DK171137B1 - Kovalent modificering af et polyanionisk polysaccharid - Google Patents

Description

DK 171137 Bl

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et polyanionisk polysaccharid.

Dansk patentansøgning nr. 2055/85 angår kovalent modificerede bakterielle polysaccharider og immunogene protei-5 ner samt kovalente konjugater af sådanne polysaccharider sammenknyttet med en bigenerisk spacer (et afstandsstykke), som tillader bevis for kovalent og 1 ettere grænsning og koncentrering af biologisk ønskelige enheder, med immunogen bakteriel membran eller andre proteiner, hvilke kon-10 jugater er nyttige komponenter af bakterielle vacciner.

Den foreliggende ansøgning angår en fremgangsmåde til fremstilling af blandt andet sådanne polysaccharider.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

15 Rensede kapsulære polysaccharider af bakterier er blevet anvendt til at fremstille vacciner mod de beslægtede bakterier, men de resulterende immunrespons har ofte været mindre tilfredsstillende end ønskeligt, specielt i meget små børn eller individer med uudviklet eller 20 mangelfulde immunologiske systemer. Haemophilus influenzae type b kapsulært polysaccharid kan f.eks. ikke provokere et immunrespons i børn, hvilket gør dette polysaccharid ueffektivt i sig selv til tilvejebringelse af beskyttelse mod de alvorlige pædiatriske medicinske problemer, der 25 forårsages af H. influenzae type b bakterier. Forbedring af immunogeniciteten af disse polysaccharider kan ofte opnås ved at kombinere dem med proteiner. Se f.eks.

Schneerson et al., "Haemophilus Influenzae Type b Polysaccharide-Protein Conjugates : Model for a New Genera-30 tion of Capsular Polysaccharide Vaccines, "New Dev.

with Hum. & vet. Vaccines, 77-94 (1980); Schneerson, et a 1., J. Exptl. Med., 15 2, 361 (19808 og Anderson,

Infection and Immunity, 233 ( 1983 ).

» DK 171137 B1 2

Der må imidlertid udvises omhu ved valget af det protein, som skal kombineres med disse polysaccharider.

Uisse proteiner (f.eks. pertussionogen) er ikke-speci-fikke stimulatorer for immunsys ternet i børn. Disse protei-5 ner kan til en vis grad forøge immunresponset for poly- saccharidantigener, men uheldigvis fører sådan ikke-spe-cifik aktivering til uønskede biologiske virkninger (nemlig reaktogenicitet) . De meget foretrukne specifik forbedrede immunrespons mod disse polysaccharidantigener 10 kan opnås i børn ved "konjugering" af disse polysaccha rider til de passende proteiner som først rapporteret af W. f. Goebel og 0. T. Avery i 1929 (J. Exptl. Medicin 50, 521-531 (1929)).

Midlerne til kombinering af polysaccharidet og protein 15 må også udvælges med omhu. Hvis den immunologiske for bedring, som man mener, realiseres som følge af den molekylære lighed mellem polysacchariddeterminanterne og prote in-"bær er"-determinanterne, vil disse dele ikke let adskilles i det biologiske system. Ikke-kovalente 20 komplekser, der dannes af den polyanioniske egenskab for polysacchariderne og den polykationiske egenskab for "bærer"-proteinerne, kan stimulere immunrespons, men disse komplekser er kemisk labile, og de resulterende immunrespons ses at udvise T-ce11euafhængighed.

25 Modsætningsvis ville kovalente konjugater af polysaccha rider og protein have meget større kemisk stabilitet og kunne vise T-celleafhængige immunrespons.

Kovalente polysaccharid/protein-konjugater er blevet omtalt i litteraturen, men den eksakte natur af den 30 kovalente binding er ikke blevet vist eller bestemt kvantitativt, da den eneste prøve for kovalens har været aktivitet in vivo, og de omhandlede processer i litteraturen har været vanskelige at reproducere. Haemophilus influenzae type b og Streptococcus pneumoniae 35 type 6a polysaccharid blev omsat med cyanogenbromid, 3 DK 171137 B1 derpå med adipinsyre-dihydrazid, derpå "koblet" med tetanustoxoid eller dolkhale-hæmacyaninproteiner i Schneerson et al. J. Exptl. Med., 152, 361 (1980) og Infection and Immunity, 4_0, 245 (1983). Pneumococal 5 type 19F polysaccharid blev koblet til bovinserumalbumin direkte ved dannelse af iminer (Schiff-baser) fra de reducerende ender af polysacchariderne og de tilsvarende aminogrupper (dvs. lysiner) af proteinet, efterfulgt af reduktion af disse aminer med natriumcyanoborhydrid 10 (Lin et al., Immunology, 46, 333 (1982)).

Yderligere blev polysaccharider knyttet til diazoterede aromatiske aminer koblet til proteinernes tyrosiner i K. K. Nixdorff et al., Immunology 2j?, 87 (1975), og polysaccharider knyttet til aromatiske aminer blev kon-15 verteret til isothiocyanater, som derpå blev knyttet til de modsvarende aminogrupper i proteinets lycin i S. B. Svenson og A. A. Lindberg, J. Immunolog. Methods 25, 323 (1979). I hvert tilfælde var det resulterende konjugat imidlertid kun karakteriseret ved sin opførsel 20 i gelpermeeringskromatografi. I endnu et eksempel (S.

Nutani et al., Infection an Immunity 2ϋ> 971 (1982)) blev polysaccharidet pollulanaktiveret med cyanurchlo-rid, derpå omsat med tetanustoxoid. I dette tilfælde blev konjugaterne karakteriseret ved elektroforese og 25 kun vist at være forskellige fra udgangsmaterialerne.

I ingen af disse tilfælde blev kovalensen vist på anden måde end ved at inddrage en aggregeret molekylvægt, hvorved man forvekslede kovalens med interaktionen af polyanioner og polykationer i molekylære komplekser, 30 da disse komplekser også vil give en aggregatmolekylvægt.

Det tilsigtes derfor med den foreliggende opfindelse at binde polysacchariddeterminanter til protein-"bærer"-determinanter, så at det molekylære slægtsskab for disse dele kunne opretholdes i biologiske systemer. Det tilsig- DK 171137 B1 ll tes også med den foreliggende opfindelse kovalent at binde kapsulære polysaccharider med bærerproteiner og at udvikle en metode, ved hvilken den kovalente natur af denne binding kunne vises og bestemmes kvantitativt.

5 Det tilsigtes yderligere med opfindelsen at opnå ke misk stabile polysaccharid/protein-konjugater, som viser T-celle afhængighed, og som ville være nyttige som vaccine-komponenter til at fremkalde beskyttende serumantistof mod visse bakterier, specielt bakterier beslægtet med 10 de anvendte polysaccharider. Det tilsigtes yderligere med den foreliggende opfindelse at udvikle en fremgangsmåde til at solubilisere polysaccharider, især polyan-ioniske polysaccharider og kovalent modificere disse polysaccharider med henblik på fremstilling af polysaccha-15 rid/protein-konjugaterne. Endnu et formål med den fore liggende opfindelse er at udvikle en metode til at rense og koncentrere kovalent-bundne polysaccharid/protein-kon-jugater til fjernelse af ukonjugerede makromolekyler og overskud af reaktanter. Derudover tilsigtes det med 20 den foreliggende opfindelse at udvikle metoder til be handling under anvendelse af disse konjugater i immunologisk effektive vacciner til anvendelse mod f.eks. meningitis og otitis media.

Den foreliggende opfindelse er rettet på kovalent modi-25 ficeret bakterielle polysaccharider og kemisk stabile konjugater af sådanne polysaccharider med kovalent modificerede immunogene membranproteiner, virale protein-underenheder, syntetiske polypeptider, bakterielle toxo-ider og andre egnede immunogene proteiner, hvilke konju-30 gater er nyttige bestanddele af immunogene bakterielle vacciner. Polysaccharid/protein-konjugaterne ifølge opfindelsen kobles via bigeneriske spacere indeholdende en kovalent thioethergruppe, hvori de bigeneriske spacere er atomkædesammenknyttende makromolekyler (såsom 35 polysaccharider og proteiner), en del af hvilke spacere 5 DK 171137 B1 stammer fra et modificeret makromolekyle (f.eks. det kovalent modificerede polysaccharid) og den anden del stammer fra det andet modificerede makromolekyle (f.eks. det funktionaliserede protein).

5 I fremgangsmåden ifølge opfindelsen funktionaliseres polysaccharidet kovalent i ét eller flere trin til fremstilling af et polysaccharid med fremspringende elektro-phile centre eller fremspringende thiolgrupper. Poly-saccharidet solubi1iseres foretrukkent først i et ikke-10 hydroxylisk organisk opløsningsmiddel, derivatiseres derpå med et bifunktionelt aktiveringsmiddel, før det omsættes med en bis-nucleophi1. Det nucleophilt-funktionali-serede polysaccharid omsættes derpå enten med et reagens til dannelse af fremspringende elektrophile steder eller 15 omsættes med et reagens til dannelse af fremspringende thiogrupper. Ved passende valg af den bis-nucleophile, dvs. en sådan, som reagerer med det aktiverede polysaccharid og fører til et kovalent modificeret polysaccharid med fremspringende elektrophile steder eller thiolgrupper, 20 eller valg af den passende nucleophil, kan yderligere funktionalisering af det nucleophilt funktionaliserede polysaccharid undgås.

Uafhængigt af den kovalente modificering af polysaccharid-et omsættes det passende bakterielle "bærer"-protein 25 med reagenser, der danner fremspringende thiogrupper, eller med reagenser, der danner fremspringende elektrophile centre, i en et- eller to-trins proces. Passende kovalent modificerede polysaccharider og proteiner omsættes derpå til dannelse af de kovalente polysaccharid/pro-30 tein-konjugater og renses for at fjerne ukonjugerede makro- molekyler og overskud af reagenser og for at muliggøre, at den immunogene dosis kan bestemmes baseret på kovalent bundet polysaccharid.

m 6 DK 171137 B1

Den kovalente natur af bindingen kan bevises absolut og defineres ved kløvning (som ved hydrolyse) af poly-saccharidet fra dets fremspringende elektrophile del eller thiolgruppedel og kløvning af proteinet fra dets 5 fremspringende thiolgruppedel eller elektrophilgruppedel, efterfulgt af analyse for det thioetherholdige bigeneriske spacermolekyle, så at bestemmelse af spacerkoncentrationen i forhold til en markør-aminosyre (lysin) analyse for protein bestemmer kovalens.

10 Immunogene vacciner indeholdende immunologisk effektive mængder af polysaccharid/protein-konjugaterne eller derivater deraf kan derfor fremstilles.

Konjugaterne ifølge opfindelsen kan være vilkårlige stabile polysaccharid/protein-konjugater, koblet via 15 bigenerisk spacere indeholdende en thioethergruppe og primær amin, som danner hydrolytisk labile kovalente bindinger med polysaccharidet og proteinet. Foretrukne konjugater ifølge opfindelsen er imidlertid de, som kan repræsenteres ved formlen PS-A-E-S-B-Pro eller Ps-A'-20 S-E'-B'-Pro, hvori Ps betegner et polysaccharid, Pro betegner et bakterieprotein, og A-E-S-B og A'-S-E'-B' udgør bigeneriske spacere, som indeholder hydrolytisk stabile kovalente thioetherbindinger, og som danner kovalente bindinger (såsom hydrolytisk-labile ester-amid-25 bindinger) med makromolekylerne, Pro og Ps. I spaceren,

A-E-S-B, er S svovl, E er transformationsproduktet fra en thiophilgruppe, som kan omsættes med en thiolgruppe, og det har formlen Q

-^(CB2>pNv1 eller -^Η-,

O

hvori R er H eller CH^, og p er 1 til 3, A er t 7 DK 171137 B1 WH w f -CN(CH-) Y(CH„) -NH-, hvori W er 0 eller NH, m er 0 Z m Z n til 4, n er 0 til 3, og Y er CH^, 0, S, NR' eller CHCC^H, hvor R' er H eller alkyl med 1-2 carbonatomer, så at hvis Y er kan ikke både m og n være lig med 5 nul, og hvis Y er 0 eller S, så er m større end 1, og

Z

i n er større end 1, og B er -(CH„) CH(CH0) D-, hvori L p 2 q 0

II

q er 0 til 2, Z er NH^, NHCR', COOH eller H, hvor 0 n R' og p er som defineret i det foregående, og D er C, NR', H 0 0 i ii ii eller N-CtCh^^C.I spaceren A'-S-E'-B' er S svovl, A'

IaJ

II

10 er -CNH(CH„) R"-, hvori a er 1 til 4, og R" er CH„ eller L 3 L· HOY ' i II i NCCH'Ch^p, hvor Y' er eller NHCOR', og M, p og R' er som defineret i det foregående, og E' er transformationsproduktet af en thiophilgruppe, som er blevet

R

/ omsat med en thiolgruppe, og som har formlen -CH-, hvori 0 ti 15 R som difineret i det foregående, og B' er -C-, eller E'

O

II

Λ 2 er I N- , og B' er -CH^JpC-, hvori p er 1 til 3. End-

II

O

videre er de bigeneriske spacere A-E-S-B og A'-S-E'-B' E-S-B- og A'-S-E'-komponenterne detekterbare og kvanti- DK 171137 B1 8 tativt bestemmelige, hvor denne identificering reflekterer kovalensen af konjugatbindingen, der knytter den side af thioethersvovlet, som stammer fra det kovalent modificerede polysaccharid med den side af spaceren, 5 som stammer fra det funktionaliserede protein.

Polysacchariderne ifølge opfindelsen kan være vilkårlige bakterielle polysaccharider med syregrupper, men er ikke tænkt begrænset til nogen særlige typer. Eksempler på sådanne bakterielle polysaccharider omfatter Strepto-10 coccus pneumoniae (pneumococal) type 6a, 6b, 10A, 11A, 18C, 19A, 19F, 20, 22F og 23F, polysaccharider; gruppe B Streptococus type la, Ib, II og III:, Haemophilus influenzae (H. flu) type b polysaccharid; Neisseria meningidis (miningococal) gruppe A, B, C, X, Y, W135 15 og 29E polysaccharider; og Escherichia coli Kl, K12, K13, K92 og K100 polysaccharider. Særligt foretrukne polysaccharider er imidlertid de kapsulære polysaccharider valgt fra gruppen bestående af H. flu type b polysaccharid, som beskrevet i Rosenberg et al, J. Biol.

20 Chem., 236, 2845-2849 (1961) og Zamenhof ét al., J.

Biol. Chem., 203, 695-704 (1953); Streptococcus pneumoniae (pneumococcal) type 6B eller type 6A polysaccharid som beskrevet i Robbins et al., Infection and Immunity, 26, No. 3, 1116-1122 (dec., 1979); pneumococcal type 25 19F polysaccharid, som beskreyet i C. J. Lee et al.,

Reviews of infectionus Diseases, J3, No. 2, 323-331 (1981) og pneumococcal type 23F polysaccharid som beskrevet i 0. Larm et al., Adv. Carbohyd Chem. og Biochem. 33, 295-321, R. S. tipson et al., udg., Academic Press, 1976. 1

Proteinerne ifølge opfindelsen er de med påvist sikkerhed og påviselig immunogenicitet, men de er ikke begrænset til nogen særlig type. Egnede proteiner omfatter bakterie-membranproteiner, vilkårlige af forskellige planteproteiner, 9 DK 171137 B1 såsom edestin eller sojabønnetrypsininhibitor, virale proteinunderenheder, såsom hepatitis A og B, herpes gD og gC, Epstein-Barr eller varicella zosterunderenheder, syntetiske polypeptider, diphtheria toxoid eller· tetanus-5 toxoid, men er foretrukkent Neisseria meningitidis (meningo coccal) B serotype ydre membranproteiner, som er T-celle-stimulatorer. Et eksempel på disse serotypeproteiner er blevet beskrevet i Helting et al., "Serotype Determinant Proteins of Neisseria Miningitidis", Actapath.

