FI80722B - Gelbildande plysackarid, dess framstaellning ch anvaendning. - Google Patents

Description

1 80722

Geeliä muodostava polysakkaridi, sen valmistus ja käyttö Tämä keksintö koskee geeliä muodostavaa polysakkaridia, sen valmistusmenetelmää geeliä muodostavan polysakkaridin saamiseksi uuttamalla mikro-organismin viljelmiä sekä sen käyttöä vesipitoisen geelin aikaansaamiseksi.

Kuten tiedetään, polysakkaridihydrokolloideja, joita saadaan kasveista ja merilevistä, käytetään menestyksellä elintarvike-, maaöljy- ja tekstiiliteollisuudessa samoin kuin monessa muussakin teollisuuden haarassa. Näiden polysakkaridien kaupallinen käyttö perustuu mm. niiden kykyyn modifioida veden Teologisia ominaisuuksia halutulla tavalla. Tällaisilla polysakkarideilla on erityistä merkitystä elintarviketeollisuudessa ja öljyntuotannos-sa, erityisesti mitä tulee menetelmiin parantaa porausten öljy saantoa.

Lisäksi tiedetään, että monet mikro-organismit erittävät polysakkarideja solunulkopuolisesti. Ottaen huomioon, että tällaisilla mikrobiaalisilla polysakkarideilla on ainutlaatuisia fysikaalisesti ja kemiallisesti muuttumattomia ominaisuuksia ja niitä voidaan saada johdonmukaisesti talteen, lukuisat näistä mikrobi-aalisesti saaduista polysakkarideista ovat osoittautunett kaupallisesti mielenkiintoisiksi.

Kuten edellä mainittiin, polysakkarideja voidaan saada luonnon lähteistä (kasvi- tai mikrobilähteistä) samalla, kun myös synteettiset lähteet ovat huomionarvoisia. Esimerkkejä luonnon ja synteettisistä lähteistä ovat arabi-, karaja- ja traganttikumit (kasvieritteitä), guar- ja Johanneksen leipäpuun pavun kumi (siemenuutteita), agartuotteet, alginaatit ja karrageeni (merileväuutteita), tärkkelys (maissi- ja perunatärkkelys), pektiini, gelatiini, dekstraani- ja ksantaanikumit (luonnontuotteita), dekstriini (tärkkelys), karboksimetyyliselluloosa (selluloosa), polyvinyylialkoholi, polyakryylihappo ja etyleenioksidipolymeerit (synteettisiä tuotteita).

Viime vuosina varsinkin synteettisesti ja mikrobiaalisesti saadut kumihartsit ovat olleet voimakkaassa nousussa kasviskumihartsien kustannuksella. Tällaisten kumihartsien luonteenomaiset käytöt esi- 2 80722 merkiksi stabilisaattoreina ja suspendointiaineina, paksuntimina, kalvonmuodostusaineina, kosteutta säilyttävinä kolloideina, koagu-lointiaineina, voiteluaineina jne, löytyvät pesuaineiden, tekstiilien, liimojen, paperin, maalien, elintarvikkeiden, lääkkeiden ja kosmeettisten tuotteiden alueelta. Lisäksi eräitä mikrobiaalisesti valmistettuja polysakkarideja voidaan hydrolyysin jälkeen käyttää myös lähtöaineina synteettisten oligosakkaridien ja polysakkaridien valmistukseen.

Esimerkkejä tyypillisistä mikrobiaalisesti valmistetuista polysakkarideista ovat: 1) Dekstraani (molekyylipaino n. 100 000), joka on valmistettu sakkaroosista Leuconostoc mesenteroides-lajin viljelysuodosten vaikutuksella.

2) Ksantaanikumi, joka on valmistettu glukoosista Xanthomonas capestris-lajin (KelcoCo.) avulla.

3) Alginaatit, jotka on valmistettu Azotobacter vinelandii-lajin (Tate and Lyle) avulla.

