DE69815244T2

DE69815244T2 - Galactosylierte hydroxyalkylpolysaccharide und ihre derivate

Info

Publication number: DE69815244T2
Application number: DE69815244T
Authority: DE
Inventors: N. H. Cheng; G. Robert NICKOL; George Wang; Jun Li
Original assignee: University of Miami; Hercules LLC
Current assignee: University of Miami; Hercules LLC
Priority date: 1997-04-29
Filing date: 1998-04-27
Publication date: 2004-04-22
Anticipated expiration: 2018-04-28
Also published as: CA2261603A1; EP0907662A1; EP0907662B1; AU738188B2; US6433161B1; AU7271398A; WO1998049201A1; DE69815244D1

Description

Diese Erfindung betrifft galactosylierte Hydroxyalkylpolysaccharide und Verfahren zu ihrer Herstellung.
Hintergrund der Erfindung
Enzymatische Verfahren zur Herstellung und Modifizierung von Polysacchariden sind fachbekannt. Zum Beispiel offenbart US-PS 5,149,640 ein Galactose-Transferprodukt, das durch ein Verfahren hergestellt wird, in welchem man einen Mikroorganismus, der ein Galactose-Transferprodukt erzeugen kann, auf eine Kombination aus Lactose oder einem Galactosedonor und einem Galactoserezeptor einwirken läßt; und in welchem das erzeugte Galactose-Transferprodukt aufgefangen wird.
US-PS 5,180,674 lehrt ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung von Saccharidzusammensetzungen. Das Verfahren ist reiterativ und umfasst die folgenden drei Schritte: 1) Eine Glycosyl-Transferase, die eine vorausgewählte Saccharideinheit auf eine Akzeptorgruppe übertragen kann, wird isoliert durch Inkontaktbringen der Akzeptorgruppe mit einer Mischung, von der vermutet wird, daß sie die Glycosyl-Transferase enthält, unter Bedingungen, die wirksam zur Bindung der Akzeptorgruppe und Glycosyl-Transferase und dadurch zur Isolierung der Glycosyl-Transferase sind. Die Akzeptorgruppe ist ein Protein, ein Glycoprotein, ein Lipid, ein Glycolipid oder ein Kohlehydrat; 2) Die isolierte Glycosyl-Transferase wird dann verwendet, um die Bindung zwischen der Akzeptorgruppe und der vorausgewählten Saccharideinheit zu katalysieren; 3) Schritte (1) und (2) werden mehrere Male wiederholt, wobei das in der ersten Wiederholung des Verfahrens erhaltene Zwischenprodukt als Akzeptorgruppe der zweiten Wiederholung verwendet wird.
US-PS 4,957,860 offenbart ein Verfahren zur Erzeugung von Oligosacchariden durch Reaktion zwischen Lactose und β-Galactosidase.
In US-PS 4,942,128 wird ein Verfahren zur Erzeugung von mikrobieller Cellulose offenbart, welches das Impfen einer Menge von Nährmedium, das ein Polysaccharidderivat wie Carboxymethylcellulose umfasst, mit einem Cellulose erzeugenden Mikroorganismus umfasst. Aus diesem Verfahren resultierende Cellulose soll hoch absorptionsfähig sein.
Die Herstellung von Galactosylcyclodextrin durch Transgalactosylierung wurde von K. Koizumi et al. berichtet, Carbohydrate Research, 278 (1995) 129–142.
EP-A-0 281 655 offenbart Stärkeetherderivate von Monosacchariden.
Hydroxyalkylpolysaccharide, insbesondere Hydroxyalkylcellulose oder Cellulosederivate und Hydroxyalkylguar oder Guarderivate, werden weithin als Rheologiemodifizierer, Verdickungsmittel und für eine Vielzahl anderer Anwendungen verwendet. Verfahren zur Modifizierung dieser Stoffe durch Galactosylierung, d. h. Umwandlung von Hydroxylgruppen zu Galactosiden, wurden gesucht, um die Eigenschaften der Hydroxyalkylpolysaccharide zu modifizieren und ihre Leistung zu verbessern.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Zusammensetzung umfasst galactosyliertes Hydroxyalkylpolysaccharid und Galactosidaseenzym, worin das Hydroxyalkylpolysaccharid einen Grad der Substitution durch Galactoseeinheiten aufweist, die an Hydroxylgruppen des Hydroxyalkylpolysaccharids durch galactosidische Bindungen gebunden sind.