10 Mikrobiol. Scand. Sect. C, 8j?, 69-78 ( 1981) og Frasch et al., J. Bact., 127, 973-9Θ1 (1976).

Således kan konjugaterne , Ps-A-E-S-B-Pro, ifølge opfindelsen indholde spacere, hvis komponenter omfatter derivater af bl.a.: carbondioxid, 1,4-butandiamin og S-carboxymethy1-15 N-acetylhomocystein; carbondioxid, 1,5-pentandiamin, og S-carboxymethyl-N-acetylhomocystein; carbondioxid, 3-oxa-l,5-pentandiamin og S-carboxymethy1-N-acetylhomocystein; carbondioxid, 1,4-butandiamin og S-carboxymethy1-N-acetylcystein; carbondioxid, 1,3-propandiamin og S-car-20 boxymethyl-N-benzoylhomocystein; carbondioxid, 3-aza-l,5- pentandiamin og S-carboxymethy1-N-acetylcystein; og carbondioxid, 1,2-ethandiamin, glycin og S-(succin-2-y1)-N-acetylhomocystein. Konjugaterne PS-A'-S-E'-B'-Pro, ifølge opfindelsen kan indeholde spacere, hvis komponenter 25 omfatter derivater af bl.a.: parbondioxid og S-carboxy- methylcysteamin; carbondioxid og S-(α-carboxyethy1)cysteamin; carbondioxid og S-carboxymethylhomocysteamin; carbondioxid, S-(succin-2-y1)cysteamin og glycin; og carbondioxid og S-carboxymethylcystein. 1 I fremgangsmåden ifølge opfindelsen kovalentmodificeres polysaccharidet ved (a) solubilisering deraf i et ikke-hy-droxylisk organisk opløsningsmiddel efterfulgt af (b) aktivering deraf med et bi funktionelt reagens, (c) omsæt- DK 171137 B1 10 ning af dette aktiverede polysaccharid med en bis-nucleophil og endelig, om nødvendigt, yderligere (d) funktionalisering af dette modificerede polysaccharid ved enten omsætning (i) med et reagens, der danner elektrophile (f.eks.

5 thiophile) steder eller (ii) med et reagens, der danner tiolgrupper. Omvendt omsættes proteinet enten (i) med et reagens, der danner thiolgrupper eller (ii) med et reagens, der danner thiophile steder, hvorpå det kovalent modificerede polysaccharid og det funktionelle protein 10 omsættes under dannnelse af det stabile kovalent bundne konjugat, og den endelige blanding renses til fjernelse af uomsatte polysaccharider og proteiner.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen omfatter også valg af en nucleophil eller bis-nucleophil, som vil reagere 15 med det aktiverede polysaccharid til dannelse af et kovalent modificeret polysaccharid med fremspringende elektrophile steder eller fremspringende thiolgrupper, hvorved man undgår behovet for yderligere at funktionali-sere det bis-nucleophilt! modificerede polysaccharid før 20 omsætning af det kovalent modificerede polysaccharid ved det kovalent modificerede protein. Funktionalise-ringen af proteinet kan også udføres i mere end et trin efter valget af reaktanter i disse trin.

A. FREMSTILLING AF POLYSACCHAflIDET

25 I det første trin med kovalent modificering af polysaccha- ridet må det faste polysaccharid solubiliseres.

Da de nucleophile alkoholiske hydroxylgrupper i et polysaccharid ikke kan konkurrere kemisk for elektrophile reagenser med hydroxylgrupperne fra vand i en vandig 30 opløsning, må polysaccharidet være opløst i et ikke-vandigt (ikke-hydroxylisk) opløsningsmiddel. Sådanne opløsningsmid- DK 171137 B1 11 ler omfatter dimethy1formamid, dimethylsulfoxid, dimethyl-acetamid, formamid, N,N'-dimethylimidazolidinon og andre lignende polære, aprotiske opløsningsmidler, foretrukkent dimethylformamid.

5 Foruden anvendelsen af disse opløsningsmidler har ansøger ne vist, at ved overføring af polysacchariderne ifølge opfindelsen (f.eks. de kapsulære polysaccharider af H. influenzae type b, som er ribose/ribitolphosphat-polymere, og af pneumococ type 6B 19F og 23F), som har sure hydrogenatomer, 10 såsom phosphorsyremono- og diestere, i en passende salt form, bliver disse polysaccharider let opløselige i ovennævnte opløsningsmidler. De sure hydrogenatomer i dissse makromolekyler kan erstattes med store hydrofobe kationer, såsom tri- eller tetraalkylammonium med 15 1 til 5 carbonatomer, l-azabicyclo[2.2.2]octan,l,8-diaza- bicyclo[5.4.0]undec-7-en eller lignende kationer, især tri- eller tetraalkylammonium med 1 til 5 carbonatomer i alkylgruppen, og de resulterende tri- eller tetraalkylammonium- eller lignende salte af phosphorylerede 20 polysaccharider opløses let i ovennævnte opløsningsmid ler ved 17 °C - 50 °C, under omrøring i 1 minut til 1 time.

Delvis hydrolyseret H. influenzae type b polysaccharid er blevet konverteret til tetrabutylammoniumsalt, derpå 25 opløst i dimethylsulfoxid (Egan et al., J. Arner. Chem.

Soc., 104, 2898 (1982)), men dette produkt er ikke længere antigent og derfor ubrugeligt til fremstilling af vacciner. Modsætningsvis opnår ansøgerne solubi 1 i sering af et intakt, uhydrolyseret polysaccharid ved at passere poly-30 saccharidet gennem en stærk sur kationbytterharpiks, på tetraalkylammoniumform, eller ved omhyggelig neutralisering af polysaccharidet med tetraalkylammoniumhydroxid, foretrukkent ved førstnævnte procedure og derved bevare DK 171137 B1 12 levedygtigheden for polysaccharidet til anvendelse i immunogenvaccine.

Efterfølgende trin rettes derpå mod at overskride den anden væsentlige fysisk-kemiske begrænsning ved at frem-5 stille kovalente bindinger til polysaccharider, der mangler funktionelle grupper på polysacchariderne, bortset fra hydroxylgrupper, som er reaktive nok med reagenser, der er almindelige eller praktisk anvendelige til funktionali-sering af enheder, med hvilke binding er ønsket. Aktivering 10 af polysaccharidet til dannelse af et aktiveret polysaccha- rid, omsætning med bis-nucleophiler til dannelsen af et nucleophilt-funktionaliseret polysaccharid og funktiona-lisering med reagenser, der danner enten elektrophile steder eller thiolgrupper, er alle rettet mod kovalent 15 modificering af polysaccharidet og udvikling af funktion elle grupper på polysaccharidet ved forberedelse til konjugering.

I det næste trin aktiveres det solubiliserede polysaccharid ved omsætning med et bi funktionelt reagens ved ca.

20 0 °C - 50 °C under omrøring i 10 minutter til 1 time med det afgørende vægtforhold mellem aktiveringsmiddel og polysaccharid i området 1:5 til 1:12. Indtil nu er aktiveringen blevet udført ved omsætning af polysaccharidet med cyanogenbromid. Derivater aktiveret 25 med cyanogenbromid, som har en "tendens" til vicinale

dioler, har imidlertid udvist transient stabilitet under dialyse mod en phosphatpuffer. Skønt aktivering med cyanogen stadig er mulig ifølge den foreliggende opfindelse, anvendes dette reagens kun i ringe grad til aktive-30 ring af polysaccharider, og det foretrækkes ikke. I

stedet fortrækkes bi funktionelle reagenser til aktivering af polysaccharidet, herunder kulsyrederivater, 0 2 " 3 2 3 ,R -C-R , hvori R og R uafhænigigt kan betegne azolyl, 13 DK 171137 Bl såsom imidazolyl, halogenider eller phenylestere, såsom p-nitropheny1 eller polyhalogenphenyl.

Carbonyldiimidazol, et særligt foretrukkent reagens, vil reagere med hydroxylgrupperne under dannelse af 5 imidazolylurethaner af polysaccharidet, og arylchlor- formiater, herunder f.eks. nitrophenylchlorformiat, vil producere blandede carbonater af polysaccharidet.

I hvert tilfælde er det resulterende aktiverede poly-saccharid meget følsomt over for nucleophile reagenser, 10 såsom aminer, og det transformeres derved til de tilsvar ende urethaner.

I det næste trin omsættes de aktiverede polysaccharid med et nucleophilt reagens, såsom en amin, især en diamin,

Η H

I I

f.eks. HN(CH2)n~NH, hvori m er 0 til 4, n er 0 til 3, og 13 Y er CH2, 0, S, NR', CHC00H, hvor R' er H eller alkyl med 1-2 carbonatoner, så at hvis Y er CH2 så kan ikke både m og n være nul, og hvis Y er 0 eller S, så er m større end 1, og n er større end 1, i et stort amin-overskud (dvs. f.eks. et 30- 100-fold· molært overskud 20 af amin i forhold til anvendt aktiverende middel). Om sætningen holdes i et isbad i 15 minutter til 1 time, holdes derpå i 15 minutter til 1 time ved ca. 17 °C -40 °C.

Et aktiveret polysaccharid ville, når det omsættes med 25 en diamin, f.eks. 1,4-butandiamin, resultere i en urethan- form af et polysaccharid med fremstikkende aminer, som derpå kan yderligere funktionalisere ved acylering.

‘ Blandede carbonater vil også reagere med diaminer til f ' opnåelse af fremstikkende aminogrupper.

30 Alternativt kan det aktiverede polysaccharid omsættes med en nucleophil, såsom et monohalogenacetamid af en ϊ m 1 4 DK 171137 B1 diaminoalkan, f.eks. 4-bromacetamidobutylamin (se W.

B. Lawson et al., Hoppe Seyler's Z. Physiol Chem., 349, 231 (1968)) til dannelse af et kovalent modificeret polysaccharid med fremstikkende elektrophile steder.

3 Eller det aktiverede polysaccharid kan omsættes med en aminothiol, såsom cysteamin (aminoethanthiol) eller cystein, eksempler på derivater af hvilke er velkendte i teknikken for peptidsyntese, til fremstilling af et polysaccharid med fremstikkende thi o 1 grupper. I begge 10 tilfælde er ingen yderligere funktionalisering nødven dig før kobling af de kovalent modificerede polysaccharid til det modificerede bakterielle "bærer"-protein.

Sidste trin i fremstillingen af polysaccharidet, den yderligere funktionalisering, og nødvendig for polysaccha-15 ridet kan finde sted ved enten at omsætte det nucleophil- funktionaliserede polysaccharid med et reagens til dannelse af elektrophile (dvs. thiophile) steder eller med et reagens til dannelse af thiolgrupper.

Reagenser egnede til anvendelse til dannelse af elektro-20 phile steder omfatter f.eks. de, der anvendes til acyle- ring til α-halogenacety1 eller β-halopropiony1,

OR

ti t derivater som X'CCHX (hvori R er H eller CH^, X er Cl,

Br eller I, og X' er nitrophenoxy, dinitrophenoxy, penta-chlorphenoxy, pentafluorphenoxy, halogenid, 0-(N-hydroxy-25 succinimidyl) eller azido), især chloreddikesyre eller α-brompropionsyre, idet reaktionen udføres ved et pH på 8 til 11 (holdt i dette område ved tilsætningen af base, om nødvendigt) og ved en temperatur på ca. 0 °C -35 °C i 10 minutter til 1 time. En aminoderivatiseret 30 polysaccharid kan acyleres med aktiverede maleimidoamino- 15 DK 171137 B1 syrer (se, 0. Keller et al, Helv. Chim. Acta., _58- 531 (1975)) til fremstilling af maleimidogrupper,

O

Ϊ -C(CH2)pM jj t. hvori p er 1 til 3, med et 2-halogen-

Y

acyleringsmiddel, såsom p-nitrophenyIbromacetat, eller 5 med et α-halogenketoncarboxylsyrederivat, f.eks.

H02C~ "CCH2Br (Ber*» ϋ» 1Z°4> (1934)) for at fremstille passende funktionaliserede polysaccha-rider, der kan undergå thiosubstituering.

Reagenser egnede til anvendelse ved dannelse af thioler 10 omfatter f.eks. acyleringsreagenser, såsom thiolactoner, feks.

hVh -(CH2)p

Ai 4 hvori R er alkyl med 1-4 carbonatomer eller monoeller bicyclisk aryl, såsom C^H,. eller og p NHCOR5 I 5 er 1 til, 0,SSCH„(CHo) CH-COX', hvori m er 0 til 4, R er 5 Z 2 m alkyl med 1-4 carbonatomer eller C^H^, og X' er som 15 defineret i det foregående, efterfulgt af behandling . NHCOR5 med HSCHoCHo0H, eller C„Hc-S-S-CH,(CH„) CHCOX', hvori m, ^ 2 2 2 i? 2 Z m R^ og X' er som defineret umiddelbart i det foregående, m 16 DK 171137 B1 efterfulgt af behandling med dithiothreitol. Sådanne raktioner udføres i en nitrogenatmosfære ved ca. 0 °C - 35 °C og et pH på 8 til 11 (med base tilsat, om nødvendigt, for at holde pH indenfor dette område) i 1 5 til 24 timer. F.eks. kan et aminoderivatiseret polysaccha- ^hcoch3 rid omsættes med j til fremstilling af et

oV

passende funktionaliseret polysaccharid.

Med disse trin fremstilles derpå kovalent modificerede polysaccharider af formerne Ps-A-E*- eller Ps-A'-SH-, , λ

10 hvori E * er -CCHX eller - C ( C H 9 ) n II , og A, A', R, X

Y

og p er som defineret i det foregående.

B. FREMSTILLING AF PROTEINET

Separat funktionalisering af det protein, der skal kobles til polysaccharidet, involverer omsætning af proteinet 15 med ét eller flere reagenser til dannelse af en thiolgrup- pe eller omsætning af proteinet med ét eller flere reagenser til dannelse af et elektrophilt (dvs. thiophilt) center.

• Ved fremstilling til konjugering med et elektrophi1t-funk- 20 tionaliseret polysaccharid omsættes proteinet i et eller to trin med ét eller flere reagenser til dannelse af thiolgruppen, såsom de acyleringsreagenser, der anvend- n m DK 171137 B1 17 es til dannelse af thiolgrupper på polysaccharider diskuteret på de foregående sider. Thiolerede proteiner kan også fremstilles ved aminering af carboxyaktiverede proteiner, såsom de, der er vist i Atassi et al., Biochem 5 et Biophys. Acta, 670, 300, (1981) med aminothioler til fremstilling af det thiolerede protein. En foretruk-ken udførelsesform for procestrinnet involverer direkte acylering af de fremstikkende aminogrupper (dvs. lysyl-grupper) af proteinet med N-acetylhomocysteinthiolacton 10 ved ca. 0 °C - 35 °C og pH 8 - 11 i ca. 5 minutter til 2 timer under anvendelse af ækvivalente vægtmængder af reaktanter. q ?»(ch2) 1, ^ , er betingelserne og metoden til fremstilling af det funktionaliserede protein som 15 omtalt i det foregående til fremstilling af det som modpart anvendelige polysaccharid ved omsætning med aktiverede maleimidosyrer.

Ved forberedelse til konjugering med et kovalent modificeret bakterielt polysaccharid med fremstikkende thiol-20 grupper acyleres proteinet med et reagens, der danner et elektrophilt center, såsom acyleringsmidler, herunder 0 CH, 0

II I -5 II

f.eks. XCH2C-X' og XCH - CX', hvori X og X' er som ? defineret i det foregående, og i N(CH2) C-χ·, hvori DK 171137 Bl 18 X' er som defineret i det foregående. Egnede proteiner med elektrophile centre omfatter f.eks. også de, der fremstilles ved acylering af de udadstikkende lysylamino-grupper med et reagens, som en aktiveret maleimidosyre, 5 f.eks.

