BG60630B2 - Ковалентно модифицирани полианионни бактериални полизахариди,техни стабилни ковалентни конюгати с имуногенни протеини свързани с хибридни молекули, - Google Patents
Ковалентно модифицирани полианионни бактериални полизахариди,техни стабилни ковалентни конюгати с имуногенни протеини свързани с хибридни молекули, Download PDFInfo
- Publication number
- BG60630B2 BG60630B2 BG096111A BG9611192A BG60630B2 BG 60630 B2 BG60630 B2 BG 60630B2 BG 096111 A BG096111 A BG 096111A BG 9611192 A BG9611192 A BG 9611192A BG 60630 B2 BG60630 B2 BG 60630B2
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- polysaccharide
- protein
- conjugates
- nhcoch
- cnch
- Prior art date
Links
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 241
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 241
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 234
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 118
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 118
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 33
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 52
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 claims description 25
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 23
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 12
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 claims description 10
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 8
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 8
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 claims description 4
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 claims description 3
- 108700000434 Cannabis sativa edestin Proteins 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims 4
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 claims 3
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 claims 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims 2
- GVNVAWHJIKLAGL-UHFFFAOYSA-N 2-(cyclohexen-1-yl)cyclohexan-1-one Chemical compound O=C1CCCCC1C1=CCCCC1 GVNVAWHJIKLAGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101150065749 Churc1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 102100038239 Protein Churchill Human genes 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 claims 1
- 229940031937 polysaccharide vaccine Drugs 0.000 claims 1
- 238000012552 review Methods 0.000 claims 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 abstract description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 6
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 abstract description 5
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 abstract description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 113
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 94
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 92
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 88
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 39
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 31
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 29
- 239000000047 product Substances 0.000 description 29
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 28
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 27
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 23
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 22
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 22
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 21
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 21
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- -1 19F polysaccharide Chemical class 0.000 description 19
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 19
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 17
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 16
- DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N tetrabutylammonium Chemical class CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC DZLFLBLQUQXARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 15
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 15
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 15
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 11
- 241001025319 Etheostoma collis Species 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 11
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 11
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 10
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 10
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 10
- DMBHHRLKUKUOEG-UHFFFAOYSA-N diphenylamine Chemical compound C=1C=CC=CC=1NC1=CC=CC=C1 DMBHHRLKUKUOEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 10
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 9
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 9
- HVNXGOPARVAZNX-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) 2-bromoacetate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(OC(=O)CBr)C=C1 HVNXGOPARVAZNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 8
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 8
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical compound C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 8
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 229920001467 poly(styrenesulfonates) Polymers 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 6
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 6
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 6
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 5
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 5
- QVYARBLCAHCSFJ-UHFFFAOYSA-N butane-1,1-diamine Chemical compound CCCC(N)N QVYARBLCAHCSFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 description 5
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 5
- 210000003918 fraction a Anatomy 0.000 description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 5
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 5
- HMZKKJDOCRYTTH-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminoethylsulfanyl)acetic acid Chemical compound NCCSCC(O)=O HMZKKJDOCRYTTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 4
- NRFJZTXWLKPZAV-UHFFFAOYSA-N N-(2-oxo-3-thiolanyl)acetamide Chemical compound CC(=O)NC1CCSC1=O NRFJZTXWLKPZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 4
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 4
- VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N cadaverine Chemical compound NCCCCCN VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 4
- 229960004753 citiolone Drugs 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000000269 nucleophilic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 4
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 4
- BWLMCOKQHQOEEE-BYPYZUCNSA-N (2s)-2-amino-4-(carboxymethylsulfanyl)butanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCSCC(O)=O BWLMCOKQHQOEEE-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 3
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 3
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 3
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- AXFZADXWLMXITO-UHFFFAOYSA-N N-acetylcysteamine Chemical compound CC(=O)NCCS AXFZADXWLMXITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 3
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 3
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 3
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 3
- 239000007330 chocolate agar Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 3
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 3
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 3
- 210000002196 fr. b Anatomy 0.000 description 3
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 3
- 239000005416 organic matter Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 3
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 3
- 238000002411 thermogravimetry Methods 0.000 description 3
- RSPCKAHMRANGJZ-UHFFFAOYSA-N thiohydroxylamine Chemical compound SN RSPCKAHMRANGJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- IFHAMTJNLDFVPU-LURJTMIESA-N (2s)-2-acetamido-4-(carboxymethylsulfanyl)butanoic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCSCC(O)=O IFHAMTJNLDFVPU-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- GQHTUMJGOHRCHB-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,6,7,8,9,10-octahydropyrimido[1,2-a]azepine Chemical compound C1CCCCN2CCCN=C21 GQHTUMJGOHRCHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 125000005210 alkyl ammonium group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 2
- 150000004982 aromatic amines Chemical class 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- HQABUPZFAYXKJW-UHFFFAOYSA-N butan-1-amine Chemical compound CCCCN HQABUPZFAYXKJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 239000012084 conversion product Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- JVHAISKAWIKKGT-UHFFFAOYSA-N dimethoxy-[(5-phenyl-1,2-oxazol-3-yl)oxy]-sulfanylidene-$l^{5}-phosphane Chemical compound O1N=C(OP(=S)(OC)OC)C=C1C1=CC=CC=C1 JVHAISKAWIKKGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 150000004820 halides Chemical class 0.000 description 2
- 125000005179 haloacetyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 125000001288 lysyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000012705 nitroxide-mediated radical polymerization Methods 0.000 description 2
- 239000012434 nucleophilic reagent Substances 0.000 description 2
- OIPPWFOQEKKFEE-UHFFFAOYSA-N orcinol Chemical compound CC1=CC(O)=CC(O)=C1 OIPPWFOQEKKFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 2
- 125000005207 tetraalkylammonium group Chemical group 0.000 description 2
- VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium hydroxide Chemical compound [OH-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 125000000101 thioether group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FHLXUWOHGKLDNF-UHFFFAOYSA-N (2-nitrophenyl) carbonochloridate Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC=C1OC(Cl)=O FHLXUWOHGKLDNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FSMSZSYDLVDCOP-YFKPBYRVSA-N (2r)-2-[acetyl(methyl)amino]-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(=O)N(C)[C@@H](CS)C(O)=O FSMSZSYDLVDCOP-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- JJVXHDTWVIPRBZ-VKHMYHEASA-N (2r)-2-[carboxy(methyl)amino]-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)N(C)[C@@H](CS)C(O)=O JJVXHDTWVIPRBZ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- VHBNOXBGFQQNSF-YFKPBYRVSA-N (2r)-2-acetamido-3-(carboxymethylsulfanyl)propanoic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CSCC(O)=O VHBNOXBGFQQNSF-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYSGHNMQYZDMIA-UHFFFAOYSA-N 1,3-Dimethyl-2-imidazolidinon Chemical compound CN1CCN(C)C1=O CYSGHNMQYZDMIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 1,3-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1NC(=O)NC1CCCCC1 ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZQXIMYREBUZLPM-UHFFFAOYSA-N 1-aminoethanethiol Chemical compound CC(N)S ZQXIMYREBUZLPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VFWCMGCRMGJXDK-UHFFFAOYSA-N 1-chlorobutane Chemical compound CCCCCl VFWCMGCRMGJXDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GXVUZYLYWKWJIM-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminoethoxy)ethanamine Chemical compound NCCOCCN GXVUZYLYWKWJIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XNCSCQSQSGDGES-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]propyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)C(C)CN(CC(O)=O)CC(O)=O XNCSCQSQSGDGES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JUIKUQOUMZUFQT-UHFFFAOYSA-N 2-bromoacetamide Chemical compound NC(=O)CBr JUIKUQOUMZUFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MONMFXREYOKQTI-UHFFFAOYSA-N 2-bromopropanoic acid Chemical compound CC(Br)C(O)=O MONMFXREYOKQTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- FAYOCELKCDKZCA-UHFFFAOYSA-N 5-hydroxy-2,4-dimethylthiophen-3-one Chemical compound CC1SC(O)=C(C)C1=O FAYOCELKCDKZCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FIHZWZBEAXASKA-UHFFFAOYSA-N Anthron Natural products COc1cc2Cc3cc(C)cc(O)c3C(=O)c2c(O)c1C=CC(C)C FIHZWZBEAXASKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000009355 Antron Species 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 235000012766 Cannabis sativa ssp. sativa var. sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000012765 Cannabis sativa ssp. sativa var. spontanea Nutrition 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VJDOAZKNBQCAGE-LMVFSUKVSA-N D-ribitol 5-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)COP(O)(O)=O VJDOAZKNBQCAGE-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical compound [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- 101001055222 Homo sapiens Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100026236 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylacetamide Chemical compound CN(C)C(C)=O FXHOOIRPVKKKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002274 Nalgene Polymers 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 229920001218 Pullulan Polymers 0.000 description 1
- 239000004373 Pullulan Substances 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010065667 Viral Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- ZGDKVKUWTCGYOA-URGPHPNLSA-N [4-[4-[(z)-c-(4-bromophenyl)-n-ethoxycarbonimidoyl]piperidin-1-yl]-4-methylpiperidin-1-yl]-(2,4-dimethyl-1-oxidopyridin-1-ium-3-yl)methanone Chemical compound C=1C=C(Br)C=CC=1C(=N/OCC)\C(CC1)CCN1C(CC1)(C)CCN1C(=O)C1=C(C)C=C[N+]([O-])=C1C ZGDKVKUWTCGYOA-URGPHPNLSA-N 0.000 description 1
- VLSOAXRVHARBEQ-UHFFFAOYSA-N [4-fluoro-2-(hydroxymethyl)phenyl]methanol Chemical compound OCC1=CC=C(F)C=C1CO VLSOAXRVHARBEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007825 activation reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N adipic acid dihydrazide Chemical compound NNC(=O)CCCCC(=O)NN IBVAQQYNSHJXBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 125000005365 aminothiol group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 1
- 125000003943 azolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- MGWWWSRHCOVLIU-UHFFFAOYSA-N benzene-1,3-diol;hydrochloride Chemical compound Cl.OC1=CC=CC(O)=C1 MGWWWSRHCOVLIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 150000001642 boronic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000008364 bulk solution Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 235000009120 camo Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 235000005607 chanvre indien Nutrition 0.000 description 1
- FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N chloroacetic acid Chemical compound OC(=O)CCl FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940106681 chloroacetic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N cyanuric chloride Chemical compound ClC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 MGNCLNQXLYJVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 150000005690 diesters Chemical class 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical group 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- NMHBKSHIKGHTFR-UHFFFAOYSA-N ethyl n-(1h-imidazol-2-yl)carbamate Chemical class CCOC(=O)NC1=NC=CN1 NMHBKSHIKGHTFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002431 foraging effect Effects 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000007306 functionalization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012817 gel-diffusion technique Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 239000006466 haemophilus medium Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 239000011487 hemp Substances 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000012499 inoculation medium Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- WNGZQMKZVLWGOD-UHFFFAOYSA-N n-(4-aminobutyl)-2-bromoacetamide Chemical compound NCCCCNC(=O)CBr WNGZQMKZVLWGOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002663 nebulization Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 229940023462 paste product Drugs 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- AMWVZPDSWLOFKA-UHFFFAOYSA-N phosphanylidynemolybdenum Chemical compound [Mo]#P AMWVZPDSWLOFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 235000019423 pullulan Nutrition 0.000 description 1
- 239000005297 pyrex Substances 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- SBYHFKPVCBCYGV-UHFFFAOYSA-N quinuclidine Chemical compound C1CC2CCN1CC2 SBYHFKPVCBCYGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007691 rabbit blood agar Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 1
- MKWYFZFMAMBPQK-UHFFFAOYSA-J sodium feredetate Chemical compound [Na+].[Fe+3].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O MKWYFZFMAMBPQK-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000006557 surface reaction Methods 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 150000005622 tetraalkylammonium hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- XFNJVJPLKCPIBV-UHFFFAOYSA-N trimethylenediamine Chemical compound NCCCN XFNJVJPLKCPIBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 1
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N urethane group Chemical group NC(=O)OCC JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003673 urethanes Chemical class 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретението се отнася до ковалентно модифицирани бактериални полизахариди и протеини, техните ковалентни конюгати, свързани чрез хибридно построена молекула, която позволява доказване на ковалентността и улеснява пречистването на конюгирания продукт, с протеин от имуногенна бактериална мембрана или други протеини. Конюгатите са компоненти, приложими в бактериални ваксини. Изобретението се отнася също до методи за получаване на посочените полизахариди, протеини и конюгати и за доказване на ковалентността на връзката между полизахаридите и протеините. 20 претенции
Description
(57) Изобретението се отнася до ковалентно модифицирани бактериални полизахариди и протеини, техните ковалентни конюгати, свързани чрез хибридно построена молекула, която позволява доказване на ковалентността и улеснява пречистването на конюгирания продукт, с протеин от имуногенна бактериална мембрана или други протеини. Конюгатите са компоненти, приложими в бактериални ваксини. Изобретението се отнася също до методи за получаване на посочените полизахариди, протеини и конюгати и за доказване на ковалентността на връзката между полизахаридите и протеините.
претенции (54) КОВАЛЕНТНО МОДИФИЦИРАНИ ПОЛИАНИОННИ БАКТЕРИАЛНИ ПОЛИЗАХАРИДИ, ТЕХНИ СТАБИЛНИ КОВАЛЕНТНИ КОНЮГАТИ С ИМУНОГЕННИ ПРОТЕИНИ, СВЪРЗАНИ С ХИБРИДНИ МОЛЕКУЛИ, МЕТОДИ ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА ПОСОЧЕНИ ТАКИВА ПОЛИЗАХАРИДИ И КОНЮГАТИ И ЗА ДОКАЗВАНЕ НА КОВАЛЕНТНОСТТА
Изобретението се отнася до ковалентно модифицирани бактериални полизахариди и имуногенни протеини, до техните ковалентни конюгати, свързани чрез хибридно построена молекула, което позволява доказване на ковалентността и улесняване на пречистването чрез имуногенни бактериални мембрани или други протеини, които конюгати са полезни компоненти на бактериалните ваксини.
Предшестващо състояние на техниката
Пречистени капсулирани бактериални полизахариди са използвани за създаване на ваксини срещу родствените бактерии, но получените в резултат имунни отговори често са по-малко задоволителни от желаните, по-специално при много малки деца или индивиди с несъвършена или с недостатъчност в имунната система. Например капсулираният полизахарид на Haemophilus influenzae от тип Ь, не може да провокира имунен отговор у деца, което прави този полизахарид неефективен при възникване на сериозните педиатрични медицински проблеми, причинени от Н. influenzae, тип Ь. Усилването на имуногенността на тези полизахариди често може да бъде осъществено чрез комбинирането им с протеини, напр. виж. лит. източник 1-3.
Този начин на работа може да бъ де използван при селекцията на протеините, които трябва да се комбинират с тези полизахариди, обаче някои протеини, като пертусиногенът, са неспецифични стимулатори на имунната система на малките деца. Тези протеини могат в известна степен да повишат имунния отговор спрямо полизахаридни антигени, но за съжаление, такова неспецифично активиране е в основата на нежелани биологични ефекти (т.нар. реактогенност). Най-предпочитаното специфично повишаване на имунните отгойори на тези полизахаридни антигени, може да се постигне у децата чрез конюгиране на тези полизахариди с подходящи протеини, както е докладвано за първи път от W. F. Goebel (4).
Начинът на комбиниране на полизахаридите и протеините следва също така внимателно да бъде обмислен. Имунологичното повишение се дължи на молекулната близост на полизахаридните детерминанти и детерминантите на протеиновия носител, тези части не могат лесно да се отделят в биологичната система. Нековалентните комплекси, получаващи се вследствие полианионния характер на полизахаридите и поликатионния характер на протеиновия носител, могат да стимулират имунните отговори, но тези комплекси са химически нестабилни и получаваният в резултат имунен отговор се проявява като Т-клетъчна независимост. В противовес на това, коваленти конюгати на полизахариди и протеини биха постигнали по-висока химична стабилност и могат да демонстрират Т-клетъчно зависими имунни отговори.
Ковалентни полизахаридно-протеинови конюгати са съобщени в литературата, но точната природа на ковалентното свързване не е доказано или количествено определено, доколкото единственият анализ за ковалентност е активността in vivo и методите, разкрити в литературата, не е възможно да бъдат възпроизведени. Полизахаридите от Haemophilus influenzae, тип b и Streptococcus pneumoniae, тип 6А се подлагат на взаимодействие с бромциан, след това с дихидразид на адипиновата киселина, следва куплиране с тетанусов анатоксин или подковообразни хемоцианинови протеини от рак (2 и
5). Полизахаридът от пневмококов тип 19F е присъединен към телешки серумен албумин директно чрез образуване на имини (Шифови бази) от редуциращите се краища на полизахаридите и свободните аминни групи (т.е. лизини) на протеина, след това тези амини се редуцират с натриев цианоборхидрид (6).
