NL8304304A - Werkwijze voor het winnen van een gelvormend polysaccharide, het gewonnen gelvormende polysaccharide, het met behulp van een dergelijk polysaccharide gewonnen gel alsmede werkwijze ter bereiding van synthetische oligo- en polysacchariden. - Google Patents

Description

ff.O. 52163 1 I i - - Werkwijze voor het winnen van een gelvormend polysaccharide, het gewonnen gelvormende polysaccharide, het met behulp van een dergelijk polysaccharide gewonnen gel alsmede werkwijze ter bereiding van synthetische oligo- en polysacchariden -

Aanvraagster noemt als uitvinders L.P.T.M. Zevenhuizen en A.R.W. van Neerven.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het winnen van een gelvormend polysaccharide door extractie van cultures van een 5 micro-organisme.

• Zoals bekend worden polysaccharide-hydrocolloïden, welke uit planten en zeewieren verkregen zijn, met succes toegepast in de levensmiddelen-1, petroleum-, textiel— alsmede vele andere industrieën. Het commerciële gebruik van deze polysacchariden is o.a. gebaseerd op het ' 10 vermogen ervan de rheologische eigenschappen van water naar wens te wijzigen. Van bijzonder belang zijn dergelijke polysacchariden in de levensmiddelenindustrie en de olie-winning, in het bijzonder met het oog op methoden ter verhoging van de olie-opbrengst bij boringen.

Voorts is bekend, dat polysacchariden door vele micro-organismen 15 extra-cellulair worden uitgescheiden. Aangezien dergelijke microbiële polysacchariden upieke fysische en chemisch constante eigenschappen bezitten, en op een regelmatige basis kunnen worden verkregen is een aantal van deze microbieel verkregen polysacchariden commercieel interessant gebleken.

20 Zoals in het bovenstaande is aangegeven kunnen polysacchariden' worden verkregen uit natuurlijke bronnen (plantaardig, microbieel) terwijl daarnaast ook synthetische bronnen in aanmerking komen. Voorbeelden van natuurlijke en synthetische bronnen zijn: arabische gom, karaya, tragacanth (planten-exudaten), guar, locust 25 bean gum (zaadextracten), agarprodukten, alginaten,carrageenan (zeewierextracten), zetmeel (mais, aardappel), pectine, gelatine, dextran, xanthan gum (natuurlijke produkten), dextrinen (zetmeel), carboxy-methylcellulose (cellulose), polyvinylalcohol, polyacrylzuur en ethyleenoxyde-polymeren (synthetisch).

30 De laatste jaren zijn vooral de synthetische en de microbieel verkregen gommen sterk in opkomst ten koste van de plantaardige gommen. Karakteristieke toepassingen voor dergelijke gommen, bijvoorbeeld als stabilisator en suspenderend middel, verdikkingsmiddel, filmvormend middel, vochtbehoudend colloid, coagulant, smeermiddel 40 enzovoorts liggen op het terrein van de wasmiddelen, textiel, kleefstoffen, papier, verf, voedingsmiddelen, farmaca en cosmetica.

8304304 ï i 2

Bovendien kunnen sommige microbieel bereide polysacchariden na hydrolyse ook als uitgangsmateriaal voor de bereiding van synthetische oligof en polysacchariden worden toegepast·

Voorbeelden van specifieke» microbieel bereide polysacchariden 5 zijn: 1) Dextran (molgewicht ongeveer 100.000)» bereid uit saccharose onder invloed van cultuurfiltraten van Leuconostoc mesenteroides.

2) Xanthan gum» bereid uit glucose met behulp van Xanthomonas capestris (Kelco Co); 10 3) Alginaten» bereid met behulp van Azotobacter vinelandii (Tate and

Lyle) en 4) Curdlan» bereid met behulp van Alcaligenes faecalis (Takeda Co).