O O

(\0^Η2>ηγ eller ved at omsætte det carboxyaktiverede protein med monohalogenacetylderivater af aminer. I begge fremstillingsreaktioner er temperaturen 0 °C - 35 °C i 5 minutter til 1 time og pH er 8 - 11.

10 C. DANNELSE AF KONJUGATET

Dannelse af konjugatet er derpå blot et spørgsmål om at omsætte et vilkårligt af de kovalent modificerede polysaccharider, der har fremspringende elektrophile centre, med et vilkårligt af de proteiner, der har frem-15 springende thiolgrupper, ved et pH på 7 - 9, i passende ækvivalente vægtforhold, i en nitrogenatmosfære i 6 -24 timer ved ca. 17 °C - 40 °_C til opnåelse af et kovalent konjugat. Eksempler på sådanne reaktioner omfatter: OH O NHCOCH3

Ps-CNCH2CH2CH2CH2NHCCH2Br + HSCH2CH2CHCO-Pro _^ OH O NHCOCH3

PsCNCH2CH2CH2CH2NHCCH2SCH2CH2CHCOPro, hvori et aktiveret polysaccharid, som er blevet omsat 20 med 4-bromacetamidobutylamin, omsættes med et protein, DK 171137 B1 19 som er blevet omsat med N-acetylhomocysteinthiolacton, til dannelse af et konjugat, og: > . λ · .

PsCNHY"NHCCH,-N I CH^CH.NHCCH0CH0CPco 2 y\/ 2 2 2 2 (hvor YM er en alkylengruppe med 2-8 carbonatomer), hvori et amino-derivatiseret polysaccharid, som er blevet 5 omsat med aktiverede maleimidosyrer, omsættes med et carboxyaktiveret protein, som er blevet amineret med en aminothiol, til dannelse af et konjugat.

Tilsvarende kan et vilkårligt af de kovalent modificerede polysaccharider med fremspringende thiolgrupper omsættes 10 med et vilkårligt af de proteiner, der har fremspringende elektrophile centre, til opnåelse af et kovalent konjugat.

Et eksempel på en sådan reaktion er:

Ps!nHCH2CH2SH + ProlcH2CH2l-N(CH2)4NHCOCH2Br _p ps11jch2ch2sch2In (ch2) 4νηΪοη2οη2^ργο, hvori et aktiveret polysaccharid, som er blevet omsat med en aminothiol, omsættes med et carboxyaktiveret 15 protein, som er blevet omsat med monohalogenacetylderiva- DK 171137 B1 20 ter af en diamin, til dannelse af et konjugat.

Skulle den elektrophile aktivitet af et overskud af halogenacetylgrupper nødvendigvis elimineres, vil reaktionen mellem konjugatet og en thiol med lav molekyl-5 vægt, såsom n-acetylcysteamin, tjene til dette formål.

Anvendelse af dette reagens, n-acetylcysteamin tillader også bekræftende undersøgelse af de anvendte halogenacetylgrupper (se sektion D), fordi den S-carboxymethylcyste-amin, som er dannet, kan detekteres entydigt ved frem-10 gangsmåden af Spackman, Moore og Stein.

Disse konjugater centrifugeres derpå ved ca. 100 000 x g under anvendelse af en rotor med fast vinkel i ca. 2 timer ved ca. 1 °C - 20 °C eller underkastes en vilkårlig række andre rensningsprocedurer, herunder gelpermeering-, 15 ionudelukkelseschromatografi, gradientcentrifugering eller andre former for forskelsadsorptionschromatografi, til fjernelse af ikke-kovalent bundne polysaccharider og proteiner under anvendelse af kovalentsprøven for den bigeneriske spacer (se i det Følgende) som metode 20 til at følge den ønskede biologiske aktivitet.

Den yderligere adskillelse af reagenser kan foretages ved størrelsesudelukkelseschromatografi i en søjle eller i tilfælde af meget store, ikke opløselige proteiner, såsom N. meningitidis B serotype ydre membranprotein 25 ved ultracentri fugering.

i Λ DK 171137 B1 21 D. Analyse for at bekræfte kovalens

Analyse af konjugatet for at bekræfte kovalensen og dermed stabiliteten af konjugatet udføres af ansøgeren ved at hydrolysere (foretrukkent med 6 N HC1 ved 110 °C 5 i 20 timer) konjugatet, efterfulgt af kvantitativ analyse for aminosyren fra den hydrolytisk stabile spacer indeholdende thioetherbindingen og proteinets ami-nosyrebestanddel. Bidraget fra proteinets aminosyrer kan fjernes, om nødvendigt, ved sammenligning med den 10 passende aminosyrestandard for det pågældende protein, idet den tilbageblevne aminosyreværdi reflekterer kon-jugatets kovalens, eller aminosyren fra spaceren kan være konstrueret til at forekomme uden for aminosyre-standarden for proteinet i analysen. Kovalensprøven 15 er også nyttig til at vise rensningsprocedurer for at markere forøgelsen af koncentration af biologisk aktive komponenter. I ovennævnte eksempler resulterer hydrolyse af DK 171137 B1 22 OH O NHCOCH3

PsCNCH2CH2CH2CH2NHCCH2SCH2CH2CHCOPro resulterer i frigørelsen af S-carboxymethylhomocystein, f2 H02CCH2SCH2CH26hC02H, hydrolyse af .............

i frigørelse af aminodicarboxylsyren ^2^^2^^^2^2^2' °9 hydrolyse af ho2c psIIch2ch2sch2 S,=H 2)^Νκ!οΗ”ΟΗ2Εργο resulterer i frigørelsen af S-carboxymethylcysteamin, f^HC^Ct^SCH^CC^H ved spaltning af Ps-A-E-S-B-Pro-molekylet ved peptidbindingerne og andre hydrolytisk ustabile bindinger. Chromatogra-fiske metoder, såsom de, der er beskrevet af Spackman, 5 Moore og Stein, kan derpå pagsende anvendes, og forholdet mellem aminosyrebestanddele kan bestemmes.

DK 171137 B1 23

E. ANVENDELSER

Et eller flere af konjugaterne ifølge opfindelsen kan anvendes i pattedyrarter til enten aktiv eller passiv beskyttelse profylaktisk eller terapeutisk mod baktere-5 mia forårsaget af den beslægtede organisme, som i de foretrukne ud førelses former ifølge opfindelsen, Haemophilus influenzae type b eller Streptococcus pneumoniae type 6B, 19F eller 23F organismer. Aktiv beskyttelse kan opnås ved at injicere en effektiv mængde (en mængde 10 i stand til at give målelige mænger af antistoffer, f.eks. 2 til 50 yug) polysaccharid på konjugatformen af hvert af konjugaterne, der administreres, pr. dosis, hel antiserum opnået fra dyr forud doseret med konjugat-et eller konjugaterne , eller globulin eller andre anti-15 stofholdige fraktioner fra nævnte antisera, med eller uden en farmaceutisk acceptabel bærer, såsom aseptisk saltvandsopløsning. Sådan globu lin; opnås fra hel antiserum ved chromatografi, salt- eller alkoholfrakti one ring eller elektro forese. Passiv beskyttelse kan opnås ved 20 standardiserede monoklonale antistofprocedurer eller ved at immunisere egnede pattedyrsværter. Anvendelsen af et adjuvans (f.eks. alun) er også omfattet af opfindelsen .

I en foretrukken ud f øre Ises f o.rm for opfindelsen anvendes 25 konjugatet til aktiv immunogen vaccinering af mennesker, specielt spædbørn og større børn. Til yderligere stabilitet kan disse konjugater også lyophiliseres i nærværelse af lactose (f.eks. ved 20 ^ug/ml H. flu polysaccharid/4 mg/ml lactose eller 50 yug/ml pneumoccocal polysaccharid/ 30 10 mg/ml lactose) før anvendelse.

Det foretrukne dosisniveau af hvert af konjugaterne eller derivater deraf er en administreret mængde svarende til 25 ^ug polysaccharid på konjugatform DK 171137 B1 24 for konjugater af pneumococcale polysaccharider og 10 ^ug polysaccharid på konjugatformen for konjugater af H. flu type b polysaccharid i en enkelt administrering.

Om nødvendigt kan der også administreres yderligere 5 en eller to doser konjugat eller derivat deraf af H.

influenzae type b polysachharid i en mængde svarende til 10 ^,ug af polysaccharidet på kon jugat f ormen.

Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

10 EKSEMPEL 1

Fremsti liirtg af H. Influenzae type b kapsulært poly-saccharid (PRP)_

Podemedium og udvikling

Et lyophiliseret rør af Haemophilus influenzae type B 15 (dyrket fra Ross 768, modtaget fra State University of New York) blev suspenderet i 1 ml sterilt Haemophilus podemedium (se det følgende), og denne suspension blev udspredt på nitten chokoladeagarplader (BBL). Efter 20 timers inkubering ved 37 °C i et lyskar blev væksten 20 på hver plade resuspenderet i 1 - 2 ml Haemophilus pode medium og samlet.

Haemphilus podemedium*

Sojapepton 10 g/liter

NaCl 5 g/liter 25 NaH2P04 3,1 g/liter

Na2HP04 13,7 g/liter K2HP0^ 2,5 g/liter

Destilleret vand til volumen 25 DK 171137 B1 * pH for opløsningen indstilles til en måleværdi på 7,2 + 0,1 (idet en typisk værdi var 7,23) og opløsningen blev steriliseret ved autoklavering ved 121 °C i 25 minutter.

5 Trin B: 2 liter Erlenmeyerkolber uden ledeplader

En tredjedel protion resuspenderet bakterie fra trin A i det foregående blev anvendt til at pode 3 2-liters kolber hver indeholdende ca. 1,0 liter komplet Haemophilus podema te r i a le ; og produktionsmedium (se i det følgende).

10 Kolberne blev derpå inkuberet ved 37 °C på en roterende omryster ved 200 omdr./min. i 5 timer. En typisk OD^gg værdi ved afslutningen af inkuberingsperioden var 0,37.

Komplet Haemophilus podestof + produktionsmedium

NaH2P0^ 3,1 g/liter 15 Na^HPO^ 13,7 g/liter

Sojapepton 10 ml/liter Gærekstrakt-diafiltrat (1) 10 ml/liiter K^HPO^ 2,5 g/liter

NaCl 5,0 g/liter 20 Glucose (2) 5,0 g/liter

Nicotinamidadenin- dinucleotid (NAD) (3) 2 mg/liter "Hemin" (ή) 5 mg/liter

Saltene og sojapepton blev opløst i små volumen varmt, pyrogenfrit vand og bragt til korrekt slutvolumen med 25 yderligere varmt, pyrogenfrit vand. Fermentorerne eller kolberne blev derpå steriliseret i ca. 25 minutter ved 121 °C og efter afkøling blev gærekstrakt-di afi 11rat (1), glucose (2), NAD (3) og "Hemin" (4) aseptisk sat til kolberne eller fermentorerne før podning.

i DK 171137 B1 26 (1) Gærekstrakt diafiltrat: 100 g ølgærekstrakt (Amber) blev opløst i 1 liter destilleret vand og ultrafiltreret i en "Amicon DC-30" hul fiber med H10X50 patroner til fjernelse 5 af molekyler med molvægt 50 000. Filtratet blev samlet og passeret gennem en 0,22 ju membran som et sterilt produkt.

(2) Glucose blev fremstillet som en steril 25 S opløsning i glas-destilleret vand.

10 (3) En lageropløsning af NAD indeholdende 20 mg/ml blev steriliseret ved filtrering gennem et "Millipore" ^filter (0,22 ^u) og aseptisk tilsat ligefør podning.

(4) En lageropløsning af "Hemin 3X" blev fremstil-

15 let ved at opløse 200 mg i 10 ml 0,1 M

NaOH, og volumet blev indstillet med destilleret, steriliseret vand til 100 ml. Opløsningen blev steriliseret i 20 minutter ved 121 °C og aseptisk sat til det endelige 20 medium før podning.

Trin C: 70-liters podestoffermentor

Tre liter af produktet fra trin B blev anvendt til at pode en 70-liters fermentor indeholdende 41,4 liter komplet Haemophilus podemateriale og produktionsmedium (frem-25 stillet som beskrevet i det foregående) og 17 ml "UC0N

B625" antiskumningsmiddel. pH var til at begynde med 7,4.

Fermenteringen blev opretholdt ved 37 °C med omrøring ved 100 omdr./min. og vist ved optisk massefylde (O.D.) 27 DK 171137 B1 og pH-bestemmelser, indtil en typisk O.D. på 0,39 var nået (efter ca. 5,5 timers forløb).

Trin D: 800-liters produktionsfermentator

Ca. 40 liter af produktet fra trin C blev anvendt til 5 at pode en 800-liters fermentator indeholdende 570 liter produktionsmedium (fremstillet som beskrevet i det foregående), tilpasset det nødvendige volumen, og 72 ml "UCON LB625" antiskumningsmiddel.

Fermenteringen blev opretholdt ved 37 °c med omrøring 10 ved 100 omdr./min., med O.D. og pH kontrolleret omkring hver anden time, indtil O.D. var ensartet i en to-timers periode, på hvilket tidspunkt fermenteringen blev afsluttet (en typisk slutværdi for O.D. var 0,54 efter 12 timers forløb).

15 Høst og inaktivering

Ca. 600 liter af portionen blev inaktiveret ved høst i en "kill tank" indeholdende 12 liter 1 %'s thimerosal.

Klaring 20 Efter 18 timer inaktivering ved 4 °C blev portionen centrifugeret i Sharpies centrifuger med 4-in. fordybninger ved en strømningshastighed indstillet til at holde produktklarheden (variabel mellem 1,3 og 3,0 liter/min. *). Den overliggende væske opnået efter centrifugering ved 25 15 000 omdr./min. blev anvendt til produktudvinding.

Isolering og koncentrering ved ultrafiltrering

Den overliggende væske fra to pr oduktionsfermenteringer blev samlet og koncentreret ved 2 °C - 8 °C i en "Romicon" DK 171137 B1 28 ultrafiltreringsenhed med ti (50 000 Daltonafskæring) hul fiberpatroner (4,5 m2 menbranareal; 2,0 lpm luftstrømning og 20 psi) koncentrering så at efter ca. 4,5 timers forløb var 1200 liter blevet koncentreret til 5 32,5 liter. Filtratet blev bortkastet.

48 og 61 %'s ethanoludfældninq

Til de 32,5 liter "Romicon"-retentat blev der dråbevis i løbet af 1 time under omrøring ved 4 °C sat 30 liter 95 ?i's ethanol til en slutkoncentrat ion på 48 volumen-!*

10 ethanol. Blandingen blev omrørt endnu 2 timer ved 4 °C

for at sikre fuldstændig udfældning, og den overliggende væske blev samlet ved hjælp af et enkelt 4-inch "Sharpies" centrifuge ved 15 000 omdr./min. (strømningshastighed = 0,27 liter/min.). Den uopløselige pellet blev bortkastet, 15 og den klarede væske blev bragt til en ethanolkoncentra- tion på 61 % ved tilsætning af yderligere 20,8 liter 95 %' s ethanol i løbet af 1 time. Blandingen blev omrørt i endnu 3 timer for at sikre fuldstændig udfældning.

Udvinding af den anden pellet 20 Det resulterende 48 %'s ethanolopløselige/61 %'s ethanol- uopløselige bundfald blev samlet ved centrifugering i en 4-inch "Sharpies" centrifuge ved 15 000 omdr./min (strømningshastighed = 0,62 liter/min.), og den 61 %' s ethanol overliggende væske blev bortkastet. Det rå pro-25 duktudbytte var 0,377 kg våd pasta.