Допълнително полизахаридите, свързани с диазотираните ароматни амини, се присъединяват към протеинови тирозини, както е описано в лит. източник 7, и полизахаридите, свързани с ароматните амини се превръщат до изотиоцианати, които след това се свързват със свободните аминогрупи на лизина от протеините в лит. източник 8. Във всеки случай, обаче, полученият конюгат е охарактеризиран само от неговото поведение при гел проникваща хроматография. В още един друг пример (9), полизахаридът, пулулан, е активиран с цианурхлорид, след което реагира с тетанусов ана-токсин. В този случай, конюгатите се охарактеризират с електрофореза, която само показва, че се различават от изходния материал.
В нито един от тези случаи не е доменстрирана ковалентност, различна от тази, която се наблюдава при агрегирано молекулно тегло, поради което се обърква ковалентността с взаимодействие между полианиони и поликатиони в молекулните комплекси, като тези комплекси дават също и агрегирано молекулно тегло.
Задачата на изобретението е да свържат полизахаридните детерминанти с детерминанти на протеиновия носител, така че молекулната близост на тези части да се запази в биологичните системи. Друг обект на изобретението е ковалентното свързване на копсулирани полизахариди с протеинови носители и създаване на метод, чрез който ковалентната природа на тази връзка може да бъде доказана и количествено определена. Като допълнителен обект на това изобретение е получаване на химически стабилни полизахарид-протеинови конюгати, които демонстрират Т-клетъчна зависимост и които могат да бъдат полезни като компоненти на ваксини за извличане на защитно серумно антитяло спрямо определена бактерия, по-специално бактерия, родствена на тази, от която е получен полизахаридът.
Задачата на изобретението е да се създаде и метод за солюбилизиране на полизахариди, по-специално полианионни полизахариди, и ковалентно модифициране на тези полизахариди в процеса на получаване на полизахарид-протеинови конюгати.
Задачата на изобретението е да се създаде и метод за пречистване и концентриране на ковалентно свързани полизахарид-протеинови конюгати за отстраняване на неконюгиралите макромолекули и излишъка от реагенти.
Задачата по-нататък на изобретението е да създаде и метод за използване на тези конюгати в имунологично-ефективни ваксини за при3 ложение срещу менингити и отитис медиа.
Същност на изобретението
Изобретението е насочено към ковалентно модифицирани бактериални полизахариди и химически стабилни конюгати на тези полизахариди с ковалентно-модифицирани имуногенни мембранни протеини, вирусни протеинови субединици, синтетични полипептиди, бактериални токсини или други подходящи имуногенни протеини, които конюгати са полезни компоненти на имуногенни бактериални ваксини. Полизахарид-протеиновите конюгати съгласно изобретението са свързани чрез хибридно построени молекулгцсъдържащи ковалентна тиоетерна група, в която хибридните структури са атомни вериги, свързващи макромолекули, като полизахариди и протеини, части от тези хибридни структури произхождат от една модифицирана молекула, например ковалентно модифициран полизахарид, а другата част от тях - от друга модифицирана макромолекула (напр. функционализиран протеин).
По метода съгласно изобретението полизахаридът се обработва в един или повече етапа, така че да бъде ковалентно функционален за получаване на полизахарид със свободни електрофилни центрове или свободни тиолови групи. За предпочитане полизахаридът отначало се солюбилизира в нехидроксилен органичен разтворител, след това се модифицира с бифункционален агент за активиране, преди да реагира с бис-нуклеофил след това. Полизахаридът с нуклеофилни функционални групи след това или реагира с агент за получаване на свободни електрофилни места или взаимодейства с реагент така, че да се получат свободни тиолови групи. Чрез подходяща селек ция на бис-нуклеофила, т.е. на такъв, който би реагирал с активиран полизахарид и в резултат се получава ковалентно-модифициран полизахарид със свободни електрофилни места или тиолова група или чрез селекция на подходящия нуклеофил, по-нататък въвеждането на функционални групи в нуклеофил-функционалния полизахарид може да се избегне.
Независимо от ковалентната модификация на полизахарида подходящият бактериален протеинов носител влиза в реакция с реагентите, образуващи свободни тиолови групи или свободни електрофилни центрове, в едно- или двуетапен процес. Подходящо ковалентно-модифицираните полизахариди и протеини след това реагират до образуване на ковалентни полизахарид-протеинови конюгати и се пречистват за отстраняване на неконюгиралите макромолекули и излишъка от реагенти и за да се създаде възможност определянето на имуногенната доза на база ковалентно свързани полизахариди.
Ковалентната природа на връзката може да бъде абсолютно доказана и определена чрез отцепване (като чрез хидролиза) на полизахарида от неговите свободни електрофилни или тиолови групи и отцепване (откъсване) на протеина от неговите свободни електрофилни или тиолови групи, след това анализиране за установяване на тиоетерсъдъжащи хибридно построени молекули, така че определянето на концентрацията на хибридно построените молекули съответства на маркерен аминокиселинен анализ (лизинов) за определяне ковалентността на протеина.
Имуногенните ваксини, съдържащи имунологично ефективно количество от полизахарид-протеиновите конюгати или техни производни, могат да бъдат получени след това много лесно на основата на общите познания за получаване на ваксини.
Конюгатите съгласно изобретението, могат да бъдат които и да са стабилни полизахарид-протеинови конюгати, свързани чрез хибридни структури, включващи тиоетерна група и първичен амин, който образува хидролитично -лабилни ковалентни връзки с полизахарида или протеина.
Предпочитани конюгати съгласно изобретението обаче са онези, които могат да бъдат представени с формулата Ps-A-E-S-B-Pro или Ps-A'-S-E'Β'-Pro, в която Ps представлява полизахарид; Pro е бактериален протеин и A-E-S-B и A'-S-E'-B1 представляват хибридни структури, които съдържат хидролитично стабилни ковалентни тиоетерни връзки и които образуват ковалентни връзки, например хидролитично лабилни естерни или амидни връзки с макромолекулите, Pro и Ps. В структурата A-ES-B, S е сяра, Е е продукт на превръщане на тиофилната група, който продукт реагира с тиоловата група и е представен с формулата
в която R еН или СН3 и р е 1 до 3; А е
W Н
II I
- С - N/CH / Y/CH / - NH z m L п в която W е О или NH, m е О до 4, η е 0 до 3, и Υ е СН2, О, S, NR', или СНСО2Н, като R' е Н или С(- или
С2-алкил, така че когато Υ е СН,, тогава m и η не могат да бъдат равни на нула, и когато Υ е О или S, тогава ш е по-голямо от 1 и η е по-голямо от I ; и В е
Ζ /
- (СН2) CH(CH2)qD като q е 0 до 2, Z е NH2,
О
II
NHCR'
СООН, или Н, като R' и р имат значенията, определени по-горе, и D е
О
II
С, NR1 или
V fl fl
N - С/СН2/2С
Тогава в структурата, A'-S-E'-B', S е сяра; А е
W
II
-CNH/CH / R” ζ « като а има значение от 1 до 4, и R” е СН2, или
НО Y'
I II /
NCCH/CH / 2 р като У' е NH2 или NHCOR', и W, ри R' имат значенията, определени както е описано по-горе, а Е' е продукт на превръщане на тиофилна група, която е реагилара с тиолова група и е представен от
R
I
- СН като R е дефиниран, както е посоче но по-горе, и В' е
О
II
- с или Е' е
О и В7 е
О II
- /СН,/ с като ре 1 до 3. По-нататък от хибридните структурни A-E-S-B и A-SЕ’-В', E-S-B и A'-S'-E' компоненти са определими, като могат да се определят и количествено и това идентифициране отразява ковалентността на връзката на конюгата, свързваща тиоетерната сяра, която произлиза от ковалентно модифицирания полизахарид, с тази част от структурата, която произлиза от функционализирания протеин. Полизахаридите съгласно изобретението могат да бъдат които и да са бактериални полизахариди с кисели групи, но не са ограничени до някои по-специални типове. Примерите за такива бактериални полизахариди включват Streptococcus pneumoniae типове 6А, 6В, 10А, 11А, 18С, 19А, 19F, 20, 22F, 23F полизахариди; Група В стрептококови типове la, lb, II и III; Heamophilus influenzae (Н.flu) тип b полизахарид; Neisseria meningitidis групи А, В, C, X, У, W 135 и 29E полизахариди; и E. coli KI, KI2, K13, K92 и KI00 полизахариди. По-специално предпочитани полизахариди са капсулираните полизахариди он групата, състояща се от H.flu тип b полизахарид, както е описано от Rosenberg и др. в 10 и 11 ; Streptococcus pneumoniae тип 6В или тип 6А полизахариди, така както са описани в (12), пневмококовият тип 19F полизахарид, както е описан от C.J.Lee и др. в (13) и пневмококовият тип 23F полизахарид, както е описан в (14).
Протеините съгласно изобретението са с доказана безопасност и демонстративна имуногенност, но не са ограничени до който и да е специален тип. Подходящи протеини са бактериалните мембранни протеини, който и до е от различните растителни протеини, като напр. едестин или соев трипсинов инхибитор, вирусни протеинови субединици, като хепатит А или В, херпес gD или gC, EpsteinBarr или варицела зостер субединици; синтетични полипептиди ; дифтериен или тетанусов токсин, но за предпочитане са протеини от външната мембрана на N.meningitidis (менингококов) В серотип, които са Тклетъчни стимулатори. Протеини от този серотип са описани в лит. източници 15 и 16.
Конюгатите Ps-A-E-S-B-Pro съгласно изобретението могат да съдържат структури, чиито компоненти включват производни на: въглероден диоксид, 1,4-бутандиамин и S-карбоксиметил-N- ацетилхомоцистеин;
1,5- пентандиамин, и въглероден диоксид и 8-карбоксиметил-^ацетилхомоцистеин; въглероден диоксид, 3- окса-1,5-пентандиамин и S-карбоксиметил-N-ацетилхомоцистеин; въглероден диоксид, 1,4-бутандиамин и Sкарбоксй метил-N-ацетилцистеин; въглероден диоксид, 1,3-пропандиамин и З-карбоксиметил-И-бензоилхомоцистеин; въглероден диоксид,3-аза6
1,5-пентандиамин и S-карбоксиметил-М-ацетилцистеин; и въглероден диоксид, 1,2-етандиамин, глицин, и S/ сукцин-2-ил/-1М-ацетилхомоцистеин. Конюгатите, Ps-A'-S-E'-B'-Pro съгласно изобретението могат да съдържат структури, чиито компоненти включват производни на въглероден диоксид и S-карбоксиметилцистеамин; въглероден диоксид и S-/aкарбоксиетил/цистеамин; въглероден диоксид, 8-/сукцин-2-ил/ цистеамин и глицин и въглероден диоксид и Sкарбоксиметилцистеин.
В метода съгласно изобретението полизахаридът е ковалентно модифициран чрез а) солюбилизирането му в нехидроксилен органичен разтворител; б) след това активирането му с бифункционален реагент, в) реакция на този активиран полизахарид с бис-нуклеофил и накрая, ако е необходимо, г) по-нататъшно въвеждане на функционални групи в модифицирания полизахарид или чрез реакция
1) с реагент, генериращ електрофилни (или тиолфилни) центрове или чрез 2) взаимодействие с реагент, генериращ тиолови групи. Протеинът, обратно, 1) или реагира с реагент, генериращ тиолови групи, или 2) с реагент, генериращ тиолфилни центрове, след което ковалентно модифицираният полизахарид и функционализираният протеин реагират заедно, за да се получи ковалентно свързан конюгат и крайната смес се пречиства за отстраняване на нереагиралите протеини и полизахариди.
Методът съглосно изобретението включва също селекция на нуклеофил или бис-нуклеофил, който ще реагира с активирания полизахарид до получаване на ковалентно модифициран полизахарид със свободни електрофилни центрове или свободни тиолови групи, поради което се явява необходимостта от по-нататъшна обработка с оглед придаване на функционалност (въвеждането на функционални групи) на бис-нуклеофил- модифицирания полизахарид преди реагирането на ковалентно модифицирания полизахарид с ковалентно модифициран протеин. Също така въвеждането на функционална група, в която и да е част на протеина може да се осъществи в повече от един етап, в зависимост от селекцията на реагентите в тези етапи.
А. Получаване на полизахарида. В първия етап, насочен към ковалентна модификация на полизахарида, твърдият полизахарид следва да бъде солюбилизиран.
Доколкото нуклеофилните алкохолни хидроксилни групи на полизахарида не могат да се конкурират химически с хидроксилните групи на водата във воден разтвор за електрофилни реагенти, полизахаридът следва да се разтваря в неволен (нехидроксилен) разтворител. Подходящи разтворители са например диметилформамид, диметилсулфоксид, диметилацетамид, формамид, N ,Ν'диметилимидазолидинон, или други аналогични полярни, апротни разтворители, за предпочитане диметилформамид.
В допълнение към използването на тези разтворители съгласно изобретението е установено, че при превръщането на полизахаридите съгласно изобретението (например капсулираните полизахариди от Н. influenzae тип Ь, които са рибозо рибитолфосфатни полимери, и пневмококовите типове 6В, 19F и 13F), които имат киселинни водороди, като моно- и диестери на фосфорната киселина под формата на подходяща сол, тези полизахариди стават лесно разтворими в горните разтворители. Киселин ните водороди в тези макромолекули могат да бъдат заместени с големи хидрофобни катиони, като три- или тетра-/^ до С5/ алкиламониев, 1 азабицикло [2.2.2] октан, 1,8-диазабицикло[5.4.0] ундец-7-ен или аналогични катиони, по-специално три или тетра-/С, до С5/ алкиламониев, и получената три или тетраалкиламониева аналогична сол на фосфорилираните полизахариди лесно се разтваря в посочените разтворители при около 17 до 50°С, и при разбъркване от 1 min до 1 h.
Частично хидролизираният полизахарид на Н.influenzae тип b се превръща в тетрабутиламониева сол, след това се разтваря в диметилсулфоксид (17), но този продукт вече не е антигенен, поради което е неприложим да приготвяне на ваксини. В противовес на това, съгласно изобретението се осъществява и солюбилизиране на нехидролизирания полизахарид чрез пропускането му през силно кисела катионоактивна йонообменна смола в тетраалкиламониева форма, или чрез внимателно неустрализиране на полизахарида с тетраалкиламониев хидроксид, като се предпочита първият вариант, и по този начин съхраняване жизнеспособността на полизахарида за използване в имуногенна ваксина.
Следващите етапи са насочени към преодоляване на другите физико-химични ограничения за създаване на ковалентни връзки с полизахариди, като липсата на функционални групи в полизахаридите други, освен хидроксилните групи, които са достатъчно реактивоспособни с общоприети или по-специално използвани реагенти за въвеждане на функционални групи, чието свързване се желае. Активирането на полизахарида, за да се получи активиран поли захарид. реакцията с бис-нуклеофилите за получаване на нуклеофилфункционален полизахарид или функционализирането му с реагенти, създаващи или електрофилни центрове, или тиолови групи, всички са насочени към ковалентно модифициране на полизахарида и създаване на функционални групи в него в подготовка за конюгиране.
В следващия етап солюбилизираният полизахарид се активира чрез реакция с бифункционален агент при около 0 до 50°С и при разбъркване от 10 min до 1 h. при критично съотношение на активиращия агент и полизахарида в интервала от 1:5 до 1:12. В известния метод активирането се е осъществявало чрез реакция на полизахарида с бромциан. Обаче производните, активирани с бромциан, които имат склонност към съседни диоли, показват преходна стабилност по време на диализиране срещу фосфатен буфер. Следователно, докато активирането с бромциан е все пак възможно съгласно изобретението този реагент недостатъчно се използва при активиране на полизахариди и не се предпочита. Вместо това предпочитани бифункционални реагенти за активиране на полизахарида включват производни на карбоксилните киселини
О II
R2 - С - R3 като R2 и R3 могат да бъдат независимо азолил, като имидазолил; халиди; или фенилови естери, като р-нитрофенилов или полихалофенилов.
Специално предпочитаният реагент карбонилдиимидазол реагира с хидроксилните групи, като се получават имидазолилуретани на полизахарида и арилхлорформиати, напри мер нитрофенилхлорформиат и дава смесени карбонати на полизахарида. Във всеки случай полученият в резултат активиран полизахарид е много чувствителен към нуклеофилни реагенти, като амини и поради това се трансформира в съответните уретани.
