DK152506B - Geldannende polysakkarid, fremgangsmaade til dets fremstilling og anvendelse af det - Google Patents

Description

DK 152506 B

Den foreliggende opfindelse angår et geldannende poly-sakkarid.

Som bekendt anvendes polysakkarid-hydrokolloider, der vindes fra planter og havalger/ med held i fødevare-, jord-5 olie- og tekstilindustrien såvel som i mange andre industrier. Den kommercielle anvendelse af disse polysakkarider er blandt andet baseret på deres evne til at modificere de reologiske egenskaber af vand efter ønske. Sådanne polysakkarider er af særlig betydning i fødevareindustrien og ved olie-10 produktion, navnlig med hensyn til metoder til at forøge olieudbyttet ved olieboringer.

Det er endvidere kendt at polysakkarider udskilles extracelLulært af mange mikroorganismer. I betragtning af den kendsgerning at sådanne mikrobielle polysakkarider 15 har enestående fysisk og kemisk konstante egenskaber og kan vindes på regulær basis,har et antal af disse mikrobielt · vundne polysakkarider vist. sig at være at kommerciel betydning.

Som nævnt foran kan polysakkarider vindes fra natur-20 lige kilder (vegetabilske eller mikrobielle), men tillige er syntetiske kilder også værd at bemærke. Eksempler på naturlige og syntiske kilder er gummi arabipum, karaya, tragant (planteexsudater), guargummi og johannesbrødskærne-mælk (frøekstrakter), agarprodukter, alginater og carra-25 genan (havalgeekstrakter), stivelse (majs- og kartoffel-), pektin, gelatine, dextran og xanthangummi (naturprodukter), dextriner (stivelse), karboxymetylcellulose (cellulose), polyvinylalkohol, polyakrylsyre og ætylenoxydpolymerer (syntiske produkter).

30 I de senere år er det særlig de syntiske og mikro bielt vundne gummier som har været i kraftig fremmarch på bekostning af de vegetabilske gummier. Karakteristiske anvendelser af sådanne gummier, fx som stabilisatorer og suspenderingsmidler, fortykkelsesmidler, filmdannelses-35 midler, fugtighedstilbageholdénde kolloider, koagulanter, smøremidler og deslige kan findes i områder såsom detergenter, tekstiler, klæbestoffer, papir, malinger, 2

DK 152506B

fødevarer, lægemidler og kosmetika. Desuden kan nogle mikrobielt fremstillede polysakkarider efter hydrolyse også bruges som udgangsmaterialer til fremstilling af syntetiske oligosakkarider og polysakkarider.

5 Eksempler på særlige mikrobielt fremstillede poly sakkarider er: 1) Dextran (molekylvægt ca. 100.000) fremstillet ud fra sakkarose under indvirkning af kulturfiltrater af Leuco-nostocs mesenteroides.

10 2) Xanthangummi, fremstillet ud fra glukose ved hjælp af Xanthomonas capestris (Kelco Co.).

3) Alginater fremstillet ved hjælp af Azotobacter vine-landii (Tate and Lyle).

4) Curdlan, fremstillet ved hjælp af Alcaligenes fae-1 5 calis (Takeda Co.).

De første to produkter er karakteriseret ved en stærk evne til at forøge viskotiteten af vandige opløsninger mens de to sidstnævnte produkter har betydelig 2q geldannende kapacitet i vandige opløsninger.

En undersøgelse har vist at forskellige former af Agrobadterium overvejende danner to typer af højmolekylære extracellulære polysakkarider, nemlig (a) succinoglykan, som er opløseligt i vand og er ansvar-22 ligt for højviskositet-opførslen af kulturerne, og (b) curdlan som er uopløseligt i koldt vand men som er opløseligt i 0,5 M NaOH og varmt vand.

Succinoglykanet er opbygget af glukose, galaktose, pyruvat og succinat i forholdet 7:1:1:1. Curdlan, som 3Q er bygget op af 3-(1-^ 3)-glukan og angives at være uopløseligt i koldt vand men opløseligt i 0,5 M NaOH og varmt vand, giver med vand efter henholdsvis neutralisation eller afkøling en forholdsvis stiv, elastisk men termo- irreversibel gel. Det har desuden vist sig at curdlans geleringsegenskaber lader noget tilbage at ønske efter 35 som curdlan for at man skal kunne opnå en gel må være til stede i en koncentration på mindst 1% eller derover, undertiden endog 2-3%.