Ein Verfahren zur Herstellung von galactosyliertem Hydroxyalkylpolysaccharid umfasst:

a) Bereitstellen wenigstens eines Hydroxyalkylpolysaccharids; und
b) Behandeln des Hydroxyalkylpolysaccharids mit einem Galactosedonor in Gegenwart von Galactosidaseenzym für eine ausreichende Zeit, um einen Substitutionsgrad mit Galactoseeinheiten an den Hydroxylgruppen des Hydroxyalkylpolysaccharids zu verursachen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Erläuterung des zur Bestimmung von gebundenen Galactoseeinheiten verwendeten Verfahrens.
2 erläutert die Reaktion von Hydroxyethylcellulose (HEC) mit einem Lactosedonor.
3 ist ein Diagramm des Substitutionsgrads von Hydroxyethylcellulose mit Galactoseeinheiten zu variierenden Reaktionszeiten.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Zusammensetzungen dieser Erfindung umfassen galactosylierte Hydroxyalkylpolysaccharide und Galactosidaseenzym. Eine Vielzahl von Hydroxyalkylpolysacchariden sind kommerziell erhältlich. Sie werden leicht hergestellt durch allgemein fachbekannte Verfahren durch Reaktion von Polysacchariden, allgemein unter alkalischen Bedingungen, mit Ethylenoxid oder C₁-C₁₂-substituiertem Ethylenoxid.
Die Hydroxyalkylpolysaccharide zur Verwendung in dieser Erfindung schließen jedes wasserlösliche Hydroxyalkylpolysaccharid ein. Bevorzugt werden sie aus der folgenden Gruppe ausgewählt: Hydroxyalkylcellulose, Hydroxyalkylcelluloseether, Hydroxyalkylguar, Hydroxyalkylguarderivate, Hydroxyalkylstärke und Hydroxyalkylstärkederivate. Bevorzugt sind die Hydroxyalkylgruppen Hydroxyethyl- oder Hydroxypropylgruppen. Besonders bevorzugt sind die Hydroxyalkylgruppen Hydroxyetkylgruppen.
Bevorzugte Hydroxyalkylcellulosen schließen Hydroxyethylcellulose (HEC) und Hydroxypropylcellulose (HPC) ein. Hydroxyalkylcelluloseether schließen wasserlösliche Ethylhydroxyethylcellulose (EHEC), Carboxymethylhydroxyethylcellulose (CMHEC), Hydroxypropylhydroxyethylcellulose (HPHEC), Methylhydroxypropylcellulose (MHPC), Methylhydroxyethylcellulose (MHEC), hydrophob modifizierte Hydroxyethylcellulose (HMHEC), hydrophob modifizierte Hydroxypropylcellulose (HMHPC), hydrophob modifizierte Ethylhydroxyethylcellulose (HMEHEC), hydrophob modifizierte Carboxymethylhydroxyethylcellulose (HMCMHEC), hydrophob modifizierte Hydroxypropylhydroxyethylcellulose (HMHPHEC), hydrophob modifizierte Methylhydroxypropylcellulose (HMMHPC), hydrophob modifizierte Methylhydroxyethylcellulose (HMMHEC), kationische Hydroxyethylcellulose (kationische HEC) und kationische hydrophob modifizierte Hydroxyethylcellulose (kationische HMHEC) ein.
Bevorzugte Hydroxyalkylguars schließen Hydroxyethylguar (HE-Guar) und Hydroxypropylguar (HP-Guar) ein. Hydroxyalkylguarderivate schließen Carboxymethylhydroxypropylguar (CMHP-Guar), hydrophob modifiziertes Hydroxyethylguar (HMHE-Guar), hydrophob modifiziertes Hydroxypropylguar (HMHP-Guar), kationisches hydrophob modifiziertes Hydroxypropylguar (kationisches HMHP-Guar) und hydrophob modifiziertes Carboxymethylhydroxypropylguar (HMCMHP-Guar) ein.
Bevorzugte Hydroxyalkylstärkederivate zur Verwendung in der Erfindung schließen Hydroxyethylstärke, Hydroxypropylstärke, oxidierte Hydroxyethylstärke, oxidierte Hydroxypropylstärke, kationische Hydroxyethylstärke, kationische Hydroxypropylstärke, Hydroxyethylstärkeacetat, Hydroxypropylstärkeacetat, Hydroxyethylstärkephosphat, Hydroxypropylstärkephosphat, depolymerisierte Hydroxyethylstärke und depolymerisierte Hydroxypropylstärke ein.