В следващия етап активираният полизахарид реагира с нуклеофилен реагент, например амин, по-специално диамини, например
Н Н
I I
HN/CH,/ Y/CH7 - NH като m е 0 до 4, пеОдоЗиУе СН2, О, S, NR', СНСО2Н, като R'е Н или С,- или С2-алкил, така че когато Y е СН2 , тогава едновременно m и η не могат да бъдат равни на 0, и ако Υ е О или S, тогава m е по-голямо от 1 и η е по-голямо от 1, като реакцията протича в голям излишък от амин (например 50- до 100-кратен моларен излишък от амина по отношение на използвания активиращ агент). Реакцията се осъществява в ледена баня от 15 min до 1 h при около . 17°до40°С.
Активиран полизахарид, когато реагира с диамин, като 1,4 бутандиамин, дава уретанова форма на полизахарид със свободни амини, в който след това могат да се вкарат функционални групи чрез ацилиране. Смесените карбонати също лесно реагират с диамини за получаване на свободни аминогрупи.
Алтернативно активираният полизахарид може да реагира с нуклеофил, като монохалоацетамид на диаминоалкан, например 4-бромацетамидобутиламин (18) за полручаване на ковалентно-модифициран полизахарид със свободни електрофилни места. Или активираният полизаха рид може да реагира с аминотиол, като цистеамин/аминоетантиол/ или цистеин, примери на производни, които са добре познати при синтеза на пептиди, като се получава полизахарид със свободни тиолови групи. И в двата случая не е необходимо допълнително вкарване на функционални групи преди присъединяването на ковалентно модифицирания полизахарид към модифицирания бактериален протеинов носител.
Последният етап от получаването на полизахарида, по-нататъшното вкарване на функционални групи , ако е необходимо в полизахарида, може да протече или чрез реагиране на нуклеофил-функционализиран полизахарид с реагент за получаване на електрофилни (т. е. тиофилни) центрове, или чрез реакция за получаване на тиолови групи.
Подходящите за получаване на електрофилни центрове реагенти, включват наприемр такива за ацилиране на α-халоацетилови или а-халопропионилови производни, като
О R II I х-с-с-н-х където R е Н или СН3; X е С1, Вг или I; и X' е нитрофенокси, динитрофенокси, пентахлорфенокси, пентафлуорфенокси, халид, О-ПЧ-хидроксисукцинимидил) или азидо, по-специално хлороцетна киселина или α-бромпропионова киселина, като реакцията се осъществява при рН 8 до 11 (поддържано в този интервал чрез добавяне на основа, ако е необходимо) и при температура приблизително от 0 до 35° С и за десет min до един h. Аминопроизводно на полизахарида може да се ацилира с малеимидоаминокиселини (19) като се получават следните малеимидо групи
в които р е 1 до 3; с 2-халоацетилиращ агент, например р-нитрофенилбромацетат; или с производно на ахалокетон-карбоксилна киселина се осъществяват в атмосфера от азот, при около 0 до 35С и при pH от 8 до 11 с добавяне на основа, ако е необходимо за запазване на pH в желания интервал. Например аминопроизводно на полизахарида може да реагира с
NHCOCH, _
//
НО2С —С Ч— ССН2Вг (20) за да се получи полизахарид с подходящи функционални групи, податлив на тиозаместване.
Реагентите, подходящи за създаване (образуване) на тиолови групи, са например, ацилиращи реагенти, като тиолактони, например
R4CNH
като R4 е С, до С4-алкил или моноили бициклоарил, като С6Н5 или С10Н13, и р е 1 до 3;
NHCOR5
I
- О SSCH /СН,/ СН - COX', като ш е 0 до 4, R5 е С - до С4-алкил или С6Н5 и X’ има значенията определени по-горе, следвано от третиране с HSCH2CH2OH, или
NHCOR5
I
С,Н4 - S - S - СН,/СН,/ СНСОХ1 като m, R5 и X1 имат значенията определени по-горе и след това третиране с дитиотреитол. Такива реакции за да.се получи полизахарид, с подходящи функционални групи.
Чрез тези етапи след това се получават ковалентно модифицирани полизахариди от вида Ps-A-E*- или Ps-A1 -SH-, като Е* е -ССНХ или
и A, X , R, X и р имат значенията определени по-горе.
Б. Получаване на протеина. Отделно въвеждане на функционални групи в протеина, така че да може да бъде присъединен към полизахарида, включва реакция на протеина с един или повече реагенти за получаване на тиолова група, или реакция на протеина с един или повече реагенти за получаване на електрофилен, например тиофилен, център.
В методиката за конюгиране с електрофилно-функционализиран полизахарид, протеинът реагира в един или два етапа с един или повече реагенти за получаване на тиолови групи, такива като ацилиращи реагенти, използвани за получаване на тиолови групи върху полизахарида, както е дискутирано по-горе. Тиолирани протеини могат да се получат чрез аминиране на карбокси-активирани протеини, като посочените в (21), с аминотиоли. Предпочитано изпълнение на този етап от процеса включва директно ацилиране на свободните аминогрупи, например лизилови групи, на протеина с N-ацетилхомоцистеинетиолактон при около 0 5 до 35°С и pH 8-11, за 5 min до 2 h, използвайки еднакви тегловни количества от реагентите.
Когато Е'В' е
условията и метода за получаване на протеин с функционални групи са същите, като описаните по-горе при получаването на съответния полизахарид с активирани малеимидови киселини.
За да се конюгира с ковалентно модифициран бактериален полизахарид със свободни тиолови групи, протеинът се ацилира с реагент, съз даващ електрофилен център и такъв ацилиращ агент може да бъде например
О СНЧ О
II I II
ХСН2С - X' и ХСН - СХ' като X и X' имат значенията, посочени по-горе; и
О II n/ch2/,c / co
- X' като X е определен по-горе. Подходящи протеини с електрофилни центрове също включват, например по лучените чрез ацилиране на свободни лизилови аминогрупи с реагент, 35 например
' или чрез реагиране на карбокси-активиран протеин с монохалоацетилни производни на диамини. И в двете реакции температурата е от 0 до
35°С, времетраенето е от 5 min до 1 45 h и pH е от 8 до 11.
В. Получаване (образуване) на конюгат.
Образуването на конюгата след това е само въпрос на реакция на който и да е ковалентно модифициран полизахарид със свободни електрофилни центрове, с който и да е от протеините със свободни тиолови групи при pH от 7 до 9, в приблизително еднакви тегловни количества, в атмосфера от азот, за от 6 до 24 h 5 при температура от 17 до 40°С.
Примерите за такива реакции включват оно
II III
Ps - CNCH2CH2CH2CH2NHCCH2Br +
NHCOCH,
I
HSCH2CH2CHCO - Pro >
OH O NHCOCH.
II I ,11I
PsCNCH2CH2CH2CH2NHCCH2SCH2 CH2CHCOPro при което активиран полизахарид, който е взаимодействал с N-ацетилкойто е реагирал с 4-бромацетамидо- хомоцистеинтиолактон, за да се побутиламин, взаимодейства с протеин, 20 лучи канюгат, и
HSCH2CH2NHCCH2CH2CPro ----------->
О
II н.
CH2CH2NHCCH2CH2C Pro sz (при което У е С28 алкилов радикал), като аминопроизводното на полизахарида, който е реагирал с активирани малеимидови киселини, взаимодейства с карбоксиактивиран протеин, който е аминиран с аминотиол, за да се получи конюгат.
Аналогично, който и да е от ковалентно модифицираните полизахариди със свободни тиолови групи може да реагира с който и да е от про45 теините, притежаващ свободни електрофилни центрове, за да се получи ковалентен конюгат. Пример за та12
кава реакция е
| 0 II | 0 II | 0 II | Η 1 | |
| PsCNiHCH2CH2SH + | ProCCH2CH2C | - N/CH2/4NHCOCH,Br | ||
| OH | OH | Ο | ο | |
| II 1 | II 1 | II | II |
PsC NCH.CH SCH С N/CH,/ NHCCFLCH СРго
2 2 2 4 2 2 като активиран полизахарид, който е взаимодействал с аминотиол, реагира с карбоксиактивиран протеин, който е взаимодействал с монохалоацетилови производни на диамина, за да се получи конюгат.
Би следвало електрофилната активност на излишъка от халоацетилни групи да се елеминира. Взаимодействието на конюгата с нискомолекулен тиол, като п-ацетилцистеамин, осъществява тази цел. Използването на този реагент, п-ацетилцистеамин, също позволява да се потвърди определянето на халоацетилните групи, които се използват (вж раздел Г), тъй като S-карбоксиметилцистеаминът, който се получава, може да бъде установен по метода на Spackman, Moore и Stein.
Тези конюгати след това се центрофугират при около 100,000 XG като се използва ротор с фиксиран ъгъл около 2 h при температура 1 до 20°С или се подлагат на която и да е процедура за пречистване, включваща гелно проникване, хроматография, с йонно изключване, стъпаловидно центрофугиране, или друга разделяща адсорбционна хроматография, за отстраняване на нековалентно свързаните полизахариди и протеини, използвайки анализ на ковалентността на хибридния строеж (вж по-долу) като метод за преследване на желана биологична активност.
По-нататъшното разделяне на реагентите може да се осъществи чрез колонна хроматография, изключваща определен размер от пробата или в случаите на особено дълги неразтворими протеини, като N-meningitidis В серотип от външната мембрана, това разделяне може да се осъществи чрез ултрацентрофугиране.
Г. Анализи за потвърждаване на ковалентността.
Анализът на конюгата за потвърждаване на ковалентността и следователно на стабилността на конюгата, се осъществява чрез хидролизиране (за предпочитане с 6N НС1 при 110°С, за двадесет часа) на конюгата, след това количествено анализиране на аминокиселината от хидролитично стабилната структура, съдържаща тиоетерна връзка, и на аминокиселините, образуващи протеина. Участието на аминокиселините на протеина може да се отстрани, ако е необходимо, чрез сравняване с подходяща за включения протеин стандартна аминокиселина, като оставащата стойност за аминокиселината с оставащата аминокиселина от интервала, рефлектираща върху ковалентността на конюгата, или аминокиселината от интервала може да бъде конструирана, за да изяви аминокиселинния стандарт на протеина в анализа. Анализът за ковалентност е също полезен за контролиране на пречистването, като се отбелязва повишаване на концентрацията на биологично активните компоненти. В горните примери хидролизата на
O NHCOCH.
II I
PsCNCH2CH2CH2CH2NHCCH2SCH, CH2CHCOPro води до освобождаване на S-карбоксиметилхомоцистеин,
NH,
I
HO2CCH2SCH2CH2CHCO2H хидролизата на
О
II II.
CH2CH2NHCCH2CH2CPro *води до освобождаване на аминодикарбоксилната киселина20 и хидролизата на ho2cch2chsch2ch2nh2
НО2С
ОН ОН оо
II | II I IIII
PsCNCH2CH SCH2CN/CH / NHCCH CH2CPro води до освобождаване на S-карбоксиметилцистеамин.
H2NCH2CH2SCH2CO2H се освобождава при разцепване на Ps-A-ES-B-Pro молекулата при пептидни връзки и при други хидролитично нестабилни връзки. Могат да бъдат приложени хроматографски методи, като на Spackman, Moore и Stein и да бъде определено количеството на аминокиселинните компоненти.
Д. Приложения.
Един или повече от конюгатите съгласно изобретението могат да бъдат използвани при бозайници за активна или пасивна защита профилактично или терапевтично срещу бак териемиа, причинена от родствени организми, например в предпочитани изпълнения на изобретението,Haemophilus influenzae тип b или Str. pneumoniae, тип 6В, 19F или 23F. Активна защита може да бъде обезпечена чрез инжектиране на ефективно количество (количество, способно да продуцира измерими количества от антитела, например от 2 до 50 pg) от полизахарида в конюгирана форма от всеки от конюгатите, приложени в доза, целия антисерум, получен от животни, инжектирани предварително с конюгат или конюгати или с глобулин, или с друго антитяло, съдържащо фракции от съ14 щия антисерум, с или без фармацевтично приемлив носител, например асептичен физиологичен разтвор. Такъв глобулин се получава от пълен 5 антисерум чрез хроматография, солево или алкохолно фракциониране или електрофореза. Пасивна защита може да се обезпечи чрез процедури на стандартно моноклонално антитяло или чрез имунизиране на подходящи бозайници като гостоприемник. Прилагането на добавка се очаква също да бъде в обхвата на изобретението.
В предпочитано изпълнение на изобретението конюгатът се използва за активна имуногенна ваксинация на хора, по-специално бебета и деца. За допълнителна стабилност тези конюгати могат също така да бъдат лиофилизирани в присъствието на лактоза (например при 20 pg/ ml от H.flu полизахарид/4 pg/ml лактоза или 50 pg/ml от пневмококов полизихарид/10 mg/ml лактоза) преди използването.
Предпочитаната доза е количество от всеки от конюгатите или от техните производни, което трябва да се приложи, съответстващо на 25 pg от полизахарида в конюгирана фор30
Среда за инокулум на Haemophilus * ма за конюгати на пневмококови полизахариди и 10 pg от полизахарида в конюгирана форма за конюгати от H.flu, тип b полизахарид при еднократна доза. Ако е необходимо се прилагат допълнително една или две дози от конюгата или неговите производни на H.flu, тип b полизахарид, в количество, съответст10 ващо на 10 pg от полизахарида в конюгираната форма.
Изобретението по-нататък се пояснява чрез следните примери, които не го ограничават.
Пример 1. Приготвяне на капсулиран полизахарид от Н. influenzae, тип b (PRP) Инокулум и развитието му.
Етап А. Лиофилизирана епрувет20 ка с Н. influenzae, тип b (култивирана от Ross 768, получена от Дъргавния Университет на Ню Йорк) се суспендира в 1 ml стерилна среда за инокулиране на Haemophilus (вж по25 долу) и тази суспензия се разпределя в 19 шоколадово-агарни панички (BBL). След 20-часово инкубиране при 37°С, културата от всяка паничка се суспендира повторно в 1-2 ml среда за Haemophilus и се обединява (събира).
| Соев пептон | 10g/l |
| NaCl | 5 g/1 |
| NaH РО | 3,1 g/1 |
| NaHPO. | 13,7 g/1 |
| К7НР(У L 4 | 2,5 g/1 |
| дестилирана вода | до определен обем |
’pH на разтвора се довежда до определена стойност 7,2 ± 0,1 (типично е pH 7,23) и разтворът се стерилизира чрез автоклавиране при 121 °C за 25 min.
Етап Б. Двулитрови незапушени Ерленмайерови колби.
Една трета част от ресуспендираните бактерии, посочени в Етап А, се използва за инокулиране на три двулитрови колби, всяка от които съдържа около 1,01 от посева на Haemophilus и производствената сре60630 да (вж по-долу). Колбите след това се инкулират при 37°С на ротационен вибратор със скорост 200 об/min
Посев на Haemophilus за около 5 h. Типичната стойност за ОП660 в края на инкубационния период е 0,37.
производствена среда и
| NaH2PO4 | 3,1 g/1 |
| Na2HPO4 | 13,7 g/1 |
| Соев пептон | Ю g/1 |
| Диафилтрат на екстракт | |
| от дрожди (1) | 10 mg/1 |
| К2НРО4 | 2,5 g/1 |
| NaCl | 5,0 g/1 |
| Глюкоза | 5,0 g/1 |
| Никотинамидаденин | |
| динуклеотид /ИАД/ (3) | ’ 2 mg/1 |
| Хемин (4) | 5 mg/1 |
Солите и соевият пептон се разтварят в малки обеми от гореща, свободна от пирогени вода и се довеждат до определен краен обем чрез добавяне на гореща апирогенна вода. Ферментаторите или колбите след това се стерилизират за около 25 min при 121 °C и след охлаждане, диафилтратът на дрождевия екстракт 1), глюкозата 2), ИАД 3) и хемина 4) се добавят асептично във ферментаторите или колбите преди инокулацията.
1) Диафилтрат на дрождев екстракт: 100 g дрождев екстракт (Amber) се разтваря в 1 литър дестилирана вода и се ултрафилтрира с Амикон ДС-30 за отстраняване на молекули с молекулно тегло 50,000. Филтратът се събира и преминава през 0,22 μ мембрана като стерилен продукт.
2) Глюкозата се приготвя като 25% разтвор в дестилирана вода.
3) Изходен разтвор на ИАД, съдържащ 20 mg/ml се стерилизира чрез филтруване през Милипоров филтър (0,22μ) и се добавя асептично точно преди инокулацията.
4) Изходен разтвор на Хемин ЗХ се приготвя чрез разтваряне на 200 mg в 10 ml 0,1 М NaOH и обемът се до20 вежда до 100 с дестилирана стерилизирана вода. Разтворът се стерилизира 20 min при 121 °C и се добавя асептично към крайната среда преди инокулацията.