4) Juoksute, joka on valmistettu Alcaligenes faecalis-lajin (Takeda COn) avulla, y

Kahdelle ensimmäiselle tuotteelle on luonteenomaista voimakas kyky nostaa vesiliuosten viskositeettia, kun taas kahdella viimeksi mainitulla tuotteella on huomattavaa geelinmuodostuskapasiteettia vesi-liuoksissa.

Tutkimus on osoittanut, että Agrobacterium-suvun eri lajit tuottavat pääasiassa kahta korkean molekyylipainon solunulkoisten polysakkaridien tyyppiä, nimittäin a) sukkinoglykaania, joka on liukoinen veteen ja vastaa viljelmien korkean viskositeetin käyttäytymisestä ja b) juoksutetta, joka on liukenematon kylmään veteen, mutta liukoinen 0,5-M NaOH:iin ja kuumaan veteen. Sukkinoglykaani rakentuu glukoosista galaktoosista, pyruvaatista ja sukkinaatista suhteessa 7:1:1:1. Juoksute, joka rakentuu β — (1 -> 3) -glukaanista ja jonka ilmoitetaan olevan liukenematon kylmään veteen, mutta liukoinen 0,5-M NaOH:iin ja kuumaan veteen, antaa veden kanssa neutraloinnin tai jäähdytyksen jälkeen melko jäykän, kimmoisan, mutta termisesti irreversiibelin geelin. Lisäksi on havaittu, että juoksutteen geelitysominaisuudet 3 80722 jättävät jonkin verran toivomisen varaa, sillä geelin saamiseksi juoksutetta on oltava läsnä vähintään 1 %:n pitoisuus tai enemmän, toisinaan jopa 2-3 %.

Lisäksi on havaittu, että tunnettujen agar-tuotteiden, kuten Gibco-agarin ja Oxoid Ion-agarin no 2 geelilujuus on epämieluisan pieni useisiin sovellutuksiin, jos painoväkevyys on pieni.

On havaittu, että yllämainitut tunnettujen tuotteiden haitat voidaan voittaa, jos käytetään polysakkaridia, joka rakentuu galaktoo-sista, glukoosista ja mannoosista suhteissa 4:1:1, joka polysakkaridi saadaan uuttamalla Rhizobium-suvun viljelmiä.

Erityisesti käytettäessä keksinnön mukaista polysakkaridia saadaan jäykkä geeli jopa vain 0,2 %:n painoväkevyydellä, jonka geelin geelilujuus on oleellisesti suurempi kuin geelillä, joka on saatu tunnetulla agarilla, kuten Gibco-agarilla.

Tarkemmin sanoen käytetään Rhizobium-suvun lajeja Rhizobium le-guminosarum, Rhizobium trifolii ja Rhizobium phaseoli.

Rhizobium-suvun viljelmien uutto suoritetaan esimerkiksi alkali-sen liuoksen, kuten 1-M NaOH-liuoksen avulla huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen saatu uute neutraloidaan laimealla hapolla. Tämä antaa jäykän geelin, jolla on suuri geelilujuus.

Rhizobium-suvun viljelmien uutto voidaan suorittaa myös lähes kiehuvalla vedellä, minkä jälkeen saatu suspensio johdetaan bakteriologisen suodattimen läpi. Jäähtyessään huoneenlämpötilaan kirkas suodos jähmettyy stabiiliksi ja jäykäksi geeliksi.

Kuten mainittiin tämän keksinnön mukainen jäykkä geeli saadaan jopa vain 0,2 %:n polysakkaridiväkevyydellä vedessä. Geeli on termisesti reversiibeli muutoslämpötilan geeli- ja soolitilan välillä ollessa 50-60°C (jähmettymispiste ja sulamispiste samassa järjestyksessä) .

Tämän keksinnön mukainen prosessi on edullista suorittaa Rhizobium leguminosarum-lajien F-13 ja RCR 1044 soluilla ja myös Rhizobium o 80722 trifolii-lajin TA-1 soluilla (säilytetään laitoksessa the Laboratory for Microbiology in Delft numerolla LMD 83,29, LMD 83,28 ja LMD 83,30).