Calciumchloridekstrakt

Det 377 g 61 ?i's ethanol-uopløselige materiale blev blandet i en "Daymax" dispersionsbeholder ved 2 °C -8 °C med 6,5 liter koldt, glas-destilleret vand. Til 30 denne blanding blev der sat 6,5 liter kold 2 M CaC^Zt^O, DK 171137 B1 29 og blandingen (s lutkoncentration = 1,0 M CaCl^) blev ekstraheret ved 4 °C i 15 minutter. Beholderen blev derpå udskyllet med 2 liter 1 M CaC^^f^O, hvilket resulterede i 15 liters slutvolumen.

5 23 % 1 s ethanolud fældning

Det 15-liters CaCl^-ekstrakt fra det foregående blev bragt til en ethanolkoncentration på 23 % ved tilsætning af 4,48 liter 95 ?ό 1 s ethanol dråbevis, under omrøring, ved 4 °C i løbet af 30 minutter. Efter yderligere 10 omrøring i 17 timer blev blandingen centrifugeret gennem en "K2 ultracentrifuge" ved 25 000 omdr./min. (strømningshastighed = 165 ml/min.) i 6,5 timer ved 4 °C.

Den overliggende væske blev fradekanteret gennem osteklæde til fjernelse af lipidlignende flydende materiale, 15 og den uopløselige pellet blev bortkastet.

37 %'s ethanoludfældninq og opsamling af rå produktpasta

Den 23 %'s ethanolopløselige overliggende væske blev bragt til en koncentration på 37 ?ό ethanol ved tilsætning af 4,33 liter 95 ?ό' s ethanol, dråbevis under omrøring 20 over et tidsrum på 30 minutter. Blandingen fik derpå lov at henstå under omrøring i 1 time, derpå uden omrøring i 14 timer for at sikre fuldstændig udfældning. Den resulterende blanding blev derpå centrifugeret i en 4-inch "Sharpies" enhed ved 15 000 omdr./min. (strøm-25 ningshastighed = 0,2 liter/min.) til samling af det pelleterede rå polysaccharid.

T riturerinq

Pellet fra centrifugeringen blev overført til en 1-gallon Waring blender indeholdende 1 liter absolut alkohol 30 og blended i 30 sekunder ved den højeste hastighed. Blend- ? DK 171137 B1 30 ing blev fortsat med 30 sekunder på on-sti 11 ingen og 30 sekunder på off-stil1 i ngen, indtil der opnåedes et hårdt, hvidt pulver. Pulveret blev samlet på en BQchner-tragt med en teflonfilterplade og vasket i sekvenser 5 in situ med to 1-liters portioner absolut ethanol og 2-liters portioner acetone. Materialet blev derpå tørret i vakuum ved 4 °C i 24 timer, hvilket resulterede i 68 g produkt (tørvægt).

Phenolekstraktioner 10 De 68 g tørt materiale fra tritureringstrinnet blev gensuspenderet i 12 liter 0,488 M natriumacetat, pH 6,9, ved hjælp af en "Daymax" dispersionsbeholder. Natriumacetatopløsningen blev straks ekstraheret med 4,48 liter frisk vandig phenolopløsning fremstillet som følger: 13 900 ml 0,488 M natriumacetat, pH 6,9, blev sat til en fem-pound-kolbe med phenol (Ma11ingkrodt krystallinsk) i en 20 liters trykbeholder og blandet, indtil der var opnået en fuldstændig opløsning. Hver phenolekstrakt blev centrifugeret i 2,5 time ved 30 000 omdr./min.

20 og 4 °C i K2 ultracentrifugen (Electronucleonics) for at bryde emulsionen. Det vandige effluent blev ekstraheret yderligere tre gange med 3,2 liter frisk vandig phenolopløsning på samme måde. Phenol faserne blev bortkastet .

25 Diafiltrerinq

Den vandige fase fra phenolekstraktionerne i det foregående (17,6 liter) blev fortyndet med 300 liter kold, g 1 as-desti 11eret vand og diafiltreret ved 4 °C på et "Amicon DC-30" ultrafiltreringsapparat under anvendel- 30 se af 3 H10P10 patroner. "Amicon"-enheden blev skyllet, og skyllevæsken blev sat til retentatet, så at det endelige volumen blev 17,5 liter. U11rafi Itratet blev bortkastet .

DK 171137 B1 31 67 Vs ethanoludfældning 0,438 liter 2,0 M CaCl2 blev/ sat til de 17,5 liter dialysat fra de foregående trin (endelig CaC^-koncentration var 0,05 M), og opløsningen blev bragt til 67 % ethanol 5 ved dråbevis tilsætning i løbet af 1 time af 35,88 liter 95 %'s ethanol til den hurtigt omrørte opløsning. Efter 4 timers omrøring efterfulgt af 12 timers yderligere henstand ved 4 °C blev den klare overliggende væske fjernet med hævert, og bundfaldet blev samlet ved centri-10 fugering i en 4-inch "Sharples"-centrifuge (15 000 omdr./min.) ved 4 °C i 45 min.. Den resulterende polysaccharidpellet blev tritureret i en 1-gallon "Waring"-blender under anvendelse af metoden med 30 sekunder i on-stillingen og 30 sekunder i off-stillingen med 2 liter absolut 15 ethanol, samlet på en Biichnertragt udstyret med teflon filterskål og vasket in situ med fire 1-liter portioner absolut ethanol efterfulgt af to 1-liter portioner acetone. Prøven blev derpå tørret på en tareret skål i vakuum ved 4 °C i 20 timer. Udbyttet var 39 g tørt pulver.

20 Ultracentrifugering i 24 % ethanol og samling af slut- produktet_

De 39 g tørt pulver fra det foregående blev opløst i 15,21 liter destilleret vand,.hvorti 1 der blev sat 0,39 liter 0,05 M CaCl2.2H20, hvilket bringer opløsningen 25 til en koncentration på 0,05 M CaCl2 og det totale volu men på 15,6 liter (2,5 mg polysaccharid/ml), og blandingen blev bragt til 24 S ethanol med dråbevis tilsætning af 4,93 liter 95 S's ethanol over 30 minutter.

Blandingen blev klaret øjeblikkeligt ved centrifugering 30 i en K2 ultracentrifuge indeholdende en K3 titanskål og en Kil "Norylkerne" (30 000 omdr./min og 100 ml/min.) i 3,5 timer ved 4 °C. Pellet blev bortkastet, og den klare overliggende væske (volumen = 19,8 liter) blev DK 171137 B1 32 bragt til en ethanolkoncentration på 37 % ved tilsætning af 4,23 liter 93 ?£' s ethanol i løbet af 30 minutter under omrøring. Efter omrøring yderligere 30 min. fik blandingen lov at henstå uden omrøring ved 4 °C i 17 5 timer hvorpå den blev samlet gennem en 4-inch "Sharples"- centrifuge ved 15 000 omdr./min. (45 min. var påkrævet).

Den resulterende pasta blev overført til en 1-gallon "Warring"-blender indeholdende 2 liter absolut ethanol og blended ved højeste hastighed 4 eller 5 gange 30 10 sekunder on og 30 sekunder off, indtil der var dannet et hårdt, hvidt pulver. Dette pulver blev samlet på en BUchnertragt med en "Zitex"-teflonskive og skyllet med to friske 0,5-liters portioner og én 1-liters portion absolut ethanol og med to 1-liters portioner acetone.

15 Produktet blev fjernet fra tragten og overført til en tareret skål til tørring i vakuum ved 4 °C (i 25,5 time).

Det endelige udbytte af produktet var 34,7 g tørvægt, og dets egenskaber var som følger:

Tabel 1-1

Hib POLYSACCHARID KEMISKE PRØVEDATA

Prøve Resultat

Fugt (TG) 13,5 %

Protein 0 ?i

Nucleinsyre 1,3 %

Ribose (pentose) 35,1 %

Phorspor 7,8 % KD ("Sepharose 4B") 0,05 0,35

Kp ("Sepharose 2B") 0,43 0,60 DK 171137 B1 33 Følgende procedurer blev anvendt til udførelse af prøverne.

1. Fugt - termogravimetri (vægttab til 100 °C) under anvendelse af en Perkin-Elmer "termo-balance" TSG-1.

5 2. Protein - Lowrymetoden, Lowry et al., J.

Biol. Chem., 193: 265 (1951).

3. Nucleinsyre - U V-metoden Warburg og Christian, Biochem Z., 310: 384 (1942).

4. Ribose - Bial-metoden Dische og Schwartz, 10 Mickorochim Acta ^:13 (1937).

5. Phosphor - Molybdatmetode Chen et al.,

Anal. Chem. 28: 1756 (1956).

6. - Bestemt på "Sepharose" 4B under anvendelse af refraktionsindeks.

Tabel 1-2

PYROGENISK STOFPRØVE

(Hib polysaccharid)

Koncentration Max. temperaturforøgelse* (mcq/ml/kq) 0 °C (3 kaniner)_ 0,1 (polysaccharid) 0,2, 0,2, 0,1 * 1,0 ml/kg dose

Polysaccharidet blev yderligere identificeret ved Agargel-diffusion som følger: Dobbeltdiffusion på agar (Ouchterlony) blev foretaget under anvendelse af "Hyland"-mønster D-plader. Antiserum mod Ross 868 stamme H. influenzae 15 blev anbragt i midterbrøndene, mens massen af polysaccha- 54 DK 171137 B1 rid i koncentrationer på 50, 25, 12,5, 6,2 og 3,1 mcg/ml bleu anbragt i satellitbrøndene. Pladen blev inkuberet ued 20 - 25 °0 i et fugtkammer i 24 timer. Precipitin-bånd blev observeret mellem polysaccharidmassen og det 5 specifikke antiserum ued polysaccharidkoncentrationer på 50, 25 og 12,5 mcg/ml.

EKSEMPEL 2

Fremstilling af Neisseria meningitidis Bil serotype 2 membranprotein_ 10 A. F ermenterinq 1 . Neisseria meningitidis gruppe Bil

Et rør indeholdende den lyophiliserede kultur af Neisseria meningitidis (opnået fra Dr. M. Artenstein, Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR), Washington, 15 D.C.) blev åbnet, og Eugenbroth (BBL) blev tilsat. Kultu ren bleu udstreget på chokoladeagarplader (BBL) og inkuberet ued 37 °C med 5% CO2 i 36 timer, efter hvilket tidsrum væksten blev høstet i 10¾ skummetmælksmedium (Difco), delt i aliquoter og frosset ved -70 °C. Orga-20 nismen blev positivt idenficeret ved agglutinering med specifikt antiserum leveret .af WRAIR og typeserum leveret af Difco.

Denne første passages kultur blev udstreget på chokoladeagarplader og inkuberet ved 37 °C med 5¾ CO2 i 18 25 timer, på hvilket tidspunkt væksten blev høstet i lOVs skummetmælksmedium, delt i aliquoter i mængder på 1 ml og frosset ved -70 °C. Organismen blev igen identificeret positivt ved agglutinering med specifikt antiserum leveret af WRAIR og typeserum leveret af Difco.

DK 171137 B1 35

Et medicinglas med kulturen fra den anden passage blev optøet og udstreget på 10 Columbia-fåreblodagarplader (CBAB-BBL). Pladerne blev inkuberet ved 37 °C med 5% CO2 i 18 timer, efter hvilket tidsrum væksten blev høstet 5 i 100 ml 10%'s skummetmælksmedium, delt i aliquoter med mængder på 0,5 ml og frosset ved -70 °C. Organismen blev positivt identificeret ved agglutinering med specifikt antiserum, ved sukkerfermentering og gramfarvning.

Et medicinglas med kuturen fra denne passage blev optø-10 et, fortyndet med Mueller-Hinton bouillon og udstreget på 40 Muel1er-Hinton-agarplader . Pladerne blev inkuberet ved 37 °C med 6% C 0 £ i 18 timer, efter hvilket tidsrum væksten blev høstet i 17 ml 10?i's skummetmælksmedium, delt i aliquoter med mængder på 0,3 ml og frosset ved 15 -70 °C. Organismen blev positivt identificeret ved gram- farvning, agglutinering med specifikt antiserum og oxidase-testen.

2. Fermentering og samling af cellepasta a. Podemediumudvikling 20 Podemediet blev dyrket fra to 0,5 ml frosne medicinglas med Neisseria meningitidis-gruppe B, B-ll fra det foregående (passage 4). Fire Mueller-Hinton-agar Blake-kol-ber blev podet, høstet ca. 18 timer senere og anvendt som podemedium for 5 liters Gotschlich's gærdialysat-25 medium ved pH 7,29. O.D. blev justeret til 0,065 ved 660 nm (Perkin Elmer). Organismen blev dyrket i fem 2 liters Erlenmeyer-kolbe (hver indeholdende 1 liter medium, se i det følgende) ved 37 °C i en ryster. O.D. blev vist ved 45, 75 og 120 minutters intervaller. Ca.

30 4 liter kultur med en O.D.^q på 0,81 (Spectronic 20) opnåedes.

DK 171137 B1 36

En 3 ml prøve blev taget til gramfarvning, isolerings-streger på CBAB, Mueller-Hinton og gærekstraktdextrosepla-der og agglutineringscheck. Alle reaktioner var tilfredsstillende .

5 b. 7P Liters podestoffermentor

Ca. 3600 ml podesto fkultur blev anvendt til at pode en steril 70 liters fermentor indeholdende 42,6 liter komplet produktionsmedium (se det følgende).

Betingelserne for den 70 liters fermentering omfattede 10 37 °C, 183 omdr./min. med 10 liter/min. luft og konstant pH-kontrol ved pH 7,0 i 5,5 timer.

Kulturen blev udhældt på Mueller-Hinton-agarplader, gærekstraktdextrose- og kaninblodagarplader (Merck) ved 37 °C og afprøvet for agglutinering med N-meningitidis 15 gruppe B antiserum. Væksten på Mueller-Hinton-agarpla der, gærekstraktdextroseplader og kaninblodagarplader var normal, og agglutineringsreaktionen var positiv.

For denne portion var den endelige O.D. 0,840 ved 660 micron efter 5,5 timers forløb.

20 c . 800 Liters produkt i onsfermentor

Ca. 46,2 liter podestofkultur blev anvendt til at pode en steril 800 liters fermentor indeholdende 568,2 liter komplet produktionsmedium (se i det følgende). Portionen blev inkuberet ved 37 °C, 100 omdr./min. med 25 60 liter/min. luft og konstant pH-kontrol på pH 7,0.

Før portionen blev inaktiveret blev kulturen udhældt på Mueller-Hinton-agarplader, gærekstraktdextroseplader og kaninblodagarplader ved 37 °C og afprøvet for agglutinering med N. meningitidis gruppe B antiserum. Væksten DK 171137 B1 37 på Mueller-HInton-agarplader, gærekstraktdextrose- og kaninblodagarplader var normal, og agglutineringsreaktionen var positiv. For denne portion var den endelige O.D. 2,24 13 timer efter podning.

3 3. Komplet medium for nefelometerkolber og 70- og 800- liters fermentorer__

Fraktion A

L-glutaminsyre 1,5 g/liter

NaCl 6,0 g/liter 10 Na2HP0^.vandfri 2,5 g/liter NH^Cl 1,25 g/liter KC1 0,09g/liter L-cystein-HCl 0,02 g/liter

Fraktion B (Gotschlich's gærdialysat) 15 1280 g Difco gærekstrakt blev opløst i 6,4 liter destille ret vand. Opløsningen blev dialyseret i "Amicon" DC-30 hulfiberdialyseenheder med tre HlOSM-patroner. Dialysa-tet og 384 g MgSO^.7H^0 og 3200 g dextrose blev opløst i dialysatet, og hele volumnet blev bragt op på 15 liter 20 med destilleret vand. pH blev indstillet til 7,4 med

NaOH og steriliseret ved filtrering gennem millipore (0,22 ^u) og sat til fermentoren indeholdende fraktion A.