Besonders bevorzugte Hydroxyalkylpolysaccharide zur Verwendung in der Erfindung sind Hydroxyethylcellulose (HEC), Ethylhydroxyethylcellulose (EHEC), Carboxymethylhydroxyethylcellulose, Methylhydroxyethylcellulose (MHEC), hydrophob modifizierte Hydroxyethylcellulose (HMHEC), hydrophob modifizierte Ethylhydroxyethylcellulose (HMEHEC), hydrophob modifizierte Carboxymethylhydroxyethylcellulose (HMCMHEC), hydrophob modifizierte Methylhydroxyethylcellulose (HMMHEC), kationische Hydroxyethylcellulose (kationische HEC) und kationische hydrophob modifizierte Hydroxyethylcellulose (kationische HMHEC).
Das am meisten bevorzugte Hydroxyalkylpolysaccharid ist Hydroxyethylcellulose (HEC).
Die Galactosylierungsreaktion wird in Gegenwart eines Galactosedonors und von Galactosidaseenzym durchgeführt. Geeignete Galactosedonoren schließen Galactose selbst und Di-, Oligo- oder Polysaccharid ein, das bei Hydrolyse Galactose liefern kann. Bevorzugt ist der Galactosedonor einer aus der Gruppe Lactose, Galactose, Galactomannane und Nitrophenyl-, Dinitrophenyl- und Trinitrophenylglycoside davon. Bevorzugte Galactomannane schließen Guar und Johannisbrotkernmehl ein. Bevorzugte Donoren schließen Lactose und Galactose ein. Der am meisten bevorzugte Donor ist Lactose.
Die Galactosidaseenzyme zur Verwendung in der Galactosylierungsreaktion sind bevorzugt β-Galactosidasen. Die Galactosylierungsreaktion kann in Gegenwart jedes Mikroorganismus durchgeführt werden, der β-Galactosidase erzeugt. Spezifische Beispiele für solche Mikroorganismen sind Bacillus circulans, Aspergillus oryzae und E. coli.
Zur Kultivierung dieser oder anderer Mikroorganismen, die für die Galactosylierungsreaktion verwendet werden, ist jede Nährmittelquelle verwendbar, so lange sie durch den Mikroorganismus assimiliert werden kann. Die Kultur wird mit dem entsprechenden Hydroxyalkylpolysaccharid und Galactosedonor zum Anfangsstadium der Kultivierung oder während der Kultivierung ergänzt. Alternativ kann das galactosylierte Produkt unter Verwendung von ruhenden Kulturen erzeugt werden.
Ein Verfahren unter Verwendung ruhender Kulturen setzt einfach eine Kulturlösung als solche ein. Ein anderes Verfahren umfasst das Isolieren von Zellen durch Zentrifugieren oder eine äquivalente Technik, Resuspendieren der Zellen in Phosphatpuffer oder einem Äquivalent, ferner Hinzugeben von Galactosedonor und Hydroxyalkylpolysaccharid zur Suspension und anschließendes Umsetzen dieser Bestandteile. Die Mikroorganismen können lebensfähige Zellen sein, oder die Zellen können einer Behandlung mit Aceton unterworfen worden sein oder können der Gefriertrocknung unterworfen worden sein. Der Mikroorganismus kann ebenfalls an einem Träger immobilisiert sein oder kann in einem Bioreaktor unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran verwendet worden sein.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Durchführung der Erfindung ist unter einer zellfreien Bedingung, d. h. unter Verwendung von Enzym, das aus dem entsprechenden Mikroorganismus isoliert wurde, zusammen mit Hydroxyalkylpolysaccharid und Galactosedonor. In diesem Fall sind die bevorzugten Enzyme diejenigen β-Galactosidasen, die aus den Organismen Bacillus circulans, Aspergillus oryzae und E. coli isoliert werden.
Im bevorzugten zellfreien Verfahren wird die Reaktion in wässriger Lösung durchgeführt. Wassermischbare organische Cosolvenzien können in Mengen verwendet werden, die nicht die Aktivität des Enzyms zerstören. Der optimale pH des Reaktionsmediums hängt von der Quelle des verwendeten Enzyms ab, aber ist bevorzugt im Bereich von 4 bis 9,5, besonders bevorzugt von 4,5 bis 7. Der pH kann durch Einschluß geeigneter Pufferstoffe, z. B. Natriumacetat, aufrechterhalten werden.
Die Menge von Hydroxyalkylpolysaccharid im Reaktionsmedium ist nicht kritisch, wobei das Verfahren bei jeder Menge von aufgelöstem Hydroxyalkylpolysaccharid durchführbar ist. Bevorzugt wird die Menge im Bereich von 0,1 bis 50 Gew.% sein, besonders bevorzugt von 0,5 bis 15 Gew.% und am meisten bevorzugt von 1 bis 10 Gew.%.