Tämän keksinnön mukainen polysakkaridi, joka on sitoutunut soluihin kapselipolysakkaridina, rakentuu toistoyksiköistä, joilla on seuraava yleinen kaava: D-Gal p ^ 4 D-Gal p i 6 P P β ->4) -D-Glc-(1 -> 3) -D-Man- (1 -> 3) -D-Gal-(1 -> 2

β I

D-Gal jossa D-Gal, D-Glc ja D-Man tarkoittavat vastaavasti D-galaktoo-sia, D-glukoosia ja D-mannoosia ja jossa polysakkaridin keskimo-lekyylipaino on vähintään 150 000 (määriteltynä pääketjun geeli-kromatografiällä Ultragel A-4 -massalla käyttäen vertailuaineina dekstraaneja, joilla on tunnettu molekyylipaino) ja että se on identtinen sellaisen polysakkaridin kanssa, joka on saatu uuttamalla Rhizobium trifolii-kannan LMD 83,30 soluja IM NaOH:lla ja neutraloimalla uute.

Tutkittiin seuraavia lajeja:

Rhizobium leguminosarum F-13, TOM, RCR-1012 ja RCR-1044.

Rhizobium trifolii TA-1 ja 0403 ja Rhizobium phaseoli 127 K-82, jotka kaikki esiintyvät laitoksen the Laboratory for Microbiology julkisessa bakteerikokoelmassa Wageningen’issa.

Viljelmien hiilihydraattianalyysi 2 ml viljelmiä pipetoidaan sentrifugiputkeen, minkä jälkeen lisätään 2 ml 2-N Na0H:a. Uuttaminen tapahtuu ravistelemalla 2 . 80722

D

tuntia huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen uutetut solut, jotka sisältävät uuttumatonta glykogeenia, sentrifugoidaan pois ja yläpuolinen neste, joka sisältää uutettua polysakkaridia, kaadetaan toiseen sentrifugiputkeen. Kapselipolysakkaridi (CPS) seostetaan lisäämällä 3 ml 2-N HCl:a, sentrifugoidaan pois, dekantoi-daan ja liuotetaan uudelleen 4 ml:aan 2-N NaOH:a. 0,1 ml tästä otetaan hiilihydraattisisällön määritykseen antroni/rikkihappo-reaktion avulla. Yläpuolista nestettä, joka sisältää erotettua happoa, eksopolysakkaridia (EPS) ja β-l,2-glukaania, voidaan käyttää näiden hiilihydraattiaineosien määrittämiseen.

Keksintöä valaistaan seuraavalla esimerkillä.

Esimerkki

Rhizobium trifolii-lajin TA-1 viljely glutamiinihappo/laktoosi/-suola-alustalla

Alustan koostumus:

Glutamiinihappoa 1 g C-lähde: 10 g laktoosia K2HPO4 1 g 100 ml:ssa vettä

MgS04 . 7 H20 0,2 g

Hivenalkuaineet:

Vitamiinit: biotiini 10 g tiamiini 100 ml suolapoistettua vettä 1000 ml

Kun aineosat on liuotettu 1 litraan suolapoistettua vettä, alusta saatetaan pH-arvoon 7,0 lisäämällä 1-N NaOH:a. 50 ml:n määrät mitataan 5 litran Erlenmeyer-pulloihin; suuremmat 1 litran määrät mitataan 5 litran Erlenmeyer-pulloihin, varustetaan sitten pumpu-litulpilla ja steriloidaan autoklaavissa 20 minuuttia 120°C:ssa. C-lähde, laktoosi, steriloidaan erikseen ja kun se on jäähtynyt, se lisätään aseptisesti perusalustalle.

Viljely suoritetaan istuttamalla 50 ml:n alusta-esiviljelmä kaltevasta putkesta, joka sisältää Rhizobium trifolii-lajin TA-I puhtaan viljelmän Rhizobium-agarilla (hiivauute, 0,1 %; mannitoli 0,5 %; K2HP04, 0,05 %; MgS04.7 H20, 0,025 %; 6 80722

CaCl2*2 H2O, 0,01 %; agar 1,0 % vedessä). Viljelmää idätetään pyörivällä ravistuskoneella 25-30°C:ssa 5-7 päivää.