For neflometerkolberne: 1 liter fraktion A og 25 ml 25 fraktion B blev tilsat, og pH blev indstillet til 7,0 til 7,2 med NaOH.

For 70 liter fermentatoren: 41,8 liter fraktion A og 900 ml fraktion B blev tilsat, og pH blev indstillet til 7,0 til 7,2 med NaOH.

DK 171137 B1 38

For 800 liter fermentatoren: 553 liter fraktion A og 15,0 liter fraktion B blev tilsat, og pH blev indstillet til 7,0 - 7,2 med NaOH.

d. Høst og inaktivering 5 Efter fuldstændig fermentering blev der sat phenol (0,5 vol.% slutkoncentration) til en separat beholder, hvortil, cellemediet derpå blev overført. Materialet blev holdt ved stuetemperatur under forsigtig omrøring, indtil kulturen ikke længere var levedygtig (ca. 24 timer).

10 e. Centri fugering

Efter ca. 24 timers forløb ved 4 °C blev 614,4 liter inaktiveret kulturmedium centrifugeret gennem Sharples-centrifuger. Vægten af cellepastaen efter phenoltilsætning var 3,875 kg.

15 B. Isolering

Trin 1: Vask af bakterielle celler

For hver isolering blev en aliquot på 200 g af ovennævnte 0,5¾ phenolinaktiverede pasta suspenderet i en 800 ml portion sterilt destilleret vand og omrørt magnetisk 20 til granulære suspensioner. De suspenderede celler blev pelletteret ved 20000 x g i 60 minutter ved 5 °C (Beckman 19 Ti-rotor, 14500 omdr./min.).

Trin 2: Ekstraktion

De vaskede celler blev suspenderet i 2000 ml 0,1 M Tris-25 0,01 M EDTA-puffer pH 8,5 med 0,5¾ natriumdeoxycholat (TED-puffer) med en Sorvall 2 kvart omnimixer ved instilling 3 i 60 sekunder. Den homogene suspension blev over- DK 171137 Bl 39 ført til 16 500 ml Erlenmeyer-kolber til ekstraktion ved 56 °C i et rystevandbad i 15 minutter (ved temperaturen).

Ekstrakten blev centrifugeret ved 20000 x g i 60 minut-5 ter ved 5 °C (Beckman 19 Ti-rotor, 14500 omdr./min.).

De viskøse overliggende væsker blev derpå dekanteret (totaltvolument = 1980 ml) og opbevaret ved 4 °C.

De ekstraherede cellepellets blev gensuspenderet i 2000 ml TED-puffer som beskrevet i det foregående. Suspensionen 10 blev ekstraheret i 15 minutter ved 56 °C og centrifu geret som i det foregående. De overliggende væsker blev dekanteret (volumen = 2100 ml) og opbevaret ved 4 °C.

Trin 3: Koncentrering ved ultrafiltrering

De overliggende væsker fra ekstraktion i trin 2 blev 15 samlet (totalvolumen = 4005 ml). 2 Liter af den samlede mængde blev anbragt i en 2 liters New Brunswick-fermenteringsbeholder knyttet til et Millipore "Pellicon"-filterapparat udstyret med to 0,45 micron durapor-membraner (overfladeareal 1/2 kvadratfeet). Den overliggende væske 20 fra ekstraktionen blev holdt ved 25 °C i fermenterings- beholderen under den 90 minutter lange koncentrerings-proces. Prøven blev koncentreret 10 gange ved et gennemsnitstransmembrantryk på 27,5 psi.

Trin 4: Samling og vask af serotypeproteinet 25 Retentatet fra trin 3 (205 ml) blev centrifugeret til pellettering af serotypeproteinet ved 160000 x g i 2 timer ved 5 °C (Beckman 45 Ti-rotor, 37000 omdr./min).

De overliggende væsker blev dekanteret og bortkastet.

DK 171137 B1 40

De opnåede proteinpellets blev vejet (8,12 g) og derpå suspenderet i TED-puffer (190 ml puffer, 20 ml/g pellet) manuelt med en glasstang og en "Dounce"-homogenisator. Suspensionen blev ekstraheret ved 56 °C i 15 minutter 5 (ved temperaturen) i en 500 ml Erlenmeyer-kolbe under rystning. Suspensionen blev centrifugeret ved 160000 x g i 2 timer ved 5 °C (Beckman 45 Ti-rotor, 37000 omdr./ min.). Den overliggende væske blev dekanteret og bortkastet (volumen = 190 ml). De opnåede pellets blev vasket 10 endnu en gang i 190 ml TED-puffer som i det foregående.

Trin 5: Udvinding af produkt

De vaskede proteinpellets fra trin 4 blev suspenderet i 100 ml destilleret vand med en glasstang og en "Dounce"-homogenisator for at sikre fuldstændig suspendering.

15 En Lovi/ry-proteinværdi på 17,0 mg/ml blev opnået for denne suspension. På dette stadie blev 200 mg af suspensionen reserveret til eksperimentel anvendelse. Den resterende massesuspension (91 ml) blev fortyndet til 8,0 mg/ml med 102,4 ml glasdestilleret vand. Den vandige 20 suspension blev centrifugeret ved 12000 x g i 15 minutter til klaring deraf for aggregater (Beckman 45 Ti-rotor, 10000 omdr./min.).

Det overliggende produkt blev fjernet omhyggeligt med pipette for at undgå den bløde aggregatpelle. Produk-25 tet blev mærket (volumen = 182,5 ml), og aliquoter blev afprøvet for sterilitet og pyrogener (sterilt produkt; ingen pyrogener). Produktet blev opbevaret ved 4 °C som en steril masse indtil anvendelse i konjugation, på hvilket tidspunkt det blev analytisk karakteriseret.

30 Udbyttet var 9,5 mg Lou/ry-protein/g oprindelig cellepas- t a.

DK 171137 B1 41 TABEL 2-1

Meningokok B serotype 2 proteinopløsning Kemiske prøvedata

Prøve Resul tat 5 Protein

Lowry 4,1 mg/ml

Nucleinsyre* RNA (Bial) 1,8¾ DNA(diphenylamin) 0,6¾ 10 Neutrale sukkerarter*

Anthron 1,05¾

Sialsyre* 3,0¾

Mo 1eky1vægt SDS-PAGE 40000d 15 *Beregnet som % af Lowry-protein.

Følgende procedurer blev anvendt ved udførelse af prøverne : 1. Protein - som i eksempel 1.

2. Nucleinsyre - farveudvikling blev iagttaget med

20 orcinolreaktionen (Bial), som svarede til 1,8% RNA

beregnet som en procentdel af proteinkoncentrationen. Diphenylaminprøven for DNA indikerede et 0,6% DNA-ind-hold beregnet som en procentdel af proteinet i masseopløsningen. 1 3. Neutrale sukkerarter - indholdet af neutralt sukker blev beregnet som en procentdel af protein fundet under anvendelse af den anthronco1 orimetri ske test.

DK 171137 B1 42 (Scott and Melvin, Anal. Chem. 2^5, 1656, 1953).

4. Sialsyre - sialsyreindholdet blev fundet under anvendelse af resorcinol-HCl-metoden (Svennerholm, Bio-chem. Biophys., Acta 2Λ, 604, 1957).

5 5. Molekylvægt - molekylvægten af det mercaptoethanol- denaturerede protein blev bestemt ved SDS-polyacry1-amidgelelektroforese (Nature 227:680 (1970), LKB Application Note 306).

EKSEMPEL 3 10 Fremstilling af H. influenzae type b polysaccharid N.

meningitidis B serotype ydre membranproteinkonjuqat I. Fremstilling af Dou/ex 50X8 (200 - 400 mesh) på tetra-n-butylammoniumformen_ 360 ml frisk Dou/ex 50X8 (200 - 400 mesh) stærkt sur 15 kationbytterharpiks (Bio-Rad) blev sat til en steril chromatografisk søjle og vasket med 1500 ml steriliseret, destilleret (sd) vand og opblødt natten over i 800 ml sd-vand. Harpiksen blev derpå sekventielt vasket med 1 liter 60:40 sd-vand:methanol, 1 liter 40:60 sd-vand: 20 methanol og 1 liter sd-vand..Harpiksen blev derpå steri liseret ved opblødning i 650 ml 3 N saltsyre (200 ml HC1, fortyndet til 800 ml med vand). Syreformen for harpiksen fik derpå lov at henstå 19,5 timer og blev derpå vasket fri for overskud af syre med vand. 1

Til denne søjle blev der derpå sat 700 ml af en 1:1 blanding af vand:40?i tetrabutylammoniumhydroxid, som blev percoleret gennem harpiksen, indtil effluenten var basisk (pH^lO). Harpiksen blev vasket fri for overskud af base med ca. 2 liter vand og derpå overført DK 171137 B1 43 til en steril beholder. Den endelige effluent var steril og pyrogenfri.

II. Fremstilling af tetra-n-butylammoniumsaltet af H. influenzae type b polysaccharid (Hib)_ 5 En 250 ml rundbundet kolbe udstyret med en magnetisk omrører blev ifyldt 3,29 g Hib og 84 ml vand. Blandingen blev omrørt i 20 minutter, og derpå blev der tilsat yderligere 15 ml vand. Omrøringen blev fortsat i yderligere 30 minutter, indtil al Hib var i opløsning. Hlb-10 opløsningen blev derpå ført til 150 ml Dou/ex 50X8 (200 - 400 mesh, tetrabutylammoniumform) i en 45 mm x 270 mm søjle. 10 ml vand blev anvendt som skyllemiddel. Søjlen blev toppet med vand, og der blev påført tryk med en håndpumpe (via et Millex FG 0,22 filter).

15 Der blev samlet 50 ml fraktioner i sterile "Nalgene"- centrifugerør (50 ml), og hvert rør blev prøvet for organisk materiale ved at anbringe en ca. 10 ^uliter aliquot på en silicagelplade under anvendelse af et sterilt smeltepunktskapillærrør. Pladen blev sprøjtet 20 med en CeIV(S0^)2/H2S0^-opløsning (1¾ CelVtSO^^ i lOSS's vandig svovlsyre), opvarmet på en varm plade, og de "organiske" aliquoter blev detekteret som sorte pletter.

Ialt 190 ml fra rør 2, 3, 4 og 5 blev kombineret i et sterilt 250 ml centrifugerør, blandet og derpå underop-25 delt ligeligt i seks tarerede 250 ml rundbundede kolber, mærket A til F. En aliquot blev afprøvet og fundet steril og pyrogenfri.

Indholdet af de seks kolber blev frosset i tøris/acetone, forbundet til to transportable vakuum-manifolds med 30 3 udgange og lyophiliseret. De nævnte vakuum-manifolds blev flyttet til den laminare strømningskappe, og kolberne blev fjernet og lukket inde i steriliserede papir- DK 171137 B1 44 poser. De blev opbevaret i en ekssikkator over ?2®5 og højvakuum ved -20 °C. En tør prøve havde samme som udgangsmaterialet Hib.

III. Fremstilling af polysaccharid/butandiamin-addukt 5 (HIb-BuA2)_

Trin A: Fremstilling af 1,4-butandiaminopløsninqen 1,46 g 1,4-butandiamin-dihydrochlorid blev anbragt i en 100 ml rundbundet kolbe og opløst i 58 ml vand. 5,0 ml 2,5 N NaOH blev tilsat, hvilket indstillede pH til 10 10,35. Opløsningen blev filtreret gennem et 0,22 ^u "Sybron-Nalge"-filter og sat til side.

Trin B: Aktivering af Hib og omsætning med 1,4-butandiamin

Til kolbe A (fra afsnit II) indeholdende 0,64 g tetra-n-buty1ammoniumsalt af PRP blev der sat en magnetisk omrø-15 rerstang og 17,5 ml dimethyl formamid. Blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 25 minutter, efter hvilket tidsrum alt materiale syntes at være i opløsning.

80 mg carbonyldiimidazol blev afvejet i en steril 6 ml serumflaske og derpå tilsat på én gang til DMF-opløs-20 ningen. Kolben blev derpå forsynet med hætte og opløs ningen blev omrørt ved stuetemperatur i 35 minutter.

I løbet af dette tidsrum blev 32 ml af den under A fremstillede butandiaminopløsning sat til en 100 ml rundbundet kolbe indeholdende en magnetisk omrørerstang og 25 omrørt i et isbad i ca. 5 minutter.

Efter de 35 minutters omrøringstid blev DMF-opløsningen med en pipette sat til den kolde 1,4-butandiaminopløsning. Omrøring i isbadet blev fortsat i 15 minutter, på hvilket tidspunkt isbadet blev fjernet, og omrøring blev fortsat DK 171137 B1 45 i yderligere 17 minutter.

Trin C; Dialyse og 1yophi1 ise ring

Opløsningen blev derpå overført til autoklaverede "Spectro-por" 2 dialyserør (cyl. vol. 0,21 ml/mm; 17 inch) og 5 blev dialyseret i et rum med 4 °C. Først blev opløsningen dialyseret mod 8 liter 0,01 M phosphatpuffer ved pH 7,0 i 5 timer, derpå dialyseret to gange mod en frisk 8 liters phosphatpuffer, først i 5 timer, derpå i 11 timer. Endelig blev opløsningen dialyseret mod 18 liter 10 vand i 6 timer.

Dialysatet (ca. 125 ml) blev underopdelt i to 250 ml rundbundede kolber efter udtagelse af en aliquot til sterilitets- og py rogenafprøvning (resultater: steril og pyrogenfri). Indholdet af disse kolber blev frosset 15 i tøris/acetone og lyophiliseret ved metoden ifølge sektion II i det foregående. Der opnåedes ialt 480 mg.

Fluorescaminprøven indikerede 468 nmol NH2/mg.

IV. Fremstilling af polysaccharid/butandiamin/bromacet-amid (Hlb-BuA^-BrAc)_ 20 Trin A: Fremstilling af p-nitrophenylbromacetat 6,30 g (45 mmol) bromeddikesyre og 6,25 g (45 mmol) p-nitrophenol blev anbragt i en 250 ml rundbundet kolbb og opløst i 50 ml methylendichlorid (CH2CI2)· Opløsningen blev omrørt i et isbad i 10 minutter, og derpå blev der 25 tilsat 10,3 g (50 mmol) dicyclohexylcarbodiimid opløst i 10 ml CH2CI2· Reaktionsblandingen blev derpå omrørt ved 4 °C i 17,25 timer.

Det udfældede dicyclohexylurinstof blev derpå filtreret DK 171137 B1 46 og filtratet koncentreret til tørhed i vakuum. Den gule rest blev sat til 35 ml 1-chlorbutan, derpå omkrystalliseret, hvilket gav 6,5 g produkt, smp. 85 - 87 °C, og dette produkt blev sat til 100 ml cyclohexan, derpå 5 omkrystalliseret, hvilket gav 4,59 g p-nitrophenylbrom- acetat, smp. 86 - 87 °C.

Analyse for CgH^NO^Br: beregnet: C 36,92; H 2,30; N 5,38; Br 30,77 fundet : C 37,66; H 2,48; N 5,28; Br 30,57.

10 H' NMR-spektret var i overensstemmelse dermed.

Trin B: Reaktion af Hlb-BuA^ 380 mg HIb-BUA2, fremstillet under sektion III i det foregående (fra 2 kolber), blev opløst i 37 ml af en pH 9 ,15 puffer i en 250 ml rundbundet kolbe med en magne-15 tisk omrørerstang.,Til denne opløsning blev der sat 346 mg p-nitrophenylbromacetat (fra trin A i det foregående) i 9 ml acetonitril, og blandingen blev omrørt ved 4 °C i 24 timer, derpå overført til 18" dialyserør ("Spectropor" 2, se sektion III). Denne opløsning blev 20 derpå dialyseret mod 18 liter vand i 5,25 timer og derpå mod en frisk 18 liters portion vand i 17,25 timer (begge dele ved 4 °C) .

