヘモフィラス接種原培地１〜２mlに再
懸濁し、対の斜面をプールした。 ヘモフィラス接種原培地 ｇ／リットル 大豆ペプトン １０ ＮａＣｌ ５ ＮａＨ2 ＰＯ4 ３．１ Ｎａ2 ＨＰＯ4 １３．７ Ｋ2 ＨＰＯ4 ２．５ 蒸留水 所要量まで
【００７６】各対の斜面からの再懸濁された細胞をヘモ
フィラス種及び産生培地約１００ml含有の３つの２５０
mlエルレンマイヤーフラスコに接種した。２５０mlフラ
スコを約１．３のＯＤ660 に達するまで３７℃で約３時
間インキュベートした。これらの培養物を用いて２リッ
トルフラスコ（下記）に接種した。
フィラス種及び産生培地約１００ml含有の３つの２５０
mlエルレンマイヤーフラスコに接種した。２５０mlフラ
スコを約１．３のＯＤ660 に達するまで３７℃で約３時
間インキュベートした。これらの培養物を用いて２リッ
トルフラスコ（下記）に接種した。
【００７７】段階Ｂ：２リットル非バッフル化エルレン
マイヤーフラスコー”段階Ａ”（上記）の培養物５mlを
用いて、各々が完全ヘモフィラス種及び産生培地（下記
参照）約１．０リットルを含有した５つの２リットルフ
ラスコの各々に接種した。次いでフラスコをロータリー
シェーカー上３７℃、約２００rpm で約３時間インキュ
ベートした。インキュベート終了時における典型的ＯＤ
660 値は約１．０であった。 完全ヘモフィラス種及び産生培地 リットル当たり ＮａＨ2 ＰＯ4 ３．１ｇ／リットル Ｎａ2 ＨＰＯ4 １３．７ｇ／リットル 大豆ペプトン １０ｇ／リットル 酵母エキス透析濾過物(1) １０ｇ／リットル Ｋ2 ＨＰＯ4 ２．５ｇ／リットル ＮａＣｌ ５．０ｇ／リットル グルコース(2) ５．０ｇ／リットル ニコチンアミドアデニンジ ヌクレオチド(NAD)(3) ２mg／リットル ヘミン(4) ５mg／リットル
マイヤーフラスコー”段階Ａ”（上記）の培養物５mlを
用いて、各々が完全ヘモフィラス種及び産生培地（下記
参照）約１．０リットルを含有した５つの２リットルフ
ラスコの各々に接種した。次いでフラスコをロータリー
シェーカー上３７℃、約２００rpm で約３時間インキュ
ベートした。インキュベート終了時における典型的ＯＤ
660 値は約１．０であった。 完全ヘモフィラス種及び産生培地 リットル当たり ＮａＨ2 ＰＯ4 ３．１ｇ／リットル Ｎａ2 ＨＰＯ4 １３．７ｇ／リットル 大豆ペプトン １０ｇ／リットル 酵母エキス透析濾過物(1) １０ｇ／リットル Ｋ2 ＨＰＯ4 ２．５ｇ／リットル ＮａＣｌ ５．０ｇ／リットル グルコース(2) ５．０ｇ／リットル ニコチンアミドアデニンジ ヌクレオチド(NAD)(3) ２mg／リットル ヘミン(4) ５mg／リットル
【００７８】塩類及び大豆ペプトンを少量の熱無発熱物
質水に溶解し、更に熱無発熱物質水で最終容量に調整し
た。次いで発酵槽又はフラスコを１２１℃で約２５分間
オートクレーブ処理により滅菌し、冷却後酵母エキス透
析濾過物（１）、グルコース（２）、ＮＡＤ（３）及び
ヘミン（４）を接種前にフラスコ又は発酵槽に無菌的に
加えた。 （１）酵母エキス透析濾過物：醸造業者の酵母エキス
〔アンバー(Amber) １００ｇを蒸留水１リットルに溶解
し、５０kdカットオフＨ１０×５０カートリッジ装備ア
ミコンＤＣ−３０中空繊維ユニットで限外濾過した。濾
液を集め、０．２２μフィルターに通して滅菌した。 （２）グルコースを蒸留水中無菌２５％溶液として調製
した。 （３）ＮＡＤ２０mg/ml 含有ストック溶液を０．２２μ
フィルターに通して滅菌し、接種直前に無菌的に加え
た。 （４）ヘミン３×のストック溶液を０．１Ｍ ＮａＯＨ
１０mlに２００mg溶解して調製し、容量を無菌蒸留水で
１００mlに調整した。溶液を１２１℃で２０分間滅菌
し、接種前に最終培地に無菌的に加えた。
質水に溶解し、更に熱無発熱物質水で最終容量に調整し
た。次いで発酵槽又はフラスコを１２１℃で約２５分間
オートクレーブ処理により滅菌し、冷却後酵母エキス透
析濾過物（１）、グルコース（２）、ＮＡＤ（３）及び
ヘミン（４）を接種前にフラスコ又は発酵槽に無菌的に
加えた。 （１）酵母エキス透析濾過物：醸造業者の酵母エキス
〔アンバー(Amber) １００ｇを蒸留水１リットルに溶解
し、５０kdカットオフＨ１０×５０カートリッジ装備ア
ミコンＤＣ−３０中空繊維ユニットで限外濾過した。濾
液を集め、０．２２μフィルターに通して滅菌した。 （２）グルコースを蒸留水中無菌２５％溶液として調製
した。 （３）ＮＡＤ２０mg/ml 含有ストック溶液を０．２２μ
フィルターに通して滅菌し、接種直前に無菌的に加え
た。 （４）ヘミン３×のストック溶液を０．１Ｍ ＮａＯＨ
１０mlに２００mg溶解して調製し、容量を無菌蒸留水で
１００mlに調整した。溶液を１２１℃で２０分間滅菌
し、接種前に最終培地に無菌的に加えた。
【００７９】段階Ｃ：７０リットル種発酵槽−段階Ｂの
産物３リットルを用いて、完全ヘモフィラス種及び産生
培地（前記のように調製）約４０リットル及びＵＣＯＮ
Ｂ６２５消泡剤１７mlを含有した発酵槽に接種した。接
種時のpHは７．４であった。 段階Ｄ：８００リットル産生発酵槽−”段階Ｃ”の産物
約４０リットルを用いて、必要容量に定められたヘモフ
ィラス種及び産生培地（前記のように調製）５７０リッ
トルを含有する８００リットル発酵槽に接種し、ＵＣＯ
Ｎ ＬＢ６２５消泡剤７２mlを加えた。
産物３リットルを用いて、完全ヘモフィラス種及び産生
培地（前記のように調製）約４０リットル及びＵＣＯＮ
Ｂ６２５消泡剤１７mlを含有した発酵槽に接種した。接
種時のpHは７．４であった。 段階Ｄ：８００リットル産生発酵槽−”段階Ｃ”の産物
約４０リットルを用いて、必要容量に定められたヘモフ
ィラス種及び産生培地（前記のように調製）５７０リッ
トルを含有する８００リットル発酵槽に接種し、ＵＣＯ
Ｎ ＬＢ６２５消泡剤７２mlを加えた。
【００８０】発酵を１００rpm 攪拌下３７℃で維持し、
ＯＤ660 及びpHレベルをＯＤ660 が２時間安定するまで
約２時間毎に測定し、しかる後発酵を終了した（典型的
最終ＯＤ660 は約２０時間後に約１．２であった）。 回収及び不活性化 約６００リットルのバッチを１％メチロサール１２リッ
トル含有”キルタンク”(Killtank)に回収することで不
活性化した。 清澄化 ４℃で１８時間の不活性化後、バッチは産物透明度を維
持しうるように調整された流速（１．３〜３．０リット
ル／min ）で４インチボウルシャープルズ連続流遠心機
において遠心した。遠心（１５，０００rpm ）後に得ら
れた上澄を産物回収に用いた。
ＯＤ660 及びpHレベルをＯＤ660 が２時間安定するまで
約２時間毎に測定し、しかる後発酵を終了した（典型的
最終ＯＤ660 は約２０時間後に約１．２であった）。 回収及び不活性化 約６００リットルのバッチを１％メチロサール１２リッ
トル含有”キルタンク”(Killtank)に回収することで不
活性化した。 清澄化 ４℃で１８時間の不活性化後、バッチは産物透明度を維
持しうるように調整された流速（１．３〜３．０リット
ル／min ）で４インチボウルシャープルズ連続流遠心機
において遠心した。遠心（１５，０００rpm ）後に得ら
れた上澄を産物回収に用いた。
【００８１】限外濾過による単離及び濃縮 ２回の産生発酵からの上澄をプールし、２０個の５０kd
カットオフ中空繊維カートリッジ（４．５ｍ2 膜面積；
２．０Lpm 気流及び２０psi ）装備のロミコンＸＭ−５
０限外濾過ユニットにおいて２〜８℃で濃縮した。濃縮
とは、約４．５時間後に約１９００リットルが５７．４
リットルに濃縮されるようなものであった。濾液は捨て
た。
カットオフ中空繊維カートリッジ（４．５ｍ2 膜面積；
２．０Lpm 気流及び２０psi ）装備のロミコンＸＭ−５
０限外濾過ユニットにおいて２〜８℃で濃縮した。濃縮
とは、約４．５時間後に約１９００リットルが５７．４
リットルに濃縮されるようなものであった。濾液は捨て
た。
【００８２】４８％及び６１％エタノール沈殿 限外濾過貯留液５７．４リットルに９５％エタノール５
３リットルを４℃で攪拌下１時間かけて４８容量％エタ
ノールの最終濃度まで滴下した。混合液を４℃で更に２
時間攪拌して完全に沈殿させ、上澄を単一の４インチシ
ャープルズ連続流遠心機に１５，０００rpm 、流速約
０．４リットル／min で通した後に集めた。ペレットを
捨て、清澄化された液体を１時間にわたる９５％エタノ
ール４０．７リットルの添加で８２％エタノールにし
た。混合液を更に３時間攪拌して、完全に沈殿させた。
３リットルを４℃で攪拌下１時間かけて４８容量％エタ
ノールの最終濃度まで滴下した。混合液を４℃で更に２
時間攪拌して完全に沈殿させ、上澄を単一の４インチシ
ャープルズ連続流遠心機に１５，０００rpm 、流速約
０．４リットル／min で通した後に集めた。ペレットを
捨て、清澄化された液体を１時間にわたる９５％エタノ
ール４０．７リットルの添加で８２％エタノールにし
た。混合液を更に３時間攪拌して、完全に沈殿させた。
【００８３】第二ペレットの回収 得られた４８％エタノール可溶性−８２％エタノール不
溶性沈殿を４インチシャープルズ連続流遠心機における
１５，０００rpm 、流速約０．２４リットル／min の遠
心により集め、８２％エタノール上澄を捨てた。粗生成
物収量は湿潤ペースト約１．４kgであった。
溶性沈殿を４インチシャープルズ連続流遠心機における
１５，０００rpm 、流速約０．２４リットル／min の遠
心により集め、８２％エタノール上澄を捨てた。粗生成
物収量は湿潤ペースト約１．４kgであった。
【００８４】塩化カルシウム抽出 ８２％エタノール不溶性物質１．４kgをデイマックス(D
aymax)分散容器内において２〜８℃で冷蒸留水２４．３
リットルと混ぜた。この混合液に冷２Ｍ ＣａＣｌ2 ・
２Ｈ2 Ｏ ２４．３リットルを加え、混合液を４℃で１
５分間インキュベートした。次いで容器を１Ｍ ＣａＣ
ｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ２リットルで洗浄し、約５０リットル
の最終容量とした。 ２３％エタノール沈殿 ＣａＣｌ2 抽出液５０リットルを攪拌下４℃で３０分間
かけて９５％エタノール１６．７リットルを滴下するこ
とにより２５％エタノールとした。更に１７時間攪拌
後、混合液を４℃でシャープルズ連続流遠心機に通すこ
とにより集めた。上澄を集め、ペレットを捨てた。 ３８％エタノール沈殿及び粗生成物ペーストの回収 ２５％エタノール可溶性上澄を攪拌下３０分間にわたる
９５％エタノール１３．９リットルの滴下により３８％
エタノールとした。次いで混合液を攪拌下で１時間しか
る後非攪拌下で１４時間放置して完全に沈殿させた。次
いで得られた混合液を４インチシャープルズ連続流遠心
機において１５，０００rpm （流速０．２リットル／mi
n ）で遠心し、沈殿粗製Ｈ．インフルエンザ多糖を集め
た。
aymax)分散容器内において２〜８℃で冷蒸留水２４．３
リットルと混ぜた。この混合液に冷２Ｍ ＣａＣｌ2 ・
２Ｈ2 Ｏ ２４．３リットルを加え、混合液を４℃で１
５分間インキュベートした。次いで容器を１Ｍ ＣａＣ
ｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ ２リットルで洗浄し、約５０リットル
の最終容量とした。 ２３％エタノール沈殿 ＣａＣｌ2 抽出液５０リットルを攪拌下４℃で３０分間
かけて９５％エタノール１６．７リットルを滴下するこ
とにより２５％エタノールとした。更に１７時間攪拌
後、混合液を４℃でシャープルズ連続流遠心機に通すこ
とにより集めた。上澄を集め、ペレットを捨てた。 ３８％エタノール沈殿及び粗生成物ペーストの回収 ２５％エタノール可溶性上澄を攪拌下３０分間にわたる
９５％エタノール１３．９リットルの滴下により３８％
エタノールとした。次いで混合液を攪拌下で１時間しか
る後非攪拌下で１４時間放置して完全に沈殿させた。次
いで得られた混合液を４インチシャープルズ連続流遠心
機において１５，０００rpm （流速０．２リットル／mi
n ）で遠心し、沈殿粗製Ｈ．インフルエンザ多糖を集め
た。
【００８５】摩 砕 遠心によるペレットを無水エタノール２〜３リットル含
有１ガロンウェアリング・ブレンダー(Waring Blender)
に移し、最高速度で３０秒間ブレンドした。ブレンドは
硬白色粉末が生じるまで３０秒間オン及び３０秒間オフ
で続けた。粉末をテフロンフィルターディスク装備ブフ
ナー漏斗で集め、その場において無水エタノール１リッ
トルで２回及びアセトン２リットルで２回連続洗浄し
た。次いで物質を減圧下４℃で２４時間乾燥し、生成物
約３３７ｇ（乾燥重量）を得た。
有１ガロンウェアリング・ブレンダー(Waring Blender)
に移し、最高速度で３０秒間ブレンドした。ブレンドは
硬白色粉末が生じるまで３０秒間オン及び３０秒間オフ
で続けた。粉末をテフロンフィルターディスク装備ブフ
ナー漏斗で集め、その場において無水エタノール１リッ
トルで２回及びアセトン２リットルで２回連続洗浄し
た。次いで物質を減圧下４℃で２４時間乾燥し、生成物
約３３７ｇ（乾燥重量）を得た。
【００８６】フェノール抽出 摩砕ステップからの乾燥物質約１６８ｇ（全体の約半
分）をデイマックス分散容器の補助でpH６．９の０．４