Tätä esiviljelmää käytetään sitten istuttamaan 1 litra samaa alustaa 5 litran Erlenmeyer-pullossa ja jälkimmäistä idätetään ravistuskoneella 30eC:ssa 7 päivää.

Geeliä muodostavan polysakkaridin eristäminen Rhizobium-vlljelmästä

Viljelyn päätyttyä bakteerit sentrifugoidaan pois suurno-peuksisessa (12 000 rpm) sentrifugissa. Tällöin saatua kirkasta sakan yllä olevaa nestettä voidaan valinnaisesti käyttää bakteerien erittämän happaman eksopolysakkaridin (EPS) eristämiseen saostamalla alkoholilla tai muodostamalla kompleksi setyylipyridiniumkloridilla (L.P.T.M. Zevenhuizen, Methylation analysis of acidic exopolysaccharides of Rhizo-bium and Agrobacterium, Carbohyd., Res. 26, 409-419 (1973)).

Neutraali geeliä muodostava kapselipolysakkaridi (CPS) on liukenematon ja sitä löydetään saadusta solupallosta. Muodostuneiden EPS- ja CPS-määrien määritys voidaan suorittaa yksinkertaisella tavalla heksoosimäärityksellä käyttäen antroni/rikkihappomenetelmää; C-lähteen (laktoosi) kulutus voidaan määrittää mittaamalla yläpuolisen nesteen pelkistys-kapasiteetti käyttäen Somogyi-Nelson-menetelmää.

Saatu solupallo suspendoidaan 200 ml:aan vettä, minkä jälkeen lisätään 200 ml 2-N NaOH:a. Uutto tapahtuu hämmentämällä 1-2 tuntia huoneenlämpötilassa. Uutetut solut sentrifugoidaan tämän jälkeen pois ja kirkas viskoosi yläpuolinen neste hapotetaan lievästi etikkahapolla tai laimealla kloo-rivetyhapolla. Tällöin erottuu tilaa vievä geeli; tämä sentrifugoidaan pois, pestään useita kertoja sentrifugiput-kessa, dialysoidaan, mikäli se on tarkoituksenmukaista, ja pakastekuivataan. Saanto: n. 2,3 g kuivaa polysakkaridimate-riaalia.

Kun edellä mainittuja lajeja RCR 1044 ja F-13 oli viljelty 0,1 % glutamiinihappoa/0,5 % mannitolia/suoloja sisältävässä väliaineessa (ks. J. Microbiol. Serol. 47 (1981), 481-497), ne antoivat 200-300 mg tuotetta, joka sisälsi yli 95 % heksoosia (laskettuna D-galaktoosista) 7 80722 määritettynä antroni/rikkihappomenetelmällä. Yllämainitut suvun Rhizobium lajit RCR 1012, 0403, TOM, 127 K-82 ja erilaiset muut lajit tuottivat pienempiä määriä samaa tuotetta.

Polysakkaridin rakenteen määritys

Taulukko I

Rhizobium trifolii-lajin TA-1 alkuperäisen ja modifioidun kapseli- polysakkaridin sokerianalyysi_

Sokerikomponentti Moolisuhde (alditoliasetaatteina)

A B C D E F

Glyseroli +

Treitoli 0,7

Erytritoli + D-mannoosi 1,0 1,00 1,00 1,00 1,00 0,17 D-galaktoosi 4,0 0,92 1,03 1,41 0,99 0,34 D-glukoosi 1,0 0,97 0,96 0,96 0,14 0,11 a) Polysakkaridi: A, alkuperäinen; B, perjodaattihapetettu ja boorihydridi-pelkistetty; C, perjodaatti-hapetettu, boorihydridi-pelkistetty ja Smith-lohkaisu (pääketju); D, osittain perjodaatti-hapetettu (0,5 tuntia), boorihydridi-pelkistetty ja Smith-lohkaisu; E, perjodaatti-hapetettu ja boorihydridi-pelkistetty (pääketju); ja F, kromitrioksidi-hapetettu, asetyloitu alkuperäinen polysakkaridi. - - - ---