3

DK 152506B

Det har endvidere vist sig at gelstyrken af kendte agarprodukter såsom "Gibco" agar og "Oxoid" ionagar nr 2 er uønskværdigt lav med hensyn til et antal arvendelser, navnlig hvis koncentrationen, regnet efter vægt, er lav.

5 Det har vist sig at de ovennævnte ulemper hos kendte produkter kan overvindes ved anvendelse af det geldannende polysakkarid ifølge opfindelsen, der er opbygget af galak-tose, glukose og mannose i mængdeforholdet 4:1:1, og ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved det i krav 1 angivne.

10 Navnlig opnås der ved anvendelse af polysakkaridet ifølge opfindelsen en stiv gel med en vægtkoncentration på kun 0,2%, og gelstyrken af denne gel er væsentligt større end gelstyrken af en gel vundet med en kendt agar såsom "Gibco" agar.

15 Opfindelsen angår således yderligere en anvendelse af det angivne polysakkarid til dannelse af en vandig gel.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af det angivne geldannende polysakkarid, og den er ejendommelig ved at cellemassen fra en kultur af en stamme 20 af Rhizobium ekstraheres med et vandigt ekstraktionsmiddel.

Ifølge opfindelsen kan der især bruges stammer af arterne Rhizobium leguminosarum, Rhizobium trifolii og Rhizobium phaseoli.

Ekstraktionen af kulturen af slægten Rhizobium kan fx 25 ifølge opfindelsen udføres ved hjælp af en alkalisk opløsning; ifølge opfindelsen fx en M NaOH opløsning, hensigtsmæssigt ved stuetemperatur, hvorefter den vundne ekstrakt neutraliseres med tynd syre. Dette giver en stiv gel med høj gelstyrke.

30 Som vandigt ekstraktionsmiddel kan der ifølge opfin delsen også anvendes næsten kogende vand, hvorefter den vundne suspension føres gennem et bakteriologisk filter.

Ved afkøling til stuetemperatur størkner det klare filtrat til en stabil og stiv gel.

25 Som nævnt vindes der en stiv gel med polysakkaridet ifølge opfindelsen, selv ved en koncentration på kun 0,2% polysakkarid i vand. Gelen er termoreversibel, med en overgangstemperatur mellem gel-tilstand og sol-tilstand mellem 50°C og 60°C (henholdsvis størkningspunkt og smeltepunkt).

4

DK 152506B

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres fortrinsvis med celler af stammerne F-13 og RCR 1044 af arten Rhizobium leguminosarum, eller med stammen TA-1 af Rhizobium trifolii (deponeret i Laboratory for Microbiology i Delft under 5 numrene LMD 83.29, LMD 83.28 og LMD 83.30).

Polysakkaridet ifølge opfindelsen, der er bundet til cellerne son etkapsel-polysakkarid, er opbygget af gentagne enheder med følgende almene formel: 10 D-Gal e i 4 15 D-Gal 6 20 3 3 β 4) -D-Glc- (1—> 3) -D-Man- (1-» 3) -D-Gal- (l-=? 2

• T

i 25 D_ Gal hvor D-Gal, D-Glc og D-Man står for D-galaktose, D-glukose, og D-mannose, og idet polysakkaridet har en gennemsnitlig 30 molekylvægt på mindst 150.000 (bestemt ved gelkromatogra-gering af hovedkæden og "Ultragel" A-4 med dextraner af kendt molekylvægt som referencesubstans).

Forsøg Følgende stammer undersøgtes:

Rhizobium leguminosarum F-13, TOM RCR-1012 og RCR- 1044.

35 5

DK 152506B

Rhizobium trifolii TA-1 og 0403 og Rhizobium phaseoli 127K-82, alle tilstede i den offentlige bakteriesamling hos Laboratory for Microbiology i Wageningen.