De eerste twee produkten worden gekenmerkt door een sterk viscosit teitsverhogend vermogen van waterige oplossingen terwijl de laatstge* 15 noemde twee produkten. een aanzienlijk gelvormend vermogen in waterige oplossingen bezitten.

Uit onderzoek is gebleken» dat Agrobacteriumfsoorten voornamelijk twee typen hoogmolekulaire extratcellulaire polysacchariden produceren: (a) succinoglycan» dat oplosbaar is in water en verantwoordelijk is voor 20 het hoogtvisceuze gedrag van de cultures en (b) curdlan» dat onoplosbaar is in koud water» doch oplosbaar in 0.5 M NaOÏÏ en heet water. Het succinoglycan is opgebouwd uit glucose, galactose, pyruvaat en succinaat in een verhouding van 7:1:1:1. Curdlan, dat opgebouwd is uit/4τ(1->3) glucan en, zoals vermeld onoplosbaar is in 25 koud water maar oplosbaar in 0.5 M NaOH en in heet water, levert na neutraliseren, respectievelijk afkoelen met water een tamelijk stevig, veerkrachtig maar thermofirreversibel gel. Bovendien is gebleken dat de geleereigenschappen van curdlan enigermate te wensen overlaten, aangezien voor het verkrijgen van een gel het curdlan in een concentrat· 30 tie van ten minste 1% of meer, soms zelfs 2 S 3%, aanwezig dient te zijn.

Voorts is gebleken, dat de gelsterkte van bekende agartprodukten zoals Gibcofragar en Oxoid Ion agar No. 2, in het bijzonder bij lage gewichtsconcentraties, voor een aantal toepassingen ongewenst klein is. 35 Gevonden werd, dat men de bovengenoemde, aan bekende produkten klevende nadelen kan opheffen, wanneer men een polysaccharide, opgebouwd uit galactose, glucose en mannose in de verhouding van 4:1:1 toepast, welk polysaccharide verkregen wordt door extractie van cultures van het geslacht Rhizoblum.

8304304 i * 3

Met behulp van een polysaccharide volgens de uitvinding wordt namelijk reeds bij een gewichtsconentratie van 0,2% een stevig gel verkregen, waarvan de gelsterkte aanzienlijk groter is dan die van een met een bekende agar zoals Gibco-agar verkregen gel.

5 Meer in het bijzonder worden van dit geslacht Rhizobium de soorten

Rhizobium-leguminosarum, Rhizobiunt-trifolii en Rhizobium-phaseoli toegepast·

De extractie van de cultures van het geslacht Rhizobium vindt bijvoorbeeld plaats met behulp van een alkalische oplossing zoals 10 een M NaOH-oplossing bij kamertemperatuur, waarna het verkregen extract met verdund zuur wordt geneutraliseerd. Men verkrijgt hierbij een stevig gel met een grote gelsterkte.

De extractie van de cultures van het geslacht Rhizobium kan ook met behulp van nagenoeg kokend water plaatsvinden, waarna de verkregen 15 suspensie door een bacteriologisch filter wordt geleid. Bij afkoelen tot kamertemperatuur stolt het heldere filtraat tot een stabiel en stevig gel.

Een stevig gel volgens de uitvinding wordt, zoals vermeld, reeds bij een concentratie van 0,2% polysaccharide in water verkregen.

20 Het gel is thermoreversibel met een overgangstemperatuur gel^sol-toestand tussen 50 en 60°C (stolpunt respectievelijk smeltpunt).

De werkwijze volgens de uitvinding wordt bij voorkeur uitgevoerd met cellen van de Rhizobium leguminosarum-stammen F-13 en RCR 1044 alsook de Rhizoblum-trifolii-stam TA-1. (Gedeponeerd bij het 25 Laboratorium voor Microbiologie te Delft onder de nrs.LMD 83.29, LMD 83.28 en LMD 83.30).