Taulukko II

Rhizobium trifolii-lajin TA-1 alkuperäisen ja modifioidun kapse-lipolysakkaridin metylointianalyysi_

Metyloitu sokeri3^ T1"^ _Moolisuhde0^_ _A B C D E F_ 2.3.4.6- Man 1,00 1,00 2.3.4.6- Gal 1,07 1,80 0,34 2.4.6- Man 1,54 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 2.4.6- Gal 1,58 0,96 0,99 1,05 1,11 0,93 0,83 2.3.6- Gal 1,65 0,84 2.3.6- Glc 1,79 0,88 0,83d)0,46 2,3-Glc 2,98 0,70 3-Glc 4,58 0,87 0,88 8 80722 a) 2,3,4,6-Man = 2,3,4,6-tetra-O-metyyli-D-mannoosi jne.

b) Vastaavien alditoliasetaattien retentioajat verrattuna 1,5-di-0-asetyyli-2,3,4,6-tetra-O-metyyli-D-glusitolin re-tentioaikaan "sulatetulla piidioksidi"-kolonnilla WCOT-OV-225 190°C:ssa.

c) Polysakkaridi: A, alkuperäinen; B, perjodaatti-hapetettu ja boorihydridi-pelkistetty; C, perjodaatti-hapetettu, boori-hydridi-pelkistetty ja Smith-lohkaisu; D, perjodaatti-hapetettu, boorihydridi-pelkistetty, metyloitu, Smith-lohkaisu ja trideuterio-metyloitu; E, osittain perjodaatti-hapetetty (0,5 h), boorihydridi-pelkistetty ja Smith-lohkaisu; F, per-jodaatti-hapetettu, boorihydridi-pelkistetty, Smith-lohkaistu pääketju.

d) 2,6-di-0-trideuteriometyyli-3-0-metyyli-D-glukoosi.

Saadun polysakkaridin hydrolyysi (2-M trifluorietikkahappo, 100°C, 6 h) tuotti D-galaktoosia, D-glukoosia ja D-mannoosia moolisuhteessa 4:1:1 (taulukko I, sarake A), mikä antaa olettaa heksasakkariditoistoyksikköä. Mitään uronihappoja, tai asyyli-, (asetyyli-, sukkinyyli-) tai asetaaliryhmään sitoutuneita pyruvaattisubstituentteja ei todettu. Polysakkaridin metylointianalyysi (taulukko II, sarake A) osoittaa kahta D-galaktosyylipääteryhmää, yhtä (1 -> 3)-sitoutunutta D-manno-syylijäännöstä, yhtä (1 -> 3)-sitoutunutta D-galaktosyyli-jäännöstä ja yhtä (1 -> 4)-D-galaktosyylijäännöstä ja kaksois-haarautunutta D-glykosyylijäännöstä asemien 0-1, 2, 4, 6 kautta.