De 100 ml dialysat blev i sekvenser filtreret gennem et 0,45 yU "Sybron Nalge"-filter og et 0,20 filter.

25 Derpå blev det delt ligeligt i seks 100 ml rundbundede kolbfer, så frosset og lyophi1iseret som i sektion II.

Ialt 0,28 g Hlb-BuA^-BrAc blev opnået. Fluorescamin-prøven indikerer 128 nmol NH2/mg, hvilket resulterer i 340 nmol bromacetylgrupper/mg ifølge differensen.

30 Nephelometriprøven indikerer den samme antigenicitet DK 171137 B1 47 som for udgangspolysaccharidet.

V. Konjugation af Hlb-BuA^-BrAc til funktionaliseret N. meningitidis membranprotein (NMP)_

Trin A : Funktiona1 isering af NMP med N-acetyl homocyste-5 inthiolacton_

Til en 6 ml serumflaske indeholdende 42 mg ethyldiamin-tetraeddikesyre og 8 mg dithiothreitol blev der sat 5 ml pH 11,3 boratpuffer. 3,8 ml af ovennævnte opløsning blev sat til en 30 ml rundbundet kolbe og 11,5 ml af 10 en opløsning af Neisseria meningitidis ydre membranpro tein (NMP) blev tilsat. pH af den resulterende blanding blev indstillet til 11,39 med 40 - 50 ^uliter 2,5 N NaOH.

Flasken blev lukket med en serumprop af svampetypen, 15 og luften blev erstattet med nitrogen under anvendelse af en Fi restone-vent il (ACE Glass Co.). 53 mg N-acetyl-homocysteinthiolacton blev tilsat i en nitrogenboks, og den resulterende opløsning henstod i N2~atmosfæren ved stuetemperatur i 16,7 timer. Denne opløsning blev 20 derpå ført til en søjle indeholdende 120 ml "Sephadex" G25 (fin), som blev kørt i nitrogenboksen. Eluering skete med pH 8 phosphatpuffep, og 5 ml fraktioner blev samlet og afprøvet ved Ellman-testen for thioler. Basis-linieseparation af høj-moleky1 vægt sthίο 1 (dvs. protein) 25 fra materiale med lav molekylvægt blev foretaget.

Trin B; Konjugering

De højmolekylære fraktioner blev kombineret og sat til én af 50 ml kolberne indeholdende 0,06 g HIb-BuA^-BrAc (sektion IV). Denne opløsning henstod i N^-boksen ved 30 stuetemperatur i 6 timer og blev ført til et sterilt DK 171137 B1 48 "5pectropor"-dialyserør og dialyseret ved 4 °C mod 18 liter vand i 15 timer og derpå dialyseret mod endnu 18 liter vand i 24 timer.

Trin C. Centri fuqerinq 5 Dialysatet (ca. 32 ml) blev overført med en pipette i 25 ml og 7 ml fraktioner til to polycarbonatcentrifuge-rør og centrifugeret ved 4 °C i 2 timer ved 37000 omdr./ min. (100000 x g) i en Beckman Ti 60-rotor. De overliggende væsker blev dekanteret, og de opnåede pellets blev 10 overført til en "Dounce"-homogenisator med ca. 8 ml vand, homogeniseret og sendt tilbage til et af centrifuge-rørene. Dette rør blev fyldt til 23 ml med vand, hvilket gav en komplet resuspension, og røret blev gencentrifugeret ved 37000 omdr./Min. (100000 x g) ved 4 °C i 2 15 timer. De andre overliggende væsker blev dekanteret, og de tilsvarende pellets blev "Dounce"-homogeniseret i 8 ml vand. Homogenisatet blev overført til et sterilt 15 ml "Nalge"-centri fugerør og fortyndet til 15 ml med vand.

20 Efter henstand ved 4 °C natten over sås en lille smule flokkulent fast stof, og det blev fjernet ved en kort (5 min.) centrifugering i en klinisk centrifuge ved ca. 2500 omdr./min.

Ovennævnte aktivering, konjugering og centrifugerings-25 procedurer blev gentaget to gange på lignende måde.

Der blev analyseret for protein og polysaccharidindhol, S-carboxymethylhomocystein (SCMHC), lysin forhold , sterilitet og pyrogenicitet. Alle prøver var sterile og pyro-genfri. De andre resultater fremgår af den efterfølgende 30 tabel.

DK 171137 B1 49

Polysaccharid Protein

Forsøg _yuq/ml_ ^uq/ml Forhold SCMHC/lysin 1 105 1210 0,09 0,011 2 154 1700 0,09 0,019 5 3 166 1800 0,09 0,027

Ensartetheden af forholdet mellem polysaccharid og protein, som karakteriserer konjugatet, bekræfter reproducerbarheden af processen, og forholdet mellem S-carboxymethyl-homocystein og lysin er en indikation for reakt ionseffek-10 tiviteten, med et resultat større end 0 som bevis for covalensen af bindingen mellem de covalent-modificerede polysaccharider og proteiner.

Opløsningerne blev kombineret til en klinisk portion og lyophi1 i seret i nærværelse af lactose (20 ^ug/ml 15 polysaccharid/4 mg/ml lactose).

EKSEMPEL 4

Fremstilling af H. influenzae type b polysaccharid-N. meningitidis B serotype ydre membranproteinkonjugat "capped" med N-acetylcyteamin_ 20 Fremstillingen af funktionaliseret polysaccharid, ΗIb-BuA2~BrAc, er den samme som i eksempel 3 (sektion I til IV). Fremstillingen af funktionaliseret NMP er den samme som i eksempel 8 (for fremstillingen af trin B ( 111 )-NMP-konjugat) sektion IVA). 1 2 3 4 5 6

Til en kolbe indeholdende 4 ml thioleret protein (5,6 2 ^umol SH ifølge E1lman-prøve) blev sat 59 mg HIb-BuA2~BrAc 3 (300 nanomol bromacetyl ifølge differens). Kolben blev 4 forseglet med en membran, afgasset, idet luften blev 5 erstattet med nitrogen, og opløsningen henstod i 18,5 6 timer. 6 ml vand blev tilsat, og opløsningen blev over- DK 171137 B1 50 ført til et 10 ml polycarbonatcentrifugerør og centrifugeret i 2 timer ved 43000 omdr./min. i en Beckman 73 Ti-rotor ved 4 °C. Den overliggende væske blev fjernet, og pellet blev resuspenderet med en "Dounce"-homogenisator 5 i 10 ml af en pH Θ, 0,1 M phosphatpuffer indeholdende 106 mg N-acetylcysteamin, opløsningen blev afgasset og henstod ved stuetemperatur i 19,5 timer.

Den blev derpå centrifugeret som i det foregående (43000 omdr./min., 4 °C, 2 timer, 75 Ti-rotor). Pellet blev 10 suspenderet (uden homogenisering) i 9,7 ml vand og gencen trifugeret som i det foregående. Den resulterende pellet blev gensuspenderet med homogenisering i 25 ml vand og derpå fortyndet til 30 ml med vand, hvilket gav en vandig suspension af det "capped" produkt.

15 Analyse af konjugatet var:

Polysaccharid- Protein- HIB/protein- koncentration koncentration koncentration 188 yug/ml 1200 ^ug/ml 0,157

Sinco: SCMHC/lysin = 0,096 20 S-carboxymethylcysteamin/Lysin = 0,20.

EKSEMPEL 5

Antistofrespons i dyr med H. influenzae type b polysaccha-rid-N. meningitidis B serotype ydre membranproteinkonjuqat

Et H. influenzae type b polysaccharid-N. meningitidis 25 B serotype ydre membranproteinkonjugat fremstillet og lyophiliseret ifølge proceduren i eksempel 3 blev afprøvet for immunogenrespons i ICR/Ha-mus og Rhesus-aber med forskellig alder, og resultaterne blev samlet i tabel 2 og 3.

DK 171137 B1 51

Analysen af konjugatet var:

Polysaccharid- Protein- Ps/protein- Udbytte koncentration koncentration f orhold_ P s 276 yug/ml 2,38 mg/ml 0,12 6,l?i 5 TABEL 5-1

Serumantistofrespons for ICR/Ha-mus med forskellig alder immuniseret med H. influenzae type b polysaccharid/pro- tein-kon.juqater_ RIA-titer (GMT) ng ab/ml 10 Prøve Mus, alder, dage* 7 21 28 35 H. flu polysaccharid/ protein-konjugater 282** 2111 8645 15860 201** 1 2 3 4 5 6 * alder på tidspunktet for den første injektion; mus 2 injiceret s.c. med 2 ^ug/0,1 ml på dag nr. 0, 14; 3 tappet for blod på dag nr. 21.

4 ** separat kuld; 7-8 mus i alle grupper.

5

Styrken af H. influenzae type b polysaccharidkonjugat 6 blev afprøvet i mus og resultaterne vist i tabel 5-2.

Konjugatet viste sig at være yderst immunogent.

DK 171137 B1 52 TABEL 5-2

Studier over thymisk afhængighed i nøgne (athymiske) mus immuniseret med H. influenzae type b polysaccharid/ protein-konjugater.

5 Dosis RIA-titer (GMT) ng ab/ml yUg Nu/Nu

Prøve Polysaccharid Mus* Mus* H. flu polysaccharid/ (1) 2,5 1.802 11.362 protein-konjugater (2) 1.304 8.712 10 Saltvandskontrol (1) - 50 (2) 55 *mus injiceret subcutant på dag nr. 0 og 14; tappet for blod på dag nr. 21.

Responset i Nu/Nu mus udgjorde som gennemsnit ca. 15¾ 15 af responset i Nu/+ mus, hvilket indikerede, at konjuga- tet var et thymusafhængigt antigen.

DK 171137 B1 53 TABEL 5-3

Serumantistofrespons for Rhesus-aber immuniseret med H. influenzae type b polysaccharid/protein-konjugater

Rhesus- RIA-titer (GMT) ng ab/ml 5 aber Dosis dage alder* polysaccharid 0 14 28 42 2-3 måneder 20 /ug 50 116 195 3036 4 måneder 20 ^ug 50 414 437 1548 18 måneder 20 /ug 124 5858 4785 7447 10 *Tre aber pr. gruppe.

Som vist i tabel 2 inducerede H. influenzae type b poly-saccharid-konjugat et højt immunogent respons i Rhesusaber af forskellig alder.

EK5EMPEL 6 15 Konjugationen af pneumokok-polysaccharid type 19F og ydre membranprotein fra Neisseria meningitidis_ I: Fremstilling af tetra-n-butylammoniumsaltet af pneu-mokok-polysaccharid type 19F_

En 25 ml rundbundet kolbe udstyret med en magnetisk 20 omrører blev tilsat 50 mg polysaccharid type 19F (Merck) og 5 ml H^O, og blandingen blev omrørt i 20 minutter. Opløsningen blev derpå påført en 3 ml søjle af "Dou/ex" 50 x 8 (200 - 400 mesh, tetrabutylammoniumform), elueret med vand og samlet i en 25 ml Erlenmeyer-kolbe. 1

Opløsningen blev prøvet for polysaccharidindhold på DK 171137 B1 54 silicagelplader sprøjtet med CeIV(SO^)2/H2S0^-opløsning, derpå opvarmet på en varmeplade, hvilket resulterede i, at de aliquoter, der indeholder polysaccharid, bliver detekterbare som sorte pletter. Opløsningen indeholdende 5 polysaccharid 19F blev frysetørret, og der blev udvundet 5 2 mg.

II. Reaktion af tetrabutylammoniumsaltet af pneumokok- typen 19F med carbonyldiimidazol efterfulgt af omsæt-ninq med 1,4-butandiamin (19F-BuA^)_ 10 Trin A; Fremstilling af 1,4-butandiaminoplosninqen 40 mg 1,4-butandiamin-dihydrochlorid blev opløst i 1,0 ml (^0 og indstillet til pH 9,15 med 2,5 N NaOH.

Trin B: Aktivering af type 19F polysaccharid og omsæt-ninq med 1,4-butandiamin_ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Til en 25 ml rundbundet kolbe indeholdende 20 mg type 2 19F polysaccharid på tetrabutylammoniumform blev der 3 sat en magnetisk omrørerstang og 4 ml dimethylsulfoxid 4 (DMSO). Blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 5 20 minutter, på hvilket tidspunkt alt materiale var 6 i opløsning. 5 mg carbonyldiimidazol blev tilsat, og 7 reaktionsblandingen blev omrørt i 30 minutter ved stuetem 8 peratur. I løbet af dette tidsrum blev den under trin 9 A fremstillede 1,4-butandiaminopløsning sat til en 25 10 ml rundbundet kolbe med en magnetisk omrørerstang og 11 omrørt i et isbad i ca. 5 minutter. Efter de 30 minutters 12 omrøringstid blev DMSO-opløsningen sat til den kolde 13 1,4-butandiaminopløsning med en pipette. Omrøring i 14 isbadet blev fortsat i 15 minutter, efter hvilket tids 15 rum isbadet blev fjernet, men omrøring blev fortsat 16 i yderligere 15 minutter ved stuetemperatur.

DK 171137 B1 55

Trin C: Dialyse og lyophiliserinq

Opløsningen blev derpå overført til "Spectropor" 2 dialyserør og dialyseret i et rum med 4 °C under omrøring. Opløsningen blev først dialyseret mod 4 liter 0,01 M 5 phosphatpuffer ved pH 7,0 i 8 ’timer, derpå dialyseret mod 4 liter 0,01 M phosphatpuffer ved pH 7,0 i 8 timer. Endelig blev opløsningen dialyseret mod 4 liter vand 1 6 timer. Opløsningen blev derpå lyophiliseret, og 19 mg af butandiaminderivatet af type 19F polysaccharid 10 (I9F-BUA2) blev udvundet. Fluorescaminprøven indike rede 100 nmol NH2/mg materiale.

III. Omsætning af 19F-BUA2 med p-nitrophenylbromacetat Trin A: Omsætning af I9F-BuA2 15 mg 19F-BuA2 fremstillet under II i det foregående 15 blev suspenderet i 2 ml pH 9,15 puffer i en 25 ml rundbun- det kolbe med en magnetisk omrørerstang og omrørt i 10 minutter, indtil alt materiale var gået i opløsning.

Til denne opløsning blev der sat 15 mg p-nitrophenylbrom-acetat opløst i 0,2 ml acetonitril. Blandingen blev 20 omrørt ved 4 °C i 24 timer og overført til Spectropor 2 dialyserør. Der blev dialyseret to gange mod 4 liter H2O. Prøverne blev frysetørret, og 9 mg af det N-brom-acetylerede derivat af 19F-BuA2 (19F-BuA2~BrAc) blev opnået. 1

Fluorescaminprøve indikerede 57 nmol NH2/mg, hvilket resulterede i 43 nmol bromacetylgrupper/mg, ifølge differensen.

DK 171137 B1 56 IV. Konjugation af 19F-BuA2~BrAc til funktionaliseret ydre membranprotein af Neisseria Meningitidis (NMP)

Trin A i Funktionalisering af NMP med N-acetylhomocystein-thiolacton_ 5 43 mg ethylendiamintetraeddikesyre og 8 mg dithiothreitol blev opløst i 5 ml mættet boratpuffer, pH 11,30. 0i,i4 ml af ovennævnte opløsning blev ført til et 15 ml centrifugerør, og 1 ml (13,7 mg) af en opløsning af Neisseria meningitidis ydre membranprotein (NMP) blev tilsat.