Het polysaccharide volgens de uitvinding dat als kapsel-polysaccharide aan de cellen is gebonden, is opgebouwd uit repeterende, eenheden met de onderstaande algemene formule 8304304 4 ï *

DtGal

/ I

4 5 DtGal Λ i j 6 A ,4 10 —>4)*DtGlct(l-»3)*DtManf(l-»3)tDtGalt(l—> fi t

DtGal 15 waarin DtGal, DtGlc en DtMan de betekenissen Dtgalactose, Dtglucose en Dtmannose bezitten en waarbij het polysaccharide een gemiddeld molgewicht *) van minimaal 150.000 heeft.

Experimenteel.

20 De onderstaande stammen werden onderzocht:

Rhlzobiumtleguminosarum F#13, TOM, RCRtl012 en RCRfl044, Rhizobiumttrlfolii TAtl en 0403 en Rhizobiumtphaseoll 127Kt82, alle aanwezig in de openbare bacterietcollectie van het Laboratorium voor Microbiologie te Wageningen.

25 Koolhydraatanalyse van de Cultures.

Van een culture wordt 2 ml in een centrifugebuis gepipetteerd waarna 2 ml 2 N NaOH wordt toegevoegd. Een extractie vindt plaats door schudden gedurende 2 uren bij kamertemperatuur. Hierna worden de geëxtraheerde cellen, die niettgeëxtraheerd glycogeen bevatten, afgecentrifugeerd en 30 de supernatant, die de geëxtraheerde polysaccharide bevat, afgegoten in een tweede centrifugebuis. Het kapselpolysaccharide (CPS) wordt geprecipiteerd door toevoeging van 3 ml 2 N HC1, afgecentrifugeerd, afgegoten en weer opgelostrin 4 ml 2 N NaOH. Hiervan wordt 0,1 ml genomen voor een bepaling van het koolhydraatgehalte met behulp van de 35 anthronfzwavelzuurreactie. De supernatant, die uitgescheiden zuur exopolysaccharide (EPS) en^tl,2tglucaan bevat, kan verder benut worden voor de bepaling van deze koolhydraatbestanddelen.

De uitvinding wordt aan de hand van het onderstaande voorbeeld nader toegelicht maar is hiertoe geenszins beperkt: 40 *) Bepaald door gelchromatografie van de hoofdketen over Ultragel At4 met dextranen van bekend molgewicht als referentiestof· 8304304 5 ' · '

Voorbeeld

Cultivering van Rhizobium trifolii, stam TA-1 in glutaminezuur - lactose - zouten medium

Samenstelling van het medium: 5 Glutaminezuur 1 g C-bron: Lactose 10 g K2HPO4 1 g in 100 ml water

HgS04.7H20 0,2 g

Sporenelementen: FeCl3«6H20 2,5 mg H3BO3 0,01 mg 10 ZnS04.7H20 0,01 mg

CoCl2.6H20 0,01 mg CUSO4.5H2O 0,01 mg

MnCl2 1 mg

Na2Mo04.2H20 0,01 mg 15 Vitamines: biotine 10 jag thiamine 100 jig gedemineraliseerd water 1000 ml

Na oplossen van de bestanddelen in 1 1 gedemineraliseerd water wordt het medium door toevoeging van N NaOH op een pH van 7,0 ingesteld· 2C Hoeveelheden van 50 ml worden in 200 ml erlenmeyer-kolven gedoseerd; grotere hoeveelheden van 1 L worden in 5 1 erlenmeyer-kolven gedoseerd, daarna voorzien van watten—proppen en in een autoclaaf gedurende 20 min. bij 120°C gesteriliseerd. De C-bron lactose.wordt apart gesteriliseerd en na afkoelen aseptisch aan het basismedium toegevoegd.