Етап В. 70-литров посевен ферментатор
Три литра от продукта, получен от Етап Б се използват за инокулиране на 70-литров ферментатор, съ30 държащ 41,4 1 производствена среда и посев на Haemophilus, приготвени, както е описано по-горе, и 17 ml UCON В625 антипенител. Началното pH е 7,4.
Ферментацията протича при 37°С и 100 об/min разбъркване, като процесът се следи чрез оптичната плътност (ОП) и стойностите за рн ДО достигане на характерната стойност
0,39 за ОП (след около 5,5 h).
Етап Г. 800-литров производствен ферментатор
Приблизително 40 1 от продукта от етап Б се използва за инокулира45 не на 800-литров ферментатор, съдържащ 570 1 от продуктивната среда, получена, както е описана по-го ре, и антипенител UCON LB625.
Ферментацията се провежда при 37°С при разбъркване със скорост 100 об/min, като ОП и pH се проверяват всеки два часа, докато стойностите за ОП се запазят едни и същи за двучасов период, през което време ферментацията завършва (характерна крайна стойност за ОП и 0,54 след 12 h.
Събиране на културата и инактивиране.
Приблизително 600 1 от партидата се инактивират чрез събиране в резервоар за инактивиране, съдържащ 12 1 1% тиМерозал.
Избистряне
След 18 h инактивиране при 4°С културата се центрофугира в центрофуги на Шарпл при ниска скорост, варираща между 1,3 и 3,0 Ι/min и регулирана така, че да поддържа продукта бистър. Супернатантата, получена след центрофугирането (15,000 об/min),се използва за възстановяване на продукта.
Изолиране и концентриране чрез ултрафилтруване.
Супернатантата от двете производствени ферментации се събира и концентрира при 2 до 8°С в Ромиконов апарат за ултрафилтруване (50,000 Далтона) с кухи влакнести патрони (4,5 т2 мембранна повърхност; 2,0 Ι/m въздушен поток и налягане 138 кн/m2), следва концентриране така, че след приблизително
4,5 h се концентрират 1200 до 32,5 1. Филтратът се отстранява.
Утаяване с 48%-ен и с 61 %-ен етанол
Към 32,5 1 от запазения ултрафилтрат се добавя 30 I 95%-ен етанол, на капки в продължение на 1 h, при разбъркване и при 4°С до крайна концентрация 48 об.% етанол. Сместа допълнително се разбърква в продължение на 2 h при 4°С до достигане на пълно утаяване и супернатантата се събира чрез единична, 10,2 сантиметрова центрофуга на Шарпл при 15000 об/min (скорост на изтичане = 0,27 l/min). Неразтворената част се отстранява и пречистената течност се довежда до 61 % етанол с добавяне на 20,8 1 95%-ен етанол в продължение на 1 h. Сместа се разбърква в продължение на 3 h за постигане на пълно утаяване.
Регенериране на вторичната утайка след центрофугирането.
Получената разтворима в етанол -48%, неразтворима в етанол - 61 % утайка се събира чрез центрофугиране при 15000 об/min в 10,2-сантиметрова центрофуга та Шарпл (дебит = 0,62 l/min) и 61% етанолова супернатанта се отстранява. Полученият суров продукт е 0,377 Kg влажна паста.Екстракция с калциев хлорид
377 g от неразтворимия в 61 %-ен етанол продукт се смесва в дисперсионен съд на Даймекс при 2 до 8°С с 6,5 1 студена дестилирана вода. Към тази смес се добавя 6,5 1 студен 2М СаС12.Н2О и сместа (с крайна концентрация = 1,0М СаС12) се екстрахира при 4°С 15 min. Съдът след това се изплаква с 2 1 1М СаС1,,2Н2О до получаване на 15 I краен обем.
Утаяване с 23%-ен етанол
1 от екстракта с СаС12 се довежда до 23%-тно етанолово съдържание чрез добавяне на 4,48 1 95%ен етанол на капки, разбъркване при 4°С 30 min. След допълнително разбъркване 17 h сместа се центрофугира на К2 Ултрацентрофуга при 25,000 об/min (дебит 165 ml/min) за
6,5 h при 4°С. Супернатантата се отдекантира през марля за отстраняване на плаващите по повърхността липидоподобни частици и неразтвори мата утайка след центрофугиране се отстранява.
Утаяване с 37%-ен етанол и събиране на суровия пастообразен продукт
Разтворимата в 23%-ен етанол супернатанта се довежда до 37%-ен етанол чрез добавяне на 4,33 1 95% етанол, на капки при разбъркване за 30 min. Сместа се оставя да стои при разбъркване 1 h, след това без разбъркване - 14 h, за да се постигне пълно утаяване. Получената смес след това се центрофугира на 10,2сантиметрова центрофуга на Шарпл при 15000 об/min (дебит 0,2 1/min) за събиране на суровия полизахарид, утаен след центрофугирането.
Пулверизация
Утайката след центрофугирането се прехвърля в смесител на Варинг с обем 3,8 I, съдържащ 1 1 абсолютен алкохол, и се смесва с него за 30 s при висока скорост. Смесването продължава при режим на включване и изключване 30 s, докато се получи твърда бяла пудра. Пудрата се събира върху Бюхнерова фуния с тефлонов филтърен диск и се промива последователно in citu с две еднолитрови порции абсолютен етанол и две 2литрови порции ацетон. Материалът след това се изсушава под вакуум при 4°С 24 h, като в резултат се получават 68 g (сухо тегло) продукт.
Фенолна екстракция ' Полученият 68 g сух материал след етапа на пулверизация се ресуспендира в 12 1 от 0,488М натриев ацетат при pH 6,9 с помощта на дисперсионен съд на Даймекс. Разтворът на натриев ацетат веднага се екстрахира с 4,48 1 пресен воден фенолен разтвор, получен, както следва: 900 ml от 0,488М натриев ацетат, pH 6,9, се добавя към 2,3-литрова бутилка с фенол (Mallinckrodt кристален) в 20-литров автоклав и се смесва до пълно разтваряне. Всеки фенолен екстракт се центрофугира 2,5 h при 30000 об/min и 4С в К2 Ултрацентрофуга (ядрена електроника) за разрушаване на емулсията. Водният отток се екстрахира допълнително трикратно с 3,2 пресен воден фенолен разтвор по аналогичен начин. Фенолните фази се отстраняват.
Диафилтруване
Водната фаза от фенолните екстракции по-горе (17,6 1) се разрежда с 300 1 студена дестилирана вода и се диафилтрира при 4°С на Амикон ДС-30 ултрафилтрационен апарат с помощта на Н10₽10 патрони. Амиконовият апарат се изплаква и течността се добавя, така че крайният обем да е 17,5 1. Ултрафилтратът се отстранява.
Утаяване с 67%-ен етанол
Добавя се 0,438 1 2,0 М СаС12 към
17,5 1 диализат от предишния етап (крайната концентрация на СаС12 е 0,05М) и разтворът се довежда до 67% съдържание на етанол чрез добавяне на капки в продължение на един час и при интензивно разбъркване на 34,88 1 95%-ен етанол. След 4 h разбъркване следва престояване 12 h при 4°С, бистрата супернатанта се отлива и утайката се събира чрез центрофугиране в 10,2-сантиметрова центрофуга на Шарпл (15000 об/ min) при 4°С 45 min. Получената полизахаридна утайка от центрофугирането се пулверизира в 3,8-литров смесител на Веринг при режим на включване и изключване през 30s с 2 1 етанол (абсолютен), събира се върху Бюхнерова фуния с тефлонов филтърен диск и се промива in citu с 4 еднолитрови порции абсолютен етанол, последвано от две еднолитрови порции ацетон. След това пробата се изсушава под вакуум при 4°С за 20 h. Полученият продукт е 39 g суха пудра.
Ултрацентрофугиране в 20% етанол и събиране на крайния продукт
Полученият след горния етап продукт в количество, възлизащо на 39 g, се разтваря в 15,21 1 дестилирана вода, към която се добавят 0,39 1 0,05М СаС12.2Н2О, довеждайки разтвора до концентрация 0,05М СаС12 и общият обем до 15,6 1 (2,5 mg полизахарид/ml), след което сместа се довежда до 24%-ен етанол чрез добавяне на капки на 4,93 1 95%-ен етанол в продължение на 30 min. Сместа се избистря незабавно чрез центрофугиране в К2 Ултрацентрофуга, съдържаща К3 титанова чаша и Ки Норилова сърцевина (30000 об/min и 100 ml/min), 3,5 h при 4°С. Утайката се отстранява и бистрата супернатанта (обем 19,8 1) се довежда до 37 %ен етанол чрез добавяне на 4,23 1 95%-ен етанол за 30 min при разбъркване. След разбъркване в продълже- 25 ние на още 30 min, сместа се оставя в покой при 4°С 17 h и след това се събира чрез центрофугиране при 5 15000 об/min в 10,2-сантиметрова центрофуга на Шарпл (необходими са 45 min).
Получената паста се прехвърля в смесител на Варинг с вместимост 4,5 1, абсолютен етанол, и се смесва при 10 най-висока скорост 4 или 5 цикъла на включване и изключване през 30 s до получаване на твърда бяла пудра. Тази пудра се събира върху Бюхнерова фуния с тефлонов диск на 15 Цитекс и се промива последователно in citu с две 0,5-литрови пресни порции и една 1-литрова порция абсолютен етанол и с две еднолитрови порции ацетон. Продуктът се отстра20 нява от фунията и се прехвърля върху тариран съд за изсушаване под вакуум при 4°С 25,5 h. Крайният продукт възлиза на 34,7 g сухо тегло и свойствата му са описани в следващата таблица:
Таблица 1-1
HIb ПОЛИЗАХАРИД
ДАННИ ОТ ХИМИЧНИ ИЗСЛЕДВАНИЯ
Анализ на
Резултат, в % тегл.
| Влажност (TG) | 13,5 % |
| Протеин | 0,0 % |
| Нуклеинова киселина | 1,3 % |
| Рибоза (пентоза) | 35,1 % |
| Фосфор | 7,8 % |
| Кд (сефароза 4В) | .05.35 |
| Кд (сефароза 2В) | .43.60 |
За осъществяване на анализа са използвани следните процедури.
1. Влажност - Стандартната термогравиметрия (TG) (загуба на тегло до
100°С), използвайки Перкин-Елмер 45 термовезна TSG-1.
2. Протеин - Метод на Лоури (22).
3. Нуклеинова киселина - Ултра19 виолетов метод (23)
4. Рибоза - Метод на Биал (24)
5. Фосфор - Молибдатен метод (25)
6. К. - Определяне на сефарозата
4В чрез рефракционен индекс
Таблица 1-2
| Определяне на пирогенни вещества (HIb Полизахарид) | |
| Концентрация /gg/ml/kg | Макс, повишение на темпер.* 0°С (3 заека) |
| 0,1 (полизахарид) | 0,2, 0,2, 0,1 |
* 1,0 ml/kg доза
П олизахаридът по-нататък се идентифицира чрез агарова гелна дифузия, както следва. Двойна дифузия върху агар се осъществява чрез използване на панички на Хиланд модел Д. Приготвеният антисерум срещу щама на Н.influenzae Ross 768, се поставя в средните гнезда, докато масата от полизахарида с концентрация 50, 25, 12,5, 6,2 и 3,1 gg/ml се поставя в страничните гнезда. Паничките се инкубират при 20-25°С във влажна камера 24 h. Преципитинови ивици се наблюдават между основния полизахарид и специфичния антисерум при концентрация на полизахарида 50, 25 и 12,5 gg/ml.
Пример 2. Получаване на мембранен протеин от Neisseria meningitidis Bl 1, серотип 2.
А. Ферментация
1. Neisseria meningitidis, Група Bll Епруветката, съдържаща лиофилизирана култура на Neisseria meningitidis, получена от WRAIR, Вашингтон, се отваря и се добавя Engonbroth (BBL).Културата се посява на штрих върху шоколадов агар и се инкубира при 37°С с СО2 за 36 h, през което време културата се събира в среда от 10% обезмаслено мляко (среда на Difco) разредена до 1 ml и замразена до -70°С. Организмът се идентифицира позитивно чрез аглутинация със специфичен антисерум, осигурен от WRAIR, и типичен антисерум, обезпечен от Difco.
Културата от първия пасаж се поставя на штрих върху шоколадови агарни пластинки и се инкубира при 37°С с 50% СО2 за 18 h, през което време културата се събира в среда от 10% обесмаслено мляко, соведена до количество 1 ml и замразена до 70(,С. Организмът отново позитивно се идентифицира чрез аглутинация със специфичен антисерум, осигурен от WRAIR, и типичен серум, обезпечен от Difco.
Ампула с културата от втория пасаж се размразява и се поставя на штрих върху Мюлер-Хинтън Columbia Sheep Blood агарови панички (CBAB-BBL). Последните се инкубират при 37°С с 5% СО2 за 18 h, след което културата се събира в 100 ml среда от 10% обезмаслено мляко, довежда се до количество 0,5 ml и се замразява при -70°С. Организмът се идентифицира позитивно чрез аглутинация със специфичен антисерум, захарна ферментация и оцветяване по грам.
Ампула с културата от този пасаж се размразява, разрежда се с бульон на Мюлер-Хинтън и се посява на штрих върху 40 панички с агар на Мюлер-Хинтън. Паничките се инкубират при 37°С с 6% СО2 за 18 h, след което културата се събира в 17 ml среда от 10% обезмаслено мляко, довежда се до количество 0,3 ml и се замразява до -70°С. Организмът се идентифицира позитивно чрез оцветяване по грам, аглутиниране със специфичен антисерум и оксидазен тест.
2. Ферментация и събиране на клетъчната паста
а) Развитие на инокулума. Инокулумът се развива от две по 0,5 ml замразени ампули с Neisseria meningitidis, група В, ВИ (пасаж 4). Четири бутилки с агар на МюлерХинтън се инокулират, културата се събира приблизително 18 h по-късно, и се използват като инокулум за 5 1 диализатна среда на Готшли при pH 7,29. Оптичната плътност (ОП) се довежда до 0,065 при 660 nm (Perkin Elmer). Организмите се отглеждат в 5 двулитрови Ерленмайерови колби (всяка съдържаща 1 1 от средата, вж. по-нататък) при 37°С във вибратор. ОП се контролира през интервали от 45-, 75- и 120 min. Получават се приблизително 4 1 от ферментационната култура с оптична плътност (ОП 0,660) 0,81.
Проба от 3 ml се взема за оцветяване по Грам, изолират се штрихи върху СВАВ-агарови плочки, върху агарови панички на Мюлер-Хинтън и панички с екстракт от дрожди, прави се проверка чрез аглутинация.
Всички реакции са задоволителни.
б) 70-литров ферментатор: Приблизително 3600 ml зародишна култура се използва за инокулиране на стерилен 70-литров ферментатор, съдържащ 42,6 1 от пълната производствена среда.
Условиятна за 70-литровия ферментатор включват 37°С , 185 об/min с 10 Ι/min приток на въздух и непрекъснат контрол на pH при pH 7,0 за
5,5 h.
Културата се посява върху пластинки с агар на Мюлер-Хинтън, декстро5а от дрождев екстракт и върху агарни пластинки със заешка кръв (Мерк) при 37°С и се проверява за аглутинация с антисерум за Neisseria meningitidis, група В. Растежът е нормален и аглутинационната реакция е позитивна. За тази проба крайната ОП е 0,840 при 660μ след 5,5 h.
в) 800-литров производствен ферментатор: приблизително 46,2 1 от посевната култура се използва за инокулиране ie на стерилен 800-литров ферментатор, съдържащ 568,2 1 от пълната производствена среда. Партидата се инкубира при 37°С, 100 об/min с 60 Ι/min приток на кислород и постоянен контрол на pH при 7,0.
Преди да бъде инактивирана партидата, културата се поставя в Мюлер-Хинтънови агарови панички, декстрозни агарни панички и агарови панички със заешка кръв при 37°С и се изследва за аглутинация с антисерум за Neisseria meningitidis, група В. Развитието на културата в тези панички е нормално и реакцията на аглутинация - позитивна. За тази партида, крайната ОП е 2,24 тринадесет часа след инокулацията.
3. Пълна среда за нефелометрични колби и 70- и 800-литрови ферментатори
Фракция A
L-Глутаминова киселина
NaCl
Na2HPO4.безводен
NH Cl
KC1
L-цистеинхидрохлорид
Фракция Б. Дрождев диализат на Готшлих
1280 g от дрождев екстракт на Difco се разтварят в 6,4 1 дестилирана вода. Разтворът се подлага на диализа в 2 диализатора с кухи влакна Amicon ДС-30 с 3 патрона Н 10SM. Диализатът и 384 g MgSO4.7H2O и 3200 g декстроза се разтварят в диализата и общият обем се довежда до 15 1 с дестилирана вода. pH се довежда до 7,4 с NaOH и се стерилизира чрез филтриране през Милипоров филтър (0,22 рк) и се добавя към ферментатора, съдържащ фракция А.