10 Opløsningen blev afgasset og anbragt under N2~atmos- fære ved stuetemperatur i 16 timer. Opløsningen blev derpå fortyndet til et totalvolumen på 2,5 ml ved tilsætning af 1,1 ml pH 8,0 phosphatpuffer. Denne opløsning blev derpå påført en pD10-kolonne ("Sephadex" G25M), 15 som var blevet præ-ækvilibreret under N2 med pH 8,0 phosphatpuffer. Prøven blev elueret med 3,5 ml pH 8,0 phosphatpuffer. Thiolindhold blev bestemt ved Ellman-prø-ven og fundet at være 1,89 ^umol/prøve. 2,5 ml af prøven blev påført en anden PdlO søjle også præ-ækvilibreret 20 med pH 8,0 phosphatpuffer. Den blev elueret med 3,5 ml pH 8,0 phosphatpuffer. Thiolindhold ifølge Ellman-prøve var 0,44 ^umol/prøve.

Trin B: Konjugation

Til 15 ml pyrex-centrifugerøret indeholdende proteinop-25 løsningen blev der sat 9 mg 19F-BuA2~BrAc fra III i det foregående. Denne opløsning henstod i en N2~boks ved stuetemperatur i 6 timer. Den blev derpå ført til Spectropor-dialyserør og dialyseret ved 4 °C mod 4 liter vand i 8 timer og derpå igen mod 4 liter i 8 timer.

30 En aliquot blev frysetørret til aminosyreanalyse.

DK 171137 B1 57

Fundet: lys 0,141 yumol/mg SCMHC 0,0062 ^umol/mg med denne værdi større end 0 som bevis for covalens.

5 Trin C: Centrifugering

Dialysatet (ca. 10 ml) blev med en pipette overført til et polycarbonatcentrifugerør og centrifugeret ved 4 °C i 2 timer ved 37000 omdr./min. (100000 x g) i en Beckman Ti 60-rotor. De overliggende væsker blev udhældt, 10 og pellets blev overført til en homogenisator med ca.

2 ml vand, hvor de blev homogeniseret og sendt tilbage til et af centrifugerørene. Det blev fyldt til 10 ml med vand og gencentrifugeret ved 37000 omdr./min.

(100000 x g) ved 4 °C i 2 timer. Den anden overliggende 15 væske blev hældt fra, og pellet homogeniseret i 8 ml vand. Homogenatet blev opbevaret i et 15 ml plastcentri-fugerør og afprøvet for immunogenicitet.

TABEL 6-1

Serumantistofrespons af ICR/Ha mus immuniseret med pneumo-20 kok 19F-meningokok B serotype ydre membranprotein-konju- gat

Dosis /ug

Prøve Polysaccnarid RIA-titer (GMT) ng ab/ml1

Psl9F-Pro 25 konjugat 0,5 17.338

Mus injiceret i.p. på dag nr. 0, 7 og 28; tappet for blod på dag nr. 35.

DK 171137 B1 58

Som i tabel 6-1 viste konjugatet sig at være yderst immunogent.

EKSEMPEL 7

Konjugationen af pneumokok-polysaccharid type 19Γ og 5 tre gange renset hampfrøqlobulin (edestin)_ I: Fremstilling af tetra-n-butylammoniumsaltet af pneu-mokok type 19F polysaccharid _

En 50 ml rundbundet kolbe udstyret med en magnetisk omrørerstang blev tilført 105 mg polysaccharid type 10 19F (Merck) og 6 ml vand. Blandingen blev omrørt i 20 minutter, og opløsningen blev ført til en 6 ml søjle af "Dowex" 50 x 8 (200 - 400 mesh), tetra-n-butylammoni-umform). Søjlen blev elueret med vand, og eluanten blev samlet i en 50 ml Erlenmeyerkolbe. Eluanten blev prøvet 15 for polysaccharidindhold på silicagelplader, sprøjtet med CelV(S0^)2/H2S0^-opløsning og derpå opvarmet på en varm plade. De aliquoter, der indeholdt polysaccharid, blev detekteret som sorte pletter. Opløsningen indeholdende polysaccharid 19F blev frysetørret, og 112 mg 20 af tetra-n-butylammoniumsaltet af 19F blev udvundet.

II: Omsætning af tetra-n-butylammoniumsalt af pneumokok type 19F med carbonyldiimidazol efterfulgt af omsæt-ninq med 1,4-butandiamin_

Trin A: Fremstilling af 1,4-butandiaminopløsninqen 25 175 mg 1,4-butandiamin-dihydrochlorid blev opløst i 7 ml vand, og pH for opløsningen blev indstillet til 9,5 med 2,5 N NaOH.

DK 171137 B1 59

Trin B: Aktivering af type 19F polysaccharid og omsæt-ninq med 1,4-butandiamin_

Til en 50 ml rundbundet kolbe indeholdende 112 mg type 19F polysaccharid på tetrabutylammoniumformen blev der 5 sat en magnetisk omrørerstang og 5 ml dimethylsulfoxid (DMSO). Blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 10 minutter, hvorefter alt materiale var i opløsning.

13 mg carbonyldiimidazol blev tilsat, og reaktionsblandingen blev omrørt 35 minutter ved stuetemperatur. I 10 løbet af dette tidsrum blev 1,A-butiandiaminopløsningen fremstillet i trin A i det foregående sat til en 50 ml rundbundet kolbe med en magnetisk omrørerstang og anbragt i et isbad, og opløsningen blev omrørt i ca.

5 minutter. Efter de 35 minutters omrøringstid blev 15 DMSO-opløsningen tilsat med en pipette til den kolde 1,A-butandiaminopløsning. Omrøring blev fortsat i 15 minutter, hvorefter isbadet blev fjernet, og genoptaget i yderligere 15 minutter med opløsningen ved stuetemperatur.

20 Trin C: Dialyse og lyophiliserinq

Opløsningen blev derpå dialyseret i Spectropor 2 dialyserør ved A °C under omrøring. Opløsningen blev først dialyseret mod A liter 0,01 M phosphatpuffer ved pH

7,0 i 8 timer, derpå dialyseret mod A liter 0,01 M phos-25 phatpuffer ved pH 7,0 i 8 timer. Endelig blev opløsnin gen dialyseret mod A liter vand i A timer. Opløsningen blev derpå lyophiliseret, og 80 mg af butandiaminderivatet af type 19F polysaccharid (I9F-BUA2) blev udvundet. Fluorescaminprøven indikerede 77 nmol NH2/mg.

DK 171137 B1 60 III. Omsætning af 19Γ BuA^ med p-nitrophenylbromacetat Trin A: Omsætning af 19F-BuA^ 50 mg 19F-BuA2 fremstillet i sektion II i det foregående blev suspenderet i A ml pH 9,15 puffer i en 25 ml rundbun-5 det kolbe med en magnetisk omrørerstang og omrørt 10 minutter, indtil alt materiale var i opløsning. Til denne opløsning blev der sat 50 mg p-nitrophenylbromacetat opløst i 0,5 ml acetonitril. Blandingen blev omrørt ved A °C i 2A timer og derpå overført til Spectropor 10 2 dialyserør. Der blev dialyseret to gange mod A ml vand. Prøven blev derpå frysetørret, og AA mg af N-brom-acetylderivatet af 19F-BuA2 (19F-BuA2~BrAc) blev opnået.

Fluorescaminprøve indikerede 7,5 nmol NH2/mg resulterende i 69,5 nmol bromacetylgrupper/mg ifølge forskel.

15 IV. Konjugation af 19F-BuA2~BrAc til funktionaliseret og renset hampfrøglobulin (edestin)__

Trin A: Rensning af edestin ved højtryksvæskechroma-tografi (HPLC)_ 2A0 mg to gange krystalliseret edestin fra hampfrø (Sigma) 20 blev opløst i A ml 3 M guanidin, pH 7,0. Prøven blev rystet kraftigt, og 0,1 ml mercaptoethanol blev tilsat.

Efter omrystning dannedes en hel del skum.

Prøven fik lov at henstå ved stuetemperatur i 1 time og blev derpå centrifugeret i en laboratoriecentrifuge 25 til fjernelse af skummet og filtreret gennem et "Millex"- GV 0,22 micron-filter (Millipore). Halvdelen af prøven (2 ml, 120 mg) blev derpå injiceret i en præparativ molekylsigtekolonne størrelse TSK 3000 med følgende parametre: strømningshastighed: 1 ml/min., "λ g : 280 nm, 30 opløsningsmiddel: 3 M guanidin, UV-område: 2,0, diagram- DK 171137 B1 61 hastighed: 0,25 cm/min.

De passende fraktioner détekteret ved UV blev samlet og dialyseret i Spectropor 2 dialyserør mod 30 liter vand i 16 timer. Udskiftning af 3 M guanidin med vand 5 under dialyse forårsagede udfældning af det rensede edest in.

Hele prøven blev overført fra dialyseposen til et centrifugerør og centrifugeret i en laboratoriecentrifuge i 5 minutter. Pellet, som indeholder det rensede edestin, 10 blev samlet og tørret under vakuum over ^2^5* ^en anc*en halvdel af den oprindelige prøve (2 ml, 120 mg) blev derpå indsprøjtet og ført gennem identiske trin. 110 mg renset edestin blev isoleret. Det rensede edestin blev derpå opløst i 2,0 ml 3 M gii/anidin, centrifugeret, 15 filtreret og genchromatograferet yderligere to gange under anvendelse af samme procedure. Efter tre rensninger blev ialt 18 mg isoleret, som var en enkelt spids på en analytisk B TSK 3000 kolonne.

Trin B : Funktional i serinq af tre gange renset edestin 20 3 mg ethylendiamintetraeddikesyre og 5 ^uliter mercapto- ethanol blev anbragt i 1 ml 3 M guanidin. Til denne opløsning blev der sat 14 mgtre gange renset edestin fremstillet i trin A i det foregående. pH for opløsningen blev indstillet til 9,5 ved 20 ^uliter 2,5 M NaOH, og 25 opløsningen blev afgasset og anbragt under N^· 13 mg N-acetylhomocysteinthiolacton blev tilsat i en nitrogen-boks, og den resulterende opløsning henstod i ^atmosfære ved stuetemperatur i 16 timer.

Opløsningen blev derpå fortyndet til et slutvolumen 30 på 2,5 ml ved tilsætning af 1,4 ml 3 M guanidin og over ført til en PD10 kolonne ("Sephadex" G25M, Pharmacia), DK 171137 B1 62 som var blevet præ-ækvi 1 ibreret under med 3 M guanidin. Prøven blev elueret med 3,5 ml 3 M guanidin. Thiolindhold blev bestemt ved Ellman-prøven og fundet til ca. 4,38 ^umol/prøve. 2,5 ml af prøven blev påført en anden PD10-5 kolonne, også præ-ækvilibreret med 3 M guanidin og derpå elueret med 3,5 ml 3 M guanidin. Thiolindholdet ifølge Ellman-prøve var 3,24 ^umol/prøve.

Trin C; Kon.iuqerinq

Til centrifugerøret indeholdende edestinopløsningen 10 blev der sat 7 mg acetyleret type 19F polysaccharid (^F-BuA^-BrAc) (sektion III). Denne opløsning fik lov at henstå i N^-boksen ved stuetemperatur i 6 timer.

Den blev derpå overført til Spectropor 2 dialyserør og dialyseret to gange, hver gang mod 4 liter vand i 15 8 timer. Hele prøven blev frysetørret, og en lille smule blev anvendt til aminosyreanalyse.

Fundet: lysin 0,105 ^umol/mg, SCMHC 0,003 ^umol/mg, hvilket viste covalensen af bindin-20 gen mellem de modificerede polysaccharider og proteiner.

EKSEMPEL 8

Fremstilling af streptokok agalactiae Strep B-type III) polysaccharid -N. meningitidis B serotype ydre membran-proteinkon.juqat_ 25 I: Fremstilling af tetra-n-butylammoniumsalt af Strep B (III)_ 100 mg af Strep B (III) polysaccharid (fremstillet i alt væsentligt efter metoden ifølge US patentskrift DK 171137 Bl 63 nr. 4 413 057 udstedt til Carlo et al.) blev opløst i 4 ml vand og påført en 7 ml søjle af "Dowex" 50 x 8 (200 - 400 mesh) kationbytterharpiks på tetrabutyl-ammoniumform. Søjlen blev elueret med vand, og fraktio-5 nerne (3 ml) blev checket for organisk materiale ved

Ce IV(SO^ ) 2/H2S0^-metoden. De passende fraktioner blev lyophiliseret og 100 mg tetra-n-butylammoniumsalt af Strep B (III) polysaccharid blev opnået.

II: Fremstilling af polysaccharid-butandiamin-addukt 10 (Strep B (III)-BuA )_ 50 mg af trin B (III) tetrabutylammoniumsaltet blev suspenderet i 2,5 ml tør dimethylformamid (DMF) og omrørt i 10 minutter indtil fuldstændig opløsning var opnået.

5 mg 1, 5-carbonyldiimidazol blev derpå tilsat på én 15 gang, og opløsningen blev opbevaret ved stuetemperatur i 35 minutter. Denne opløsning blev derpå sat til 3 ml af en opløsning indeholdende 80 mg 1,4-butandiamin-2 HC1, hvis pH var blevet indstillet til 10,3 med 2,5 NaOH, og som var blevet afkølet i et isbad. Den resulte-20 rende blanding blev opbevaret i isbadet i 15 minutter og ved stuetemperatur i yderligere 15 minutter.

Blandingen blev derpå dialyseret mod 4 liter 0,1 M phos-phatpuffer (pH 7) 3 gange i 5 timer henholdsvis 17 timer og 7 timer. En endelig dialyse mod 4 liter vand i 18 25 timer blev efterfulgt af lyophilisering, som gav 32 mg af Strep B (111 )-butandiaminadduktet, Strep B (III) —

BuA2* Fluorescaminprøven indikerede 212 nmol NH^/mg.

III. Fremstilling af polysaccharid/butandimain-bromacet-amid (Strep B (111)-BuA^-BrAc)_ 1 26,8 mg Strep B (111)-BuA2"BuAc blev opløst i 2,5 ml pH 9 boratpuffer, og 28 mg p-nitrophenylbromacetat og DK 171137 B1 64 0,4 ml acetonitril blev sat til· opløsningen. Blandingen blev omrørt ved 4 °C i 23,5 timer og derpå dialyseret ved 4 °C mod 30 liter vand i 17 timer og derpå 4 liter vand i 6 timer. Lyophilisering gav 27 mg Strep B ( III) — 5 BuA^-BuAc. Fluorescaminprøve indikerede 35 nmol Nt^/mg resulterende i 177 nmol/mg bromacetyl ifølge forskel. Materialet blev vist at være fuldt ud antigent ved nefelo-metri.

IV. Konjugation af Strep B (111 )-BuA2~BrAc til funktiona-10 liseret N. meningitidis membranprotein (NMP)_ A. Funktionalisering af NMP: 10 ml af en NMP-opløsning (5 mg/ml) blev sat til et polycarbonatcentri fugerør og centrifugeret ved 43000 omdr./min. i 2 timer ved 4 °C i en Beckman 75 Ti-rotor. Den overliggende væske 15 blev fjernet, og pellet blev gensuspenderet i 4 ml af et pH 11,3 boratpuffer indeholdende 33,6 mg ethyldiamin-tetraeddikesyre-dinatriumsalt , 6,4 mg dithiothreitol.

Resuspensionen blev udført med en Dounce-homogenisator. Blandingen blev ført til et centrifugerør, capped med 20 en serumkappe, afgasset og nitrogeneret, og dertil blev der sat 55 mg N-acetylhomocysteinthiolacton. Den resulterende blanding henstod under N2 i 18 timer ved stuetemperatur. pH blev derpå indstillet (under N2) til 7,25 med 2,6 ml 1 M KH2P0^ og 2,6.ml 0,1 M phosphatpuffer, 25 og blandingen blev overført til et centrifugerør (under N2). Den blev derpå centrifugeret som i det foregående (2 timer, 4 °C, Ti 75-rotor 43000 omdr./min.). Efter fjernelse af den overliggende væske blev pellet resuspen·-deret (som i det foregående med en Dounce-homogenisator) 30 i 10 ml pH 8 0,1 M phosphatpuffer. Recentri fugering (som i det foregående) af denne suspension efterfulgt af resuspension af pellet i 4 ml pH 8 puffer gav en opløsning, hvis thioltiter indikerede ialt 5,6 ^umol 5H. Et kontrolforsøg viste, at det udelukkende skyldes, DK 171137 B1 65 at thioleret protein og små molekyler (f.eks. hydrolyse-ret thiolacton) ikke er til stede.