Polysakkaridi sitoi viisi moolia perjodaattia heksasakkariditoistoyksikköä kohti ja tuotti kaksi moolia muurahaishappoa 5 tunnin aikana huoneen lämpötilassa. Saadun polyaldehydin boorihydridipelkistys, jota seurasi hydrolyysi 2-M trifluori-etikkahapossa, tuotti D-glukoosia, D-galaktoosia ja D-mannoosia suhteessa 1:1:1 yhdessä glyserolin ja treitolin kanssa (taulukko I, sarake B). Polyalkoholin metylointi (taulukko II, sarake B) osoitti, että perjodaattihapetus oli lohkaissut kaksi D-galaktosyylipääteryhmää ja yhden 1 » 4)-sitoutuneen D-galaktosyylijäännöksen. Polyalkoholin Smith-lohkaisu (90 %:nen 9 80722 muurahaishappo, 40°C, 1 h) antoi tuotteen, joka oli yhä makro-molekulaarinen eikä dialysoitavissa ja sisälsi yhtä suuret määrät D-glukoosia, D-galaktoosia ja D-mannoosia (taulukko I, sarake C). Smith-lohkaistun polymeerin metylointianalyysi (taulukko II, sarake C) osoitti, että jälkimmäinen oli haarautumaton ja koostui (l->3)-sitoutuneista D-mannosyylijäännöksistä, (1>3)-sitoutuneista D-galaktosyylijäännöksistä ja (1 -> 4)-sitoutuneista D-gluko- syylijäännöksistä. D-galaktosyylisivuketjujen sitoutumiskohdat kiinnitettiin polyalkoholin metyloinnilla, mitä seurasi Smith-lohkaisu ja lohkaistun polymeerin trideuteriometylointi (taulukko II, sarake D). Saatu 2,3,6-tri-O-metyyli-D-glukoosi oli MeO-2,6-deuteroitu, mikä osoitti D-galaktosyyli- ja di-D-galaktosyylisivuketjujen sijainnit. Suhteelliset sijainnit vahvistettiin osittain perjodaatilla hapetetun ja Smith-loh-kaistun polysakkaridin metylointianalyysillä (taulukko I, sarake D). Koska D-galaktosyylipääteryhmän, jossa on trioli-ryhmä vierusasemassa, katsotaan olevan herkemmän perjodaatin vaikutukselle kuin (1 -> 4)-sitoutunut D-galaktosyylijäännös, joka sisältää dioliryhmän vierusasemassa, jokainen hapettuma-ton D-galaktosyylijäännös, joka pysyy sitoutuneena pääketjuun tällaisen hapetuksen jälkeen, osoittaa di-D-galaktosyylisivu-ketjun aseman. 2,3-di-O-metyyli-D-glukoosin muodostuminen epä- - täydellisesti perjodaatilla hapetetun ja Smith-lohkaistun polysakkaridin metylointianalyysin kautta (taulukko II, sarake E) osoitti, että di-D-galaktosyylisivuketju otti haltuunsa pääketjun D-glukosyylijäännöksen 6-aseman.

Heksaanijäännösten järjestystä pääketjussa tutkittiin sivuketjuista karsitun polysakkaridin perjodaattihapetuksella, sillä nyt (1 -> 4)-sitoutuneet D-glukosyylijäännökset ovat herkkiä perjodaattihapetukselle (taulukko I, sarake E). Polyalkoholin peräkkäinen pelkistys ja Smith-lohkaisu tuotti D-mannoosin, D-galaktoosin ja erytritolin trisakkaridituotteen, jonka metylointianalyysi (taulukko II, sarake F) antoi 2,3,4,6-tetra-O-metyyli-D-mannoosia ja 2,4,6-tri-O-metyyli-D-galaktoosia, mikä osoitti seuraavaa järjestystä: 3)-D-Man-(l -> 3)-D-Gal-(l -> 4)-D-Glc-(l -> pääketjussa.

Asyloidun alkuperäisen polysakkaridin kromitrioksidihapetus, jota seurasi sokerianalyysi (taulukko I, sarake F) osoitti, 10 80722 että kaikki sokerijäännökset olivat hapettuneita ja tästä johtuen jäännökset olivat pääasiassa β-sitoutuneita.

Yllä olevista tuloksista oli mahdollista päätellä seuraava rakenne keksinnön mukaiselle geeliä muodostavalle polysakkaridille .

D-Gal ^ i 4 D-Gal 6 l 6 8 S r ->4)-D-Glc-(1 -> 3)-D-Man-(1 -> 3)-D-Gal-(1 —> 2 3 ΐ D-Gal

Yllä oleva rakenne sisältää eräitä epätavallisia muotoja bak-teerieksopolysakkaridille, joka rakentuu toistoyksiköistä.

Se on neutraali heteropolysakkaridi ilman karbonyyliä sisältäviä substituentteja ja tämän vuoksi se muistuttaa solunulkois-ta polysakkaridikumia, jota saadaan rehuherneryhmän hitaasti kasvavasta Rhizobium-lajista CB 744 /Ärch. Biochem. Biophys.