За нефелометричните колби. 1 1 от фракция А и 25 ml от фракция Б се добавят, a pH се довежда до 7,0 - 7,2 с NaOH.
За 70-литровия ферментатор. 41,8 1 от фракция А и 900 ml от фракция Б се добавят, като pH се довежда до 7,0 - 7,2 с NaOH.
За 800-литровия ферментатор. 553 1 от фракция А и 15,0 1 от фракция Б се добавят, pH се довежда до 7,0 - 7,2 с NaOH.
г) Събиране и инактивиране. След ферментацията се добавя фенол 10,5% об/об крайна концентрация в отделен съд, в който след това се прехвърля клетъчният бульон. Материалът се оставя при стайна температура при внимателно разбъркване до загубване жизнеността на културата (около 24 h).
д) Центрофугиране. След около 24 h при 4°С температура, 614,4 I от
1.5 g/1
6,0 g/1
2.5 gl
1,25 g/1
0,09 g/1
0.02 g/1 инактивираната културална течност се подлага на центрофугиране в центрофуги на Шарпл. Теглото на клетъчната паста след добавяне на фенол е 3,875 kg.
Б1- Изолиране.
Етап 1. Промиване на бактериалните клетки. За всяко изолиране, 2000 g от горната инактивирана с фенол паста се суспендира в 800 ml стерилна дестилирана вода и се разбърква с магнитна бъркалка до получаване на гранулирана суспензия. Суспендираните клетки се подлагат на центрофугиране при 20,000 xg за 60 min при 5°С.
Етап 2. Екстракция. Промитите клетки се суспендират в 2000 ml от 0,1М Трие- 0,01 МЕДТА буфер, pH 8,5, с 0,5% натриев дезоксихолат (ТЕД Буфер) с омнимиксер на Сорвал 3 пъти по 60 s. Хомогенизираната суспензия се прехвърля в 16 Ерленмайерови колби от 500 ml, за да се екстрахира при 56°С във водна баня 15 min при разклащане.
Екстрактът се центрофугира при 20,000 xg 60 min на 5°С. Вискозната супернатантна течност се отдекантира (общ обем 1980 ml) и се оставя при 4°С.
Екстрахираната клетъчна утайка се ресуспендира в 2000 ml ТЕД Буфер, както е описано по-горе. Суспензията се екстрахира 15 min при 56°С и се центрофугира както по-горе. Супернатантата се отдекантира (обем 2100 ml) и се оставя при 4°С.
Етап 3. Концентриране чрез ултрафилтрация. Екстрахираните супернатанти от Етап 2 се отливат (общ обем 4005 ml). 2 1 от отлетите се дозират в 2 1 New Brunswick ферментационен съд, свързан с филтър на Millipore Pellicon, снабден с 2 дурапорови мембрани с размер 0,45 μ. Екстрахираната супернатанта се оставя при 25°С във ферментационния съд в продължение на процеса на концентрация в рамките на 90 min. Пробата се концентрира десетократно при средно налягане през мембраната от 187 KN/m2.
Етап 4. Събиране и промиване на протеина от дадения серотип. Съхраненият след Етап 3 продукт (205 ml) се центрофугира за утаяване на протеина от конкретния серотип при 160000 xg 2 h при 5°С. Супернатантите се декантират и изхвърлят.
Протеиновите утайки се претеглят (8,12 g) и след това се суспендират в ТЕД Буфер (190 ml буфер; 20 ml/g утайка) ръчно със стъклена бъркалка и хомогенизатор на Dounce. Суспензията се екстрахира при 56°С за 15 min (при температура) в 500милилитрови Ерленмайерови колби с разклащане. Суспензията се центрофугира при 160,000 xg 2 h при 5°С. Суспернатантата се декантира и се изхвърля (обем 190 ml).
Утайките се промиват втори път в 190 ml 5 ТЕД Буфер, както е описано по-горе.
Етап 5. Регенериране на продукта. Промитите протеинови утайки от етап 4 се суспендират в 100 ml дестилирана вода със стъклена бъркалка и хомогенизатор на Dounce до по10 лучаване на пълна суспензия. От тази суспензия се получава протеин по Лоури. възлизащ на 17,0 mg/ml. В този етап, се отделят 200 mg от суспензията за експериментални нужди. 15 Останалата част от суспензията (91 ml) се разрежда до8,0 mg/ml със 102,4 ml студена дестилирана вода. Водната суспензия се центрофугира при 12,000 xg 15 min за пречистване от 20 агрегатите.
Супернатантният продукт се изтегля внимателно с пипета, за избягване на меките агрегирали частици. Продуктът се бележи (обем 182,5 ml) 25 и еднакви количества се изпитват за стерилност и пирогени (стерилен продукт; няма пирогени). Продуктът се съхранява при 4°С като стерилна маса до използването й за конюги30 ране, когато се охарактеризира аналитично.Крайният продукт възлиза на 9,5 mg протеин по Лоури/g от изходната клетъчна паста.
Таблица 2-1
Разтвор на протеин от менингококов серотип - 2
Данни от химични изследвания
Анализ за
Протеин по Лоури
Нуклеинова киселина*
Резултат
4,1 mg/ml
РНК 1.8%
ДНК (дифениламин) 0,6%
Неутрални захари* 1,05
Антрон сиалова киселина 3,0%
Молекулно тегло SDS-PAGE 40,000 d * Изчисленията са направени като % от протеин по Лоури.
Следните методики са използвани при анализите.
1. Протеин, както е описано в промер 1.
2. Нуклеинова киселина - цветовото развитие се наблюдава чрез използване на орцинолова реакция (Bial), което съответства на 1,8% РНК, пресметнато като % от протеиновата концентрация. Дифениламиновият тест за ДНК показва 0,6%о съдържание на ДНК, като % от протеина в основния разтвор.
3. Неутрални захари - съдържанието на неутрална захар се изчислява като % от протеина, като се използва антрон колориметричен тест (26).
4. Сиалова киселина - съдържанието на сиалова киселина се установява чрез метода резорцин-НС1 (27).
5. Молекулно тегло - молекулното тегло на денатурирания с меркаптоетанол протеин се намира, както е определено чрез SDS-полиакриламидна гел електрофореза (28).
Пример 3. Получаване на конюгат между полизахарид от Н. influenzae тип b и протеин от външната мембрана на N.meningitidis серотип В.
1. Изготвяне на Dowex 50x8 (200400 меша) в тетра -п-бутиламинова форма.
360 ml от прясна Dowex 50x8 (200-400 меша) силно кисела катионобменна смола се зарежда в стерилна хроматографска колона и се промива с 1500 ml стерилизирана дести лирана (c.g.) вода и се оставя една нощ в 800 ml от същата вода. След това смолата последователно се промива в 1 1 60:40 c.g. вода:метанол, 1 1 40:60 c.g. вода:метанол и 11 стерилизирана дестилирана (c.g.) вода. След-това смолата се стерилизира чрез потапяне в 650 ml 3N хидрохлорна киселина (200 ml НС1, разредена до 800 ml с вода). Тази кисела форма на смолата се оставя за стареене 19,5 h и след това се промива с вода до отстраняване на излишната киселина.
Към тази колона след това се добавя 700 ml 1:1 смес на вода: 40% тетрабутиламониев хидроксид, която перколира през смолата, докато преминаващият поток стане основен (pH около 10). Смолата след това се промива за освобождаване от излишъка от основа с приблизително 2 1 вода и след това се прехвърля в стерилен буркан. Крайният поток е стерилен и свободен от пирогени.
II. Получаване на тетра -п-бутиламониева сол на Н.influenzae тип b полизахарид (HIb)
250-милилитрова облодънна колба, снабдена с магнитна бъркалка, се зарежда с 3,29 g HIb и 84 ml вода. Сместа се разбърква 20 min и след това се добавя допълнително количество от 15 ml вода. Бъркането продължава още 30 min, докато цялото количество HIb се включи в разтвора. Разтворът на HIb след това се подава към Dowex 50x8 (200-400 меша, тетрабутиламониева форма) в колона с размери 45x270 mm. За изплакване се използват 10 ml вода. Колоната се покрива с вода и се прилага налягане чрез използване на ръчна помпа (чрез Millex FG, 0,22 μ филтър).
50-милилитрови фракции се събират в стерилни центрофужни епруветки на Налген и всяка от тях се подлага на изпитване за наличие на органично вещество чрез прилагане на количества от приблизително 10 μ<, като се използват стерилни капиляри за определяне т.т., към силикагелни панички. Паничката се напръсква със CelV (SO4/2) H2SO4 разтвор (1% CeIV/SO4/2 в 10% водна сярна киселина), нагрява се на гореща плоча и органичните количества се откриват като черни петна. Общо 190 ml от епруветките 2, 3, 4 и 5 се събират в 250-мйлилитрова центрофужна епруветка, смесват се и след това се разпределят в 6 претеглени еднакви облодънни колби от по 250 ml, маркирани с от А до F. Изследва се една от тях и е установено, че е стерилна и свободна от пирогени.
Съдържанието на шестте колби се замразява в смес от сух лед и ацетон и се лиофцлизира. Сухата проба има същото Kd , както изходния HIb.
III. Получаване на адукт на полизахарид и бутандиамин (HIb-BuA2)
Етап А. Пригонвяне на 1,4-бутандиаминов разтвор. 1,46 g 1,4 бутандиаминов дихидрохлорид се зарежда в 100-милилитрова облодънна колба и се разтваря в 58 ml вода. Добавя се 5,0 ml 2,5 N NaOH, довеждайки pH до 10,35. Разтворът се филтрира през 0,22 μ филтър на Sybron-Nalge.
Етап Б. Активиране на HIb и реакция с 1,4-бутандиамин. Към колба А (от раздел II), съдържаща 0,64 g тетра-п-бутиламониева сол на PRP се добавя магнитна бъркалка и 17,5 ml диметилформамид. Сместа се разбърква при стайна температура 25 min, при което почти целият материал се включва в разтвора.
mg карбонилдиимидазол се претеглят в 6 ml стерилна серумна ампула и след това се добавя наведнъж към разтвора на диметилформамида. Колбата се запушва и се разбърква при стайна температура 35 min. През това време 32 ml разтвор на бутандиамин, изготвен съгласно А се поставя в 100-милилитрова облодънна колба, снабдена с магнитна бъркалка и се бърка в ледена баня около 5 min.
След 35-минутно разбъркване, диметилформамидният разтвор се добавя с пипета, към студен разтвор на
I, 4-бутандиамин. Разбъркването на ледена баня продължава 15 min, след което ледът се отстранява и продължава бъркането в продължение на 17 min.
Етап С. Диализа и лиофилизация. Разтворът след това се прехвърля в автоклавирана диализна епруветка Spectropor 2 (обем на цилиндъра 0,21 ml/mm; ~ 43 cm) и се диализира при 4°С. Най-напред, разтворът се подлага на диализа в 8 1 0,01М фосфатен буфер при pH 7,0 за 5 h, след това се диализира двукратно в пресен 8-литров фосфатен буфер, найнапред 5 h, след това - 11 h. Накрая, разтворът се диализира с 18 1 вода за 6 h.
Диализът се разпределя в две 250-милилитрови облодънни колби (в количество 125 ml) след като се вземе една проба за изпитване за стерилност и пирогени (в резултат се установява, че е стерилна и свободна от пирогени). Съдържанието на тези колби се замразява в смес от сух лед и ацетон и се лиофилизира посредством метода, изложен в раздел
II. В резултат се получават общо 480 mg.Флуоросцентен анализ показва 468 наномола NH2/mg.
IV. Получаване на полизахаридбутандиамид-бромацетамид (HlbBuA2-BrAc).
Етап А. Получаване на р-нитрофенил бромацетат. 6,39 g (45 mM) бромоцетна киселина и 6,25 g 745 mM) р-нитрофенол се поставят в 250милилитрова облодънна колба и се разтварят в 50 ml метиленов дихлорид (СН2С12). Разтворът се разбърква в ледена баня за 10 min и след това 10,3 g (50 mM) дициклохексилкарбодиимид, разтворен в 10 ml СН2С12 се добавя към него. Реакционната смес след това се бърка при 4°С 17,25 h.
Утаеният дициклохексилкарбамид след това се филтрира и филтърът се концентрира до сухо под вакуум. Жълтият остатък след това се добавя към 35 ml 1-хлорбутан, прекристализира се, при което се получават
6,5 g от продукта с температура на топене 85-87°С и този продукт се добавя в 100 ml циклохексан, прекристализира се, като се получават 4,59 g р-нитрофенил бромацетат, точка на топене 86-87°С.
Изчисленията за CgH6NO4Br показват за С: - 36,92, Н - 2,30, N 5,38, Вг - 30,77. Намерено е: за С 37,66, Н - 2,48, N - 5,28, Вг - 30,57.
Етап Б. Реакция на HIb-BuA2. 380 mg HIb-BuA2, получен съгласно раздел III по-горе (от две колби), се разтваря в 37 ml буфер с pH 9,15 в облодънна колба с обем 250 ml и с магнитна бъркалка. Към този разтвор се добавя 346 mgp-нитрофенил бромацетат (от етап А по-горе), разтворен в 9 ml ацетонитрил и сместа се разбърква при 4°С за 24 h, след това се прехвърля в диализна епруветка (споктропор 2, вж раздел III). След това този разтвор се подлага на диа лиза срещу 18 1 вода да 5,25 h и след това срещу пресни 18 1 вода за 17,25 h (и в двата случая с температура 4°С).
Диализат 100 ml последователно се филтрира през филтър на Sybron Nalge с размер на порите съответно 0,45 ри 20 μ. След това се разделя на равни части в шест 100-милилитрови облодънни колби, замразява се и се лиофилизира, както в раздел II. Получава се общо 0,28 g HIb-BuA2ВгАс. Флуоресцентната проба показва 128 наномола NH2/mg, които дават 340 наномола бромацетилни групи/mg като разлика. Нефелометричният анализ показва същата антигенност, както при изходния полизахарид.
V. Конюгиране на HIb-BuA2-BrAc с мембранен протеин от N.meningitidis,в който са въведени функционални групи (NMP).
Етап А. Въвеждане на функционални групи в NMP с N-ацетилхомоцистеин тиолактон. В 6 ml серумна ампула, съдържаща 42 mg етилендиаминтетраоцетна киселина и 8 mg дитиотреитол, се добавя 5 ml боратен буфер с pH 11,3. От този разтвор 3,8 ml се поставят в 50-милилитрова облодънна колба и се добавят
11,5 ml от разтвор на N.meningitidis мембранен протеин (NMP). pH на получената смес се довежда до 11,39 с 40-50 μΙ от 2,5 N NaOH.
Колбата се запушва и въздухът се замества с азот, като се използва огнеупорен вентил. 53 mg от N-ацетилхомоцистеин тиолактон се добавя в азотна кутия и полученият разтвор се оставя да старее при стайна температура 16,7 h. След това този разтвор се.подава в колона, съдържаща 120 ml Сефадекс С25. Елупрането се провежда с фосфатен буфер с pH 8 и 5-милилитрови фракции се събират и изпитват с теста на Елман за тиолови групи. Осъществява се разделяне на тиоловите групи с високомолекулно тегло от тези с ниско молекулно тегло.
Етап В. Конюгиране
Фракциите с високо молекулно тегло се събират и се добавят към една от 50-милилитровите колби, съдържащи 0,06 g HIb-BuA2-BrAc (раздел IV). Този разтвор се поставя~за стареене в азотна кутия при стойна температура 6 h, след което се подлага на стерилна диализа на Spectropor при 4°С срещу 18 1 вода за 15 h, след това срещу пресни други 18 1 вода за 24 h.
Етап С. Центрофугиране
Диализатът (приблизително 32 ml) се прехвърля с пипета в 25 и 7милилитрови фракции в две поликарбонатни центрофужни епруветки и се центрофугира при 4°С 2 h при 37000 об/min (100,000 xg) в Бекманов Ti 60 ротор. Супернатантите се декантират и утайката се прехвърля в хомогенизатор на Dounce в около 8 ml вода, хомогенизира се и се връща в една от центрофужните епруветки. Последната се допълва до 25 ml с вода, което предизвиква пълно ресуспендиране и тази епруветка се центрофугира при 37,000 об/min (100,000 xg) при 4°С. 2 h. Вторичните супернатанти се декантират и утайките се хомогенизират в 8 ml вода. Хомогенатът се прехвърля в стерилна 15милилитрова центрофужна епруветка и се долива до 15 ml с вода.
След стареене при 4°С една нощ се установяват малко количество едрозърнеста утайка от твърдо вещество, която се отстранява чрез кратко (5 min) въртене в клинична центрофуга при 2500 об/min.