Das Verhältnis von Galactosedonor zu Hydroxyalkylpolysaccharid auf Gewichtsbasis kann über einen weiten Bereich variieren. Allgemein wird gefunden, daß je höher das Verhältnis ist, um so höher der Grad der Galactosylierung ist, der erreicht werden kann. Das maximale Verhältnis von Galactosedonor zu Hydroxyalkylpolysaccharid wird nur durch die Löslichkeit des Donors im Reaktionsmedium beschränkt. In der hier offenbarten Arbeit wurden Verhältnisse von 1 : 1 bis 100 : 1 als zufriedenstellend aufgefunden. Jedoch sind Verhältnisse über diese Grenzen hinweg ebenfalls innerhalb der Grenzen der Erfindung.
Die verwendete Menge von Galactosidase ist nicht kritisch. Selbst sehr geringe Mengen werden die Reaktion fortschreiten lassen, obwohl mit einer geringen Geschwindigkeit. Bevorzugt ist die Menge von Galactosidase 0,5 bis 1.000 Einheiten pro Gramm Hydroxyalkylpolysaccharid. Besonders bevorzugt ist die Menge 5 bis 500 Einheiten und am meisten bevorzugt 10 bis 150 Einheiten pro Gramm Hydroxyalkylpolysaccharid: Eine "Einheit" Galactosidaseenzym wird als die Menge definiert, die 1 Mikromol pro Minute von p-Nitrophenyl-α-D-galactosid zu p-Nitrophenol und Galactose bei pH 6,5 und 25°C hydrolysieren wird.
Die Temperatur zur Reaktion ist bevorzugt von Raumtemperatur, d. h. 20 bis 25°C, bis zu einer Temperatur, bei der das Enzym inaktiviert wird, 85°C. Temperaturen von weniger als Raumtemperatur können verwendet werden, aber mit einer begleitenden Zunahme der Reaktionsdauer.
Die Reaktionsdauer für die optimale Galactosylierung hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, z. B. Temperatur, Konzentrationen der Reaktanden und Strukturen des hydroxyalkylierten Polysaccharids und Galactosedonors, die für die Reaktion ausgewählt werden. Außerdem kann es eine kompetitive Reaktion von enzymatischer Hydrolyse geben, die in einem Verlust von gebundenen Galactosegruppen resultiert. Aus diesem Grund kann etwas Experimentieren erforderlich sein, um die optimale Dauer für einen spezifischen Satz von Reaktionsbedingungen zu bestimmen. Die Fachleute für Enzymreaktionen können die optimale Dauer ohne ungebührliches Experimentieren bestimmen.
Der Verlauf der Reaktion kann zweckmäßig durch enzymatischen Test unter Verwendung von Galactoseoxidase wie in 1 gezeigt verfolgt werden, wobei R den hydroxyalkylierten Polysaccharidrest darstellt. Die Oxidationsreaktion mit Galactoseoxidase ist hochspezifisch für Galactose und Galactoside. Die durch Galactoseoxidase katalysierte Oxidationsreaktion kann durch Bestimmung des gleichzeitig erzeugten Wasserstoffperoxids durch einen Peroxidase-Chromogen-Test in einem W-Spektrophotometer bei 420 nm oder durch visuelle Beobachtung der Farbe verfolgt werden. Das Wasserstoffperoxid wird durch Messung seiner Reaktion mit Peroxidase in Gegenwart eines geeigneten chromogenen Sauerstoffakzeptors wie o-Toluidin oder o-Dianisidin bestimmt.
Vor der Analyse muß das Produkt behandelt werden, um nicht umgesetzte Galactose/und oder Galactosedonor zu entfernen. Ein zweckmäßiges Behandlungsverfahren ist die Dialyse mit einem Grenzwert des Molekulargewichts von ca. 8.000, die die Trennung der Galactose mit geringerem Molekulargewicht und/oder von Galactosedonor vom galactosylierten Hydroxyalkylpolysaccharid, nicht umgesetzten Hydroxyalkylpolysaccharid und Enzym erlaubt.
Figur 1
Der gleiche Effekt, d. h. eine grobe Trennung kleiner Moleküle von Makromolekülen, kann durch Gelfiltration mit Sepharose^® CL-4B-Gelen erreicht werden, die Polymere mit einem Molekulargewicht im Bereich von 10.000 bis 4 × 10⁷ fraktionieren.