８８Ｍ酢酸ナトリウム１２リットルに再懸濁した。酢酸
ナトリウム溶液を下記のように調製された新鮮フェノー
ル水溶液４．４８リットルで直ちに抽出した：pH６．９
の０．４８８Ｍ酢酸ナトリウム５９０mlを２０リットル
加圧容器内において８個のフェノール〔マリンクロッツ
(Mallinckrodt)結晶〕１．５kgボトルの各々に加え、混
ぜて懸濁させた。各フェノール抽出液をＫ２超遠心機
〔エレクトロヌクレオニクス(Electronucleonics) 〕に
おいて３０，０００rpm 、４℃で２．５時間遠心した。
水性流出液を前記のように新鮮フェノール水溶液で更に
３回抽出した。フェノール相は捨てた。
分）をデイマックス分散容器の補助でpH６．９の０．４
８８Ｍ酢酸ナトリウム１２リットルに再懸濁した。酢酸
ナトリウム溶液を下記のように調製された新鮮フェノー
ル水溶液４．４８リットルで直ちに抽出した：pH６．９
の０．４８８Ｍ酢酸ナトリウム５９０mlを２０リットル
加圧容器内において８個のフェノール〔マリンクロッツ
(Mallinckrodt)結晶〕１．５kgボトルの各々に加え、混
ぜて懸濁させた。各フェノール抽出液をＫ２超遠心機
〔エレクトロヌクレオニクス(Electronucleonics) 〕に
おいて３０，０００rpm 、４℃で２．５時間遠心した。
水性流出液を前記のように新鮮フェノール水溶液で更に
３回抽出した。フェノール相は捨てた。
【００８７】限外濾過 前記第一フェノール抽出からの水相（１２．２リット
ル）を冷蒸留水３００リットルで希釈し、アミコンンＤ
Ｃ−３０限外濾過装置で３個のＨ１０Ｐ１０１０kdカッ
トオフカートリッジを用い４℃で透析濾過してキャリー
オーバーフェノールを除去した。アミコンユニットを洗
浄し、洗液を貯留液に加えたところ、最終容量は３１．
５リットルであった。限外濾液は捨てた。
ル）を冷蒸留水３００リットルで希釈し、アミコンンＤ
Ｃ−３０限外濾過装置で３個のＨ１０Ｐ１０１０kdカッ
トオフカートリッジを用い４℃で透析濾過してキャリー
オーバーフェノールを除去した。アミコンユニットを洗
浄し、洗液を貯留液に加えたところ、最終容量は３１．
５リットルであった。限外濾液は捨てた。
【００８８】６７％エタノール沈殿 ２．０Ｍ ＣａＣｌ2 ０．８１リットルを前ステップ
からの透析液３１．５リットルに加え（最終ＣａＣｌ2
濃度は０．０５Ｍであった）、溶液を１時間急速に攪拌
しながら９５％エタノール４８．５リットルの滴下で８
２％エタノールとした。４時間の攪拌しかる後４℃で１
２時間放置後、上澄を吸い出し、沈殿を４インチシャー
プルズ連続流遠心機（１５，０００rpm ）において４℃
で４５分間の遠心により集めた。得られた多糖ペレット
を１ガロンウェアリングブレンダーにおいて３０秒間パ
ルスを用い無水エタノール２リットルで摩砕し、テフロ
ンフィルターディスク装備ブフナー漏斗で集め、その場
において無水エタノール１リットルで４回しかる後アセ
トン１リットルで２回洗浄した。次いでサンプルを風袋
を計った皿において減圧下４℃で２０時間乾燥した。収
量は乾燥粉末約１０２ｇであった。すべてのフェノール
抽出からの回収物をプールしたところ、全乾燥粉末で２
１２．６ｇであった。
からの透析液３１．５リットルに加え（最終ＣａＣｌ2
濃度は０．０５Ｍであった）、溶液を１時間急速に攪拌
しながら９５％エタノール４８．５リットルの滴下で８
２％エタノールとした。４時間の攪拌しかる後４℃で１
２時間放置後、上澄を吸い出し、沈殿を４インチシャー
プルズ連続流遠心機（１５，０００rpm ）において４℃
で４５分間の遠心により集めた。得られた多糖ペレット
を１ガロンウェアリングブレンダーにおいて３０秒間パ
ルスを用い無水エタノール２リットルで摩砕し、テフロ
ンフィルターディスク装備ブフナー漏斗で集め、その場
において無水エタノール１リットルで４回しかる後アセ
トン１リットルで２回洗浄した。次いでサンプルを風袋
を計った皿において減圧下４℃で２０時間乾燥した。収
量は乾燥粉末約１０２ｇであった。すべてのフェノール
抽出からの回収物をプールしたところ、全乾燥粉末で２
１２．６ｇであった。
【００８９】２９％エタノール中における超遠心及び最
終生成物の回収 上記からの乾燥粉末２１２．６ｇを蒸留水８２．９リッ
トルに溶解し、それに２Ｍ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ
（０．０５Ｍ ＣａＣｌ2 、多糖２．５mg/ml ）２．１
３リットルを加え、混合液を３０分間にわたる９５％エ
タノール２９．８６リットルの滴下で２９％エタノール
とした。混合液をＫ３チタニウムボウル及びＫｌｌノリ
ル(Noryl) コア装備のＫ２超遠心機（３０，０００rpm
及び流速１５０ml/min）で４℃における遠心により直ち
に清澄化させた。ペレットを捨て、攪拌下３０分間にわ
たる９５％エタノール１７．２２リットルの添加で３８
％エタノールとした。更に３０分間の攪拌後、混合液を
攪拌せずに４℃で１７時間放置し、沈殿を４インチシャ
ープルズ連続流遠心機において１５，０００rpm で集め
た（４５分間要した）。
終生成物の回収 上記からの乾燥粉末２１２．６ｇを蒸留水８２．９リッ
トルに溶解し、それに２Ｍ ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ
（０．０５Ｍ ＣａＣｌ2 、多糖２．５mg/ml ）２．１
３リットルを加え、混合液を３０分間にわたる９５％エ
タノール２９．８６リットルの滴下で２９％エタノール
とした。混合液をＫ３チタニウムボウル及びＫｌｌノリ
ル(Noryl) コア装備のＫ２超遠心機（３０，０００rpm
及び流速１５０ml/min）で４℃における遠心により直ち
に清澄化させた。ペレットを捨て、攪拌下３０分間にわ
たる９５％エタノール１７．２２リットルの添加で３８
％エタノールとした。更に３０分間の攪拌後、混合液を
攪拌せずに４℃で１７時間放置し、沈殿を４インチシャ
ープルズ連続流遠心機において１５，０００rpm で集め
た（４５分間要した）。
【００９０】得られたペーストを無水エタノール２リッ
トル含有１ガロンウェアリングブレンダーに移し、硬白
色粉末が生成するまで４又は５サイクルの３０秒間オン
３０秒間オフにより最大速度でブレンドした。この粉末
をヅィテックス(Zitex) テフロンディスク装備ブフナー
漏斗で集め、その場において新鮮無水エタノール０．５
リットルで２回、１リットルで１回及びアセトン１リッ
トルで２回連続洗浄した。生成物を漏斗から取出し、減
圧下４℃で（２５時間）乾燥のため風袋を計った皿に移
した。生成物の最終収量は乾燥重量で７９．１ｇであっ
た。
トル含有１ガロンウェアリングブレンダーに移し、硬白
色粉末が生成するまで４又は５サイクルの３０秒間オン
３０秒間オフにより最大速度でブレンドした。この粉末
をヅィテックス(Zitex) テフロンディスク装備ブフナー
漏斗で集め、その場において新鮮無水エタノール０．５
リットルで２回、１リットルで１回及びアセトン１リッ
トルで２回連続洗浄した。生成物を漏斗から取出し、減
圧下４℃で（２５時間）乾燥のため風袋を計った皿に移
した。生成物の最終収量は乾燥重量で７９．１ｇであっ
た。
【００９１】実施例３ＭＩＥＰについてコードするゲノムＤＮＡのクローニン
グ フェノール不活性化Ｎ．メニンギチジス細胞（実施例１
参照）約０．１ｇを新鮮なチューブにいれた。フェノー
ル不活性化細胞をＴＥ緩衝液（pH８．０の１０mMトリス
ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ）５６７μｌに再懸濁した。再
懸濁された細胞に１０％ＳＤＳ ３０μｌ及び２０mg/m
l プロテイナーゼＫ〔シグマ(Sigma) 〕３μｌを加え
た。細胞を混ぜ、３７℃で約１時間インキュベートし、
しかる後５Ｍ ＮａＣｌ １００μｌを加え、完全に混
ぜた。次いで０．７Ｍ ＮａＣｌ中１％セチルトリメチ
ルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）８０μｌを加えて
完全に混ぜ、６５℃で１０分間インキュベートした。等
容量（約０．７〜０．８ml）のクロロホルム／イソアミ
ルアルコール（各々２４：１の比率）を加えて完全に混
ぜ、約１０，０００xgで約５分間遠心した。水（上）相
を新しいチューブに移し、有機相を捨てた。等容量のフ
ェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（各々
２５：２４：１の比率）を水相に加えて完全に混ぜ、１
０，０００xgで約５分間遠心した。水（上）相を新しい
チューブに移し、０．６倍容量（約４２０μｌ）のイソ
プロピルアルコールを加えて完全に混ぜ、沈殿したＤＮ
Ａを１０，０００xgで１０分間遠心した。上澄を捨て、
ペレットを７０％エタノールで洗浄した。ＤＮＡペレッ
トを乾燥し、ＴＥ緩衝液１００μｌに再懸濁したが、こ
れはＮ．メニンギチジスゲノムＤＮＡである。
グ フェノール不活性化Ｎ．メニンギチジス細胞（実施例１
参照）約０．１ｇを新鮮なチューブにいれた。フェノー
ル不活性化細胞をＴＥ緩衝液（pH８．０の１０mMトリス
ＨＣｌ、１mM ＥＤＴＡ）５６７μｌに再懸濁した。再
懸濁された細胞に１０％ＳＤＳ ３０μｌ及び２０mg/m
l プロテイナーゼＫ〔シグマ(Sigma) 〕３μｌを加え
た。細胞を混ぜ、３７℃で約１時間インキュベートし、
しかる後５Ｍ ＮａＣｌ １００μｌを加え、完全に混
ぜた。次いで０．７Ｍ ＮａＣｌ中１％セチルトリメチ
ルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）８０μｌを加えて
完全に混ぜ、６５℃で１０分間インキュベートした。等
容量（約０．７〜０．８ml）のクロロホルム／イソアミ
ルアルコール（各々２４：１の比率）を加えて完全に混
ぜ、約１０，０００xgで約５分間遠心した。水（上）相
を新しいチューブに移し、有機相を捨てた。等容量のフ
ェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（各々
２５：２４：１の比率）を水相に加えて完全に混ぜ、１
０，０００xgで約５分間遠心した。水（上）相を新しい
チューブに移し、０．６倍容量（約４２０μｌ）のイソ
プロピルアルコールを加えて完全に混ぜ、沈殿したＤＮ
Ａを１０，０００xgで１０分間遠心した。上澄を捨て、
ペレットを７０％エタノールで洗浄した。ＤＮＡペレッ
トを乾燥し、ＴＥ緩衝液１００μｌに再懸濁したが、こ
れはＮ．メニンギチジスゲノムＤＮＡである。
【００９２】ＭＩＥＰ遺伝子の５’末端及びＭＩＥＰ遺
伝子の３’末端に対応する２種のＤＮＡオリゴヌクレオ
チドを合成した（ムラカミ，Ｅ．Ｃ．ら，１９８９年，
インフェクション・アンド・イムニティ，第５７巻、第
２３１８−２３頁）。ＭＩＥＰ遺伝子の５’末端に特異
的なＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列は５’−ＡＣＴＡ
ＧＴＴＧＣＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＣＣＣＴＧ−３’、
ＭＩＥＰ遺伝子の３’末端に関しては５’−ＧＡＡＴＴ
ＣＡＧＡＴＴＡＧＧＡＡＴＴＴＧＴＴ−３’であった。
これらのＤＮＡオリゴヌクレオチドはＮ．メニンギチジ
スゲノムＤＮＡ１０ngを用いてＭＩＥＰ遺伝子のポリメ
ラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅用のプライマーとして用い
た。ＰＣＲ増幅ステップは製造業者〔パーキン・エルマ
ー(Perkin Elmer)〕による操作に従い行った。
伝子の３’末端に対応する２種のＤＮＡオリゴヌクレオ
チドを合成した（ムラカミ，Ｅ．Ｃ．ら，１９８９年，
インフェクション・アンド・イムニティ，第５７巻、第
２３１８−２３頁）。ＭＩＥＰ遺伝子の５’末端に特異
的なＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列は５’−ＡＣＴＡ
ＧＴＴＧＣＡＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＣＣＣＴＧ−３’、
ＭＩＥＰ遺伝子の３’末端に関しては５’−ＧＡＡＴＴ
ＣＡＧＡＴＴＡＧＧＡＡＴＴＴＧＴＴ−３’であった。
これらのＤＮＡオリゴヌクレオチドはＮ．メニンギチジ
スゲノムＤＮＡ１０ngを用いてＭＩＥＰ遺伝子のポリメ
ラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅用のプライマーとして用い
た。ＰＣＲ増幅ステップは製造業者〔パーキン・エルマ
ー(Perkin Elmer)〕による操作に従い行った。
【００９３】次いで増幅されたＭＩＥＰ ＤＮＡを制限
エンドヌクレアーゼＳｐｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し
た。ＭＩＥＰの完全コード領域を含んだ１．３キロ塩基
(kb)ＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動で単
離し、電気溶出によりゲルから回収した〔分子生物学に
おける現在のプロトコール、１９８７年、オースベル、
Ｒ．Ｍ．，ブレント，Ｒ．，キングストン，Ｒ．Ｅ．，