Горното активиране, конюгиране и центрофугиране се повтарят двукратно по един и същ начин. Те се анализират за съдържание на протеин и полизахарид за S-карбоксиметилхомоцистеин (S СМНС), лизиново съотношение, стерилност и пирогенност. Всички проби са стерилни и свободни от пирогени. Останалите резултати са представени в таблицата по-нататък.
| Проба | Полизахарид gg/ml | Протеин gg/ml | Съотношение | S СМНС/Лизин |
| 1. | 105 | 1210 | .09 | .011 |
| 2. | 154 | 1700 | .09 | .019 |
| 3. | 166 | 1800 | .09 | .027 |
Постоянното съотношение между полизахарида и протеина, което характеризира конюгата потвърждава повторимостта на метода, а съотношението на S-карбоксиметилхомоцистеинът спрямо лизина е индикация за ефективността на реакцията, като при резултат над 0, се доказва ковалентността на връзката между ковалентно модифицираните полиза40 хариди и протеини.
Разтворите се събират за клинични нужди и се лиофилизират в присъствие на лактоза (20 gg/ml полизахарид 4 gg/ml лактоза).
Пример 4. Получаване на конюгат между полизахарид от Н influenzae тип В и протеин от вън шната мембрана на N. meningitidis, серотип В, затворен с N-ацетилцистеамин
Получаването на полизахарид с въведени функционални групи, HlbΒιιΑ,-BrAc, се осъществява, както е описано в пример 3 (раздел I до IV). Получаването на NMP с въведени функционални групи е същото, както е описано в пример 8, раздел IVA.
Към колба, съдържаща 4 ml тиолиран протеин (5,6 μΜ SH съгласно анализа по Елман), се добавя 59 mg HIb-BuA2-BrAc (300 ημ бромацетил). Колбата се запечатва за стерилност, дегазира се, като въздухът се замества с Ν, и разтворът се оставя да старее 18,5 h. Добавя се 6 ml вода и разтворът се прехвърля в 10-милилитрова поликарбонатна центрофужна епруветка и се центрофугира 2 h при 43000 об/min в Бекманов ротор 75 Ti при 4°С. Супернатантата се отстранява и утайката се ресуспендира с хомогенизатор на Dounce в 10 ml 0,1М фосфатен буфер с рН 8, съдържащ 106 mg N-ацетилцистеинамин, разтворът се дегазира и се оставя при стайна температура 19,5 h.
След това се центрофугира, както е описано по-горе (43,000 об/min,
4°С. 2 h, 75 Ti ротор). Утайката се суспендира (без хомогенизиране) в 9,7 ml вода и се центрофугира отно5 во, както е описано по-горе. Получената утайка се суспендира отново с хомогенизиране в 25 ml вода и след това се разрежда с 30 ml вода за получаване на водна суспензия на продукт с кепструктура. Анализът на ко10 нюгата показва следното.
Концентрация на:
полизахарид-188 gg/ml, протеин-1200 pg/ и HIB/Протеинова концентрация 15 SCMHC/лизин = 0,096
S-карбоксиметилцистеамин/лизин = 0,20
Пример 5. Тестуване на животни за реакция на антитяло с конюгат fa 20 полизахарид на Н.influenzae тип b и протеин от външната мембрана на N.meningitidis, серотип В
Конюгат, получен съгласно процедурата, описана в пример 3, се 25 подлага на изпитване за имуногенен отговор (реакция) в ICR/Hamic и Rhesus маймуни на различна възраст и резултатите се систематизират в таблици 2 и 3.
Анализът на конюгата показва следното.
Концентрация на полизахарида
Концентрация на протеин
Ps/Протеин съотношение
Добив Р
S
276 pg/ml
2,38 gg/ml
0,12
6,1 %
Таблица 5-1
Реакция срещу серумно антитяло в ICR/Ha мишки с различна възраст, имунизирани с конюгати на полизахарид от Н. influenzae тип b и протеин
Проба
RIA Титър (СМТ) нг антитяло/ml възраст на мишките, дни* .
21
35
H.influenzae полизахарид-протеин 282** 211 1 8645 15860 конюгати 201** * възраст по време на първото инжектиране; мишки, инжектирани с 2 pg/
0,1 ml на 0-вия и 14-тия ден; кървене на 21-вия ден ** отделно; 7-8 мишки във всички групи
Активността на конюгата между полизахарид от Н.influenzae, тип b и протеин се изпитва на мишки и резултатите са показани в таблица 2.
Доказва се, че конюгатът е силно 10 имуногенен.
___________________________________________________ Таблица 5-2 Изпитване на тимусна зависимост на голи мишки, имунизирани с Н.influenzae гип b полизахарид - протеинов конюгат
| Проба | Доза Полизахарид | Ria титър (GMT) нг антитяло/ml | ||
| Nu/Nu Мишка* | Nu/+ Мишка* | |||
| конюгати на H.flu | 1 | 2,5 | 1,802 | 11,362 |
| полизахарид- | ||||
| протеин | - | |||
| солев | 1 | 50 | ||
| контрол | 2 | 55 |
+ мишки, инжектирани подкожно на 0-вия и 14-тия дни; кървене на 21 ден
Отговорът в hlu/Nu мишки се коле- мишки, показвайки, че конюгатът е бае около 15% от отговора в Nu/+ тимус - зависим антиген
Таблица 5-3
Реакция (отговор) срещу серумно антитяло в Резус маймуни, имунизирани с Н.influenzae тип b полизахарид-протеинови конюгати
Резус маймуни Доза възраст* Полизахарид
RIA Титър (GMT) ng антитяло/ml дни
14 28 42
| 2-3 месеца 20gg | 50 | 116 | 195 | 3036 |
| 4 месеца 20 pg | 50 | 414 | 437 | 1548 |
| 18 месеца 20 pg | 124 | 5858 | 4785 | 7447 |
* три маймуни в група
Както е показано в таблица 2, конюгатът на полизахарида от Н.influenzae тип b показва висока имуногенност у Rhesus маймуни от различна възраст.
Пример 6. Конюгиране на полизахарид пнеумококов тип 19 F и протеин от външната мембрана на N.meningitidis
I. Получаване на тетра-н-бутиламониева сол на полизахарида пневмококов тип 19 F. 25-милиметрова облодънна колба, снабдена с магнитна бъркалка се зарежда с 50 mg полизахарид тип 19F (Мерк) и 5 ml вода и сместа се бърка 20 min.След това разтворът се пропуска през 3-милилитрова колона Dowex 50x8 (200-400 меша, тетраамониева форма), елуира се с вода и се събира в 25-милилитрова ерленмайерова колба.
Разтворът се изпитва за съдържание на полизахариди върху силикагелни плочки, напръскани с разтвор на CelV (SO4)/H2SO4, които след то- , ва се загряват върху гореща плоча, като се получава такова количество полизахарид, което може да бъде открито като черни петна. Разтворът, съдържащ полизахарид 19 F, се изсушава чрез замръзване и 52 mg се възстановяват.
II. Реакция на тетрабутиламониевата сол на пневмококовия тип 19 F с карбонилдиимидазол, последвано от реакция с 1,4-бутандиамин (19 FВиА2).
Етап А. Получаване на 1,4-бутандиаминов разтвор. Разтваря се 40 mg от 1,4-бутандиаминов дихидрохлорид в 1,0 ml вода и pH се довежда до 9,15 с 2,5 NaOH.
Етап Б. Активиране на 19 F полизахарид и реакция с 1,4-бутандиамин.
В 25-милилитрова облодънна колба, съдържаща 20 mg полизахарид 19
F в тетрабутиламониева форма се добавя магнитна бъркалка и 4 ml диметилсулфоксид (DMSO). Сместа се разбърква 20 min при стайна температура, след което сместа се разтваря. Добавя се 5 mg карбонилдиимидазол и реакционната смес се бърка 30 min при стайна температура. През това време 1,4-бутандиаминовият разтвор, получен в етап А се прехвърля в 25-милилитрова облодънна колба, снабдена с магнитна бъркалка и се бърка в ледена баня около 5 min. След 30 min се добавя разтвор на DMSO с пипета към студения разтвор на 1,4-бутандиамин. Разбъркването в ледена баня продължава 15 min, след което ледената баня се отстранява, но разбъркването продължава още 15 min при стайна температура.
Етап В. Диализа и лиофилизиране.
След осъществяването на описаните процеси разтворът се прехвърля в диализна епруветка на Spectropor 2 и се диализира при 4°С с бъркане. Разтворът се диализира срещу 4 1 0,01 М фосфатен буфер при pH 7,0 8 h, след това се диализира срещу 4 1 0,01М фосфатен буфер при pH 7,0 8 h. Накрая разтворът се диализира срещу 4 1 вода за 6 h. След това разтворът се лиофилизира и 19 mg от бутандиаминовото производно тип 19F полизахарид (19Р-ВиА2) се възстановява. Флуоресцентен анализ показва 100 nm NH2/mg вещество.
III. Реакция на 19 F-BuA2 с р-нитрофенилбромацетат
Етап А. Реакция с
IQF-BuAj. 15 mg от 19 F-BuA2, получен както е посочено в II по-горе, се суспендират в 2 ml буфер с pH
9,15 и 25-милилитрова облодънна колба, снабдена с бъркалка (магнитна) и се бърка 10 min, докато целият материал се разтвори. Към този разтвор се добавя 15 mg р-нитрофенилбромацетат, разтворен в 0,2 ml ацетонитрил. Сместа се бърка 24 h при 4°С и се прехвърля в диализна епруветка на Specropor 2. Диализира се двукратно срещу 4 1 вода. Пробата се изсушава чрез замръзване, като се получават 9 mg N-бромацетилирани производни на 19 F-BuA2.(19 F-BuA2BrAc)
Флуоросцентният анализ показва 57 nM NH2/mg, които водят до наличието на 43 пМ бромацетилни групи/ mg. —
IV. Конюгиране на 19F-BuA2-BrAc с протеин от външната мембрана на N.meningitidis (NMP) с вкарани функционални групи.
Етап А. Въвеждане на функционални групи в NMP с N-ацетилхомоцистеин тиолактон. 43 mg етилендиаминтетраоцетна киселина и 8 mg дитиотреитол се разтварят в 5 ml наситен боратен буфер, pH 11,30. 0,4 ml от посочения разтвор се прехвърля в 15-милилитрова центрофужна епруветка и се добавя 1 ml/13,7 mg разтвор на протеин от външната мембрана на N.meningitidis (NMP). Разтворът се дегазира и се поставя в азотна атмосфера при стайна температура 16 h. След това разтворът се разрежда до общ обем 2,5 ml чрез добавяне на 1,1 ml фосфатен буфер с pH 8,0. След това този разтвор се прилага към PDJ0 колона (Сефадекс G25M), която е предварително калибрирана под азот с фосфатен буфер с pH 8,0. Пробата се елуира с
3,5 ml фосфатен буфер с pH 8,0. Тиоловото съдържание се определя с анализ на Елман и възлиза на 1,89 μΜ/проба.
2,5 ml от пробата се прилагат към втора PD10 колона също предварително калибрирана ' с фосфатен буфер с pH 8,0. Елуира се с 3,5 ml фосфатен буфер с pH 8,0. Тиоловото съдържание по Елман е 0,44 μΜ/проба.
Етап Б. Конюгиране. В 15-милилитрова центрофужна епруветка от пирекс съдържаща протеиновия разтвор, се добавят 9 mg 19 F-BuA2-BrAc от етап III по-горе. Разтворът се оставя за стареене при стайна температура за 6 h. След това се прехвърля а диализна епруветка на Spectropor 2 и се диализира при 4°С срещу 4 1 вода 8 h и след това отново срещу 4 1 вода 8 h. Определено количество се изсушава чрез замразяване за аминокиселинен анализ.
Намерено е: лизин 0,141 μΜ/mg S СМНС. 0,0062 μΜ/mg, като с тази стойност, която е по-голяма от 0, се доказва ковалентност на връзката.
Етап В. Центрофугиране. Диализатът (приблизително 10 ml) се прехвърля с пипета в поликарбонатна центрофужна епруветка и се центрофугира при 4°С 2 h при 37,000 об/ min (100,000 g) в Бекманов Ti60 ротор. Супернатантите се отливат и утайките се прехвърлят в хомогенизатор с около 2 ml вода, където се хомогенизират и се връщат в една от центрофужните епруветки. Тя се допълва до 10 ml с Н2О и се центрофугира отново при 37,000 об/min (100,000 g) при 4°С 2 h. Втората супернатанта се отлива и утайката се хомогенизира в 8 ml вода. Хомогенизатът се съхранява в 15-милилитрова пластмасова центрофужна епруветка и се изпитва за имуногенност.
Таблица 6-1
| Реакция срещу серумно антитяло в ICR/На мишки, имунизирани с конюгат на полизахарид от пневмококов 19 F-протеин от външната мембрана от менингококов В серотип | ||
| Проба | Доза, mg порлизахарид | RIA Титър (GMT) ng/ml* |
| Ps 19F-Pro | ||
| конюгат | 0,5 | 17,338 |
* мишките са инжектирани интраперитониално на 0-вия, 7-ия, 28-ия ден. Кървене на 35-тия ден.
Както показва таблица 6-1, конюгатът е силно имуногенен.
Пример 7. Свързване на полизахарид от пневмококов 19 F и трикратно пречистен протеин от конопено семе (Едестин)
I. Получаване на тетра-п-бутиламониева сол на полизахарид от пневмококов 19 F тип
50-милилитрова облодънна колба с магнитна бъркалка се зарежда с 105 mg полизахарид тип 19 F (Merck) и 6 ml вода. Сместа се разбърква 20 min и разтворът се прокарва през 6 ml колона Dowex 50x8 (200-400 меша, тетра-п-бутиламониева форма). Колоната се елуира с вода и елуантът се събира в 50 ml Ерленмайерова колба, след което се подлага на анализ за съдържание на полизахарид върху силикагелни плочки, напръскани с разтвор на CelV (SO4)2/ H2SO4, които се загряват върху горещи пластинки. Съответното съдържание на полизахарид се открива като тъмни петна. Разтворът, съдържащ полизахарид 19 F, се изсушава чрез замразяване и 112 mg от тетра-п-бутиламониевата сол на 19 F се възстановява.
II. Взаимодействие на тетра-п-бутиламониевата сол на пневмококовия тип 19 F с карбонилдиимидазол, след ваночуг реакция с 1,4-бутандиамин. Етап А. Получаване на 1,4-бутандиаминовият разтвор.
175 mg от 1,4-бутандиаминов дихидрохлорид се разтварят в 7 ml во20 да и pH се довежда до 9,5 с 2,5N NaOH.
Етап Б. Активиране на полизахарида тип 19 F и реакция с 1,4-бутандиамин
В 50-милилитрова облодънна колба, съдържаща 112 mg полизахарид 19F в тетрабутиламониева форма се прибавя магнитна бъркалка и 5 ml диметилсулфоксид (DMSO). Сместа се разбърква при стайна температура 10 min, след което материалът е разтворен. 13 mg карбонилдиимидазол се добавя и реакцията продължава 35 min при разбъркване. През то35 ва време 1,4-бутандиаминовият разтвор, получен в етап А по-горе, се прехвърля в 50 ml колба с магнитна бъркалка и се поставя в ледена баня, като се разбърква около 5 Min. След
35 min разбъркване DMSO разтворът се добавя с пипета към студения разтвор на 1,4-бутандиаминов разтвор. Разбъркването продължава 15 min, през което време ледената баня се отстранява и се връща допълнително за 15 min с разтвор при стайна температура.
Етап В. Диализа и лиофилизиране
Разтворът се диализира в диализна епруветка на Spectropor 2 при 4°С. Първоначално разтворът се диализира срещу 4 1 0,01 М фосфатен буфер при pH 7,0 за 8 h, след това се диализира срещу 4 I 0,01М фосфатен буфер при pH 7,0 за 8 h. Накрая разтворът се диализира срещу 4 1 вода за 4 h. След това разтворът се лиофилизира и 80 mg бутандиаминовото производно на полизахарид тип 19 F (19F-BuA2) се възстановява. Флуоресцентната проба показва 77 NH2/mg. -
III. Реакция на 19F ВиА2 с р-нитрофенилбромацетат
Етап А. Реакция на 19F ВиА2 mg 19F BuA2, получен в раздел II, се разтваря в 4 ml буфер с pH
9,15 в 25 милилитрова облодънна колба с магнитна бъркалка и се бърка 10 min, докато целият материал се разтвори. Към този разтвор се добавя 50 mg р-нитрофенилбромацетат, разтворен в 0,5 ml ацетонитрил. Сместа се бърка при 4°С 24 h и след това се прехвърля в диализна епруветка на Spectropor 2. Диализира се двукратво срещу 4 1 вода. След това пробата се лиофилизира и се получава 44 mg от N-бромацетилово производно на 19F BuA2 (19F BuA2ВгАс). Флуоресцентрана проба показва 7,5 nm NH2/mg, които водят до наличието на 69,5 nm бромацетилова rpyna/mg.