Der Grad der Galactosylierung in den galactosylierten Hydroxyalkylpolysacchariden wird als "Grad der Substitution" ausgedrückt. Polysaccharide enthalten allgemein 3 reaktive Hydroxylgruppen pro Monomereinheit. Die Hydroxyalkylierung des Polysaccharids verändert nicht die Anzahl dieser Hydroxylgruppen. Stattdessen tauscht sie ursprüngliche Hydroxylgruppen gegen Hydroxylgruppen aus, die am Ende der Hydroxyalkylkette sind. Die durchschnittliche Anzahl von Hydroxylgruppen pro Monomereinheit, die durch Galactoseeinheiten substituiert sind, ist der Grad der Substitution. Theoretisch beträgt dann der maximale Grad der Substitution 3. In der vorliegenden Erfindung beträgt der Grad der Substitution von 0,01 bis 3. Bevorzugt ist er von 0,01 bis 1 und am meisten bevorzugt von 0,01 bis 0,5.
In Bezug auf den Mechanismus der Galactosylierungsreaktion und die Struktur der Produkte sind die folgenden Anmerkungen, obwohl sie als richtig angenommen werden, spekulativ und sollten nicht als Beschränkung der Erfindung aufgefaßt werden. Polysaccharide enthalten allgemein Hydroxylgruppen in großer Anzahl neben dem Polymerrückgrat. Wie oben angegeben wurde, verändert die Hydroxyalkylierung des Polysaccharids nicht die Anzahl dieser Hydroxylgruppen. Stattdessen ersetzt es ursprüngliche Hydroxylgruppen gegen Hydroxylgruppen, die am Ende der Hydroxylalkylketten sind. Es wird angenommen, daß das Galactosylierungsverfahren dieser Erfindung die Reaktion an diesen Hydroxyalkylhydroxylen begünstigt. Insbesondere wenn das Hydroxyalkylpolysaccharid ein Hydroxyethylpolysaccharid ist, sind die Hydroxyalkylhydroxyle primär, und es wird von ihnen erwartet, daß sie deutlich für die Reaktion gegenüber der großen Anzahl von sekundären Hydroxylgruppen begünstigt werden, die am Rückgrat eines typischen Polysaccharids vorhanden sind. Eine Erläuterung der vorgeschlagenen Reaktion unter Verwendung von Hydroxyethylcellulose (HEC) als Beispiel ist in 2.
Figur 2
Die galactosylierten Hydroxyalkylpolysaccharide dieser Erfindung besitzen Verwendung in einer Vielzahl von Gebieten, einschließlich Verdickungsmitteln, Rheologiemodifizierern und Schutzkolloiden.
Diese Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, die nur exemplarisch sind und nicht zur Beschränkung gedacht sind. Alle Prozentangaben und Teile sind gewichtsbezogen, wenn nichts anderes angegeben wird.
Materialien
Hydroxyethylcellulose: Natrosol^® 250LR von Hercules Incorporated, Wilmington, Delaware.
Hydroxypropylcellulose: Klucel^® Typ MF von Hercules Incorporated, Wilmington, Delaware.
Galactosidasen: β-Galactosidasen von Aspergillus oryzae (EC 3.2.1.23; Qualität XI) und von E. coli (EC 3.2.1.23; Qualität VI) wurden von Sigma Inc., St. Louis, Missouri erworben.
β-Galactosidase von Bacillus circulans wurde von Daiwai Kasei Co., Ltd., Osaka, Japan erhalten.
Die thermostabile CLONEZYME-Glycosidasebank wurde erhalten von Recombinant Biocatalysis, Inc., Philadelphia, Pennsylvania.
Verfahren zur enzymatischen Galactosylierung und Polymerreinigung
Zu einer Lösung aus Hydroxyalkylpolysaccharid und Lactose in Natriumacetatpuffer (pH 4,85) wurde β-Galactosidase gegeben. Nach der gewünschten Reaktionsdauer wurde die Reaktionsmischung durch Erwärmen für 5 Minuten auf 100°C beendet. Die Reaktionsmischung wurde dann direkt auf eine Sepharose^® CL-4B-Gelsäule aufgetragen, die dann mit Wasser eluiert wurde. Die Polymer enthaltenden Fraktionen (bestimmt durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung von 3 : 7 : 2 Ammoniak : i-Propanol : Wasser) wurden lyophilisiert, um zu einem weißen membranartigen Feststoff zu führen.
Verfahren für den Peroxidase-Chromogen-Test
Das Oxidase-Chromogene-Reagens wurde hergestellt durch Vermischen von 0,5 ml Galactoseoxidase (70 Einheiten), 0,5 ml Meerrettichperoxidase (100 mg/l), 0,5 ml o-Toluidin (200 mg/l) und 0,5 ml der Substratlösung (die Reaktionskonzentration betrug weniger als 1,39 × 10^–4 M, d. h. 278 mmol in 2 ml Lösung) und dann Überführen der Mischung in einen Inkubator für 1 Stunde bei 30°C. Die maximale Chromogenese fand innerhalb von 60 Minuten statt. Die Färbung, die sich entwickelt hatte, wurde bei 420 nm gelesen. Zur Kalibrierung der Untersuchung wurde eine Auftragung der Extinktion bei 420 nm gegen bekannte Mengen von Lactose hergestellt. Vergleich der Testergebnisse mit der Kalibrierungsauftragung ergab Werte für die Menge gebundener Galactose in diesen Testmaterialien.