5 Kulhydratanalyse af kulturerne 2 ml af en kultur pipetteres ind i et centrifugerør hvorefter der tilsættes 2 ml 2N NaOH. Der finder en ekstaktion sted ved at man ryster i 2 timer ved stuetemperatur. Derefter 1 q fracentrifugeres de ekstraherede celler, der indeholder ikke-ekstraheret .glykogen, og den ovenstående væske, der indeholder det ekstraherede polysakkarid, udhældes i et andet centrifugerør. Kapsel-polysakkaridet (CPS) udfældes ved tilsætning af 3 ml 2N HCl, fracentrifugeres __ dekanteres og genopløses i 4 ml 2N NaOH. 0,1 ml deraf 15 udtages til bestemmelse af kulhydratindholdet ved hjælp af anthron/svovlsyre-reaktionen. Den ovenstående væske, der indeholder udskilt syre, exopolysakkarid (EPS) og ø-l,2-glukan, kan bruges videre til bestemmelse af disse 2q kulhydratbestanddele.

Opfindelsen skal i det følgende belyses nærmere under henvisning til følgende eksempel.

Eksempel ^ Dyrkning af Rhizobium trifolii, stamme TA-1 (LMD 83.30), i glutaminsyre/laktose/salt-medium:

Mediets sammensætning 30 Glutaminsyre 1 g C-kilde: laktose 10 g K2HP04 1 g i 100 ml vand

MgS04.7H20 0,2 g

Sporelementer: FeCl3-6H20 2,5 mg 35 H3B03 0,01 mg

ZnS04.7H20 0,01 mg

CoCl2.6H20 0,01 mg

Pncn ς«· η n m mrr 6

DK 152506B

MnCl2 1,00 mg

Na2Mo04.2H20 0,01 mg

Vitaminer: biotin 10 pm tiamin 100 pm 5 demineraliseret vand 1000 ml

Efter at bestanddelene er blevet opløst i 1 liter demineraliseret vand bringes mediet til en pH-værdi på 7,0 ved tilsætning af N NaOH. Portioner på 50 ml afmåles 10 i 200 ml store Erlenmeyerkolber; større mængder på 1 liter afmåles i 5 liter store Erlenmeyerkolber og derefter forsynes de med bomuldspropper og steriliseres i en autoklav i 20 minutter ved 120°C. Kulstofkilden, laktose, steriliseres særskilt og sættes efter at være blevet afkølet 15 aseptiske til grundmediet.

Dyrkningen udføres ved podning af en forkultur af 50 ml medium fra et skråkulturrør indeholdende en ren kultur af Rhizobium trifolii stamme TA-1 på Rhizobium agar (gærekstrakt 0,1%; mannitol 0,5%; K2HP04 0,05%; 20 MgSO^. 7H20 0,025%; CaCl2.2H20 0,01%; agar 1,0% i vand). Kulturen inkuberes på en roterende rystemaskine ved 25-30°C i 5-7 dage. Denne forkultur bruges derefter til podning af en liter af samme medium i en 5 liter stor Erlenmeyerkolbe og der inkuberes så på en rystemaskine 25 ved30°C i 7 dage.

Isolering af det geldannende polysakkarid fra Rhizobium-kulturen_______________________________________________

Efter dyrkningens afslutning fracentrifugeres bak-30 ferierne i en højhastighedscentrifuge (12.000 opm). Den klare ovenstående væske der vindes derved kan eventuelt bruges til at isolere det sure exopolysakkarid (EPS) som udskilles af bakterierne ved udfældning med alkohol eller ved at der dannes et kompleks med cetylpyridiniumklorid (L.P.T.M. Zevenhuizen; Methylation analysis of acidic exo-polyccharides of Rhizobium and Agrobacterium. Carbohyd.

Res. 26, 409-419 (1973)).

35 7

DK 152506B

Det neutrale geldannende kapsel-polysakkarid (CPS) er uopløseligt og findes i den cellepille som vindes.

En bestemmelse af de dannede mængder EPS og CPS kan udføres på simpel måde ved hjælp af en hexose-bestem-5 melse under anvendelse af anthron/svovlsyre metoden; konsumet af C-kilden (laktose) kan bestemmes ved måling af reduktionskapaciteten af den ovenstående væske under anvendelse af den af Somogyi-Nelson angivne metode.