124 (1968) 292-2987. Rakenne sisältää myös kaksoishaaroittu-nutta sokerijäännöstä, mikä on epätavallinen piirre bakteeri-polysakkarideilla. Samanlaisia piirteitä esiintyy myös Klebsiella-suvun kapselipolysakkarideilla, tyypit 33 ja 38 /Carbohydrate Research 70 (1979) 134-14£7· Yllä esitetty tämän keksinnön mukaisen geeliä muodostavan polysakkaridin rakenne on ensimmäinen, josta on ilmoitettu nopeasti kasvavan Rhizobia-lajin liukenemattomalla kapselipolysakkaridilla.

Rakenteen määritysmenetelmät

Rakenteen määrityksessä käytettyä sokerianalyysiä ja metyloin-tianalyysiä on kuvattu julkaisussa Carbohydrate Research 26 il 80722 (1973) 409-419 ja Chem. Commun. Univ. Stockholm, 8 (1976) 1-75.

Perjodaattihapetus.

Polysakkaridia (100 mg) liuotettiin veteen (50 ml) 60°C:ssa. 0,03-M natriummetaperjodaattia (50 ml) lisättiin hämmennettyyn liuokseen, minkä jälkeen seos jäähdytettiin välittömästi huoneen lämpötilaan. Näytteitä (0,1 ml) laimennettiin ajoittain 25 ml:ksi ja perjodaattikulutus määritettiin spektrofoto-metrisesti aallonpituudella 223 nm. Muurahaishapon vapautuminen määritettiin titraamalla 0,1-M NaOH:lla sen jälkeen kun konvertoitumaton perjodaatti oli pelkistetty etyleeniglykolilla. Hapettuminen tapahtui nopeasti pimeässä 20°C:ssa; 8 tunnin kuluttua lisättiin ylimäärin etyleeniglykolia ja hapettunut tuote eristettiin dialyysillä ja sitä pelkistettiin yli yön natriumboorihydridillä (200 mg). Ylimääräinen pelkistysaine lohkaistiin etikkahapolla ja seos dialysoitiin ja pakastekui-vattiin.

Smith-lohkaisu.

Tuotteen (84,8 mg) Smith-lohkaisua suoritettiin 1 h 40°C:ssa 90 %:sessa muurahaishapossa (40 ml). Muurahaishappo haihdutettiin pois tyhjössä ja jäännöksen vesiliuos dialysoitiin ja pakastekuivattiin. Osa (33,1 mg) tuotteesta (43,1 mg) liuotettiin 15-mM NalO^riin (40 ml). Neljän päivän kuluttua pimeässä seos puhdistettiin yllä kuvatulla tavalla. Osa (10 mg) tuotteesta (30 mg) saatettiin sokerianalyysiin ja toinen osa (10 mg) saatettiin 1 tunniksi 40°C:ssa Smith-lohkaisuun 90 %:sessa muurahaishapossa (5 ml). Liuos haihdutettiin tyhjössä ja pakastekuivattiin, minkä jälkeen jäännös saatettiin mety-lointianalyysiin.

Kromitrioksidihapetus.

Kromitrioksidihapetus suoritettiin tavalla, jota Lindberg ja Lönngren /Methods Enzymol. 50 (1978), 20-24) ovat kuvanneet.

Rhizobium trifolii TA-l-kapselipolysakkaridin ja kahden tunne-tun agartuotteen geelilujuuksien vertailu_ ' ia 80722

Geelilujuusmääritysten tulokset esitetään liitteenä olevassa kuviossa.

Geelilujuudet määritetään mittaamalla geelien murtolujuudet Overload Dynamics type S-100-geelitestauslaitteella; kuormi-tuskennon männän halkaisija oli 12,7 mm. Tutkittavat geelit preparoitiin kuumentamalla, mitä seurasi jäähdytys vedessä eri painoväkevyyksillä (0,1-2,0 % paino/tilavuus).