ムーア，Ｄ．Ｄ．，スミス，Ｊ．Ａ．，セイドマン，
Ｊ．Ｇ．及びストルール，Ｋ．編集，グリーン・バブリ
ッシング・アソシ．(Carrent Protocols in Molecular
Biology,（１９８７），Ausubel,R.M.,Brent,R.,Kingst
on,R.E.,Moore,D.D.,Smith,J.A.,Seidman,J.G.and Stru
hl,K.,eds.,Greene Publishing Assoc.)] 。
エンドヌクレアーゼＳｐｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断し
た。ＭＩＥＰの完全コード領域を含んだ１．３キロ塩基
(kb)ＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動で単
離し、電気溶出によりゲルから回収した〔分子生物学に
おける現在のプロトコール、１９８７年、オースベル、
Ｒ．Ｍ．，ブレント，Ｒ．，キングストン，Ｒ．Ｅ．，
ムーア，Ｄ．Ｄ．，スミス，Ｊ．Ａ．，セイドマン，
Ｊ．Ｇ．及びストルール，Ｋ．編集，グリーン・バブリ
ッシング・アソシ．(Carrent Protocols in Molecular
Biology,（１９８７），Ausubel,R.M.,Brent,R.,Kingst
on,R.E.,Moore,D.D.,Smith,J.A.,Seidman,J.G.and Stru
hl,K.,eds.,Greene Publishing Assoc.)] 。
【００９４】プラスミドベクターｐＵＣ−１９をＳｐｅ
Ｉ及びＥｃｏＲＩで切断した。ゲル精製されたＳｐｅＩ
−ＥｃｏＲＩ ＭＩＥＰ ＤＮＡをＳｐｅＩ−ＥｃｏＲ
ＩｐＵＣ−１９ベクターに結合し、大腸菌株ＤＨ５を形
質転換するために用いた。１．３kbp ＭＩＥＰ ＤＮＡ
含有ｐＵＣ−１９ベクターを含む形質転換株を制限エン
ドヌクレアーゼ地図作成により同定し、ＭＩＥＰ ＤＮ
Ａを配列決定してその同一性を確認した。
Ｉ及びＥｃｏＲＩで切断した。ゲル精製されたＳｐｅＩ
−ＥｃｏＲＩ ＭＩＥＰ ＤＮＡをＳｐｅＩ−ＥｃｏＲ
ＩｐＵＣ−１９ベクターに結合し、大腸菌株ＤＨ５を形
質転換するために用いた。１．３kbp ＭＩＥＰ ＤＮＡ
含有ｐＵＣ−１９ベクターを含む形質転換株を制限エン
ドヌクレアーゼ地図作成により同定し、ＭＩＥＰ ＤＮ
Ａを配列決定してその同一性を確認した。
【００９５】実施例４ｐｃ１／１．Gal １０ｐ（Ｂ）ADH1t ベクターの組立て Ｇａｌ １０プロモーターはＳａｕ３Ａ及びＨｉｎｄII
I で開裂後に得られた０．５キロ塩基対(kbp) 断片をゲ
ル精製することによりプラスミドＹＥｐ５２〔ブローチ
ら，１９８３年，遺伝子発現の実験操作，イノウエ，Ｍ
（編集），アカデミック・プレス，第８３−１１７頁(B
roach,et al., （１９８３）in Experimental Manipula
tion of Gene Expression, Inouye,M(Ed),Academic Pre
ss,pp.８３−１１７）〕から単離した。ＡＤＨ１ターミ
ネーターはＨｉｎｄIII 及びＳｐｅＩ開裂で得られた
０．３５kbp 断片をゲル精製することによりベクターｐ
ＧＡＰ．ｔＡＤＨ２〔ニスカーンら，１９８６年，ジー
ン，第４６巻、第１３５−１４１頁(Kniskerm et al.,
（１９８６），Gene, ４６，pp. １３５−１４１）〕か
ら単離した。２つの断片をＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩで切
断されたゲル精製ｐｕｃ１８△ＨｉｎｄIII ベクター
（ＨｉｎｄIII 部位はｐＵＣ１８をＨｉｎｄIIIで切断
し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片でブラ
ント末端化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合させることに
より除去した）にＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させ、親ベ
クターｐＧａｌ １０−ｔＡＤＨ１を作製した。これは
Ｇａｌ １０ｐ．ＡＤＨ１ｔ結合箇所で唯一のＨｉｎｄ
III クローニング部位を有している。
I で開裂後に得られた０．５キロ塩基対(kbp) 断片をゲ
ル精製することによりプラスミドＹＥｐ５２〔ブローチ
ら，１９８３年，遺伝子発現の実験操作，イノウエ，Ｍ
（編集），アカデミック・プレス，第８３−１１７頁(B
roach,et al., （１９８３）in Experimental Manipula
tion of Gene Expression, Inouye,M(Ed),Academic Pre
ss,pp.８３−１１７）〕から単離した。ＡＤＨ１ターミ
ネーターはＨｉｎｄIII 及びＳｐｅＩ開裂で得られた
０．３５kbp 断片をゲル精製することによりベクターｐ
ＧＡＰ．ｔＡＤＨ２〔ニスカーンら，１９８６年，ジー
ン，第４６巻、第１３５−１４１頁(Kniskerm et al.,
（１９８６），Gene, ４６，pp. １３５−１４１）〕か
ら単離した。２つの断片をＢａｍＨＩ及びＳｐｈＩで切
断されたゲル精製ｐｕｃ１８△ＨｉｎｄIII ベクター
（ＨｉｎｄIII 部位はｐＵＣ１８をＨｉｎｄIIIで切断
し、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片でブラ
ント末端化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合させることに
より除去した）にＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させ、親ベ
クターｐＧａｌ １０−ｔＡＤＨ１を作製した。これは
Ｇａｌ １０ｐ．ＡＤＨ１ｔ結合箇所で唯一のＨｉｎｄ
III クローニング部位を有している。
【００９６】ｐＧａｌ １０．ｔＡＤＨ１の唯一のＨｉ
ｎｄIII クローニング部位は、ｐＧａｌ １０．ｔＡＤ
Ｈ１をＨｉｎｄIII で切断し、切断ＤＮＡをゲル精製
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて下記ＨｉｎｄIII −Ｂ
ａｍＨ１リンカー： ５’−ＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＧ−３’ ３’−ＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＧＡ−５’ に結合させることにより唯一のＢａｍＨＩクローニング
部位に変えた。得られたプラスミドｐＧａｌ １０
（Ｂ）ｔＡＤＨ１はＨｉｎｄIII 部位を失い、唯一のＢ
ａｍＨ１クローニング部位を形成していた。
ｎｄIII クローニング部位は、ｐＧａｌ １０．ｔＡＤ
Ｈ１をＨｉｎｄIII で切断し、切断ＤＮＡをゲル精製
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて下記ＨｉｎｄIII −Ｂ
ａｍＨ１リンカー： ５’−ＡＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＧ−３’ ３’−ＧＣＣＴＡＧＧＣＴＣＧＡ−５’ に結合させることにより唯一のＢａｍＨＩクローニング
部位に変えた。得られたプラスミドｐＧａｌ １０
（Ｂ）ｔＡＤＨ１はＨｉｎｄIII 部位を失い、唯一のＢ
ａｍＨ１クローニング部位を形成していた。
【００９７】Ｇａｌ １０ｐ．ｔＡＤＨ１断片をＳｍａ
Ｉ及びＳｐｈＩ切断でｐＧａｌ １０（Ｂ）ｔＡＤＨ１
から単離し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼでブラント末端化
し、ゲル精製した。酵母シャトルベクターｐＣ１／１
〔ブレークら、１９８４年、プロシーディング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第
８１巻、第４６４２−４６４６頁(Brake et al.,（１９
８４），Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,８１，pp. ４６４２
−４６４６）〕をＳｐｈＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼでブラント末端化し、増幅させた。この断片をＴ
４ＤＮＡリガーゼでベクターに結合させた。次いで結合
反応混合物を用いて大腸菌ＨＢ１０１細胞をアンピシリ
ン耐性に形質転換し、形質転換株を一本鎖の32Ｐ標識Ｈ
ｉｎｄIII−ＢａｍＨＩリンカーとのハイブリッド形成
によりスクリーニングした。新規ベクター組立て体Ｐｃ
ｉ１１．Ｇａｌ １０ｐ（Ｂ）ＡＤＨ１ｔはＨｉｎｄII
I 及びＢａｍＨＩ切断で確認した。
Ｉ及びＳｐｈＩ切断でｐＧａｌ １０（Ｂ）ｔＡＤＨ１
から単離し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼでブラント末端化
し、ゲル精製した。酵母シャトルベクターｐＣ１／１
〔ブレークら、１９８４年、プロシーディング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンスＵＳＡ，第
８１巻、第４６４２−４６４６頁(Brake et al.,（１９
８４），Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,８１，pp. ４６４２
−４６４６）〕をＳｐｈＩで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼでブラント末端化し、増幅させた。この断片をＴ
４ＤＮＡリガーゼでベクターに結合させた。次いで結合
反応混合物を用いて大腸菌ＨＢ１０１細胞をアンピシリ
ン耐性に形質転換し、形質転換株を一本鎖の32Ｐ標識Ｈ
ｉｎｄIII−ＢａｍＨＩリンカーとのハイブリッド形成
によりスクリーニングした。新規ベクター組立て体Ｐｃ
ｉ１１．Ｇａｌ １０ｐ（Ｂ）ＡＤＨ１ｔはＨｉｎｄII
I 及びＢａｍＨＩ切断で確認した。
【００９８】実施例５ＭＩＥＰ＋リーダーＤＮＡ配列を有する酵母ＭＩＥＰ発
現ベクターの組立て ＭＩＥＰの完全コード領域を含むＤＮＡ断片をＳｐｅＩ
及びＥｃｏＲＩによるｐＵＣ１９．ＭＩＥＰ＃７の切
断、ＭＩＥＰ ＤＮＡのゲル精製、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼでのブラント末端化によって形成した。酵母内部発
現ベクターｐＣ１／１．Ｇａｌ １０ｐ（Ｂ）ＡＤＨ１
ｔをＢａｍＨＩで切断し、子牛腸アルカリホスファター
ゼで脱リン酸化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼでブラント
末端化した。ＤＮＡをゲル精製して未切断ベクターを除
去した。
現ベクターの組立て ＭＩＥＰの完全コード領域を含むＤＮＡ断片をＳｐｅＩ
及びＥｃｏＲＩによるｐＵＣ１９．ＭＩＥＰ＃７の切
断、ＭＩＥＰ ＤＮＡのゲル精製、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼでのブラント末端化によって形成した。酵母内部発
現ベクターｐＣ１／１．Ｇａｌ １０ｐ（Ｂ）ＡＤＨ１
ｔをＢａｍＨＩで切断し、子牛腸アルカリホスファター
ゼで脱リン酸化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼでブラント
末端化した。ＤＮＡをゲル精製して未切断ベクターを除
去した。
【００９９】ＭＩＥＰの１．１kbp ブラント末端化断片
をブラント末端化ｐｃ１／１．Ｇａｌ １０ｐ（Ｂ）Ａ
ＤＨ１ｔベクターに結合させ、結合反応混合物を用いて
コンピテント大腸菌ＤＨ５細胞をアンピシリン耐性に形
質転換した。形質転換株はＭＩＥＰ−ベクター結合箇所
と重複する配列と相同的であるようにデザインされた32
Ｐ標識ＤＮＡオリゴヌクレオチド：５’．．．ＡＡＧＣ
ＴＣＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＴＧＣＡＡＴＧ．．．３’と
のハイブリット形成によりスクリーニングした。ＤＮＡ
をハイブリット形成陽性形質転換株から産生させ、Ｋｐ
ｎＩ及びＳａｌＩで切断して、ＭＩＥＰ断片がＧａｌ
１０プロモーターからの発現にとり適正な向きであるこ
とを確認した。更にＤＮＡ組立ての確認はＧａｌ １０
プロモーターからＭＩＥＰコード領域をジデオキシ配列
決定することにより得た。
をブラント末端化ｐｃ１／１．Ｇａｌ １０ｐ（Ｂ）Ａ
ＤＨ１ｔベクターに結合させ、結合反応混合物を用いて
コンピテント大腸菌ＤＨ５細胞をアンピシリン耐性に形
質転換した。形質転換株はＭＩＥＰ−ベクター結合箇所
と重複する配列と相同的であるようにデザインされた32
Ｐ標識ＤＮＡオリゴヌクレオチド：５’．．．ＡＡＧＣ
ＴＣＧＧＡＴＣＣＴＡＧＴＴＧＣＡＡＴＧ．．．３’と
のハイブリット形成によりスクリーニングした。ＤＮＡ
をハイブリット形成陽性形質転換株から産生させ、Ｋｐ
ｎＩ及びＳａｌＩで切断して、ＭＩＥＰ断片がＧａｌ
１０プロモーターからの発現にとり適正な向きであるこ
とを確認した。更にＤＮＡ組立ての確認はＧａｌ １０