Den vundne cellepille suspenderes i 200 ml vand hvor-10 efter der tilsættes 200 ml 2N NaOH. Ekstraktionen finder sted ved omrøring i 1-2 timer ved stuetemperatur. De ekstraherede celler fracentrifugeres derefter og den klare, viskose ovenstående væske syrnes svagt med eddikesyre eller med tynd- saltsyre. Derefter udskiller der sig en 15 voluminøs gel; denne fracentrifugeres, vaskes flere gange i centrifugerøret, dialyseres hvis der er behov for det og frysetørres. Udbytte ca. 2,3 g tørt polysakkaridmate-riale.

Efter dyrkning i et 0,1% glutaminsyre/0,5% mannitol/ 20 salt-medium . ( se J. Microbiol. Serol. 47 (1981), 481-497) gav de ovennævnte stammer RCR 1044 og F-13 200-300 mg af et produkt som indeholdt mere end 95% hexose (regnet på D-galaktose), bestemt ved hjælp af anthron/svovl-syremetoden. De ovennævnte stammer er RCR 1012, 0403, 25 TOM, 127 K-82 og forskellige andre stammer af slægten Rhizobium gav mindre mængder af samme produkt.

Bestemmelse af polysakkaridets struktur

30 Tabel X

Sukkeranalyse af det oprindelige og modificerede kapsel-' polysakkarid fra Rhizobium trifolii stamme TA-1 35 s

DK 152506B

Sukkerkomponent Molforhold a) som alditolacetater _A B_C_D_E_F_

Glycerol + 5 Threitol 0,7

Erythritol + D-mannose 1,0 1,00 1,00 1,00 1,00 0,17 D-Galaktose 4,0 0,92 1,03 1,41 0,99 0,34 D-Glukose 1,0 0,97 0,96 0,96 0,14 0,11 10 a) Polysakkarid: A oprindeligt; B perj.odat-oxyderet og borhydrid-reduceret; C per j.odat-oxy deret, borhy dr id-reduceret og underkastet Smith-spaltning (hovedkæde); D partielt perjodat-oxy.deret (1/2 time), borhydrid-reduceret og ^ Smith-spaltning; E perjodat-oxyderet og borhydrid-reduceret (hovedkæde); og F kromtrioxyd-oxyderet, acetyleret og oprindeligt polysakkarid.

Tabel II

20 Metyleringsanalyse af det oprindelige og modicificerede kapselpolysakkarid fra Rhizobium trifolii stamme TA-1

Metyleret sukker. Molforhold

A B C D E F

25 -—-— 2.3.4.6- Man 1,00 1,00 2.3.4.6- Gal 1,07 1,80 0,34 2.4.6- Man 1,54 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 2.4.6- Gal 1,58 0,96 0,99 1,05 1,11 0,93 0,83 30 2,3,6-Gal 1,65 0,84 2.3.6- Glc 1,79 0,88 0,83d)0,46 2,3-Glc 2,98 0,70 3-Glc 4,58 0,87 0,88 a) 2,3,4,6-Man = 2,3,4,6-tetra-O-Metyl-D-mannose og så fremdeles 9

DK 152506B

b) Retentionstid af de tilsvarende alditolacetater i forhold til retentionstiden af 1,5-di-0-acetyl-2,3,4,6-tetra-O-metyl-D-glucitol på en "fused silica" WCOT-OV-225 kolonne ved 190°C.

5 c) Polysakkarid: A oprindeligt; B perjodat-oxyderet og borhydrid-reduceret C perjodat-oxyderet, borhydrid-reduceret og Smith-spaltning; D perjodat-oxyderet, borhydrid-reduceret, metyleret, Smith-spaltning og trideuteriometyleret; E partielt perjodat-oxyderet (1/2 time), borhydrid-reduceret 10 og Smith-spaltning; F perjodat-oxyderet, borhydrid-reduceret, Smith-spaltet hovedkæde.

d) 2,6-Di-0-trideuteriometyl-3-0-metyl-D-glukose.