Beispiel 1
Dieses Beispiel erläutert die Wirkung der Reaktionsdauer auf das Ausmass der Galactosylierung von Hydroxyethylcellulose unter einem Standardsatz von Reaktionsbedingungen.
Lactose (2 g), Hydroxyethylcellulose (0,219 g) und β-Galactosidase mit Ursprung Aspergillus oryzae (0,025 g, 110 Einheiten) wurden in 2,5 ml Natriumacetatpuffer bei pH 4,5 gelöst. Man ließ die Reaktion bei Raumtemperatur fortschreiten und überwachte zur Bestimmung des Ausmasses der Galactosylierung zu bestimmten Zeiten unter Verwendung des Standard-Testverfahrens. Die Ergebnisse werden nachfolgend in 3 dargestellt.
Figur 3
Es ist ersichtlich, daß das höchste Mass der Galactosylierung bei ca. 6 Stunden auftrat. Es wird angenommen, daß der Abfall zu Zeiten von mehr als 6 Stunden aufgrund enzymatischer Hydrolyse des Produkts besteht.
Beispiel 2
Dieses Beispiel zeigt die schwache Glucosidaseaktivität von Aspergillus oryzae-β-Galactosidase.
Zwei Reaktionen wurden wie folgt verglichen. In der ersten wurde eine 9 Gew.%ige Lösung von Hydroxyethylcellulose in Natriumacetatpuffer bei pH 4,5 als Blindprobe verwendet, während in der zweiten eine 9 Gew.%ige Lösung von Hydroxyethylcellulose im gleichen Puffer mit β-Galactosidase (10 mg/ml, 44 Einheiten/ml) inkubiert wurde. Man ließ beide Reaktionen für 6 Stunden fortschreiten und beendete dann durch Sieden für 10 Minuten. Die intrinsischen Viskositäten beider Reaktionsmischungen wurden bei 25°C unter Verwendung eines Ubbelohde-Viskosimeters bestimmt. In der ersten betrug die intrinsische Viskosität 1,4 und in der zweiten 0,55. Dies zeigt einen Depolymerisierungseffekt in der Galactosylierung unter Verwendung von Aspergillus oryzae-β-Galactosidase.
Beispiel 3
Dieses Beispiel zeigt die Wirkungen verschiedener Verhältnisse und Konzentrationen von Galactosedonor und Hydroxyethylcelluloseakzeptor und die Wirkung der Gegenwart von organischem Lösungsmittel auf die Reaktion.
Reaktionen, die Enzym aus Aspergillus oryzae verwenden, wurden bei Raumtemperatur in Puffer bei pH 4,85 durchgeführt, und das Enzym wurde in einer Menge von 25 mg (110 Einheiten) in 2,5 ml Reaktionsmedium verwendet. Die Reaktionen, die CLONEZYME Gly001-02 verwenden, wurden bei 70°C in Puffer bei pH 6,0 durchgeführt. Das CLONEZYME Gly001-02 wurde in einer Menge von 1 mg in 2,5 ml Reaktionsmedium verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Es ist ersichtlich, daß organische Lösungsmittel die Enzymaktivität hemmen, aber nicht vollständig unterdrücken, und daß eine Erhöhung des Verhältnisses von Galactosedonor zu Hydroxyethylcellulose das Ausmass der Galactosylierung erhöht.
Beispiel 4
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Erhöhung des Ausmasses der Galactosylierung durch Rezyklieren von Produkt durch mehrere Reaktionsstufen.
Die Galactosylierung wurde für 6 Stunden unter Verwendung der gleichen, für Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Produkt wurde durch Dialyse und Lyophilisierung in der gewöhnlichen Weise isoliert. Der Grad der Substitution betrug 0,036. Das Produkt wurde durch die gleichen Reaktionsbedingungen zwei weitere Male rezykliert. Die Substitutionsgrade von 0,069 und 0,048 wurden in den Produkten des ersten bzw. zweiten Umlaufs gefunden.
Beispiel 5
Dieses Beispiel erläutert die Galactosylierung von Hydroxypropylcellulose in Gegenwart von β-Galactosidase.