プロモーターからＭＩＥＰコード領域をジデオキシ配列
決定することにより得た。
【０１００】形質転換株によるＭＩＥＰの発現はウェス
ターンブロット分析により検出した。形質転換株で産生
された組換えＭＩＥＰはポリアクリルアミドゲルにおい
てＯＭＰＣベシクルから精製されたＭＩＥＰと同時移動
し、ＭＩＥＰに特異的な抗体と免疫反応した。
ターンブロット分析により検出した。形質転換株で産生
された組換えＭＩＥＰはポリアクリルアミドゲルにおい
てＯＭＰＣベシクルから精製されたＭＩＥＰと同時移動
し、ＭＩＥＰに特異的な抗体と免疫反応した。
【０１０１】実施例６５’修正ＭＩＥＰ ＤＮＡ配列を有する酵母ＭＩＥＰ発
現ベクターの組立て ＨｉｎｄIII 部位、保存酵母５’非翻訳リーダー（ＮＴ
Ｌ）、メチオニン開始コドン（ＡＴＧ）、成熟ＭＩＥＰ
の最初の８９コドン（＋２０位においてＡｓｐで始ま
る）及びＫｐｎＩ部位（＋８９位）を含むＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドをポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術を用
いて作製した。ＰＣＲは鋳型としてプラスミドｐＵＣ１
９ＭＩＥＰ４２＃７及びプライマーとして下記ＤＮＡオ
リゴマーを用いて製造業者〔パーキン・エルマー・セタ
ス(Perkin Elmer Cetus)〕から示されるように行った： ５’ＣＴＡＡＧＣＴＴＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＡＣＧＴＴ
ＡＣＣＴＴＧＴＡＣＧＧＴＡＣＡＡＴＴ３’及び ５’ＡＣＧＧＴＡＣＣＧＡＡＧＣＣＧＣＣＴＴＴＣＡＡ
Ｇ３’
現ベクターの組立て ＨｉｎｄIII 部位、保存酵母５’非翻訳リーダー（ＮＴ
Ｌ）、メチオニン開始コドン（ＡＴＧ）、成熟ＭＩＥＰ
の最初の８９コドン（＋２０位においてＡｓｐで始ま
る）及びＫｐｎＩ部位（＋８９位）を含むＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドをポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術を用
いて作製した。ＰＣＲは鋳型としてプラスミドｐＵＣ１
９ＭＩＥＰ４２＃７及びプライマーとして下記ＤＮＡオ
リゴマーを用いて製造業者〔パーキン・エルマー・セタ
ス(Perkin Elmer Cetus)〕から示されるように行った： ５’ＣＴＡＡＧＣＴＴＡＡＣＡＡＡＡＴＧＧＡＣＧＴＴ
ＡＣＣＴＴＧＴＡＣＧＧＴＡＣＡＡＴＴ３’及び ５’ＡＣＧＧＴＡＣＣＧＡＡＧＣＣＧＣＣＴＴＴＣＡＡ
Ｇ３’
【０１０２】ＭＩＥＰクローンの５’領域を除去するた
め、プラスミドｐＵＣ１９ＭＩＥＰ４２＃７をＫｐｎＩ
及びＨｉｎｄIII で切断し、３，４ｋｂｐベクター断片
をアガロースゲル精製した。２８０ｂｐ・ＰＣＲ断片を
ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄIII で切断し、アガロースゲル精
製し、３，４ｋｂｐベクター断片と結合させた。大腸菌
ＨＢ１０１（ＢＲＬ）の形質転換株をＤＮＡオリゴヌク
レオチドハイブリッド形成によりスクリーニングし、陽
性形質転換株からのＤＮＡを制限酵素切断により分析し
た。変異がＰＣＲステップで導入されていないことを保
証するため、陽性形質転換株の２８０ｂｐ ＰＣＲ形成
ＤＮＡを配列した。得られたプラスミドは酵母ＮＴＬ、
ＡＴＧコドン及びＡｓｐコドン（アミノ酸＋２０）で始
まるＭＩＥＰの全オープン読取り枠（ＯＲＦ）からなる
ＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩインサートを含んでいる。
め、プラスミドｐＵＣ１９ＭＩＥＰ４２＃７をＫｐｎＩ
及びＨｉｎｄIII で切断し、３，４ｋｂｐベクター断片
をアガロースゲル精製した。２８０ｂｐ・ＰＣＲ断片を
ＫｐｎＩ及びＨｉｎｄIII で切断し、アガロースゲル精
製し、３，４ｋｂｐベクター断片と結合させた。大腸菌
ＨＢ１０１（ＢＲＬ）の形質転換株をＤＮＡオリゴヌク
レオチドハイブリッド形成によりスクリーニングし、陽
性形質転換株からのＤＮＡを制限酵素切断により分析し
た。変異がＰＣＲステップで導入されていないことを保
証するため、陽性形質転換株の２８０ｂｐ ＰＣＲ形成
ＤＮＡを配列した。得られたプラスミドは酵母ＮＴＬ、
ＡＴＧコドン及びＡｓｐコドン（アミノ酸＋２０）で始
まるＭＩＥＰの全オープン読取り枠（ＯＲＦ）からなる
ＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩインサートを含んでいる。
【０１０３】酵母ＭＩＥＰ発現ベクターは下記のように
組立てた。ｐＧＡＬ１０／ｐｃ１／１及びｐＧＡＰ／ｐ
Ｃ１／１ベクター〔ブラスク(Vlasuk), Ｇ．Ｐ．ら，１
９８９年，Ｊ．Ｂ．Ｃ．，第２６４巻，第１２，１０６
−１２，１１２頁〕をＢａｍＨＩで切断し、ＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノウ断片で平滑末端化し、子牛腸アル
カリホスファターゼで脱リン酸化した。これらの直鎖ベ
クターをクレノウ処理かつゲル精製された前記酵母ＮＴ
Ｌ、ＡＴＧ及びＭＩＥＰのＯＲＦを含有したＨｉｎｄII
I −ＥｃｏＲＩ断片と結合させて、ｐＧａｌ １０／ｐ
ｃ１／ＭＩＥＰ及びｐＧＡＰ／ｐＧＡＰ／ｐＣ１／ＭＩ
ＥＰを形成した。
組立てた。ｐＧＡＬ１０／ｐｃ１／１及びｐＧＡＰ／ｐ
Ｃ１／１ベクター〔ブラスク(Vlasuk), Ｇ．Ｐ．ら，１
９８９年，Ｊ．Ｂ．Ｃ．，第２６４巻，第１２，１０６
−１２，１１２頁〕をＢａｍＨＩで切断し、ＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノウ断片で平滑末端化し、子牛腸アル
カリホスファターゼで脱リン酸化した。これらの直鎖ベ
クターをクレノウ処理かつゲル精製された前記酵母ＮＴ
Ｌ、ＡＴＧ及びＭＩＥＰのＯＲＦを含有したＨｉｎｄII
I −ＥｃｏＲＩ断片と結合させて、ｐＧａｌ １０／ｐ
ｃ１／ＭＩＥＰ及びｐＧＡＰ／ｐＧＡＰ／ｐＣ１／ＭＩ
ＥＰを形成した。
【０１０４】サッカロミセス・セレビシアエ株Ｕ９(gal
10pgal 4-）をプラスミドｐＧａｌ１０／ｐ／ｐＣ１／
ＭＩＥＰで形質転換した。組換えクローンを単離し、Ｍ
ＩＥＰの発現に関して試験した。クローンを２％グルコ
ース(w/v) 含有合成培地（leu-) 中振盪下３７℃で約
６．０のＯＤ660 まで増殖させた。次いでガラクトース
を２％(w/v) まで加えて、ＭＩＥＰの発現をＧａｌ １
０プロモーターから誘導させた。細胞をガラクトース誘
導後更に４５時間にわたり約９．０のＯＤ600まで増殖
させた。次いで細胞を遠心により回収した。細胞ペレッ
トを蒸留水で洗浄し、凍結した。
10pgal 4-）をプラスミドｐＧａｌ１０／ｐ／ｐＣ１／
ＭＩＥＰで形質転換した。組換えクローンを単離し、Ｍ
ＩＥＰの発現に関して試験した。クローンを２％グルコ
ース(w/v) 含有合成培地（leu-) 中振盪下３７℃で約
６．０のＯＤ660 まで増殖させた。次いでガラクトース
を２％(w/v) まで加えて、ＭＩＥＰの発現をＧａｌ １
０プロモーターから誘導させた。細胞をガラクトース誘
導後更に４５時間にわたり約９．０のＯＤ600まで増殖
させた。次いで細胞を遠心により回収した。細胞ペレッ
トを蒸留水で洗浄し、凍結した。
【０１０５】組換えＭＩＥＰに関するウェスターンブロ
ット 酵母がＭＩＥＰを発現したか否かを調べるため、ウェス
ターンブロット分析を行った。１２％、１mm、１０〜１
５ウェルのノベックス・レムリ(Novex Laemmli) ゲルを
用いた。酵母細胞をＨ2 Ｏ中ガラスビーズで破壊した
（ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は破壊プロセスに
おいて２％で用いられる）。細胞破片を１０，０００xg
で１分間の遠心により除去した。
ット 酵母がＭＩＥＰを発現したか否かを調べるため、ウェス
ターンブロット分析を行った。１２％、１mm、１０〜１
５ウェルのノベックス・レムリ(Novex Laemmli) ゲルを
用いた。酵母細胞をＨ2 Ｏ中ガラスビーズで破壊した
（ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は破壊プロセスに
おいて２％で用いられる）。細胞破片を１０，０００xg
で１分間の遠心により除去した。
【０１０６】上澄みＭＩＥＰのポリアクリルアミドゲル
精製に関して前記したようにサンプルランニング緩衝液
と混ぜた。サンプルはブロモフェノール色素マーカーが
ゲルから出るまで参照コントロールとしてＯＭＰＣを用
い３５mAでランさせた。タンパク質をノベックス移入装
置で０．４５μ孔径ニトロセルロースペーパー上に移し
た。移入後ニトロセルロースペーパーをリン酸緩衝液中
において１時間かけ５％牛血清アルブミンでブロック
し、しかる後１：１０００希釈のウサギ抗ＭＩＥＰ抗血
清（標準的操作を用いてゲル精製ＭＩＥＰ免疫により生
成させた）１５mlを加えた。室温で一夜インキュベート
後、１：１０００のアルカリホスファターゼ複合化ヤギ
抗ウサギＩｇＧ１５mlを加えた。２時間のインキュベー
ト後、ファースト・レッドＴＲ塩（ＦＡＳＴ ＲＥＤ
ＴＲ ＳＡＬＴ）（シグマ）及びナフトール−ＡＳ−Ｍ
Ｘホスフェート（シグマ）を用いてブロットを展開させ
た。
精製に関して前記したようにサンプルランニング緩衝液
と混ぜた。サンプルはブロモフェノール色素マーカーが
ゲルから出るまで参照コントロールとしてＯＭＰＣを用
い３５mAでランさせた。タンパク質をノベックス移入装
置で０．４５μ孔径ニトロセルロースペーパー上に移し
た。移入後ニトロセルロースペーパーをリン酸緩衝液中
において１時間かけ５％牛血清アルブミンでブロック
し、しかる後１：１０００希釈のウサギ抗ＭＩＥＰ抗血
清（標準的操作を用いてゲル精製ＭＩＥＰ免疫により生
成させた）１５mlを加えた。室温で一夜インキュベート
後、１：１０００のアルカリホスファターゼ複合化ヤギ
抗ウサギＩｇＧ１５mlを加えた。２時間のインキュベー
ト後、ファースト・レッドＴＲ塩（ＦＡＳＴ ＲＥＤ
ＴＲ ＳＡＬＴ）（シグマ）及びナフトール−ＡＳ−Ｍ
Ｘホスフェート（シグマ）を用いてブロットを展開させ
た。
【０１０７】実施例７組換えＭＩＥＰの細菌発現 １．３キロ塩基対ＭＩＥＰ遺伝子インサートを含むプラ
スミドｐＵＣ１９−ＭＩＥＰを制限エンドヌクレアーゼ
ＳｐｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断した。１．１kbp 断片を
当業界で公知の標準的技術によりアガロースゲルで単離
精製した。２つのシストロンＴＡＣプロモーター及び唯
一のＥｃｏＲＩ部位を含むプラスミドｐＴＡＣＳＤをＥ
ｃｏＲＩで切断した。ブラント末端を製造業者の指示に
従いＴ４ＤＮＡポリメラーゼ〔ベーリンガー・マンハイ
ム(Boehringer Mannheim) により１．３kbp ＭＩＥＰ
ＤＮＡ及びｐＴＡＣＳＤベクターの双方で形成したブ
ラント末端化１．３kbp ＭＩＥＰ ＤＮＡを製造業者の
指示に従いＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハ
イム）でブラント末端化ベクターに結合させた。結合さ
せたＤＮＡを用いて製造業者の指示に従い大腸菌株ＤＨ
５ａＩＱＭＡＸ（ＢＲＬ）を形質転換させた。形質転換
細胞をカナマイシン２５μg/ml及びペニシリン５０μg/
ml含有寒天プレート上におき、３７℃で約１５時間イン
キュベートした。ＭＩＥＰと相同的な配列をもつＤＮＡ
オリゴヌクレオチドを32Ｐで標識し、標準ＤＮＡハイブ
リッド形成技術を用いて形質転換株のプレートから溶離
された変性コロニーを含むニトロセルロースフィルター
をスクリーニングするために用いた。ハイブリッド形成
で陽性のコロニーを制限エンドヌクレアーゼで地図化
し、ＭＩＥＰ遺伝子の向きを調べた。
スミドｐＵＣ１９−ＭＩＥＰを制限エンドヌクレアーゼ
ＳｐｅＩ及びＥｃｏＲＩで切断した。１．１kbp 断片を
当業界で公知の標準的技術によりアガロースゲルで単離
精製した。２つのシストロンＴＡＣプロモーター及び唯
一のＥｃｏＲＩ部位を含むプラスミドｐＴＡＣＳＤをＥ
ｃｏＲＩで切断した。ブラント末端を製造業者の指示に
従いＴ４ＤＮＡポリメラーゼ〔ベーリンガー・マンハイ
ム(Boehringer Mannheim) により１．３kbp ＭＩＥＰ
ＤＮＡ及びｐＴＡＣＳＤベクターの双方で形成したブ
ラント末端化１．３kbp ＭＩＥＰ ＤＮＡを製造業者の
指示に従いＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハ
イム）でブラント末端化ベクターに結合させた。結合さ
せたＤＮＡを用いて製造業者の指示に従い大腸菌株ＤＨ
５ａＩＱＭＡＸ（ＢＲＬ）を形質転換させた。形質転換
細胞をカナマイシン２５μg/ml及びペニシリン５０μg/
ml含有寒天プレート上におき、３７℃で約１５時間イン
キュベートした。ＭＩＥＰと相同的な配列をもつＤＮＡ
オリゴヌクレオチドを32Ｐで標識し、標準ＤＮＡハイブ
リッド形成技術を用いて形質転換株のプレートから溶離
された変性コロニーを含むニトロセルロースフィルター