Hydrolyse af det vundre polysakkarid (2M trifluored-^ dikesyre, 100°C, 6 timer) gav D-galaktose, D-glukose og D-mannose i et molforhold på 4:1:1 (Tabel I, kolonne A), hvilket tyder på en hexasakkarid-gentagelsesenhed. Der konstateredes ikke nogen uronsyrer eller acyl-, (acetyl-, succinyl-) eller acetalbundne pyruvatsubstituenter. Mety-2q leringsanalysen af polysakkaridet (tabel II, kolonne A) viser to D-galaktosyl-endegrupper, én (1-}3)-bundet D-mannosylrest, én (1 3)-bundet D-galaktosylrest og én (1—7 4) D-galaktosylrest og en dobbeltforgrenet D-gliko-sylrest via 0-1,2,4,6.

25 Polysakkaridet optog fem mol perjodat pr. gen tagen hexasakkaridenhed og gav to mol myresyre i løbet af 5 timer ved stuetemperatur. Borhydridreduktionen af det vundne polyaldehyd efterfulgt af hydrolyse i 2M tri-fluoreddikesyre gav D-glukose, D-galaktose og D-mannose 2Q i forholdet 1:1:1 sammen med glycerol og threitol (tabel I, kolonne B). Metylering af polyalkoholen (tabel II, kolonne B) viste at perjodat-oxyodationen havde spaltet to D-galaktosyl-endegrupper og én (1^4)-bundet D-galaktosylrest. Smith-spaltningen af polyalkoholen (90% myresyre, 25 40°C, 1 time) gav et produkt som stadig var makromoleky- lært og ikke-dialyserbart og indeholdt ens mængder D-g]ukose, D-galaktose og D-mannose (tabel I, kolonne C).

En metyleringanalyse af den Smith-spaltede polymer (tabel 10

DK 152506B

II, kolonne C) viste at sidstnævnte var uforgrenet og bestod af (1—)3)-bundne D-mannosylrester, (1—?3)-bundne D-galaktosylrester og (1—^4)-bundne D-glukosylrester. Bindingspunkterne for D-galaktosyl-sidekæderne var fikse-5 ret ved metylering af polyalkoholen, efterfulgt af Smith-spaltning og trideuteriometylering af den spaltede polymer (tabel II, kolonne D). Den vundne 2,3,6-tri-0-metyl-D-glukose var MeO-2,6-deutereret, hvilket viste positionerne af D-galaktosyl- og di-D-galaktosyl-sidekæderne. De 10 relative positioner blev fastslået ved metyleringsanalyse af partielt per jodat-oxyderet og Smith-spaltet polysakkarid (tabel I, kolonne D). Eftersom en D-galaktosy1-endegruppe som har en vicinal triolgruppe anses for mere følsom for perjodat-angreb end en (1—7 4)-bundet D-galaktosyl-15 rest som indeholder en vicinal diolgruppe, vil enhver ikke-oxyderet D-galaktosyIrest som forbliver bundet til hovedkæden efter en sådan oxydation vise positionen af di-D-galaktosyl-sidekæden. Dannelse af 2,3-di-O-metyl-D-glukose via metyleringsanalyse af ufuldstændigt perjo-20 dat-oxy.deret og Smith-spaltet polysakkarid (tabel II, kolonne E) viste at di-D-galaktosyl-sidekæden optog stilling 6 i hovedkæde-D-glukosyl-restén.

Sekvensen af hexoserester i hovedkæden blev undérsøgt ved perj odat-oxy.dat i on af polysakkaridet efter at det 25 var strippet for sidekæderne eftersom de nu (1—=7 4)-bundne D-glykosylrester er følsomme for perjodat-oxydation (tabel I, kolonne E). En successiv reduktion og Smith-spaltning af polyalkoholen gav et trisakkaridprodukt af D-mannose, D-galaktose og erythritol, og metyleringsanalyse heraf 30 (tabel II, kolonne F) gav 2,3,4,6-tetra-O-metyl-D-mannose og 2,4,6-tri-O-metyl-D-galaktose, hvilket viser følgende sekvens: 3) -D-Man- (1-^3) -D-Gal- (1^. 4) -D-Glc- (1 —=> i hovedkæden.