25 Cultivering vindt plaats door enting van een voorculture van 50 ml medium vanaf een schuine buis met een reinculture van Rhizobium trifolii stam TA-1 op Rhizobiumragar (gist-extract. 0.1%; mannitol, 0.5%; K2HPO4, 0,05%; MgS04.7H20, 0,025%; CaCl2.2H20, 0,01%; agar, 1,0% in water). De culture wordt gelncubeerd op een roterende 30 schudmachine bij 25-30° gedurende 5-7 dagen. Deze voorculture wordt vervolgens geënt in 1 1 van hetzelfde medium in een 5 L erlenmeyer-kolf en deze op een schudmachine bij 30° gedurende 7 dagen geincubeerd.

Isolatie van het gelvormende polysaccharide uit de Rhizobium-cultuur.

35 Na afloop van de cultivering worden de bacteriën in een hoog- toerige (12 000 rpm) centrifuge afgecentrifugeerd. De hierbij verkregen heldere supernatant kan eventueel benut worden voor de isolatie van het door de bacteriën uitgescheiden zure exopolysaccharide (EPS) door middel van precipitatie met alcohol of door complex-vorming met cetyl-40 pyridiniumchloride (L.P.T.M. Zevenhuizen. Methylation analysis of 8304304 • t 6 acidic exopolysaccharides of Rhizobium and Agrobacterium»

Carbohyd.Res. 26,409*419 (1973))

Het neutrale gelvormende kapselfpolysaccharide (CPS) is onoplosbaar en wordt aangetroffen in de verkregen celpellet» Een bepaling van de 5 gevormde hoeveelheden EPS en CPS kan op eenvoudige wijze worden uitgevoerd door middel van een hexosefbepaling met de anthronfzwavelzuur methode; het verbruik van de Cfbron (lactose) door meting van het reducerend vermogen volgens SomogyifNelson van de supernatant.

De verkregen celpellet wordt gesuspendeerd in 200 ml water waarna 10 200 ml 2 N NaOH wordt toegevoegd. Extractie vindt plaats door roeren gedurende 1*2 uren bij kamertemperatuur. De geëxtraheerde cellen worden vervolgens afgecentrifugeerd en de heldere visceuze supernatant wordt met azijnzuur of met verdund zoutzuur licht aangezuurd· Hierbij scheidt zich een volumineuze gel af; deze wordt afgecentrifugeerd, enige malen 15 gewassen in de centrifugebuis, eventueel gedialyseerd en gevriesdroogd. Opbrengst ca. 2,3 g droog polysaccharidekmateriaal.

Na cultivatie in een 0,1% glutaminezuur*0,5% mannitolfzouten* medium (zie J.Microbiol. Serol. 47 (1981), 481*497) leverden de bovengenoemde stammen RCR 1044 en Ff13 200*300 mg produkt op met meer 20 dan 95% hexose' (berekend op Dtgalactose) bepaald met behulp van de anthronfzwavelzuurfmethode. De bovenvermelde stammen RCR 1012, 0403, TOM, 127 Kf82 en verscheidene andere stammen van het geslacht Rhizobium leverden geringere hoeveelheden van hetzelfde produkt op.

8304304 7

Structuuropheldering van het polysaccharide»

Tabel I

5 Suikeranalyse van het oorspronkelijke en gemodificeerde kapselpoly-saccharide van Rhizobium-trifolii stam TA-1.

10 Suiker-component Molverhouding a) (als alditolacetaten)

A B C D E F

Glycerol + 15 Threitol 0,7

Erythritol + D-Mannose 1,0 1,00 1,00 1,00 1,00 0,17 D-Galactose 4,0 0,92 1,03 1,41 0,99 0,34 D-Glucose 1,0 0,97 0,96 0,96 0,14 0,11 20 a)Polysaccharide: A, oorspronkelijk; B periodaat-geoxydeerd en boor-hydride-gereduceerd; C periodaat-geoxydeerd, boorhydride-gereduceerd en Smith-ontleed (hoofdketen), D, gedeeltelijk periodaat-geoxydeerd (0,5 uur), boorhydride-gereduceerd en Smith-ontleed» E, periodaat-25 geoxydeerd en boorhydride-gereduceerd (hoofdketen); en F, chroomtri-oxyde-geoxydeerd, geacetyleerd oorspronkelijk polysaccharide· 8304304