をスクリーニングするために用いた。ハイブリッド形成
で陽性のコロニーを制限エンドヌクレアーゼで地図化
し、ＭＩＥＰ遺伝子の向きを調べた。
【０１０８】形質転換株によるＭＩＥＰの発現をウェス
ターンブロット分析により検出した。形質転換株で産生
された組換えＭＩＥＰはポリアクリルアミドゲルにおい
てＯＭＰＣベシクルから精製されたＭＩＥＰと同時移動
し、ＭＩＥＰに特異的な抗体と免疫反応した。
ターンブロット分析により検出した。形質転換株で産生
された組換えＭＩＥＰはポリアクリルアミドゲルにおい
てＯＭＰＣベシクルから精製されたＭＩＥＰと同時移動
し、ＭＩＥＰに特異的な抗体と免疫反応した。
【０１０９】実施例８ ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりＯＭＰＣリポソ
ーム又は組換え細胞から精製されたＭＩＥＰの製造 １８×１４cm、３mm厚のアクリルアミド／ＢＩＳ（３
７．５：１）ゲルを用いた。濃縮用ゲルは４％ポリアク
リルアミド、分離用ゲルは１２％ポリアクリルアミドで
あった。約５μg のＯＭＰＣタンパク質又は組換え宿主
細胞タンパク質をゲル当たりで用いた。ＯＭＰＣ １ml
にサンプル緩衝液（４％グリセロール、３００mM ＤＴ
Ｔ、１００mMトリス、０．００１％ブロモフェノールブ
ルー、pH７．０）０．５mlを加えた。混合液を１０５℃
に２０分間加熱し、ゲルに担持させる前に室温まで冷却
した。ゲルをブロモフェノールブルーがゲルの底に達す
るまで冷却下２００〜４００mAでランさせた。ゲルの垂
直ストリップを（約１〜２ｃｍ幅で）切取り、クマシー
ノ酢酸銅（０．１％）で染色した。ストリップをＭＩＥ
Ｐバンド（約３８ｋｄ） が可視化するまで脱染色し
た。次いでストリップをその原ゲル位置に置き、ＭＩＥ
Ｐ領域を小刀でゲルの残部から切出した。
ーム又は組換え細胞から精製されたＭＩＥＰの製造 １８×１４cm、３mm厚のアクリルアミド／ＢＩＳ（３
７．５：１）ゲルを用いた。濃縮用ゲルは４％ポリアク
リルアミド、分離用ゲルは１２％ポリアクリルアミドで
あった。約５μg のＯＭＰＣタンパク質又は組換え宿主
細胞タンパク質をゲル当たりで用いた。ＯＭＰＣ １ml
にサンプル緩衝液（４％グリセロール、３００mM ＤＴ
Ｔ、１００mMトリス、０．００１％ブロモフェノールブ
ルー、pH７．０）０．５mlを加えた。混合液を１０５℃
に２０分間加熱し、ゲルに担持させる前に室温まで冷却
した。ゲルをブロモフェノールブルーがゲルの底に達す
るまで冷却下２００〜４００mAでランさせた。ゲルの垂
直ストリップを（約１〜２ｃｍ幅で）切取り、クマシー
ノ酢酸銅（０．１％）で染色した。ストリップをＭＩＥ
Ｐバンド（約３８ｋｄ） が可視化するまで脱染色し
た。次いでストリップをその原ゲル位置に置き、ＭＩＥ
Ｐ領域を小刀でゲルの残部から切出した。
【０１１０】切出された領域を立方形（約５mm）に切断
し、pH０．１の０．０１Ｍトリス緩衝液で溶出させた。
２回の溶出サイクル後、溶出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り純度に関して評価した。溶出物を共通プールの溶出物
と合わせ、pH１０の６０mMアンモニア−ギ酸に対して４
８時間透析した。一方、溶出タンパク質は水中５０％酢
酸に対して透析するすることもできる。透析後溶出タン
パク質を蒸発乾固させた。物質をＰＤ１０サイジングカ
ラム〔ニュージャージー州ピスカッタウェイのファルマ
シア(Pharmacia) 〕に通して更に精製し、室温で貯蔵し
た。
し、pH０．１の０．０１Ｍトリス緩衝液で溶出させた。
２回の溶出サイクル後、溶出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り純度に関して評価した。溶出物を共通プールの溶出物
と合わせ、pH１０の６０mMアンモニア−ギ酸に対して４
８時間透析した。一方、溶出タンパク質は水中５０％酢
酸に対して透析するすることもできる。透析後溶出タン
パク質を蒸発乾固させた。物質をＰＤ１０サイジングカ
ラム〔ニュージャージー州ピスカッタウェイのファルマ
シア(Pharmacia) 〕に通して更に精製し、室温で貯蔵し
た。
【０１１１】実施例９共有ＰＲＰ−ＯＭＰＣ複合体におけるＭＩＥＰのキャリ
ア活性 免疫処置 ：雄性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス〔マサチューセッ
ツ州ウィルミントンのチャールズ・リバー(Charles Riv
er) 〕を０．０１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．５ml中
に懸濁されたＯＭＰＣに共有結合されたＰＲＰ（ＰＲＰ
−ＯＭＰＣ；ＰＲＰ２．５μg 及びＯＭＰＣ１７μg 含
有）又はＤＴにカップリングされたＰＲＰ（ＰＲＰ−Ｄ
Ｔ；ＰＲＰ２．５〜７．５μg 及びＤＴ１．８〜５．４
μg 含有）〔オンタリオ州ウィローデールのコナフト・
ラボラトリーズ(Connaught Laboratories)〕で復腔内
（ＩＰ）免疫した。第二グループの雄性Ｃ３Ｈ−ＨｅＮ
マウスはＭＩＥＰ１７μg 、ＯＭＰＣ１７μg 又はＯＭ
ＰＣ−ＩＡＡ（Ｎ−アセチルホモシステインチオラクト
ンで誘導されかつヨードアセトアミドでキャップされた
ＯＭＰＣ）１７μgmのいずれかを受容した。養子移入実
験用の細胞ドナーを２１日間離して２回ＩＰ免疫し、脾
臓細胞を二次免疫後１０日目に採取した。養子移入受容
体は、137 Ｃｓ源から５００Ｒ全身γ線照射をうけかつ
直ちにＰＲＰ−ＤＴとＯＭＰＣ、ＭＩＥＰ又はＯＭＰＣ
−ＩＡＡとで別々にプライム化された２同系ドナーの各
々からの８×１０7 脾臓細胞の静脈内注射で再調整され
た雄性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスであった。コントロールマ
ウスはＰＲＰ−ＯＭＰＣでプライム化された１ドナーマ
ウスから８×１０7 脾臓細胞及び非プライム化ドナーマ
ウスから同数の脾臓細胞を受容した。
ア活性 免疫処置 ：雄性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス〔マサチューセッ
ツ州ウィルミントンのチャールズ・リバー(Charles Riv
er) 〕を０．０１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢＳ）０．５ml中
に懸濁されたＯＭＰＣに共有結合されたＰＲＰ（ＰＲＰ
−ＯＭＰＣ；ＰＲＰ２．５μg 及びＯＭＰＣ１７μg 含
有）又はＤＴにカップリングされたＰＲＰ（ＰＲＰ−Ｄ
Ｔ；ＰＲＰ２．５〜７．５μg 及びＤＴ１．８〜５．４
μg 含有）〔オンタリオ州ウィローデールのコナフト・
ラボラトリーズ(Connaught Laboratories)〕で復腔内
（ＩＰ）免疫した。第二グループの雄性Ｃ３Ｈ−ＨｅＮ
マウスはＭＩＥＰ１７μg 、ＯＭＰＣ１７μg 又はＯＭ
ＰＣ−ＩＡＡ（Ｎ−アセチルホモシステインチオラクト
ンで誘導されかつヨードアセトアミドでキャップされた
ＯＭＰＣ）１７μgmのいずれかを受容した。養子移入実
験用の細胞ドナーを２１日間離して２回ＩＰ免疫し、脾
臓細胞を二次免疫後１０日目に採取した。養子移入受容
体は、137 Ｃｓ源から５００Ｒ全身γ線照射をうけかつ
直ちにＰＲＰ−ＤＴとＯＭＰＣ、ＭＩＥＰ又はＯＭＰＣ
−ＩＡＡとで別々にプライム化された２同系ドナーの各
々からの８×１０7 脾臓細胞の静脈内注射で再調整され
た雄性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスであった。コントロールマ
ウスはＰＲＰ−ＯＭＰＣでプライム化された１ドナーマ
ウスから８×１０7 脾臓細胞及び非プライム化ドナーマ
ウスから同数の脾臓細胞を受容した。
【０１１２】抗ＰＲＰ抗体に関するＥＬＩＳＡ：反応性
アミン類をマーバーグ(Marburg) らの米国特許第４，８
８２，３１７号明細書で記載されたようにカルボニルジ
イミダゾールとの処理及びブタンジアミンとの反応で精
製されたＨ．インフルエンザＰＲＰに導入した。この誘
導化ＰＲＰをpH８．４の０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩
衝液でセファデックス(Sephadex)Ｇ−２５によるクロマ
トグラフィーに付した。ジメチルスルホキシド中Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドビオチン〔イリノイ州ロックフ
ォードのピアース・ケミカル(Pierce Chemical) 〕を最
終濃度０．３mg/ml まで溶出液に加え、暗所中環境温度
（約２５〜２８℃）で４時間反応させた。未反応Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドビオチンをＰＢＳ中セファデッ
クスＧ−２５によるゲル濾過で除去した。コスター(Cos
tar)（マサチューセッツ州ケンブリッジ）ポリビニルク
ロリドＥＬＩＳＡプレートを環境温度及び湿度１００％
で一夜かけpH９．５の０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝
液中１０μg/mlでアビジン（ピアース・ケミカル）５０
μg ／ウェルにてコートした。プレートを０．０５％ツ
イーン２０（ＴＢＳ−Ｔ）含有pH８．５の０．０５Ｍト
リス緩衝液で３回洗浄し、環境温度及び湿度１００％に
おいて１時間かけＴＢＳ−Ｔ＋０．１％ゼラチン（ブロ
ック用緩衝液）でブロックした。プレートを洗浄せずに
ブロットし、ＰＢＳ中１５〜４０μg/mlのＰＲＰ−ビオ
チン５０μg ／ウェルを加え、プレートを１時間インキ
ュベートした。プレートをサンプル添加前にＴＢＳ−Ｔ
で３回洗浄した。サンプルをブロック用緩衝液に２倍連
続希釈で加え、環境温度及び湿度１００％で２時間イン
キュベートした。次いでプレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗
浄し、ブロック用緩衝液で希釈された適切なアルカリホ
スファーゼ複合化抗免疫グロブリンを加えた。用いられ
た抗体はヤギ抗マウスＩｇＭ〔ペンシルバニア州ウェス
トグローブのジャクソン・イムノリサーチ(Jackson Imm
unoresearch)〕，ＩｇＧ（Ｆｃ）（ジャクソン・イムノ
リサーチ）、ＩｇＧ１（ガンマ）（メリーランド州ゲイ
ザースバーグのＢＲＬ）、ＩｇＧ２ａ（ガンマ）（ＢＲ
Ｌ）、ＩｇＧ２ｂ（ガンマ）〔アラバマ州バーミンガム
のサザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ(Souther
n Biotechnology Associates) 〕、ＩｇＧ３（ガンマ）
（サザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ）及びヤ
ギ抗ウサギＩｇＧ（ジャクソン・イムノリサーチ）であ
った。プレートを環境温度及び湿度１００％で２時間イ
ンキュベートし、ブロック用緩衝液で洗浄し、基質展開
をｐ−ニトロフェニルホスフェート〔１Ｍジエタノール
アミン中１mg/ml ；メリーランド州ゲイザースバーグの
カーケガード・アンド・ペリー(Kirkegaard and Perr
y)〕で行った。希釈はサンプル吸光度が８試薬ブランク
の平均吸光度＋標準偏差の３倍を超えかつ連続希釈間の
吸光度差が０．０１以上であった場合に陽性と考えられ
た。終点力価は前記のようにＥＬＩＳＡで陽性反応を示
した最大希釈倍率の逆数と規定された。逆数力価の対数
を二方向分散分析により処理グループ間で比較した〔リ
ンドマン，Ｒ．Ｈ．ら，１９８０年，二変数及び多変数
分析の紹介、スコット・フォレスマン（発行），ニュー
ヨーク(Lindeman,R.H.et al., （１９８０），Introdac
tion to Bivariate and Multivariate Analysis,Scott
Foresman(pub.),New Yrk) 〕。
アミン類をマーバーグ(Marburg) らの米国特許第４，８
８２，３１７号明細書で記載されたようにカルボニルジ
イミダゾールとの処理及びブタンジアミンとの反応で精
製されたＨ．インフルエンザＰＲＰに導入した。この誘
導化ＰＲＰをpH８．４の０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩
衝液でセファデックス(Sephadex)Ｇ−２５によるクロマ
トグラフィーに付した。ジメチルスルホキシド中Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドビオチン〔イリノイ州ロックフ
ォードのピアース・ケミカル(Pierce Chemical) 〕を最
終濃度０．３mg/ml まで溶出液に加え、暗所中環境温度
（約２５〜２８℃）で４時間反応させた。未反応Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドビオチンをＰＢＳ中セファデッ
クスＧ−２５によるゲル濾過で除去した。コスター(Cos
tar)（マサチューセッツ州ケンブリッジ）ポリビニルク
ロリドＥＬＩＳＡプレートを環境温度及び湿度１００％