En kromtrioxyd-oxydation af det acylerede oprinde-35 lige polysakkarid efterfulgt af sukkeranalyse (tabel I, kolonne F) viste at alle sukkerresterne var oxyderet og at resterne følgelig var hovedsagelig B-bundne.

11

DK 152506B

Af. de foran beskrevne data var det muligt at udlede følgende struktur for det geldannende polysakkarid ifølge opfindelsen: D-Gal 5 1

8 I

4 D-Gal 1° ] β J, 6 B β β —4.) -D-Glc- (1—/ 3) -D~Man- (1—=? 3) -D-Gal- (1-=?· 15 2

• T

i D-Gal 20

Den ovenfor viste struktur indbefatter nogle usædvanlige træk for et bakterielt exopolysakkarid som er opbygget af gentagelsesenheder. Det er et neutralt heteropolysakka-rid uden karbonylholdige substituenter og ligner derfor ^ den extracel^lære polysakkarid gummi. fra den langsomt voksende Rhizobium stamme CB 744 hørende til Cowpeagruppen (Arch. Biochem. Biophys. 124 (1968) 292-298). Strukturen indeholder også en dobbelt forgrenet sukkerrest, hvilket er et usædvanligt træk for bakterielle polysakkarider. Lig-^ nende træk forefindes også hos kapsel-polysakkariderne fra Klebsiella type 33 og type 38 (Carbohydrate Research 70 (1979) 134-144). Ovennævnte struktur af det geldannende polysakkarid ifølge opfindelsen er det første som er rapporteret for et uopløseligt kapsel-polysakkarid for en ^ hurtigt voksende stamme af Rhizobium.

12

DK 152506B

Metoder til strukturbestemmelse

Den sukkeranalyse og metyleringsanalyse som er anvendt i strukturbestemmelsen er beskrevet i Carbohydrate Research 26 (1973) 409-419 og Chem. Commun. Univ. Stockholm 8 (1976) 5 1-75.

Perj odat-oxydationen 100 mg polysakkarid opløstes i 50 ml vand ved 60°C.

Der sattes 50 ml af 0,03M natriummetaperjodat til den 10 omrørte opløsning, hvorefter blandingen straks afkøledes til stuetemperatur. Prøver på 0,1 ml blev fortyndedes med mellemrum til 25 ml og perjodat-konsumet bestemtes spektro fotometrisk ved 223 nm. Frigivelsen af myresyre bestemtes ved titrering med 0,1M NaOH efter reduktion af uomdannet 15 per3 odat med ætylenglykol. Oxydationen fandt hurtigt sted i mørke ved 20°C; efter 8 timer tilsattes der overskud af ætylenglykol og det oxyderede produkt isoleredes ved dialyse og reduceredes derefter natten over med 200 mg natriumborhydrid.

Det overskydende reduktionsmiddel spaltedes med eddikesyre 20 og blandingen dialyseredes og frysetørredes.

Smith-spaltning

Smith-spaltningen af produktet (84,8 mg) udførtes i en time ved 40°C i 40 ml 90%s myresyre. Myresyren af-dampedes i vakuum og en opløsning af remanensen i vand dialyseres og frysetørredes. En portion på 33,1 mg af produktet (43,1 mg) opløstes i 40 ml 15 mM NalO^. Efter 4 dage i mørke oparbejdedes blandingen på den ovenfor beskrevne måde. En del (10 mg) af produktet (30 mg) underkastdes sukkeranalyse og en anden del (10 mg) underkastedesi 1 time ved 40°C en Smith-spaltning i 5ml 90%s myresyre. Opløsningen inddampedes i vakuum og frysetørredes hvor efter remanensen underkastes metyleringsanalyse.

35 Kromtrioxyd-oxydationen

Kromtrioxyd-oxydationen udførtes på den måde der er beskrevet af Lindberg og Lonngren (Method Enzymol.

13

DK 152506B

50 (1978) 20-24).

Sammenligning af gelstyrkerne af kapsel"polys akkar idet fra Rhizobium trifolii TA-1 og to kendte agarprodukter 5 Resultaterne af gelstyrkebestemmelserne fremgår af vedlagte tegning.