B. Konjugation og rensning: Til 4 ml resuspenderet pellet blev der (under N2) sat 24 ml Strep B ( 111)-BuA^-BuAc, 5 og blandingen henstod i 18,75 timer ved stuetemperatur under N^· Blandingen blev overført til et 10 ml polycar-bonatcentrifugerør og toppet med vand. Efter centrifugering (som i det foregående) blev pellet resuspenderet (som i det foregående) i 10 ml vand og gencentrifugeret 10 (som i det foregående). Den endelige pellet blev re suspenderet i 15 ml (som i det foregående), og suspensionen havde et proteinindhold på 2,7 mg/ml og et poly-saccharidindhold på 0,263 mg/ml.

SCMHC/lys-forholdet var 0,044.

15 EKSEMPEL 9

Fremstilling af Escherichia coli Kl kapsulært polysaccha-r id__

Podemedium og podematerialeudviklinq

En lyophiliseringsflaske med Escherichia coli Kl stamma-20 teriale (modtaget fra Dr. Jofin Robbins, BOB) blev optøet og fortyndet med ca. 1 ml trypticase-hysoy-glucose (THG)-mædium. En trypticase-sojaagar blev derpå udstreget på den skrå flade dagen før fermenteringen og inkuberet natten over ved 37 °C, på hvilket tidspunkt vækst 25 på skråkulturen blev fjernet og suspenderet i 1 liter THG-medium.

Trypticase-hysoy-glucose (THG)-medium fremstilles ved autoklavering af 9,5 liter opløsning A ved 121 °C i 90 minutter efterfulgt af afkøling deraf og tilsætning DK 171137 B1 66 til 500 ml opløsning B, som er blevet autoklaveret separat ved 121 °C i 30 minutter.

Opløsning A

a. Trypticase-sojasuppe (BBL) 300 g 5 b. "Hysoy" (Sheffield) 100 g c. Phenolrødt 90 mg d. UC0N LB625 antiskumningsmiddel (Union Carbide) 10 ml e. Destilleret vand tilstrækkelig til 10 at give 9,5 liter opløsning.

Opløsning B

a. Dextrose (vandfri) 50" g b. Destilleret vand en tilstrække- 15 lig mængde til at give 500 ml opløsning.

F ermenterinq 1 liter af vækst-THG-mediet, som er blevet podet fra agarskråkulturerne, blev dyrket i en 2-liters Erlenmeyer-20 kolbe ved 37 °C med omrøring ved 200 omdr./min. i 6 timer (på hvilket tidspunkt cellevækst blev iagttaget).

Denne ene liter blev derpå podet over i 10 liter THG-medi-um i en 14 liters New Brunswick Scientifi c-fermentor, hvori luftstrømmen blev sat til 2 liter/min., og omrøring 25 blev sat til 200 omdr./min. pH blev indstillet og holdt ved 6,8 til 7,4 med 10¾ NaOH i 6 timer, når to lignende 0.D.-aflæsninger blev iagttaget.

Høst og klaring

Den endelige fermenteringssuppe fra det foregående blev 30 derpå sat til en 5 gallon plastflaske indeholdende hexa- DK 171137 B1 67 decyltrimethylammoniumbromid (endelig koncentration 0,3¾ vægt/vol.). Efter 4 timers forløb ved 4 °C, hvorunder hexadecyltrimethylammoniumbromid-udfældet polysac-charid fik lov at sætte sig, blev suppen afprøvet for 5 inaktivering, og når den var sikret, blev der centrifu geret i en laboratoriecentrifuge af mærket "Sharpies" ved ca. 30000 omdr./min. i 20 minutter, og den overliggende væske blev bortkastet. Cellepellet (ca. 66 g) blev gemt til i so leringsformå1.

10 Suspension og ekstraktion

Tre pellets fra tre fermenteringsportioner blev suspenderet individuelt i 400 ml 1,0 M CaCl^» og disse suspensioner blev ekstraheret i en omni-mixer, neddykket i et isvandsbad i 30 minutter på stilling 2 og kombi-15 neret.

25%'s ethanoludfældninq til f.jernelse af forureninger 373 ml absolut ethanol blev tilsat dråbevis (til en ethanolkoncentration på 25% ) under omrøring til den 1130 ml store CaC^-suspension fra det foregående trin, 20 og blandingen henstod natten over ved 10 °C. Det resul terende bundfald blev fjernet ved centrifugering i en Beckman J-21B centrifuge ved.11000 x g i 30 minutter ved 4 °C og bortkastet.

75S5's ethanoludfældning til opsamling af råt polysac-2 5 chari d_ 2560 ml absolut ethanol blev tilsat dråbevis (til en 75¾'s slutkoncentration) under omrøring til den 1280 ml store klare overliggende væske fra det foregående udfældningstrin, og blandingen fik lov at henstå natten 30 over ved 4 °C for at sikre fuldstændig udfældning af DK 171137 B1 68 det rå polysaccharid.

Udv/indinq af det rå polysaccharid

Det uopløselige bundfald blev udvundet ved centrifugering i Beckman-21B-enheden ved 11000 x g i 30 minutter 5 ved 4 °C og vasket én gang med ca. 200 ml absolut ethanol og én gang med ca. 200 ml acetone, idet begge vaskevæsker bortkastes. Det uopløselige produkt blev derpå tørret i vakuum ved 4 °C over vandfri CaC^ (udbytte 4,6 g).

Phenolekstraktion og dialyse 10 De 4,6 g råt polysaccharid blev suspenderet i 400 ml 0,488 M natriumacetat, pH 6,9, ved 11,5 mg/ml under anvendelse af en Dounce-homogenisator, og denne opløsning blev ekstraheret tre gange med separate 200 ml portioner vandig phenolopløsning fremstillet ved at sætte 180 15 ml 0,488 M natriumacetat, pH 6,9, til en et pound-kolbe

Mallincrodt-krystalliserende phenol indtil fuldstændig opløsning. Hver phenolekstrakt blev derpå centrifugeret ved 11000 x g i 30 minutter ved 4 °C for at bryde emulsionen, og de vandige faser blev luftet, samlet og ekstra-20 heret, idet phenol faserne blev bortkastet.

De samlede vandige faser bley dialyseret ved 4 °C i 24 timer med portioner af glasdestilleret vand, så at det endelige dialyseforhold var større end 1:100000.

75%'s ethanoludfældninq til samling af polysaccharidet 25 7,6 ml 2 M CaC^ blev sat til det 305 ml store dialy sat fra foregående trin til en slutkoncentration på 0,05 M CaCl^, og 938 ml absolut ethanol blev tilsat dråbevis (til en koncentration på 7 5% ethanol) til den hurtigt omrørte opløsning. Efter henstand natten over DK 171137 B1 69 ved 4 °C blev det resulterende bundfald samlet ved centrifugering i en Beckman-enhed i 30 minutter ved 11000 x g og 4 °C, derpå vasket én gang med 200 ml absolut ethanol, én gang med ca. 200 ml acetone og tørret i vakuum 3 over vandfrit CaCl^ ved 4 °C (udbytte = 1.7 g).

Ultracentrifuqerinq

De 1,7 g polysaccharid blev gensuspenderet i 170 ml 0,05 M CaCl2, 18,9 ml absolut ethanol blev tilsat dråbevis, under omrøring, og opløsningen blev centrifugeret 10 ved 100000 x g ved 4 °C i 2 timer.

Produktsamlinq

Den resulterende 180 ml klare overliggende væske blev fjernet ved dekantering og 468 ml ethanol blev tilsat dråbevis (til en koncentration på 75?ό ethanol under 15 omrøring for at udfælde polysaccharidet. Blandingen henstod natten over ved 4 °C for at sikre fuldstændig udfældning, produktet blev samlet ved centrifugering ved 11000 x g i 30 minutter ved 4 °C, vasket én gang med 200 ml absolut ethanol, én gang med 200 ml acetone 20 og tørret i vakuum over vandfri CaCl2 ved 4 °C (udbytte = 1,46 g).

Ultracentrifugering

De 1,46 g polysaccharid blev gensuspenderet i 150 ml 0,05 M CaCl2, 50 ml absolut ethanol blev tilsat dråbe-25 vis (til en 25%’s koncentration) til den hurtigt omrør te opløsning, og opløsningen blev ultracentrifugeret ved 100000 x g og 4 °C i 2 timer.

DK 171137 Bl 70

Endelig produktsamlinq

Den resulterende 190 ml klare overliggende væske blev fjernet fra pellet ved dekantering, og 190 ml ethanol blev tilsat dråbevis (til en koncentration på 50?ί) under 5 omrøring- Blandingen fik lov at henstå i 2 dage ved 4 °C for at sikre fuldstændig udfældning, og det endelige produkt blev samlet ved centrifugering i Beckman J-21B-centrifugen ved 11000 x g i 30 minutter ved 4 °C. Endelig blev produktet vasket én gang med ca. 200 10 ml ethanol, én gang med ca. 200 ml acetone og tørret i vakuum over vandfri CaC^ ved 4 °C (udbytte = 1,2 g).

EKSEMPEL 10

Fremstilling af E. coli Kl kapsulært polysaccharid-N. meningitidis B-serotype ydre membranproteinkonjuqat 15 I. Fremstilling af tetra-n-butylammoniumsalt af E. coli

Kl polysaccharid_ 103 mg E. coli Kl polysaccharid (fremstillet efter metoden ifølge eksempel 9) blev opløst i 2 ml vand, og opløsningen blev ført på en 4 ml søjle af "Do\i/ex" 50 x 8 (200 -20 400 mesh) tetra-n-butylammoniumform). Søjlen blev elue- ret med vand, og fraktionerne (3 ml) blev kontrolleret for organisk materiale ved Ce (IV ) S0^ ) 2^2 ^0^_me t oden .

De passende fraktioner blev lyophiliseret og produktet tørret i en ekssikkator over P2^5» hvilket gav 134 mg 25 af tetrabutylammoniumsaltet. Et lignende tidligere præ parat blev analyseret ved 'HNMR og syntes at have groft set støkiometriske mængder af tetra-n-butylammoniumion.

DK 171137 Bl 71 II. Fremstilling af polysaccharid/butandiamin-addukt (E. coli K1-BuA2)_ 134 mg salt fremstillet under I blev opløst i 3 ml tør, afgasset dimethylformamid og omrørt i 12 minutter. 12,7 5 mg 1,1-carbonyldiimidazol blev derpå tilsat i én portion, og opløsningen blev omrørt i 30 minutter. Derpå blev opløsningen sat til 6 ml af en iskølet vandig opløsning indeholdende 145 mg 1,4-butandiamin-2 HC1, hvis pH var blevet indstillet på 10,35 med 2,5 N NaOH. Denne opløsning 10 blev omrørt i 12 minutter i isbadet og i 20 minutter ved stuetemperatur. Derpå blev den dialyseret tre gange mod 4 liter 0,1 M phosphatpuffer (pH 7) i 5,5 timer, 16 timer og 3,75 timer. En endelig dialyse mod 4 liter vand blev foretaget på 4,5 timer. Lyophilisering gav 15 73 mg E. coli Kl-BuA^. F1uorescaminprøven indikerede 180 nmol NH2/mg.

III. Fremstilling af polysaccharid/butandiamin/brom- acetamid (E. coli K1-BuA^-BuAc)_ 6B mg E. coli KI-BUA2 blev opløst i 6,7 ml pH 9 borat-20 puffer, og 70 mg p-nitropheny1-bromacetat i 1,5 ml aceto- nitril blev tilsat. Blandingen blev opbevaret i 19 timer ved 4 °C og derpå dialyseret mod 32 liter vand og 4 liter vand i 8 timer og 13 turner. Opløsningen blev lyo-philiseret til 74 mg E. coli Kl-BuA2~BrAc. F luorescamin-25 prøve indikerede 50 nmol N^/mg resulterende i 120 nmol bromacety1/mg ifølge differens.

IV. Konjugation af E. coli Kl-BuA^-BuAc til funktiona- liseret N. meningitidis membranprotein (NMP)_

Fremstillingen af funktionaliseret NMP er den samme 30 som i eksempel 8, ^sektion IV-A. Til et centrifugerør

indeholdende 4 ml thioleret NMP-protein (9 ^umol SH

DK 171137 B1 72 ifølge E1lman-prøve) bleu der sat 25 mg E. coli Kl-BuA^-BrAc (120 nmol bromacetyl/mg). Røret blev lukket med en serumkappe, afgasset, nitrogeneret og henstod i 18,5 timer. Der blev derpå fortyndet med 6 ml pH 8 puffer 5 og centrifugeret i 2 timer ved 43000 omdr./min. ved 4 °C i en Ti 75-rotor. Den overliggende væske blev fjer-i: net, og pellet blev gensuspenderet i 10 ml pH 8 puffer med "Dounce"-homogenisator efterfulgt af recentrifugering som i det foregående. Pellet fra denne anden centrifu-10 gering blev suspenderet i 10 ml vand og centrifugeret som i det foregående en tredje gang. Pellet blev derpå gensuspenderet i 20 ml vand.

Analyse for konjugatet var:

Polysaccharid- Protein- Ps/protein- 15 koncentration koncentration forhold_ 336 ^ug/ml 1000 yug/ml 0,34 SCMHC/lysin var 0,015.

Claims (5)

1. Fremgangsmåde til kovalent modificering af et polyan- ionisk polysaccharid, kendetegnet ved, at 5 man (a) solubi 1 i se rer polysaccharidet i et ikke-vandigt, polært, aprotisk opløsningsmiddel, ^ (b) aktiverer polysaccharidet med et bi funktionelt rea gens, (c) omsætter dette aktiverede polysaccharid med en bis-nucleophil, og eventuelt (d) omsætter det aktiverede polysaccharid, som er blevet ^ omsat med en bis-nucleophil, med et reagens, der danner udhængende elektrophile steder.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det ikke-vandige, polære, aprotiske opløsningsmid-del er valgt blandt dimethyl formamid, dimethylsulfoxid, dimethylacetamid og N,N1-dimethylimidazolidinon, især dimethyl formamid.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det bi funktionelle reagens er valgt blandt kul- Z O 0 2 *1 3 2 3 syrederivater, R -C-R , hvori R og R separat betegner azolyl, halogenider eller phenylestere, specielt carbonyl-diimidazol. 1

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at bis-nucleophilen er en diamin med formlen H_N(CH„) Y(CH„) NH„, hvor m er 0 - 4, n er 0 - 3, og Y er Cl·^, 0, S, NR', CHCO^H, hvor R' er H eller alkyl 2^ med 1 eller 2 carbonatomer, så at ikke både m og n er 0, hvis Y er Cl·^, og m større end 1, og n er større end 1, hvis Y er 0 eller S. 74 DK 171137 B1

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det reagens, der danner elektrophile OR II \ steder, er X'CCHX, hvori X' er nitrophenoxy, dinitro-^ phenoxy, pentachlorphenoxy, pentafluorphenoxy , halogenid, 0-(N-hydroxysuccinimidy1) eller azido, og R er H eller CH.J, og X er Cl, Br eller I, eller en aktiveret maleimido- 0 10 8 / |J syre, X'C(CH2)p N II , hvori p er 1 - ?> og X' er Y som defineret i det foregående. 15 20 25 1 35