で一夜かけpH９．５の０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝
液中１０μg/mlでアビジン（ピアース・ケミカル）５０
μg ／ウェルにてコートした。プレートを０．０５％ツ
イーン２０（ＴＢＳ−Ｔ）含有pH８．５の０．０５Ｍト
リス緩衝液で３回洗浄し、環境温度及び湿度１００％に
おいて１時間かけＴＢＳ−Ｔ＋０．１％ゼラチン（ブロ
ック用緩衝液）でブロックした。プレートを洗浄せずに
ブロットし、ＰＢＳ中１５〜４０μg/mlのＰＲＰ−ビオ
チン５０μg ／ウェルを加え、プレートを１時間インキ
ュベートした。プレートをサンプル添加前にＴＢＳ−Ｔ
で３回洗浄した。サンプルをブロック用緩衝液に２倍連
続希釈で加え、環境温度及び湿度１００％で２時間イン
キュベートした。次いでプレートをＴＢＳ−Ｔで３回洗
浄し、ブロック用緩衝液で希釈された適切なアルカリホ
スファーゼ複合化抗免疫グロブリンを加えた。用いられ
た抗体はヤギ抗マウスＩｇＭ〔ペンシルバニア州ウェス
トグローブのジャクソン・イムノリサーチ(Jackson Imm
unoresearch)〕，ＩｇＧ（Ｆｃ）（ジャクソン・イムノ
リサーチ）、ＩｇＧ１（ガンマ）（メリーランド州ゲイ
ザースバーグのＢＲＬ）、ＩｇＧ２ａ（ガンマ）（ＢＲ
Ｌ）、ＩｇＧ２ｂ（ガンマ）〔アラバマ州バーミンガム
のサザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ(Souther
n Biotechnology Associates) 〕、ＩｇＧ３（ガンマ）
（サザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ）及びヤ
ギ抗ウサギＩｇＧ（ジャクソン・イムノリサーチ）であ
った。プレートを環境温度及び湿度１００％で２時間イ
ンキュベートし、ブロック用緩衝液で洗浄し、基質展開
をｐ−ニトロフェニルホスフェート〔１Ｍジエタノール
アミン中１mg/ml ；メリーランド州ゲイザースバーグの
カーケガード・アンド・ペリー(Kirkegaard and Perr
y)〕で行った。希釈はサンプル吸光度が８試薬ブランク
の平均吸光度＋標準偏差の３倍を超えかつ連続希釈間の
吸光度差が０．０１以上であった場合に陽性と考えられ
た。終点力価は前記のようにＥＬＩＳＡで陽性反応を示
した最大希釈倍率の逆数と規定された。逆数力価の対数
を二方向分散分析により処理グループ間で比較した〔リ
ンドマン，Ｒ．Ｈ．ら，１９８０年，二変数及び多変数
分析の紹介、スコット・フォレスマン（発行），ニュー
ヨーク(Lindeman,R.H.et al., （１９８０），Introdac
tion to Bivariate and Multivariate Analysis,Scott
Foresman(pub.),New Yrk) 〕。
【０１１３】抗ＰＲＰ抗体定量に関するＲＩＡ：抗ＰＲ
Ｐ抗体の量に関して試験される血清の実験サンプルを希
釈液として牛胎児血清を用い１：２．１：５及び１：２
０希釈した。各希釈血清サンプル２５μl を０．５μlm
ＲＩＡバイアル〔サーステッズ(Sarstedt)〕に二重に移
した。12 5 Ｉで標識されたＰＲＰの溶液を希釈液として
リン酸緩衝液を用い３００〜８００カウント/min(cpm)/
５０μlmとなるように希釈した。希釈125 Ｉ−ＰＲＰ５
０μl を各ＲＩＡバイアルに移し、十分に混ぜ、４℃で
約１５時間インキュベートした。硫酸アンモニウムの飽
和溶液７５μl を４℃で各ＲＩＡバイアルに加え、十分
に混ぜ、４℃で１時間インキュベートした。次いでＲＩ
Ａバイアルを１０，０００xgで１０分間遠心し、上澄を
捨て、ペレットのcpm をガンマカウンター（ＬＫＢ）で
測定した。
Ｐ抗体の量に関して試験される血清の実験サンプルを希
釈液として牛胎児血清を用い１：２．１：５及び１：２
０希釈した。各希釈血清サンプル２５μl を０．５μlm
ＲＩＡバイアル〔サーステッズ(Sarstedt)〕に二重に移
した。12 5 Ｉで標識されたＰＲＰの溶液を希釈液として
リン酸緩衝液を用い３００〜８００カウント/min(cpm)/
５０μlmとなるように希釈した。希釈125 Ｉ−ＰＲＰ５
０μl を各ＲＩＡバイアルに移し、十分に混ぜ、４℃で
約１５時間インキュベートした。硫酸アンモニウムの飽
和溶液７５μl を４℃で各ＲＩＡバイアルに加え、十分
に混ぜ、４℃で１時間インキュベートした。次いでＲＩ
Ａバイアルを１０，０００xgで１０分間遠心し、上澄を
捨て、ペレットのcpm をガンマカウンター（ＬＫＢ）で
測定した。
【０１１４】既知量の抗ＰＲＰ抗体を含有した連続２倍
希釈の抗血清からなる標準曲線を前記のように作成し、
実験血清サンプルと並行して調べた。標準曲線における
抗ＰＲＰ抗体の量は最大抗体量として１４μg /ml 及び
最少抗体量として０．０５６μg/mlの間であった。すべ
てのサンプルは二重にランさせた。
希釈の抗血清からなる標準曲線を前記のように作成し、
実験血清サンプルと並行して調べた。標準曲線における
抗ＰＲＰ抗体の量は最大抗体量として１４μg /ml 及び
最少抗体量として０．０５６μg/mlの間であった。すべ
てのサンプルは二重にランさせた。
【０１１５】二重サンプルの平均cpm を標準曲線と比較
して、実験血清サンプル中に存在する抗ＰＲＰ抗体の量
を計算した。 養子移入受容体の抗体応答：ＰＲＰ−ＤＴとＭＩＥＰ、
ＯＭＰＣ又はＩＡＡ−ＯＭＰＣとで別々にプライム化さ
れた脾臓細胞の受容体は４日以内で相当量の血清ＩｇＧ
１及びＩｇＧ２ａ抗ＰＲＰ抗体の産生によりＰＲＰ−Ｏ
ＭＰＣ免疫に応答した（図１参照）。ＭＩＥＰ、ＯＭＰ
Ｃ又はＩＡＡ−ＯＭＰＣでキャリアプライム化された脾
臓細胞で再調整された放射線照射マウスは、ＯＭＰＣプ
ライム化ではなくＰＲＰ−ＤＴプライム化された脾臓細
胞を受容したコントロールマウスよりもＰＲＰ−ＯＭＰ
Ｃ免疫後に有意に高いＩｇＧ１（ｐ＜０．００１）及び
ＩｇＧ２ａ（ｐ＜０．０４）抗ＰＲＰ抗体力価を有して
いた。ＰＲＰ−ＤＴとＭＩＥＰ、ＯＭＰＣ又はＩＡＡ−
ＯＭＰＣとで別々にプライム化された脾臓細胞を受容し
たマウスにおけるＰＲＰ−ＯＭＰＣ免疫に対する血清抗
体応答はＰＲＰ−ＯＭＰＣでプライム化された脾臓細胞
を受容したマウスの場合に匹敵した（６〜１３日目のＩ
ｇＧ１抗体に関してｐ＞０．１２及び９〜１３日目のＩ
ｇＧ２ａ抗体に関してｐ＞０．５）。抗体応答は、ＰＲ
Ｐ−ＤＴプライム化及びＭＩＥＰ又はＯＭＰＣプライム
化脾臓細胞で再調整された放射線照射マウスがタンパク
質キャリアなしにＰＲＰで免疫された場合には観察され
なかった。統計的分析は二方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）
により行った（リンドマン，Ｒ．Ｈ．ら，二変数及び多
変数分析の紹介、１９８０年，スコット・フォレスマ
ン，ニューヨーク）。これらの結果は、キャリアＴヘル
パー細胞を誘導するＯＭＰＣと同様にマウスで官能化さ
れたＭＩＥＰも抗ＰＲＰ・ＩｇＧ抗体の形成に応答する
ことを立証している。
して、実験血清サンプル中に存在する抗ＰＲＰ抗体の量
を計算した。 養子移入受容体の抗体応答：ＰＲＰ−ＤＴとＭＩＥＰ、
ＯＭＰＣ又はＩＡＡ−ＯＭＰＣとで別々にプライム化さ
れた脾臓細胞の受容体は４日以内で相当量の血清ＩｇＧ
１及びＩｇＧ２ａ抗ＰＲＰ抗体の産生によりＰＲＰ−Ｏ
ＭＰＣ免疫に応答した（図１参照）。ＭＩＥＰ、ＯＭＰ
Ｃ又はＩＡＡ−ＯＭＰＣでキャリアプライム化された脾
臓細胞で再調整された放射線照射マウスは、ＯＭＰＣプ
ライム化ではなくＰＲＰ−ＤＴプライム化された脾臓細
胞を受容したコントロールマウスよりもＰＲＰ−ＯＭＰ
Ｃ免疫後に有意に高いＩｇＧ１（ｐ＜０．００１）及び
ＩｇＧ２ａ（ｐ＜０．０４）抗ＰＲＰ抗体力価を有して
いた。ＰＲＰ−ＤＴとＭＩＥＰ、ＯＭＰＣ又はＩＡＡ−
ＯＭＰＣとで別々にプライム化された脾臓細胞を受容し
たマウスにおけるＰＲＰ−ＯＭＰＣ免疫に対する血清抗
体応答はＰＲＰ−ＯＭＰＣでプライム化された脾臓細胞
を受容したマウスの場合に匹敵した（６〜１３日目のＩ
ｇＧ１抗体に関してｐ＞０．１２及び９〜１３日目のＩ
ｇＧ２ａ抗体に関してｐ＞０．５）。抗体応答は、ＰＲ
Ｐ−ＤＴプライム化及びＭＩＥＰ又はＯＭＰＣプライム
化脾臓細胞で再調整された放射線照射マウスがタンパク
質キャリアなしにＰＲＰで免疫された場合には観察され
なかった。統計的分析は二方向分散分析（ＡＮＯＶＡ）
により行った（リンドマン，Ｒ．Ｈ．ら，二変数及び多
変数分析の紹介、１９８０年，スコット・フォレスマ
ン，ニューヨーク）。これらの結果は、キャリアＴヘル
パー細胞を誘導するＯＭＰＣと同様にマウスで官能化さ
れたＭＩＥＰも抗ＰＲＰ・ＩｇＧ抗体の形成に応答する
ことを立証している。
【０１１６】実施例１０ＭＩＥＰの分裂誘発活性 Ｎ．メニンギチジスＯＭＰＣから精製されたＭＩＥＰを
リンパ球増殖アッセイで分裂誘発活性について試験し
た。ネズミ脾臓リンパ球はＣ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ３Ｈ／Ｆ
ｅＪ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ又はＢａｌｂ／ｃマウスから得
た。マウスは未処置であるか又は既にＰＲＰ−ＯＭＰＣ
で接種されていた。脾臓細胞を無菌細メッシュスクリー
ンに通して間質破片を除去し、Ｋ培地〔ＲＰＭＩ １６
４０（ギブコ）＋１０％牛胎児血清（アーマー(Armou
r)）、２mMグルタミン（ギブコ）、１０mMヘペス（ギブ
コ）、１００μg/mlペニシリン／１００μg/mlストレプ
トマイシン（ギブコ）及び５０μM β−メルカプトエタ
ノール（バイオラッド(Biorad)）〕に懸濁した。細胞の
破砕凝塊にピペットで移した後、懸濁液を３００xgで５
分間遠心し、ペレットを赤血球溶離用緩衝液〔９０％
０．１６Ｍ ＮＨ4 Ｃｌ（フィッシャー(Fisher)）、１
０％０．７ＭトリスＨＣｌ（シグマ）、pH７．２〕に室
温で２分間かけ細胞０．１ml/ml 緩衝液で再懸濁した。
細胞を牛胎児血清５mlで下層化し、４０００xgで１０分
間遠心し、しかる後Ｋ培地で２回洗浄し、Ｋ培地に５×
１０6 細胞／mlで再懸濁した。これらの細胞をタンパク
質又はペプチドサンプル１００μlmと共に９６ウェルプ
レートに三重に（１００μl ／ウェルで）いれた。
リンパ球増殖アッセイで分裂誘発活性について試験し
た。ネズミ脾臓リンパ球はＣ３Ｈ／ＨｅＮ、Ｃ３Ｈ／Ｆ
ｅＪ、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ又はＢａｌｂ／ｃマウスから得
た。マウスは未処置であるか又は既にＰＲＰ−ＯＭＰＣ
で接種されていた。脾臓細胞を無菌細メッシュスクリー
ンに通して間質破片を除去し、Ｋ培地〔ＲＰＭＩ １６
４０（ギブコ）＋１０％牛胎児血清（アーマー(Armou
r)）、２mMグルタミン（ギブコ）、１０mMヘペス（ギブ
コ）、１００μg/mlペニシリン／１００μg/mlストレプ
トマイシン（ギブコ）及び５０μM β−メルカプトエタ
ノール（バイオラッド(Biorad)）〕に懸濁した。細胞の
破砕凝塊にピペットで移した後、懸濁液を３００xgで５
分間遠心し、ペレットを赤血球溶離用緩衝液〔９０％
０．１６Ｍ ＮＨ4 Ｃｌ（フィッシャー(Fisher)）、１
０％０．７ＭトリスＨＣｌ（シグマ）、pH７．２〕に室
温で２分間かけ細胞０．１ml/ml 緩衝液で再懸濁した。
細胞を牛胎児血清５mlで下層化し、４０００xgで１０分
間遠心し、しかる後Ｋ培地で２回洗浄し、Ｋ培地に５×
１０6 細胞／mlで再懸濁した。これらの細胞をタンパク
質又はペプチドサンプル１００μlmと共に９６ウェルプ
レートに三重に（１００μl ／ウェルで）いれた。
【０１１７】Ｎ．メニンギチジスのＭＩＥＰを実施例７
で前記したように精製した。コントロールタンパク質は
牛血清アルブミン、ＰＲＰ−ＯＭＰＣ、ＯＭＰＣ自体及
びリポ多糖（内毒素）を含有していた。すべてのサンプ
ルを１、６．５、１３、２６、５２、１０５及び１３０
μg/mlの濃度までＫ培地で希釈し、しかる後それらの最
終濃度がそれらの原濃度の半分となるように前記のよう
にいれた。三重ウェルをＫ培地のみに懸濁された各タイ
プの細胞に関してもインキュベートし、細胞増殖のベー
スラインを定めた。
で前記したように精製した。コントロールタンパク質は
牛血清アルブミン、ＰＲＰ−ＯＭＰＣ、ＯＭＰＣ自体及
びリポ多糖（内毒素）を含有していた。すべてのサンプ
ルを１、６．５、１３、２６、５２、１０５及び１３０
μg/mlの濃度までＫ培地で希釈し、しかる後それらの最
終濃度がそれらの原濃度の半分となるように前記のよう
にいれた。三重ウェルをＫ培地のみに懸濁された各タイ
プの細胞に関してもインキュベートし、細胞増殖のベー
スラインを定めた。
【０１１８】培養３、５又は７日目に、ウェルを１mCi/
２５μl 含有3 Ｈ−チミジン（アマーシャム）２５μl
でパルス標識した。ウェルを１６〜１８時間後にスカッ
トロン・ハーベスター(Skatron harvester) で回収し、
カウント／min （cpm)を液体シンチレーションカウンタ
ーで測定した。cpm の正味変化はＫ培地のみで細胞によ
りウェル当たりで測定されたcpm の平均数を実験cpm の
平均から差し引くことにより計算された。刺激インデッ