IV. Конюгиране на 19 F-BuA2ВгАс с функционализиран и пречистен глобулин от конопено семе (едестин).
Етап А. Пречистване на едестин чрез високоефективна течна хроматография (HPIC)
240 mg от двукратно кристализиран едестин от конопено семе (Сиг ма) се разтварят в 4 ml ЗМ гуанидин с pH 7,0. Пробата се разклаща интензивно и се добавя 0.1 ml меркаптоетанол. По време на разклащането се образува голямо количество пяна.
Пробата се оставя при стайна температура 1 h и се центрофугира за отстраняване на пяната, филтрува се през Милекс-GV 0,22 микронов филтър (Millipore). Половината от пробата (2 ml, 120 mg) се инжектира върху колона TSK 3000 - молекулно сито със следните параметри: скорост на протока: 1 ml/min; λ max: 280 nm; разтворител: ЗВ гуанидин; УВ обхват: 2,0; скорост: 0,25 cm/min.
Съответните фракции така, както са определени чрез У В анализ, се събират и диализират на Spectropor 2 срещу 30 I вода 16 h. Заместването на ЗМ гуанидин с вода по време на диализирането причинява утаяване на пречистения едестин.
Цялата проба се прехвърля от диализатора в центрофужна епруветка и се центрофугира 5 min. Утайката, която съдържа пречистения едестин, се събира и изсушава под вакуум в присъствие на Р2О5. Останалата половина от изходната проба (2 ml. 120mg) след това се инжектира и преминава през идентични етапи. Изолира ~с е 110 mg пречистен едестин. Пречистеният едестин след това се разтваря в 2,0 ml ЗМ гуанидин, центрофугира се, филтрува се и се хроматографира още два пъти допълнително, като се прилага горната процедура. След три пречиствания, се изолират общо 18 mg, което представлява единичен пик в аналитичната В TSK 3000 колона.
Етап Б. Въвеждане на функционални групи в тройно пречистения едестин.
mg етилендиаминтетраоцетна киселина и 5 И меркаптоетанол се поставят в 1 ml ЗМ гуанидин. Към този разтвор се добавя 14 mg трикратно пречистен едестин, получен съгласно етап А по-горе. pH на разтвора се довежда до 9,5 с 20 ml 2,5 М NaOH и разтворът се дегазира и поставя под атмосфера на N2.13 mg N-ацетилхомоцистеин тиолактон се добавя в азотна камера и полученият разтвор се оставя да старее в азотна атмосфера при стайна температура 16 h.
След това разтворът се разрежда до краен обем 2,5 ml чрез добавяне на 1,4 ml ЗМ гуанидин и се прилага към PD10 колона (Sephadex G 25 М Pharmacia), която се калибрира предварително в присъствието на N2 с ЗМ гуанидин. Пробата се елуира с 3,5 ml ЗМ гуанидин. Тиоловото съдържание се определя чрез проба на Елман и се установява, че е приблизително 4,38 μΜ/проба. 2.5 ml от пробата се прилагат към втора колона PD10, предварително калибрирана с ЗМ гуанидин и след това се елуира с 3,5 ml ЗМ гуанидин. Тиоловото съдържание, определено по Елман е 3,24 μΜ/ проба.
Етап В. Конюгиране.
В центрофужна епруветка, съдържаща едестинов разтвор, се добавя 7 mg бромацетилиран полизахарид 19 F тип (19F-BuA2-BrAc ) раздел III. Този разтвор се оставя да старее в азотна камера при стайна температура 6 h. След това той се прехвърля в диализна епруветка на Spectropor 2 и се диализира друкратно, всеки път срещу 4 1 вода 8 h. Цялата проба се изсушава чрез замразяване и малка част от нея се изпраща за аминокиселинен анализ.
Намерено: лизинг 0,105 μΜ/πίβΛ СМНС, 0,003 μΜ/mg, доказвайки ковалентността на връзката между модифицираните полизахариди и про теините.
Пример 8. Получаване на конюгат на Streptococcus agaloctiae (STREP В-ТУРЕ III) полизахарид и протеин от N.meningitidis в серотип от външната мембрана
I. Получаване на тетра-н-бутиламониева сол от Етап Б (III).
100 mg от полизахарида, получен в етап Б III, (получен съгласно метода описан в US патент № 4,413057) се разтварят в 4 ml вода и се пропуска през 7-милилитрова колона от Dowex 50x8 (200-400 меша),.катионообменна смола, тетрабутиламониева форма. Колоната се елуира с вода и фракциите (3 ml) се проверяват за органични вещества чрез CelV (SO4)2/H2SO4 - метод. Съответните фракции се лиофилизират и се получават 100 mg тетрабутиламониевата сол на полизахарид Strep В (III).
II. Получаване на полизахаридбутандиаминов дадукт Strep В /III/ВиА2) mg от тетрабутиламониевата сол на Strep В (III) се разтварят в
2,5 ml сух диметилформамид и се бърка 10 min до пълно разтваряне. 5 mg 1,1-карбонилдиимидазол се добавя наведнъж и разтворът се оставя при стайна температура 35 min. Този разтвор след това се добавя към 3 ml разтвор, съдържащ 80 mg 1,4-бутандиамин 2НС1, чиято pH стойност е доведена зо 10,3 с 2,5 N NaOH и който е охладен в ледена баня. Получената смес се оставя в ледена баня 15 min след това 15 min при стайна температура.
След това сместа се диализира срещу 4 1 0,1 М фосфатен буфер (pH
7) три пъти, съответно в продължение на 5 h , 17 h и 7 h. Последната диализа срещу 4 1 вода за 18 h се последва от лиофилизиране, което води до получаване на 32 g бутандиаминов продукт от Етап Б (III), а именно Strep В (III)-BuA,. Флуоресцентната проба показва 212 nM NH2/mg.
III. Получаване на полизахаридбутандиамин бромацетамид (Strep В /Ш/-ВиА2-ВгАс)
26,8 mg (Strep В /1П/-ВиА2) се разтварят в 2,5 ml боратен буфер с pH 9 и към разтвора се добавят 28 mg р-нитрофенил бромацетат в 0,4 ml ацетонитрил. Сместа се разбърква при 4°С 23,5 h и след ТОва се диализира при 4°С срещу 30 1 вода 17 h и след това срещу 4 1 вода 6 h. След лиофилизиране се получават 27 mg τ продукта. Флуоресцентната проба показва 35 пМ NH2/mg, което води до 177 μΜ/mg бромацетил като разлика. Нефелометричната проба показва пълна антигенност.
IV. Конюгат на (Strep В /III/ВиА2~ВгАс и мембранен протеин от типа N.meningitidis (NMP) с функционални групи
А. Въвеждане на функционални групи в NMP: 10 ml от разтвора на NMP (5 mg/ml) се зареждат в поликарбонатна епруветка при 43,000 об/ min. 2 h при 4°С в Бекманов Ti ротор. Супернатантата се отстранява и утайката се суспендира повторно в 4 ml боратен буфер с pH 11,3. съдържащ 33,6 mg динатриева солна етилдиаминтетраоцетна киселина, 6,4 mg дитиотреитол. Повторно суспендиране се осъществява с хомогенизатор на Доунс . Сместа се прехвърля в центрофужна епруветка, покрива се със серумна тапа, дегазира се, азотира се и към нея се добавя 55 mg N-ацетилхомоцистеин тиолактон. Получената смес се оставя за стареене в азотна атмосфера 18 h при стайна температура. След това pH се довежда до 7,25 с 2,6 ml 1М КН2РО4 и 2,6 ml 0,1 М фосфатен буфер, смес та се прехвърля в центрофужна епруветка (под азот). Центрофугира се, както по-горе, (43000 об/min. 2 h, 4UC, Ti 75 ротор). След отстраняване на супернатантата, утайката се суспендира отново в 10 ml, pH 8,0, 0,1М фосфатен буфер (с хомогенизатор на Доунс). Повторното центрофугиране на тази суспензия, последвано от повторно суспендиране на утайката в 4 ml буфер с pH 8,0, води до разтвор, чийто тиолов титър показва общо 5,6 μΜ SH. Контролната проба показъа, че това се дължи единЬтвено на протеин и на малки молекули като хидролизиран тиолактон.
Б. Конюгиране и пречистване. Към 4-те ml повторно суспендирана утайка се добавят 24 ml (под азот) от (Strep В /III/-BuA2-BRAc и сместа се оставя да старее 18,75 h на стайна температура. Сместа се прехвърля в 10-милилитрова поликарбонатна центрофужна епруветка и се покрива с вода. След центрофугиране утайката се ресуспендира в 10 ml вода и се центрофугира отново. Крайната утайка се ресуспендира в 15 ml вода, както по-горе, и суспензията има протеиново съдържание, 2,7 mg/ml и полизахаридно съдържание 0,263 mg/ml.
Съотношението между S СМНС/ лизин е 0,044.
Пример 9. Получаване на Е.colli К1 капсулиран полизахарид
Инокулиране и развитие на зародиша
Лиофилизирана проба от Е.colli К1, (получена от Dr. John Robbins, BOB) се стапя и разрежда с приблизително 1 ml от Trypticase-hysoy глюкоза (THG) среда. Един Tryptocase-soy наклонен arap се посява на штрих 1 ден преди ферментацията и се инкубира за една нощ при 37°С, през което време развилата се култура се отстранява и се суспендира в 1 1 THG среда. THG средата се получава чрез автоклавиране на 9,5 1 от разтвор А при 121 °C 90 min, охлажда се и към нея се добавят 500 ml от разтвор В. който се автоклави5 ра отделно при 121 °C 30 min.
Разтвор А
а. Trypticase-soy бульон300 g
б. Hysoy (Sheffield)100 g
в. Фенол ред 90mg
г. UCON LB-625-антипенител (Union Carbide)10 ml
д. Дестилирана вода, достатъчна, за да се получи разтвор9,5 1
Разтвор В
а. Декстроза (анхидр.)50 g
б. Дестилирана вода, достатъчно, за да се получи разтвор 500 ml
Ферментация
Един литър от хранителната среда THG, която е инокулирана с агарова изходна култура, се култивира в 2-литрова Ерленмайерова колба при 37°С с разбъркване при 200 об/ min 6 h, когато се наблюдава прорастване на клетките. Този един литър след това се посява (инокулира) в 10 1 THG среда в 14-литров ферментатор, в който притокът на въздух е 2 Ι/min и разбъркването е 200 об/min, pH се довежда до 6,8-7,4 д 10% NaOH за 6 h, когато се наблюдават две еднакви стойности за ОП (оптична плътност).
Събиране и избистряне
Крайната ферментационна култура от описаните примери се добавя към 22-литрова пластмасова бутилка, съдържаща хексадецилтриметиламониев бромид (крайна концентрация 0,3% тегл/об). Бутилката престоява 4 h при 4°С, през което време полизахаридът, утаен с хексадецилтриметиламониев бромид, се оставя да се утаи, пробата се изпитва за инактивиране и се центрофугира в лабораторна центрофуга на Sharpies при приблизително 30000 об/min 20 min, след което супернатантата се отстранява. Клетъчната утайка (приб20 лизително 66 g) се запазва за целите на изолирането.
Суспендиране и екстракция
Три утайки от три ферментации се суспендират поотделно в 400 ml 25 1,0 м СаС12 и тези суспензии се екстрахират в Omni-миксер, потопен н ледено студена водна баня 30 min на позиция 2 и се събират.
Утаяване с 25% етанол за отст30 раняване на онечистванията
373 ml абсолютен етанол се добавя на капки (до 25% етанолна концентрация), при разбъркване, към 1130 ml суспензия на СаС12 от пре35 дишния етап и сместа се оставя една нощ при 4°С. Получената утайка се отстранява чрез центрофугиране в Бекманова J-21, В центрофуга при · 11,000 xG 30 min при 4°С и се изх40 върля.
Утаяване със 75% етанол за събиране на суровия полизахарид
2560 ml абсолютен етанол се добавя на капки (до крайна концент45 рация 75%) чрез разбъркване към 1280 ml бистра супернатантна течност от предходния етап на утаяване и сместа се оставя една нощ при 4°С, за да се осигури пълно утаяване на суровия полизахарид.
Регенериране на суровия полизахарид
Неразтворимият полизахарид се регенерира чрез центрофугиране с центрофуга на Бекман-21 В при 11000 xG 30 min при 4°С и се промива еднократно с около 200 ml абсолютен етанол и веднъж с около 200 ml ацетон, като промивните течности се изхвърлят, неразтворимият продукт се изсушава във вакуумпри 4°С над безводен СаС12 (добив 4,6 g).
Фенолна екстракция и диализа
4.6 g от суровия полизахарид се суспендира в 400 ml 0,488 М натриев ацетат, pH 6,9, при 11,5 mg/ml чрез хомогенизатор на Daunce и този разтвор се екстрахира трикратно с по 200 ml воден разтвор на фенол, получен чрез добавяне на 180 ml 0,488 М натриев ацетат, pH 6,9 в половинлитрова бутилка на Mallincrodt. Всеки фенолен разтвор след това се центрофугира при 11000 xG 30 min, при 4°С за разрушаване на емулсията, и водните фази се аспирират, обединяват се и се екстрахират като фенолните фази се отстраняват.
Обединените водни фази се диализират при 4°С 24 h, чрез изменение на дестилираната вода, така че крайното диализно число е по-голямо от 1:100,000.
Утаяване със 75% етанол за събиране на полизахарида
7.6 ml от 2М СаС12 се добавят към 305 ml от диализата от предходния етап до крайна концентрация 0,05 М СаС12 и 938 ml абсолютен етанол се добавя на капки (до концентрация 75%-ен етанол). След престояване една нощ при 4°С получената утайка се събира чрез центрофугиране на Бекманова центрофуга 30 min при
11000 xG и 4°С, след това се промива еднократно с около 200 ml абсолютен етанол, еднократно с около 200 ml ацетон и се изсушава под вакуум над безводен СаС12 при 4°С (добив 1,7 g).
Ултрацентрофугиране
1,7 g полизахарид се суспендира повторно в 170 ml 0,05 М СаС12, добавя се 18,9 ml абсолютен етанол на капки при разбъркване и разтворът се центрофугира при 100,000 xG при 4°С 2 h.
Събиране на продукта
Получената бистра супернатанта се отделя чрез отдекантиране и 468 ml етанол се добавя на капки (до концентрация 75% етанол) при разбъркване, за да се утаи полизахаридът. Сместа се оставя една нощ, за да се осъществи пълно утаяване, и продуктът се събира чрез центрофугиране при 11000 xG 30 min при 4°С, промива се еднократно с 200 ml абсолютен етанол, веднъж с 200 ml ацетон и се изсушава под вакуум над безводен СаС12 при 4°С (добив 1,46 g).
Ултрацентрофугиране 1,46 g от полизахарида се суспендира повторно в 150 ml 0,05 М СаС12, 50 mi абсолютен етанол се добавя . на капки (до 25% концентрация) и разтворът се ултрацентрофугира при 100,000 xG при 4°С 2 h.
Събиране на крайния продукт
Получените 190 ml бистра супернатанта се отстраняват; от утайката чрез декантиране и се добавя 190 ml етанол на капки (до концентрация 50%) при разбъркване. Сместа се оставя два дни при 4°С до пълно утаяване и крайният продукт се събира чрез центрофугиране на центрофуга на Бекман J-21 В при 11000 xG 30 min при 4°С. Накрая продуктът се промива еднократно с около 200 ml етанол, веднъж с около 200 ml аце тон и се изсушава под вакуум над безводен СаС12 при 4°С (добив 1,2 g).
Пример 10. Получаване на конюгат между Е.Colli К1 капсулиран полизахарид и протеин от външната мембрана на N.meningitidis серотип В
I. Получаване на тетра-п-бутиламониева сол на Е.colli К1 полизахарид
103 mg полизахарид от Е.colli К1, получен по метода от пример 9, се разтваря в 2 ml вода и разтворът се пропуска през 4 ml колона на Dowex 50x8 (200-400 меша, тетра-п-бутиламониева форма). Колоната се елуира с вода и фракциите (3 ml) се изпитват за органични вещества с Се/ 1V/SO4/H2SO4 метода. Подходящите фракции се лиофилизират и продуктът се изсушава в десикатор над Р2О5, като се получават 134 mg тетрабутиламониева сол.