TABEL II

« 8

Methyleringsanalyse van het oorspronkelijke en gemodificeerde kapsel-polysaccharide van Rhizobium-trifolii, stam TA-1 5 ________

Gemethyleerde suiker a) T b) Molverhouding c)

A B C D E F

10 2,-3,4,6-Man 1,00 1,00 2.3.4.6- Gal 1,07 1,80 0,34 2.4.6- Man 1,54 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 2.4.6- Gal 1,58 0,96 0,99 1,05 1,11 0,93 0,83 2.3.6- Gal 1,65 0,84 15 2,3,6-Glc 1,79 0,88 0,83d) 0,46 2,3-Glc 2,98 0,70 3-Glc 4,58 0,87 0,88 a) 2,3*4,6-Man * 2,3*4,6-tetra-O-methyl-D-mannose enzovoorts.

20 b) Retentie-tijd van de overeenkomstige alditol-acetaten ten opzichte van die van 1,5-di-0-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-methyl-D-glucltol op een· "fused-silica"-WCOT-OV-225-kolom bij 190°C.

c) Polysaccharide: A, oorspronkelijk, B, periodaat-geoxydeerd en boorhydride-gereduceerd, C, periodaat-geoxydeerd, boorhydride-25 gereduceerd en Smith-ontleed; D, periodaat-geoxydeerd, boorhydride-gereduceerd, gemethyleerd, Smith-ontleed en trideuteriogemethyleerd; E, gedeeltelijk periodaat-geoxydeerd (0,5 uur), boorhydride-gereduceerd en Smith-ontleed; F, periodaat-geoxydeerde, boorhydride-gereduceerde, Smith-ontlede hoofdketen.

30 d) 2,6-Di-0-trideuteriomethyl-3-0-methyl-D-glucose.

De hydrolyse van het verkregen polysaccharide (2 M trifluorazijn-zuur, 100 °C, 6 uren) leverde D-galactose, D-glucose en D-mannose in een molverhouding van 4:1:1 (tabel I, kolom A) op, wat een hexa-saccharide repeterende eenheid suggereert. Er konden geen uronzuren, 35 acyl-, (acetyl-, succinyl-) of acetaal-gebonden pyruvaat-substituenten worden aangetoond. Uit de methyleringsanalyse van polysaccharide (tabel II, kolom A) bleken twee D-galactosyl-eindgroepen, een (1-^3)-gebonden D-mannosyl-, een (1 3)-gebonden D-galactosyl- en een (1-^4) D-galactosyl-rest en een dubbel vertakte D-glucosylrest via 0-1,2,4,6 40 aanwezig te zijn.

8304304 Λ 9

Het polysaccharide nam vijf mol periodaat per repeterende hexasaccharide-eenheid op en leverde twee mol mierezuur op binnen 5 uren bij kamertemperatuur. De boorhydride-reductie van het verkregen poly-aldehyde, gevolgd door hydrolyse in 2-M-trifluorazi jnzuur leverde 5 D-glucose, D-galactose en D-mannose in een verhouding van 1:1:1 op tesamen met glycerol en threitol (tabel I, kolom B). Methylering van de polyalcohol (tabel II, kolom B) gaf aan dat door de periodaat-oxydatie twee D-galactosyl-eindgroepen en een (ï-*4)-gebonden D-galactosyl-rest waren ontleed· Be Smith-ontleding van de polyalcohol (90Z 10 mierezuur» 40°C, 1 uur) levert een produkt op, dat nog macromoleculair was en niet-dialyseerbaar en gelijke hoeveelheden aan D-glucose, D-galactose en D-mannose (tabel I, kolom C) bezat· Een methylerings-analyse van het Smith-ontlede polymeer (tabel II, kolom C) gaf aan dat dit onvertakt was en uit (1-¾) gebonden D-mannosyl-, (1 ** 3) 15 gebonden D-galactosyl- en (l->4) gebonden D-glucosylresten bestond.