クスは平均実験cpm をコントロールウェルの平均cpm で
割ることにより決定された。
２５μl 含有3 Ｈ−チミジン（アマーシャム）２５μl
でパルス標識した。ウェルを１６〜１８時間後にスカッ
トロン・ハーベスター(Skatron harvester) で回収し、
カウント／min （cpm)を液体シンチレーションカウンタ
ーで測定した。cpm の正味変化はＫ培地のみで細胞によ
りウェル当たりで測定されたcpm の平均数を実験cpm の
平均から差し引くことにより計算された。刺激インデッ
クスは平均実験cpm をコントロールウェルの平均cpm で
割ることにより決定された。
【０１１９】図２で示されるように、ＯＭＰＣ及びＰＲ
Ｐ−ＯＭＰＣのみならずＭＩＥＰワクチンも既に接種さ
れたマウスからのリンパ球を増殖させた。この分裂誘発
活性は、ＭＩＥＰがウサギ発熱原性アッセイで測定され
る検出可能リポ多糖（ＬＳＰ）を含まず、増殖効果が銀
染色ポリアクリルアミドゲルに検出可能レベル以下の量
で存在するＬＰＳにより起こされた場合よりも大きいこ
とから、ＬＰＳに起因しないようであった。
Ｐ−ＯＭＰＣのみならずＭＩＥＰワクチンも既に接種さ
れたマウスからのリンパ球を増殖させた。この分裂誘発
活性は、ＭＩＥＰがウサギ発熱原性アッセイで測定され
る検出可能リポ多糖（ＬＳＰ）を含まず、増殖効果が銀
染色ポリアクリルアミドゲルに検出可能レベル以下の量
で存在するＬＰＳにより起こされた場合よりも大きいこ
とから、ＬＰＳに起因しないようであった。
【０１２０】実施例１１ Ｎ．メニンギチジスＭＩＥＰへのＨ．インフルエンザタ
イプｂ ＰＲＰ多糖の複合化 化学的複合化は米国特許第４，８８２，３１７号明細書
で開示された方法に従い行った。pH１１．５の０．１Ｍ
ホウ酸緩衝液３ml中ＭＩＥＰ１０mgをエチレンジアミン
四酢酸二ナトリウム塩（ＥＤＴＡ、シグマ・ケミカル
ズ）１０mg及びジチオスレイトール（シグマ・ケミカル
ズ）４mgと混ぜた。タンパク質溶液をＮ2 で十分にフラ
ッシングした。Ｎ−アセチルホモシステインチオラクト
ン（アルドリッチ・ケミカルズ）１２５mgをＭＩＥＰ溶
液に加え、混合液を室温で１６時間インキュベートし
た。次いでそれをpH９．５の４mMＥＤＴＡ含有０．１Ｍ
ホウ酸緩衝液２リットルに対してＮ2 下室温で２４時間
にわたり２回透析した。次いでチオール化タンパク質を
エルマン試薬（シグマ・ケミカルズ）によりチオール含
量に関して分析し、タンパク質濃度をブラッドフォード
(Bradford)試薬（ピアース・ケミカルズ）により調べ
た。ＰＲＰへのＭＩＥＰの複合化のために、１．５倍過
剰（wt/wt)のブロモアセチル化Ｈ．インフルエンザ血清
タイプｂ ＰＲＰをＭＩＥＰ溶液に加え、pHを１Ｎ Ｎ
ａＯＨで９〜９．５に調整した。混合液をＮ2 下室温で
６〜８時間インキュベートした。反応時間経過後、Ｎ−
アセチルシステアミン（ケミカル・ダイナミクス）２５
μl を混合液に加え、Ｎ2 下室温で１８時間放置した。
複合体溶液を１Ｎ ＨＣｌでpH３〜４に酸性化し、１
０，０００xgで１０分間遠心した。上澄１mlをＦＰＬＣ
スペロース(Sperose) ６Ｂ〔１．６×５０cm、ファルマ
シア(Pharmacia) 〕のカラムに直接適用し、複合体をＰ
ＢＳで溶出させた。多糖−タンパク質複合体（ＰＲＰ−
ＭＩＥＰ）を含有した放出容量ピークをプールした。次
いで複合体溶液を滅菌のため０．２２μフィルターで濾
過した。
イプｂ ＰＲＰ多糖の複合化 化学的複合化は米国特許第４，８８２，３１７号明細書
で開示された方法に従い行った。pH１１．５の０．１Ｍ
ホウ酸緩衝液３ml中ＭＩＥＰ１０mgをエチレンジアミン
四酢酸二ナトリウム塩（ＥＤＴＡ、シグマ・ケミカル
ズ）１０mg及びジチオスレイトール（シグマ・ケミカル
ズ）４mgと混ぜた。タンパク質溶液をＮ2 で十分にフラ
ッシングした。Ｎ−アセチルホモシステインチオラクト
ン（アルドリッチ・ケミカルズ）１２５mgをＭＩＥＰ溶
液に加え、混合液を室温で１６時間インキュベートし
た。次いでそれをpH９．５の４mMＥＤＴＡ含有０．１Ｍ
ホウ酸緩衝液２リットルに対してＮ2 下室温で２４時間
にわたり２回透析した。次いでチオール化タンパク質を
エルマン試薬（シグマ・ケミカルズ）によりチオール含
量に関して分析し、タンパク質濃度をブラッドフォード
(Bradford)試薬（ピアース・ケミカルズ）により調べ
た。ＰＲＰへのＭＩＥＰの複合化のために、１．５倍過
剰（wt/wt)のブロモアセチル化Ｈ．インフルエンザ血清
タイプｂ ＰＲＰをＭＩＥＰ溶液に加え、pHを１Ｎ Ｎ
ａＯＨで９〜９．５に調整した。混合液をＮ2 下室温で
６〜８時間インキュベートした。反応時間経過後、Ｎ−
アセチルシステアミン（ケミカル・ダイナミクス）２５
μl を混合液に加え、Ｎ2 下室温で１８時間放置した。
複合体溶液を１Ｎ ＨＣｌでpH３〜４に酸性化し、１
０，０００xgで１０分間遠心した。上澄１mlをＦＰＬＣ
スペロース(Sperose) ６Ｂ〔１．６×５０cm、ファルマ
シア(Pharmacia) 〕のカラムに直接適用し、複合体をＰ
ＢＳで溶出させた。多糖−タンパク質複合体（ＰＲＰ−
ＭＩＥＰ）を含有した放出容量ピークをプールした。次
いで複合体溶液を滅菌のため０．２２μフィルターで濾
過した。
【０１２１】実施例１２ＰＲＰ−ＭＩＥＰ複合体の免疫原性の立証 免疫処置：雄性Ｂａｌ b/cマウス（マサチューセッツ州
ウィルミントンのチャールズ・リバー）を前形成ミョウ
バン０．５ml中ＰＲＰ２．５μg を用いて実施例１１で
記載されたようにＭＩＥＰに共有結合されたＰＲＰでＩ
Ｐ免疫した。コントロールマウスはＰＲＰ・ＣＲＭ〔ア
ンダーソン，Ｍ．Ｅ．ら，１９８５年，ジャーナル・オ
ブ・ペディアトリクス，第１０７巻，第３４６−３５１
頁(Anderson,M.E.et al., （１９８５），Ｊ．Pediatri
cs. １０７，pp. ３４６−３５１）〕（ＰＲＰ２．５μ
g/ＣＲＭ６．２５μg ；ヒト用量の１／４）、ＰＲＰ−
ＤＴ（ＰＲＰ２．５μg/ＤＴ１．８μg ；一定量のＰＲ
Ｐが用いられるようなヒト用量の１／１０）及びＰＲＰ
−ＯＭＰＣ（ＰＲＰ２．５μg/ＯＭＰＣ３５μg ；ヒト
用量の１／４）として投与される相当量のＰＲＰで免疫
した。
ウィルミントンのチャールズ・リバー）を前形成ミョウ
バン０．５ml中ＰＲＰ２．５μg を用いて実施例１１で
記載されたようにＭＩＥＰに共有結合されたＰＲＰでＩ
Ｐ免疫した。コントロールマウスはＰＲＰ・ＣＲＭ〔ア
ンダーソン，Ｍ．Ｅ．ら，１９８５年，ジャーナル・オ
ブ・ペディアトリクス，第１０７巻，第３４６−３５１
頁(Anderson,M.E.et al., （１９８５），Ｊ．Pediatri
cs. １０７，pp. ３４６−３５１）〕（ＰＲＰ２．５μ
g/ＣＲＭ６．２５μg ；ヒト用量の１／４）、ＰＲＰ−
ＤＴ（ＰＲＰ２．５μg/ＤＴ１．８μg ；一定量のＰＲ
Ｐが用いられるようなヒト用量の１／１０）及びＰＲＰ
−ＯＭＰＣ（ＰＲＰ２．５μg/ＯＭＰＣ３５μg ；ヒト
用量の１／４）として投与される相当量のＰＲＰで免疫
した。
【０１２２】６〜１３．５週令の幼児アカゲザルをミョ
ウバンに吸着されたＰＲＰ−ＭＩＥＰ複合体で免疫し
た。各サルは総用量０．５mlで２つの異なる注射部位か
ら複合体０．２５mlを受容した。サルを０．２８及び５
６日目に免疫し、血液サンプルを２〜４週間毎に採取し
た。
ウバンに吸着されたＰＲＰ−ＭＩＥＰ複合体で免疫し
た。各サルは総用量０．５mlで２つの異なる注射部位か
ら複合体０．２５mlを受容した。サルを０．２８及び５
６日目に免疫し、血液サンプルを２〜４週間毎に採取し
た。
【０１２３】抗体応答は実施例９で記載されたＥＬＩＳ
Ａで測定したが、これは免疫グロブリン応答のクラス及
びサブクラスを識別する。全抗ＰＲＰ抗体を定量するＲ
ＩＡ（実施例９参照）もサル応答を評価するために用い
た。ＰＲＰ−ＭＩＥＰ複合体の受容体の抗体応答は図３
で示されている。
Ａで測定したが、これは免疫グロブリン応答のクラス及
びサブクラスを識別する。全抗ＰＲＰ抗体を定量するＲ
ＩＡ（実施例９参照）もサル応答を評価するために用い
た。ＰＲＰ−ＭＩＥＰ複合体の受容体の抗体応答は図３
で示されている。
【０１２４】結果は、ＰＲＰ−ＭＩＥＰ複合体がＩｇＧ
抗ＰＲＰ抗体及び記憶応答からなる免疫応答をマウスで
発現させうることを示す。これは測定可能な抗ＰＲＰ抗
体を発現しないＰＲＰ−ＣＲＭ及びＰＲＰ−ＤＴとは対
照的である。このためＭＩＥＰはＰＲＰ用の免疫学的キ
ャリアタンパク質として機能し、ＰＲＰ抗原と共有結合
した場合に抗ＰＲＰ抗体応答を示すことができる。した
がって精製ＭＩＥＰは細菌多糖複合体ワクチンの製造上
において異種ＯＭＰＣに代わる有効な免疫原性キャリア
タンパク質である。
抗ＰＲＰ抗体及び記憶応答からなる免疫応答をマウスで
発現させうることを示す。これは測定可能な抗ＰＲＰ抗
体を発現しないＰＲＰ−ＣＲＭ及びＰＲＰ−ＤＴとは対
照的である。このためＭＩＥＰはＰＲＰ用の免疫学的キ
ャリアタンパク質として機能し、ＰＲＰ抗原と共有結合
した場合に抗ＰＲＰ抗体応答を示すことができる。した
がって精製ＭＩＥＰは細菌多糖複合体ワクチンの製造上
において異種ＯＭＰＣに代わる有効な免疫原性キャリア
タンパク質である。
【０１２５】実施例１３ＭＩＥＰとの接触後におけるインターロイキン−２誘導 ＣＴＬＬ細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ２１４としてアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能）
〔ギリス，Ｓ．及びスミス，Ｋ．，１９７７年，ネーチ
ャー，第２６８巻，第１５４−１５６頁(Gillis,S. and
Smith,K. （１９７７）Nature, ２６８，pp. １５４−
１５６）〕を１０％デファインド(Defined) 牛胎児血清
〔ハイクローン(HyClone) 〕、２μM ・Ｌ−グルタミン
（ギブコ）、１００μg/mlペニシリン、１００μM スト
レプトマイシン（ギブコ）、２０μM ２−メルカプトエ
タノール（バイオラッド）、１０％ラットＴ細胞ポリク
ローン（コラボレィティブ・リサーチ社）で補充された
ＲＰＭＩ１６４０（ギブコ）中で維持した。ＣＴＬＬ細
胞を２〜３日間毎に１〜２×１０4 細胞／mlで接種し
た。ＩＬ−２に関して試験される上澄は、ＭＩＥＰ５０
μg/ml、ＰＲＰ−ＯＭＰＣ５０μg/ml、牛血清アルブミ
ン（ピアース）５０μg/ml又は培地単独と共に各々等容
量を含んだ６ウェルプレート（コスター）内で末梢血リ
ンパ球を４×１０6 細胞／mlで培養することにより得
た。上澄を培養中に２、３又は４日間隔で回収し、アッ
セイ時まで凍結した。ＩＬ−２に関するアッセイはギリ
スら、ジャーナル・オブ・イムノロジー，第１２０巻，
第２０２７−２０３２頁，１９７８年で記載されたよう
に行った。２倍連続希釈上澄を調製し、１００μl をラ
ットＴ細胞ポリクローンのない前記培地中で１時間枯渇
された４０００ＣＴＬＬ細胞を含むウェルにいれた。す
べてのサンプルを９６ウェルプレート（コスター）で三
重に調製した。プレートを３７℃、８％ＣＯ2 で一夜イ
ンキュベートした。各ウェルを3 Ｈ・チミジン（アマー
シャム）１μＣｉで１０時間かけてパルス標識し、ベー
タプレート・フィルターメート(BetaPlate filtermate)
（ファルマシア／ＬＫＢ）で回収し、ベータプレート１
２０５（ＬＫＢインストルメンツ）で読取った。ＩＬ−
２標準曲線も組換えヒトＩＬ−２〔セルラー・プロダク
ツ社(Cellular Products,Inc) 〕を用いて同時に作成し
た。ＩＬ−２の定量測定はギリスら，ジャーナル・オブ
・イムノロジ−，第１２０巻，第２０２７−２０３２
頁，１９７８年の方法を用いて計算した。組換えＩＬ−
２を用いたプロビット分析により最大 3Ｈ−チミジン取
込み量の５０％として１Ｕ／mlのＩＬ−２を決定した。
試験上澄はＩＬ−２のＵ／mlが決定された最大 3Ｈ−チ
ミジン取込み率としても表示された。
ン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能）
〔ギリス，Ｓ．及びスミス，Ｋ．，１９７７年，ネーチ
ャー，第２６８巻，第１５４−１５６頁(Gillis,S. and
Smith,K. （１９７７）Nature, ２６８，pp. １５４−
１５６）〕を１０％デファインド(Defined) 牛胎児血清
〔ハイクローン(HyClone) 〕、２μM ・Ｌ−グルタミン
（ギブコ）、１００μg/mlペニシリン、１００μM スト
レプトマイシン（ギブコ）、２０μM ２−メルカプトエ
タノール（バイオラッド）、１０％ラットＴ細胞ポリク
ローン（コラボレィティブ・リサーチ社）で補充された
ＲＰＭＩ１６４０（ギブコ）中で維持した。ＣＴＬＬ細
胞を２〜３日間毎に１〜２×１０4 細胞／mlで接種し
た。ＩＬ−２に関して試験される上澄は、ＭＩＥＰ５０
μg/ml、ＰＲＰ−ＯＭＰＣ５０μg/ml、牛血清アルブミ
ン（ピアース）５０μg/ml又は培地単独と共に各々等容
量を含んだ６ウェルプレート（コスター）内で末梢血リ
ンパ球を４×１０6 細胞／mlで培養することにより得
た。上澄を培養中に２、３又は４日間隔で回収し、アッ
セイ時まで凍結した。ＩＬ−２に関するアッセイはギリ