II Получаване на полизахаридбутандиаминов аддукт (Е.colli К1 ВиА2)
134 mg от солта, получена в раздел I, се разтварят в 3 ml сух диметилформамид и се разбърква 12 min
12,7 mg 1,1-карбонилдиимидазол след това се добавя наведнъж и[ разтворът се разбърква 30 min. След това този разтвор се добавя към 6 ml охладен с лед воден разтвор, съдържащ 145 mg 1,4 бутандиамин 2НС1, чието pH се довежда до 10,35 с 2,5 N NaOH. Този разтвор се разбърква 15 min в ледена баня и 20 min на стайна температура. След това се диализира трикратно срещу 4 1 0,1 М фосфатен буфер (pH 7) 5,5 h, 16 h и 3,75 h. Последната диализа срещу 4 1 Н2О протича за 4,5 h. След лиофилизацията се получава 73 mg Е.colli KI - ВиА2. Флуоресцентната проба сочи 180 пМ NH2/mg.
III Получаване на полизахаридбутан диаминобромацетамид (Е.colli Ki - BuA2-BrAc) mg Е.colli К1 - ВиА2 се разтваря в 6,7 ml боратен буфер с pH 9 и се прибавя 70 mg р-нитрофенилбромацетат в 1,5 ml ацетонитрил. Сместа се оставя 19 h при 4°С и след това се диализира срещу 32 I Н2О и срещу 4 1 вода в продължение на 8 h и на 13 h, респективно. Разтворът се лиофилизира до 74 mg от Е.colli К1 BuA2-BrAc. Флуоресцентната проба проказва 50 пМ NH2/mg, които водят до разлика от 20 пМ бромацетил/mg.
IV Конюгиране- на Е.colli К1 BuA2-BrAc с мембранен протеин на N.meningitidis с въведени функционални групи (NMP).
Получаването на NMP с функционални групи е същото, както в пример 8, раздел IV-A. Към центрофужна епруветка, съдържаща 4 ml тиолиран NMP протеин (9 μΜ SH чрез проба на Елман), се добавя 25 mg Е.colli KI - BuA2-BrAc (120 пт бромацетил/mg). Епруветката се покрива със серум, дегазира се, обработва се с азот и се оставя за стареене 18,5 h. Слбед това се разрежда с 6 ml буфер с pH 8 и се центрофугира 2 h при 43000 об/min при 4°С в Ti 75 ротор. Супернатантата се отстранява и утайката се суспендира повторно в 10 ml буфер с pH 8 с хомогенизатор на Dounce и след това се центрофугира отново, както по-горе. Утайката от второто центрофугиране се суспендира в 10 ml вода, центрофугира се, както по-горе, за трети път. Утайката след това се суспендира отново в 20 ml вода.
Анализът на конюгата показва следното.
Съдържание на полизахарид
336 pg/ml
S СМНС/лизин е 0,015.
Съдържание на протеин 1000 pg/ml
Ps/протеин съотношение
0,34
Claims (28)
- ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ1. Стабилни, ковалентно-свързани полизахарид-протеинови конюгати, включващи полианионни бактериални полизахариди с киселинни групи и имуногенни протеини, свързани чрез хибридно построени молекули, съдържащи тиоетерни връзки, които могат 10 да бъдат представени с формулата АE-S-B, в която Е означава a R означава Н илиII IО R II I или—ССН- С N/CH7 Y/CH,/ NH 1 m 2 η като m има стойност 0 до 4, η 0 до 3, 25 СН2, тогава m и η не са равни на нуW е 0 или ΝΗ и Υ е СН2, О, S, NR', ла, а когато Υ е 0 или S, тогава m е или СНСО2Н, като R' е Н или С,- 2,3 или 4 и η е 2 или 3 и В е или С2-алкил, така че когато Υ еΖ I- (CH2)pCH(CH2)qD като р има стойност 1 до 3, q е 0 до 2, Z е NH2,NHCR'II оСО2Н или Н, и D еО Н О ОII I II IIС, NR’,N-C/CH,/2C, като R' има значенията, определени по-горе. 45
- 2. Стабилни, ковалентно-свърза ти съгласно претенция 1, в които хибридно построените молекули имат следната формула ни полизахарид-протеинови конюга39OH O NHCOCH,II I II I cnch2ch2ch2ch2nhcch2sch2 ch2chco
- 3. Полизахарид-протеинови конюгати съгласно претенция 1, в които бактериалният капсулиран полизахарид, с киселинни групи е избран от групата полизахариди Haemophilus influenzae тип b полизахарид, и Streprococcus pneumoniae тип 6В, 19F и 23 F полизахариди.3. Полизахарид-протеинови коню гати съгласно претенция 1, в които имуногенният протеин е протеин от менингококов В серотип от външната мембрана или едестинов протеин.5. Стабилен, ковалентно-свързан 10 полизахарид-протеинов конюгат, състоящ се от Haemophilus influenzae тип b полизахарид, свързан чрез структура с формулаОН НО NHCOCHII I I HI I cnch2ch2ch2ch2n cch sch ch chco c протеин от менингококов В серотип от външната мембрана.6. Полизахарид-протеинови конюгати съгласно претенция 1, в които бактериалният капсулиран полизахарид, съдържащ киселинни групи, е полизахарид от пневмококов тип 6В, имуногенният протеин е от менинго20 коков В серотип от външната мембрана и хибридно построената молекула може да бъде представена е формулатаOH О NHCOCHII I II ICNCH СН СН СН NHCCH SCH сн снсо7. Полизахарид-протеинови конюгати съгласно претенция 1, в които бактериалният капсулиран полизахарид, имащ киселинни групи, е от пневмококов тип 19 F полизахарид, имуногенният протеин е от менингококов В серотип от външната мемб30 рана и хибридно построената молекула може да бъде представена с формулатаОНО NHCOCH,II I cnch2ch2ch2ch2nhcch2sch2 сн2снсо8. Полизахарид-протеинови конюгати съгласно претенция 1, в които бактериалният капсулиран полизахарид, имащ киселинни групи, е от пневмококов тип 23 F, имуногенни- ят протеин е от менингококов В серотип от външната мембрана и хибридно построената молекула може да 40 бъде представена с формулатаOH О NHCOCH,II I \\ ICNCH2CH2CH2CH2NHCCH2SCH2 сн2снсо9. Състав, съдържащ имунологично активно количество, както за активна, така и за пасивна защита на бозайници от бактериемия, причинена от определени организми, от стабилни, ковалентно свързани полизахарид-протеинови конюгати съгласно претенция 1, антисерум, получен от тези конюгати, или гама глобулин, или други фракции на този антисерум, съдържащи антитяло и подхо- дящ за фармацевтични цели носител.10. Състав съгласно претенция 9, съдържащ и спомагателна добавка.5 11. Състав съгласно претенция 9 или 10, в който полизахарид-протеиновите конюгати съдържат един или повече членове от групата, състояща се от полизахарид от Haemophilus influenzae тип b, свързан чрез хиб10 ридно построена молекула с формулатаOH О NHCOCH,II I II ICNCH СН СН СН NHCCH SCH СН2СНСО с протеин от менингококов В серотип от външната мембрана; пневмококов полизахарид от типа 6В, свърОН |1 I cnch2ch2ch2 с менингококов протеин от серотипВ от външната мембрана, пневмоко- 25 ков тип 19 F полизахарид, свързанОН II I cnch2ch2ch2 с протеин от менингококов В серотип от външната мембрана и пневмококов тип 23 F полизахарид, свърОНII ICNCH СН СН зан чрез хибридно построена молекула с формулаО NHCOCHII I :h2nhcch2sch2 сн2снсо чрез хибридно построена молекула с формулаО NHCOCHII I :h2nhcch2sch2 сн2снсо зан чрез хибридно построена молекула с формулаО NHCOCH,II I 2nhcch sch2 сн2снсо с протеин от менингококов В серотип от външната мембрана.12. Състав съгласно претенция 11, в който имунологично-ефективното количество е количество от всеки от конюгатите в състава, така че всеки конюгат съдържа от 2-50 mg от полизахарида в конюгирана форма.13. Състав съгласно претенция 9, предназначен за активна и пасивна защита на хора.14. Състав съгласно претенция 12, в който имунологично-ефективно количество е количество от всеки конюгат в състава, така че всеки конюгат да съдържа 25 mg от полизахарида в конюгирана форма за ко45 нюгати от пневмококови полизахариди и 10 мкг от полизахарида в конюгирана форма за конюгатите на полизахариди от Haemophilus influenzae тип b.15. Метод за лечение на бозайници срещу бактериемия, причинена от сродни организми, който включва прилагане към споменатите бозайници на имунологично-ефективно количество от състав, включващ един или повече типа полизахарид-протеинови конюгати, съдържащи бактериални капсуловани полизахариди, имащи кис'елин5 ни групи, свързани чрез хибридно построени молекули с тиоетерна връзка, с имуногенни протеини, както и фармацевтично приемлив носител, или аджувант, или и двата.16. Метод за лечение на бозайници съгласно претенция 15, при който полизахарид-протеиновите конюгати включват един или повече чле нове на групата, състояща се от Haemophilus influenzae тип b полиза15 харид, свързан чрез хибридно построена молекула с формулаОН О NHCOCHII I II ICNCH СН СН СН NHCCH SCH сн снсо с протеин менингококов тип В от вън- полизахарид, свързан чрез хибридно шна мембрана, пневмококов тип 6В построена молекула с формулаОН О NHCOCH,II I II ICNCH СН СН СН NHCCH SCH сн снсо с протеин от менингококов серотип В от външна мембрана, полизахарид от пневмококов тип 19 F, свър зан чрез хибридно построена молеку ла с формулаОН О NHCOCH,II I II ICNCH СН СН СН NHCCH SCH СН снсо с протеин от менингококов серотип зан чрез хибридно построена молекуВ от външна мембрана, и полиза- 35 ла с формула харид от пневмококов тип 23 F, свърОН О NHCOCH.II I II ICNCH СН СН СН NHCCHSCH СН снсо с протеин от менингококов серотип В от външна мембрана.17. Метод за лечение на бозайници съгласно претенция 15, при който обекти на лечение са бебета и деца и ефективното количество от състава в единична доза е количество, съответстващо на 25 pg полизахарид в конюгирана форма за конюгати на пневмококови полизахариди и 10 pg от полизахарид в конюгирана форма 45 за конюгати на полизахарид отHaemophilus influenzae тип b и протеин.18. Метод за лечение на бозайници съгласно претенция 17, при който се добавят един или два реимунизационни състава към количеството полизахарид-протеинов конюгат, съдържащ Haemophilus influenzae тип b полизахарид, свързан чрез хибридно построена молекула с формулаОН О NHCOCHII I II ICNCH CH CH CH NHCCH SCH сн CHCO с протеин от менингококов тип В от външна мембрана, съответстващ на 10 pg полизахарид в конюгирана форма, като се прилага за лечение на бебета и деца.19. Полизахарид-протеинови конюгати съгласно претенция 1, в кои-ОН II I20. Полизахарид-протеинови конюгати съгласно претенция 1, в който бактериалният капсулован полизахарид, имащ киселинни групи, е Esherichia coli К1 полизахарид, иму то капсулованият бактериален полизахарид, имащ киселинни групи, е група В стрептококов тип la, 1в, If или III полизахарид, имуногенният протеин е от менингококов В серотип от външна мембрана и хибридно построената молекула е формулаО NHCOCHII I cnch2ch2ch2ch NHCCH SCH2 CH2CHCO ногенният протеин е от менингококов серотип В от външна мембрана и хибридно построената молекула е с формулаOH O NHCOCHII I II ICNCH CH CH CH NHCCH SCH CH2CHCOЛИТЕРАТУРА1. Schneerson et al., Haemophilus influenzae Type b Polysaccharide-Protein Conjugates; Model for a New Generation of Capsular Polysaccharide Vaccines, New Dev. with Hum. amd Vet. Vaccines, 77-94 (1980).2. J.Exptl. Med., 152, 361 (1980)3. Infection and Immunity, 39, 233 (1983)
- 4. J.Exptl. Medicine, 50, 521-531 (1929)
- 5. Infection and Immunity, 40, 245 (1983)
- 6. Immunology, 46, 333 (1982)
- 7. Immunology, 29, 87 (1975)
- 8. J. Immunolog. Methods, 25, 323 (1979)
- 9. Infection and Immunity, 36, 971 (1982) 20
- 10. J. Biol. Chem., 236, 2845-2849 (1961)
- 11. J. Biol. Chem., 203, 695-704 (1953)
- 12. Infection and Immunity, 26, N3, 251 116-1122 (Dec. 1979)
- 13. Reviews of Infections Diseases, 3, N2, 323-331 (1981)5
- 14. Adv. Carbohydr. Chem. andBiochem. 33, 295-321
- 15. Actapath. Microbiol. Scand. Sect. C, 89, 69-78 (1981)
- 16. J. Bact., 127, 973-981 (1976)
- 17. J. Amer. Chem. Soc., 104, 289810 (1982)
- 18. Z. Physiol. Chem., 349, 251 (1968)
- 19. Helv. Chim. Acta, 58, 531 (1975)15
- 20. Ber. 67, 1204 (1934)
- 21. Biochem. et Biophys. Acta, 670, 300 (1981)
- 22. J. Biol. Chem., 193, 265 (1951)
- 23. Biochem. Z., 310, 384 (1942)
- 24. Mickorchim, Acta, 2, 13 (1937)
- 25. Anal. Chem., 28, 1756 (1956)
- 26. Anal. Chem., 25, 1656 (1953)
- 27. Biochem. Biophys. Acta, 24, 604 (1957)
- 28. Nature, 227, 680 (1970)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/719,678 US4695624A (en) | 1984-05-10 | 1985-04-04 | Covalently-modified polyanionic bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers, and methods of preparing such polysaccharides and conjugates and of confirming covalency |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG60630B2 true BG60630B2 (bg) | 1995-10-31 |
Family
ID=24890945
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG096111A BG60630B2 (bg) | 1985-04-04 | 1992-03-19 | Ковалентно модифицирани полианионни бактериални полизахариди,техни стабилни ковалентни конюгати с имуногенни протеини свързани с хибридни молекули, |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| BG (1) | BG60630B2 (bg) |
| LV (1) | LV5807B4 (bg) |
| MX (1) | MX9203156A (bg) |
-
1992
- 1992-03-19 BG BG096111A patent/BG60630B2/bg unknown
- 1992-06-23 MX MX9203156A patent/MX9203156A/es unknown
-
1996
- 1996-07-22 LV LV960293A patent/LV5807B4/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| LV5807B4 (lv) | 1997-08-20 |
| MX9203156A (es) | 1992-07-01 |
| LV5807A4 (lv) | 1997-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK171137B1 (da) | Kovalent modificering af et polyanionisk polysaccharid | |
| US4882317A (en) | Covalently-modified bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins with bigeneric spacers and methods of preparing such polysaccharides and conjugataes and of confirming covalency | |
| US4830852A (en) | Covalently-modified neutral bacterial polysaccharides, stable covalent conjugates of such polysaccharides and immunogenic proteins and methods of preparing such polysaccharides and conjugates | |
| US5371197A (en) | Protein-dimeric polysaccharide conjugate vaccine | |
| RU2645071C2 (ru) | Способы гликоконъюгирования и композиции | |
| KR100243958B1 (ko) | 뉴모코커스 다당류 결합체 백신 및 이의 제조방법 | |
| TW201808328A (zh) | 多價肺炎球菌多醣-蛋白質共軛物組成物(二) | |
| AU2010219288A1 (en) | Multivalent meningococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine | |
| JPH01500036A (ja) | 免疫原性複合体 | |
| JPH05148157A (ja) | 肺炎連鎖球菌からの多糖抗原 | |
| JPH11507964A (ja) | ２，５−アンヒドロ−ｄ−マンノース末端構造を持つ、抗原性グループｂ連鎖球菌▲ｉｉ▼型および▲ｉｉｉ▼型多糖断片とその複合ワクチン | |
| Lee | Bacterial capsular polysaccharides: immunogenicity and vaccines | |
| BG60630B2 (bg) | Ковалентно модифицирани полианионни бактериални полизахариди,техни стабилни ковалентни конюгати с имуногенни протеини свързани с хибридни молекули, | |
| CN115671274B (zh) | 一种载体蛋白与多糖共价键连接成结合物的方法及应用 | |
| RU2818894C1 (ru) | Свободные от примеси с-полисахарида капсульные полисахариды streptococcus pneumoniae с остатком 2,5-ангидроманнозы на восстанавливающем конце | |
| AU2014201676B2 (en) | Multivalent meningococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine | |
| JPH0656690A (ja) | 免疫キャリア及び増強性質を有するネイセリア・メニンギチジスの外膜のクラスｉｉタンパク質 | |
| CA2047030A1 (en) | Class ii protein of the outer membrane of neisseria meningitidis having immunologic carrier and enhancement properties |