De bindingsplaatsen van de D-galactosyl-zijketens werden bevestigd door methylering van de polyalcohol, gevolgd door Smith-ontleding en trideuteriomethylering van het ontlede polymeer (tabel II, kolom D).

Het verkregen 2,3,6-tri-O-methyl-D-glucose had MeO-2,6 gedeutereerd 20 onder indicatie van de plaatsen van de D-galactosyl- en de di-D- galactosyl-zijketens. De onderlinge plaatsen werden vastgesteld door methyleringsanalyse van gedeeltelijk periodaat-geoxydeerd en Smith-ontleed polysaccharide (tabel I, kolom D). Aangezien een D-galactosyl-eindgroep welke een vicinale triol-groep bevat, meer ontvankelijk 25 geacht wordt voor een periodaat-aantasting dan een (1-»4) gebonden D-galactosylrest, welke een vicinale diol-groep bevat, zal elke niet-geoxydeerde D-galactosylrest, welke aan de hoofdketen na een dergelijke oxydatie gebonden blijft, de plaats van de di-D-galactosylzijketen aangeven. De vorming van 2 f3-di-0-methy1-D-glucose via methylerings-30 analyse van onvolledig periodaat-geoxydeerd en Smith-ontleed polysaccharide (tabel II, kolom E) gaf aan, dat de di-D-galactosylzijketen plaats 6 van de hoofdketen-D-glucosylrest bezette.

De volgorde van de hexose-resten in de hoofdketen werd onderzocht door periodaat-oxydatie van het van zijketens ontdane polysaccharide 35 daar de nu (l->4) gebonden D-glucosylresten gevoelig zijn voor periodaat-oxydatie (tabel I, kolom E). Een achtereenvolgende reductie en Smith-ontleding van de polyalcohol leverde een trisaccharide-produkt van D-mannose, D-galactose en erythritol op waarvan een methyleringsanalyse (tabel II, kolom F) 2,3,4,6-tetra-O-methyl-D-mannose en 40 2,4,6-tri-O-metbyl-D-galactose gaf, wat wees op de onderstaande volgorde: 8304304 10 3)-D-Man-( 1-9-3)-D-Gal-(l-T>4)-D-Glc-(l-? in de hoofdketen.

Een chroomtrioxyde-oxydatie van het geacyleerde oorspronkelijke polysaccharide gevolgd door een suikeranalyse (tabel I, kolom F) liet zien dat alle suikerresten waren geoxydeerd en derhalve de 5 resten hoofdzakelijk^-gebonden waren.

Uit de bovenstaande gegevens kon de onderstaande structuur voor het gelvormende polysaccharide volgens de uitvinding worden afgeleid.

D-Gal 10 1 4 i 4 D-Gal 15 4 i *•4 /$ # 4)-D-Glc-(1 -*3)-D-Man-(l-*3)-D-Gal-(1 -* 2 A\ 20 1 D-Gal

De bovenvermelde structuur omvat enige ongebruikelijke aspecten voor een bacterieel exo-polysaccharide dat uit repeterende eenheden 25 is opgebouwd· Het is een neutraal heteropolysaccharide zonder carbonyl-bevattende substituenten en lijkt derhalve op de extra-cellulaire polysaccharide gom uit de langzaam groeiende Rhizoblum-stam CB 744 van de cowpea-groep (Arch. Biochem. Biophys. 124 (1968) 292-298). De structuur bevat ook een dubbelvertakte suikerrest, 30 hetgeen een zeldzaam aspect van bacteriële polysacchariden is.