Zwei Experimente wurden durchgeführt. Im ersten wurden das Enzym Aspergillus oryzae (0,1 g, 440 Einheiten), Hydroxypropylcellulose (0,1 g) und Lactose (4,6 g) in 13,3 ml Natriumacetatpuffer (pH 4,85) gelöst. Nach 48 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Erwärmen für 5 Minuten auf 100°C beendet. Sie wurde dann direkt auf eine Sepharose^® CL-4B-Säule aufgeladen und mit Wasser eluiert. Die das Polymer enthaltenden Fraktionen (bestimmt durch Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung von NH₃/i-Propylalkohol/Wasser, 3 : 7 : 2) wurden unter Erhalt des gewünschten Produkts lyophilisiert. Der Grad der Substitution betrug 0,027.
Im zweiten Experiment waren die Vorgänge und Mengen von Enzym, Hydroxypropylcelluhose und Lactose die gleichen, aber sie wurden in 13,3 ml einer 1/1-Mischung aus Acetonitril und Natriumacetatpuffer gelöst. Der Grad der Substitution betrug 0,024.
Es ist nicht beabsichtigt, daß die hier dargestellten Beispiele als Beschränkung der Erfindung aufgefaßt werden sollten, sondern vielmehr werden sie zur Erläuterung einiger der spezifischen Ausführungsformen der Erfindung vorgelegt. Verschiedene Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung können vorgenommen werden, ohne vom Umfang der. anhängenden Patentansprüche abzuweichen.

Claims

Zusammensetzung, die galactosyliertes Hydroxyalkylpolysaccharid und Galactosidaseenzym umfasst, worin das Hydroxyalkylpolysaccharid mit Galactoseeinheiten substituiert ist, die an Hydroxylgruppen des Hydroxyalkylpolysaccharids durch glactosidische Bindungen gebunden sind.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, worin wenigstens ein Teil der Galactoseeinheiten an Hydroxylgruppen am Ende der Hydroxyalkylketten des Hydroxyalkylpolysaccharids gebunden sind.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, worin das Hydroxyalkylpolysaccharid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Hydroxyethylpolysacchariden und Hydroxypropylpolysacchariden besteht.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 3, worin das Hydroxyalkylpolysaccharid Hydroxyethylpolysaccharid umfasst.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 3, worin das Hydroxyalkylpolysaccharid Hydroxypropylpolysaccharid umfasst.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, worin das Hydroxyalkylpolysaccharid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Hydroxyalkylcellulose, Hydroxyalkylcelluloseethern, Hydroxyalkylguar, Hydroxyalkylguarderivaten, Hydroxyalkylstärke und Hydroxyalkylstärkederivaten besteht.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 6, worin das Hydroxyalkylpolysaccharid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Hydroxyethylcellulose (HEC), Hydroxypropylcellulose (HPC), wasserlöslicher Ethylhydroxyethylcellulose (EHEC), Carboxymethylhydroxyethylcellulose (CMHEC), Hydroxypropylhydroxyethylcellulose (HPHEC), Methylhydroxypropylcellulose (MHPC), Methylhydroxyethylcellulose (MHEC), hydrophob modifizierter Hydroxyethylcellulose (HMHEC), hydrophob modifizierter Hydroxypropylcellulose (HMHPC), hydrophob modifizierter Ethylhydroxyethylcellulose (HMEHEC), hydrophob modifizierter Carboxymethylhydroxyethylcellulose (HMCMHEC), hydrophob modifizierter Hydroxypropylhydroxyethylcellulose (HMHPHEC), hydrophob modifizierter Methylhydroxypropylcellulose (HMMHPC), hydrophob modifizierter Methylhydroxyethylcellulose (HMMHEC), kationischer Hydroxyethylcellulose, (kationischer HEC) und kationischer, hydrophob modifizierter Hydroxyethylcellulose (kationischer HMHEC) besteht.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 6, worin das Hydroxyalkylpolysaccharid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Hydroxyethylguar (HE-Guar), Hydroxypropylguar (HP-Guar), Carboxymethylhydroxypropylguar (CMHP-Guar), hydrophob modifiziertem Hydroxyethylguar (HMHE-Guar), hydrophob modifiziertem Hydroxypropylguar (HMHP-Guar), kationischem, hydrophob modifiziertem Hydroxypropylguar (kationischem HMHP-Guar) und hydrophob modifiziertem Carboxymethylhydroxypropylguar (HMCMHP-Guar) besteht.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 6, worin das Hydroxyalkylpolysaccharid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Hydroxyethylstärke, Hydroxypropylstärke, oxidierter Hydroxyethylstärke, oxidierter Hydroxypropylstärke, kationischer Hydroxyethylstärke, kationischer Hydroxypropylstärke, Hydroxyethylstärkeacetat, Hydroxypropylstärkeacetat, Hydroxyethylstärkephosphat, Hydroxypropylstärkephosphat, depolymerisierter Hydroxyethylstärke und depolymerisierter Hydroxypropylstärke besteht.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, worin das Hydroxyalkylpolysaccharid Hydroxyethylcellulose ist.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, worin der Substitutionsgrad des Hydroxyalkylpolysaccharids mit Galactoseeinheiten 0,01 bis 3 beträgt.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 11, worin der Substitutionsgrad mit Galactoseeinheiten 0,01 bis 1 beträgt.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 12, worin der Substitutionsgrad mit Galactoseeinheiten 0,01 bis 0,5 beträgt.
Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, worin das Hydroxyalkylpolysaccharid ein Hydroxyetkylpolysaccharid ist und der Substitutionsgrad mit Galactoseeinheiten 0,01 bis 3 beträgt.
Zusammensetzung gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Galactosidaseenzym eine β-Galactosidase ist, ausgewählt aus einem Mikroorganismus, der aus der Gruppe isoliert ist, die aus Bacillus circulans, Aspergillus oryzae und E. coli besteht.
Zusammensetzung gemäss einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Galactosidaseenzym eine β-Galactosidase ist, die aus Aspergillus oryzae isoliert ist.
Verfahren zur Herstellung von galactosyliertem Hydroxyalkylpolysaccharid wie in einem der Ansprüche 1 bis 14 definiert, umfassend: (a) Bereitstellen wenigstens eines Hydroxyalkylpolysaccharids; und (b) Behandeln des Hydroxyalkylpolysaccharids mit einem Galactosedonor in Gegenwart von Galactosidaseenzym für eine ausreichende Zeit, um einen Substitutionsgrad mit Galactoseeinheiten an den Hydroxylgruppen des Hydroxyalkylpolysaccharids zu verursachen.
Verfahren gemäss Anspruch 17, worin das Hydroxyalkylpolysaccharid Hydroxypropylcellulose ist.
Verfahren gemäss Anspruch 17, worin der Galactosedonor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Lactose, Galactose, Galactomannanen und Nitrophenyl-, Dinitrophenyl- und Trinitrophenylglycosiden davon besteht.
Verfahren gemäss Anspruch 19, worin das Galactomannan aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Guargummi und Johannisbrotkernmehl besteht.
Verfahren gemäss Anspruch 17, worin das Galactosidaseenzym eine β-Galactosidase ist, die aus einem Mikroorganismus isoliert ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Bacillus circulans, Aspergillus. oryzae und E. coli besteht.
Verfahren gemäss Anspruch 21, worin das Galactosidaseenzym eine β-Galactosidase ist, isoliert aus Aspergillus oryzae.
Verfahren gemäss Anspruch 17, die in einem wässrigen Medium stattfindet.
Verfahren gemäss Anspruch 23, worin das wässrige Medium wassermischbares organisches Lösungsmittel enthält.
Verfahren gemäss Anspruch 17, worin das Gewichtsverhältnis von Galactosedonor zu Hydroxyalkylpolysaccharid 1 : 1 bis 100 : 1 beträgt.
Verfahren gemäss Anspruch 17, worin das Galactosidaseenzym in einem Mass von 0,5 bis 1.000 Einheiten pro Gramm Hydroxyalkylpolysaccharid verwendet wird.
Verfahren gemäss Anspruch 26, worin das Galactosidaseenzym in einem Mass von 5 bis 500 Einheiten pro Gramm Hydroxyalkylpolysaccharid verwendet wird.
Verfahren gemäss Anspruch 27, worin das Galactosidaseenzym in einem Mass von 10 bis 150 Einheiten pro Gramm Hydroxyalkylpolysaccharid verwendet wird.
Verfahren gemäss Anspruch 17, worin das Hydroxyalkylpolysaccharid aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Hydroxyetkylpolysaccharid und Hydroxypropylpolysacchariden besteht, der Galactosedonor aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Lactose, Galactose, Galactomannanen und Nitrophenyl-, Dinitrophenyl- und Trinitrophenylglycosiden davon besteht, und das Galactosidaseenzym eine β-Galactosidase ist, die aus einem Mikroorganismus isoliert wird, der aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Bacillus circulans, Aspergillus oryzae und E. coli besteht.
Verfahren gemäss Anspruch 29, worin das Verhältnis von Galactosedonor zu Hydroxyalkylpolysaccharid 1 : 1 bis 100 : 1 beträgt und das Galactosidaseenzym in einem Mass von 0,5 bis 1.000 Einheiten pro Gramm Hydroxyalkylpolysaccharid verwendet wird.