Gelstyrkerne bestemmes ved måling af brudstyrkerne af gelerne ved hjælp af en "Overload Dynamics" type S-100 geltester; stempeldiameteren. af belastningscellen var 10 12,7 mm. De til undersøgelse værende geler fremstilledes ved opvarmning efterfulgt af afkøling i vand ved forskellige vægtkoncentrationer (0,1-2,0% vægt/rumfang).

Det kan sluttes af figuren at bakteriegelen ifølge opfindelsen har højere gelstyrke ved samme vægtkoncentra-15 tioner end to kendte agar-arter der har været anvendt som sammenligningsmateriale, nemlig "Gibco" agar og "Oxoid,My ion agar nr. 2. Specielt opnåedes der ved lave vægtkoncentrationer (0,1-0,4%) endnu forholdsvis stive geler med bakterie-polysakkaridet ifølge opfindelsen, mens dette dårligt nok 20 var muligt længere med de to agar-arter i dette koncentrationsområde. Desuden viser bakterieproduktet sig at være mere elastisk end de kendte agar-arter ved at bakteriegelen tillod større deformering (8 mm penetrationsdybde af stemplet) end de mere sprøde agar-arter, der kun tillod 25 4 mm deformation før brudpunktet af gelerne blev nået.

Desuden viste den bakterielle gel sig at have kortere "hærdningstider" (mindre end 1/2 time) end "hærdnings-tiderne" ("setting times")af de to agar-arter (over en time) for at nå maksimal gelstyrke efter smeltning og 30 afkøling til stuetemperatur. Den bakterielle gel var stabil over et pH-område på 2-11 og en sterilation (20 minutter ved 120°C) havde ikke nogen ugunstig virkning på gelstyrken.

"Gibco"-agar forhandles af Gibco Europe B.V. i Hoofd- /θ\ dorp, Holland, og "Oxoid,AEV ion agar nr. 2 af Pharmachemie 35 B.V. i Haarlem, Holland.

Claims (9)

1. Geldannende polysakkarid, kendetegnet ved at det er opbygget af gentagne enheder med formlen

2. Fremgangsmåde til fremstilling af det i krav 1 angivne geldannende polysakkarid, kendetegnet ved at cel- 30 lemassen fra en kultur af en stamme af slægten Rhizobium ekstraheres med et vandigt ekstraktionsmiddel.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved at der bruges en kultur af en stamme af arten Rhizobium le-guminosarum, arten Rhizobium trifolii eller arten Rhizobium 35 phaseoli.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, kendetegne t ved at der bruges en kultur af Rhizobium leguminosa- DK 152506B rum LMD 83.29 eller LMD 83.28 eller af Rhizobium trifolii LMD 83.30.

5. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 2-4, kendetegnet ved at der som vandigt ekstraktions- 5 middel anvendes en alkalisk opløsning og at den vundne ekstrakt derefter neutraliseres med en tynd syre.

5 D-Gal β i 4

10 D-Gal 6 ^ 6 ege 15 —^ 4 ) -D-Glc-(1—y3)—D—Man—(1—*>3)—D—Gal — (l-1? 2 • T i

20 D-Gal hvor D-Gal, D-Glc og D-Man står for D-galaktose, D-glukose, og D-mannose, at polysakkaridet har en gennemsnitlig molekylvægt på mindst 150.000 og at det er identisk med det po-25 lysakkarid der vindes ved ekstraktion af celler af Rhizobium trifolii LMD 83.30 med 1 M NaOH og neutralisation af ekstrakten.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved at der bruges M NaOH som alkalisk opløsning.

7. Fremgangsmåde ifølge;krav 5 eller 6, kendeteg-10 net ved at ekstraktionen udføres ved stuetemperatur.

8. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 2-4, kendetegnet ved at der som vandigt ekstraktionsmiddel anvendes næsten kogende vand og at den vundne varme suspension føres igennem et bakteriologisk filter.

9. Anvendelse af polysakkaridet ifølge krav 1 til dannel se af en vandig gel. 20 25 30 35