Dergelijke aspecten zijn ook aanwezig in de kapsel-polysacchariden van Klebsiella, typen 33 en 38 (Carbohydrate Research 70 (1979) 134-144). De voorgestelde structuur van het gelvormende polysaccharide volgens de uitvinding is de eerste welke voor een onoplosbaar kapsel-polysaccharide 35 van een snelgroeiende stam der Rhizobia is vermeld.

Methoden van structuurbepaling.

De bij de structuurbepaling toegepaste suiker-analyse en methylerings-analyse zijn in Carbohydrate Research 26 (1973) 409-419 en 40 Chem.Commun.Univ. Stockholm, 8 (1976) 1-75 beschreven.

8304304 11 , , 9

De Periodaat-oxydatie.

Polysaccharide (100 mg) werd opgelost in water (50 ml) bij 60®C.

Aan de geroerde oplossing werd 0,03 M natriummetaperiodaat (50 ml) toegevoegd waarna het mengsel onmiddellijk tot kamertemperatuur werd 5 afgekoeld. Hét tussenpozen werden monsters (0,1 ml) verdund tot 25 ml en werd het periodaatverbruik spectrofotometrisch bij 223 nm bepaald.

Het vrijkomen van mierezuur werd door titratie met 0,1 M NaOH bepaald na reductie van onomgezet periodaat met ethyleenglycol. De oxydatie verliep snel in donker bij 20®C; na 8 uren werd een overmaat 10 ethyleenglycol toegevoegd en werd het geoxydeerde produkt geïsoleerd door dialyse en daarna gedurende een nacht met natriumboorhydride (200 mg) gereduceerd. De overmaat reductiemiddel werd met azijnzuur ontleed en het mengeel werd gedialyseerd en gevriesdroogd.

15 De Smith-ontleding·

De Smith-ontleding van het produkt (84,8 mg) werd uitgevoerd gedurende 1 uur bij 40®C in 90Z mierezuur (40 ml). Het mierezuur werd in vacuo afgedampt en een oplossing van het residu in water werd gedialyseerd en gevriesdroogd. Een deel (33,1 mg) van het produkt (43,1 mg) werd 20 opgelost in 15 mK NaI04 (40 ml). Na 4 dagen in het donker werd het mengsel op de bovenbeschreven wijze opgewerkt· Een deel (10 mg) van het produkt (30 mg) werd aan een suiker-analyse onderworpen en een ander deel (10 mg) werd bij 40®C gedurende 1 uur aan een Smith-ontleding in 90% mierezuur (5 ml) onderworpen. De oplossing werd 25 in vacuo ingedampt en gevriesdroogd, waarna het residu aan een methyleringsanalyse werd onderworpen.

De chroomtrioxyde-oxydatie.

De chroomtrioxyde-oxydatie werd uitgevoerd op de door Lindberg en 30 LSnngren (Methods Enzymol. 50 (1978), 20-24) beschreven wijze.

Vergelijking van de gelsterkten van het kapselpolysaccharide van Rhizobium trifolii TA-1 en een tweetal bekende agar-produkten.

De resultaten van de bepaalde gelsterkten zijn in de bijgaande figuur 35 weergegeven.

De gelsterkten zijn bepaald door meting van de breek-sterkten van de gels met behulp van een Overload Dynamics, type S-100, geltester; de plunjer-diameter van de load cell bedroeg 12,7 mm. De te onderzoeken gels werden bereid door verhitting, gevolgd door afkoeling in water bij 40 verschillende gewichteconcentraties (0.1-2.0%; w/v).