Liitteenä olevasta kuviosta voidaan päätellä, että tämän keksinnön mukaisella bakteerigeelillä on suurempi geelilujuus samoilla painoväkevyyksillä kuin kahdella tunnetulla agarilla, joita käytettiin vertailumateriaalina, nimittäin Gibco-aga-rilla ja Oxoid-Ion-agarilla n:o 2. Erityisesti pienillä paino-väkevyyksillä (0,1-0,4 %) saatiin vielä melko jäykkiä geelejä tämän keksinnön mukaisella bakteeripolysakkaridilla, kun taas tämä oli tuskin enää mahdollista ko. kahdella agarilla sanotulla väkevyysalueella. Lisäksi bakteerituote osoittautuu kimmoi-sammaksi kuin tunnetut agarit niin, että bakteerigeeli salli suuremman muodonmuutoksen (männän 8 mm:n tunkeutumissyvyyden) - . kuin hauraammat agarit, jotka sallivat vain 4 mm:n muodonmuu toksen, ennenkuin geelien murtumispiste saavutettiin. Lisäksi ‘. bakteerigeelillä havaittiin olevan lyhyemmät "kovettumisajät" (alle 1/2 h) kuin ko. kahden agarin "kovettumisajät” (yli 1 h) maksimi geelilujuuden saavuttamiseen sulatuksen ja jäähdytyksen jälkeen huoneen lämpötilaan. Bakteerigeeli oli stabiili pH-alueella 2-11 ja steriloinnilla (20 min. 120°C:ssa) ei ollut haitallista vaikutusta geelilujuuteen.

Gibco-agaria markkinoi Gibco Europe B.V., Hoofddorp, Alankomaat ja Oxoid Ion-agaria n:o 2, Pharmachemie B.V., Haarlem, ; Alankomaat.

Claims (9)

1. Geeliä muodostava polysakkaridi, tunnettu siitä, että se rakentuu seuraavan kaavan mukaisista toisto-yksiköistä D-Gal β ir 4 D-Gal β * 6 β β β ->4) -D-Glc-(1 -> 3) -D-Man- (1 -> 3) -D-Gal-(1 -> 2 β f 1 D-Gal D-Gal, D-Glc ja D-Man tarkoittavat vastaavasti D-galaktoo-sia, D-glukoosia ja D-mannoosia, että polysakkaridin keskimääräinen molekyylipaino on ainakin 150 000 ja että se on identtinen sellaisen polysakkaridin kanssa, joka on saatu uuttamalla Rhizobium trifolii-kannan LMD 83,30 soluja IM NaOH:lla ja neutraloimalla uute.

2. Menetelmä sellaisen geeliä muodostavan polysakkaridin valmistamiseksi, joka muodostuu seuraavan kaavan mukaisista toistoyksiköistä D-Gal β * 4 D-Gal β ir 6 β β β ->4) -D-Glc-(1 -> 3) -D-Man- (1 -> 3) -D-Gal-(1 -> i4 80722 2 β ΐ D-Gal jossa D-Gal, D-Glc ja D-Man tarkoittavat vastaavasti D-glaktoosi, D-glukoosi ja D-mannoosi, tunnettu siitä, että Rhizobium-suvun kantaviljelyn solumassaa uutetaan vesipitoisen uuttoaineen avulla.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään seuraavien lajien viljelyjä: Rhizobium leguminosarum, Rhizobium trifolii tai Rhizobium phaseoli.

4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetään kantojen Rhizobium leguminosarum LMD 83,29 tai LMD 83,28 tai Rhizobium trifolii LMD 83,30 viljelyjä.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 2-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että uutetaan Rhizobium-suvun viljelyjä alkalisen liuoksen avulla jonka jälkeen saatu uute neutraloidaan laimealla hapolla.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että alkalisena liuoksena käytetään IM NaOH:a.

7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että uutos suoritetaan huoneen lämpötilassa.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 2-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Rhizobium-suvun viljelyjä uutetaan melkein kiehuvalla vedellä ja saatu suspensio syötetään bakteriologisen suodattimen läpi.

9. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen polysakkaridin käyttö vesipitoisen geelin aikaansaamiseksi. 15 80722