スら、ジャーナル・オブ・イムノロジー，第１２０巻，
第２０２７−２０３２頁，１９７８年で記載されたよう
に行った。２倍連続希釈上澄を調製し、１００μl をラ
ットＴ細胞ポリクローンのない前記培地中で１時間枯渇
された４０００ＣＴＬＬ細胞を含むウェルにいれた。す
べてのサンプルを９６ウェルプレート（コスター）で三
重に調製した。プレートを３７℃、８％ＣＯ2 で一夜イ
ンキュベートした。各ウェルを3 Ｈ・チミジン（アマー
シャム）１μＣｉで１０時間かけてパルス標識し、ベー
タプレート・フィルターメート(BetaPlate filtermate)
（ファルマシア／ＬＫＢ）で回収し、ベータプレート１
２０５（ＬＫＢインストルメンツ）で読取った。ＩＬ−
２標準曲線も組換えヒトＩＬ−２〔セルラー・プロダク
ツ社(Cellular Products,Inc) 〕を用いて同時に作成し
た。ＩＬ−２の定量測定はギリスら，ジャーナル・オブ
・イムノロジ−，第１２０巻，第２０２７−２０３２
頁，１９７８年の方法を用いて計算した。組換えＩＬ−
２を用いたプロビット分析により最大 3Ｈ−チミジン取
込み量の５０％として１Ｕ／mlのＩＬ−２を決定した。
試験上澄はＩＬ−２のＵ／mlが決定された最大 3Ｈ−チ
ミジン取込み率としても表示された。
【０１２６】図４はこの実験結果がＩｌ−２濃度の増加
を誘導しうるＭＩＥＰの能力を立証していることを示
す。図４で示された結果は３日目の時点から導き出され
た。
を誘導しうるＭＩＥＰの能力を立証していることを示
す。図４で示された結果は３日目の時点から導き出され
た。
【図１】ＰＲＰ−ＤＴとＭＩＥＰ、ＯＭＰＣ又はＩＡＡ
−ＯＭＰＣとで別々にプライム化された脾臓細胞を受容
した養子移入受容体の抗体応答はＰＲＰ−ＯＭＰＣで免
疫後所定日に採取された血液サンプルにおいてＥＬＩＳ
Ａにより測定した。
−ＯＭＰＣとで別々にプライム化された脾臓細胞を受容
した養子移入受容体の抗体応答はＰＲＰ−ＯＭＰＣで免
疫後所定日に採取された血液サンプルにおいてＥＬＩＳ
Ａにより測定した。
【図２】インビトロにおけるＭＩＥＰの分裂誘発活性に
関するリンパ球増殖アッセイ。細胞ＤＮＡ中への 3Ｈ−
チミジン取込み増加は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｐ
ＲＰ−ＯＭＰＣ、ＯＭＰＣ又はＭＩＥＰとの細胞の接触
後に測定した。
関するリンパ球増殖アッセイ。細胞ＤＮＡ中への 3Ｈ−
チミジン取込み増加は牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｐ
ＲＰ−ＯＭＰＣ、ＯＭＰＣ又はＭＩＥＰとの細胞の接触
後に測定した。
【図３】ＰＲＰ−ＭＩＥＰ複合体がマウス及び幼児アカ
ゲザルにおいて免疫原性に関し試験された。抗体応答は
ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡにより測定した。
ゲザルにおいて免疫原性に関し試験された。抗体応答は
ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡにより測定した。
【図４】サイトカイン産生の誘導例としてＭＩＥＰとの
接触後における培養中のマウス脾臓細胞によるＩｌ−２
産生の誘導。結果は３日間の培養時点からサンプルを用
いて得た。
接触後における培養中のマウス脾臓細胞によるＩｌ−２
産生の誘導。結果は３日間の培養時点からサンプルを用
いて得た。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年８月１２日
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図４】
【図３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/02 ＡＤＳ 9284−4Ｃ 39/12 9284−4Ｃ 39/35 9284−4Ｃ 39/385 9284−4Ｃ // Ｃ０７Ｋ 15/04 8619−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/31 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ａ 8214−4Ｂ Ｃ 8214−4Ｂ (Ａ６１Ｋ 37/02 39:00） 9284−4Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:36） 7804−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 マーガレット エー．リウ アメリカ合衆国，19010 ペンシルヴァニ ア，ローズモント，クシュマン ロード ４ (72)発明者 アーサー フリードマン アメリカ合衆国，18966 ペンシルヴァニ ア，チャーチヴィル，フロッグ ホロー ロード 121 (72)発明者 ジョセフ ワイ．タイ アメリカ合衆国，19034 ペンシルヴァニ ア，フォート ワシントン，シナモン ド ライヴ 1370 (72)発明者 ジョン ジェー．ドネリー アメリカ合衆国，19083 ペンシルヴァニ ア，ヘイヴァータウン，ブライアーウッド ドライブ 1505
Claims (15)
- 【請求項１】 抗原に対する免疫応答を増加させるため
の方法であって、 グラム陰性細菌の外膜から精製された実質上純粋な形の
タンパク質の投与からなる方法。 - 【請求項２】 実質上純粋な形でネイセリア・メニンギ
チジス血清グループＢの外膜のクラスIIタンパク質の投
与からなる、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 抗原の投与から更になる、請求項２記載
の方法。 - 【請求項４】 抗原が細菌、ウイルス、哺乳動物細胞、
真菌、リケッチア、アレルゲン、毒物又は毒液、合成ペ
プチド及びポリペプチド断片から誘導される、請求項３
記載の方法。 - 【請求項５】 抗原に対する免疫応答を増加させるため
の方法であって、 組換え宿主細胞で産生されたグラム陰性細菌の外膜の組
換えタンパク質の投与からなる方法。 - 【請求項６】 組換え宿主細胞で産生されたネイセリア
・メニンギチジス血清グループＢの外膜の組換えクラス
IIタンパク質の投与からなる、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 抗原の投与から更になる、請求項６記載
の方法。 - 【請求項８】 抗原が細菌、ウイルス、哺乳動物細胞、
真菌、リケッチア、アレルゲン、毒物又は毒液、合成ペ
プチド及びポリペプチド断片から誘導される、請求項７
記載の方法。 - 【請求項９】 哺乳動物においてサイトカインのレベル
を増加させるための方法であって、 グラム陰性細菌の外膜から精製された実質上純粋な形の
タンパク質の投与からなる方法。 - 【請求項１０】 実質上純粋な形でネイセリア・メニン
ギチジス血清グループＢの外膜のクラスIIタンパク質の
投与からなる、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 組換え宿主細胞で産生されたネイセリ
ア・メニンギチジス血清グループＢの外膜の組換えクラ
スIIタンパク質の投与からなる、請求項９記載の方法。 - 【請求項１２】 哺乳動物においてインターロイキン−
２のレベルを増加させるための方法であって、 グラム陰性細菌の外膜から精製された実質上純粋な形の
タンパク質の投与からなる方法。 - 【請求項１３】 組換え宿主細胞で産生されたグラム陰
性細菌の外膜の組換えタンパク質の投与からなる、請求
項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 哺乳動物においてインターロイキン−
２のレベルを増加させるための方法であって、 実質上純粋な形でネイセリア・メニンギチジス血清グル
ープＢの外膜のクラスIIタンパク質の投与からなる方
法。 - 【請求項１５】 哺乳動物においてインターロイキン−
２のレベルを増加させるために、組換え宿主細胞で産生
されたネイセリア・メニンギチジス血清グループＢの外
膜の組換えクラスIIタンパク質の投与からなる、請求項
１４記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US55520490A | 1990-07-19 | 1990-07-19 | |
| US63945791A | 1991-01-10 | 1991-01-10 | |
| US639457 | 1991-01-10 | ||
| US555204 | 1991-01-10 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0656690A true JPH0656690A (ja) | 1994-03-01 |
Family
ID=27070823
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3269964A Pending JPH0656690A (ja) | 1990-07-19 | 1991-07-19 | 免疫キャリア及び増強性質を有するネイセリア・メニンギチジスの外膜のクラスｉｉタンパク質 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0656690A (ja) |
| KR (1) | KR920002631A (ja) |
| AU (1) | AU8114091A (ja) |
| CA (1) | CA2047043A1 (ja) |
| FI (1) | FI913473A (ja) |
| IL (1) | IL98837A0 (ja) |
| MX (1) | MX9100272A (ja) |
| NO (1) | NO912822L (ja) |
| PT (1) | PT98381A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003527079A (ja) * | 1999-04-30 | 2003-09-16 | カイロン コーポレイション | ナイセリアゲノム配列およびそれらの使用方法 |
| JP2003532404A (ja) * | 2000-05-08 | 2003-11-05 | マイクロサイエンス リミテッド | ビルレンス遺伝子、タンパク質およびそれらの使用 |
-
1991
- 1991-07-15 CA CA002047043A patent/CA2047043A1/en not_active Abandoned
- 1991-07-15 IL IL98837A patent/IL98837A0/xx unknown
- 1991-07-18 MX MX9100272A patent/MX9100272A/es unknown
- 1991-07-18 PT PT98381A patent/PT98381A/pt not_active Application Discontinuation
- 1991-07-18 FI FI913473A patent/FI913473A/fi not_active Application Discontinuation
- 1991-07-18 AU AU81140/91A patent/AU8114091A/en not_active Abandoned
- 1991-07-18 NO NO91912822A patent/NO912822L/no unknown
- 1991-07-19 JP JP3269964A patent/JPH0656690A/ja active Pending
- 1991-07-19 KR KR1019910012308A patent/KR920002631A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003527079A (ja) * | 1999-04-30 | 2003-09-16 | カイロン コーポレイション | ナイセリアゲノム配列およびそれらの使用方法 |
| JP2003532404A (ja) * | 2000-05-08 | 2003-11-05 | マイクロサイエンス リミテッド | ビルレンス遺伝子、タンパク質およびそれらの使用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU8114091A (en) | 1992-01-23 |
| NO912822L (no) | 1992-01-20 |
| MX9100272A (es) | 1992-02-28 |
| CA2047043A1 (en) | 1992-01-20 |
| IL98837A0 (en) | 1992-07-15 |
| FI913473A (fi) | 1992-01-20 |
| PT98381A (pt) | 1992-05-29 |
| FI913473A0 (fi) | 1991-07-18 |
| NO912822D0 (no) | 1991-07-18 |
| KR920002631A (ko) | 1992-02-28 |
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