8304304 12

Uit dé bijgaande figuur kan worden afgeleid, dat het bacterietgel volgens de uitvinding bij gelijke gewichtsconcentraties een grotere gelsterkte bezit dan een tweetal bekende als vergelijkingsmateriaal gebruikte agars namelijk Gibcotagar en Oxoid Ion agar No. 2. In het 5 bijzonder werden bij lage gewichtsconcentratle (0,1*0.4%) met het bacteriepolysaccharide volgens de uitvinding nog redelijk stevige gels verkregen, terwijl dit met de beide agars in dit concentratiebereik nauwelijks meer mogelijk was. Verder bleek het bacterietproduct elastischer te zijn dan de bekende agars, doordat het bacteriegel een 10 grotere vervorming toeliet (8 mm indringtdiepte van de plunjer) dan de brossere agars, die slechts 4 mm vervorming toelieten, alvorens het breekpunt van de gels werd bereikt. Bovendien werden kortere "setting times" (uur) voor het bacteriegel gevonden, vergeleken met de "setting times" voor de beide agars (>1 uur) ter verkrijging van een 15 maximale gelsterkte na opsmelten en afkoelen tot kamertemperatuur. Het bacteriegel was stabiel in een pHttraject van 2*11 en een sterilisatie (20 min., 120°C) had geen nadelige invloed op de gelsterkte.

Het Gibcotagar wordt in de handel gebracht door Gibco Europe B.V. te Hoofddorp en het Oxoid Ion agar No. 2 door Pharmachemie B.V. te 20 Haarlem.

8304304

Claims (10)

13 " ; m

1· Werkwijze voor het. winnen van een gelvormend polysaccharide door extractie van cultures van een micro-organisme, met het kenmerk» dat men een polysaccharide» opgebouwd uit galactose» glucose en mannose in een verhouding van 4:1:1 wint 5 door extractie van cultures van een stam van het geslacht Rhizobium.

2. Werkwijze volgens conclusie l»met het kenmerk» dat men cultures van de soort Rhizobium-leguminosarum. Rhizobium-trifolii of Rhizobium-ohaseoli toepast.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2» met het kenmerk» 10 dat men cultures van de Rhizobium-legimunosarum-stam R 13 of RCR 1044 of van de Rhizohium-trifolii-stam TA-1 toepast·

4. Werkwijze volgens één of meer der conclusies 1-3, met het kenmerk, dat men de cultures van het geslacht Rhizobium aan een extractie met behulp van een alkalische oplossing onderwerpt en het 15 verkregen extract vervolgens met een verdund zuur neutraliseert·

5· Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat men als alkalische oplossing M NaOH toepast.

6· Werkwijze volgens conclusie 4 of 5, met het kenmerk, dat men de extractie bij kamertemperatuur 20 uitvoert·

7. Werkwijze volgens één of meer der conclusies 1-3, met het kenmerk, dat men de cultures van het geslacht Khizobium aan een extractie met nagenoeg kokend water onderwerpt en de verkregen hete suspensie door een bacteriologisch filter leidt. * 8304304 ——— -----—.....— ............ΙΓ — *

8. Gelvormend polysaccharide, opgebouwd uit repeterende eenheden met de formule DtGal 5 1 $ i 4 DtGal 10. i 6 6 4 4 —> 4)tDtGlct(l-*3)tDtMant(l->3)tDtGalt(l 2 4 t 15 1 DtGal waarin DtGal, DtGlc en DtMan de betekenissen Dtgalactose, Dtglucose en Dtmannose bezitten en met een gemiddeld molgewicht van minimaal 150.000.

9. Gel, verkregen onder toepassing van een polysaccharide, 20 gewonnen met behulp van de werkwijze volgens êén of meer der conclusies 1#7 respectievelijk van een polysaccharide volgens conclusie 8.

10. Werkwijze ter bereiding van synthetische oligot en polysacchariden, met het kenmerk, dat men daarbij als 25 uitgangsmateriaal een produkt toepast, dat verkregen is door hydrolyse van een met behulp van de werkwijze volgens éên of meer der conclusies lt7 gewonnen polysaccharide respectievelijk van een polysaccharide volgens conclusie 8. tmmtt 8304304