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"Verfahren zur Herstellung wasserlöslicher stabilisierter
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Enzymderivate und deren Verwendung" Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Herstellung wasserlöslicher Enzymderivate, welche sich gegenüber den nativen
Enzymen durch eine verbesserte Stabilität in wäßriger Lösung auszeichnen, die nach
diesem Verfahren gewonnenen Enzymderivate sowie deren Verwendung.
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Die Entwicklungen auf dem in neuerer Zeit intensiv bearbeiteten Gebiet
der Enzyme sind unter anderem auf die Gewinnung sogenannter immobilisierter - das
heißt unlöslicher - Enzyme beziehungsweise entsprechender Enzymderivate sowie deren
technische Verwendbarkeit ausgerichtet. Beispielhaft für die umfangreiche Zeitschriften-und
Patent-Literatur auf diesem Gebiet seien hier die nachstehenden Literaturstellen
genannt: Angewandte Chemie, Jahrgang 84 (1972), Seiten 319 - 330; DE-AS 23 34 900;
DE-AS 25 60 647; DE-AS 24 06 833; DE-AS 26 03 319; DE-AS 26 29 692; DE-AS 27 26
188; DE-OS 27 32 301; DE-OS 27 40 008 und DE-OS 28 28 194.
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In den angeführten Literaturstellen wird generell das Ziel angestrebt,
stabile unlösliche Enzymformen zu gewinnen, die möglichst die ursprüngliche Aktivität
des natürlichen Enzyms aufweisen.
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Demgegenüber ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue stabile
wasserlösliche Enzymderivate bereitzustellen, die die Aktivität der ursprünglichen
Enzyme auch gelöst in wäßrigen Systemen über längere Zeit beibehalten Die Erfindung
geht von der überraschenden Feststellung aus, daß sich die aufgezeigte Aufgabenstellung
lösen läßt, indem man Enzyme, die freie primäre Aminogruppen aufweisen, an aldehydgruppenhaltige
Polysaccharide bindet und das so gewonnene immobilisierte Enzymderivat anschließend
reduziert.
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Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren zur Herstellung
wasserlöslicher stabilisierter Enzymderivate, welches dadurch gekennzeichnet ist,
daß man freie primäre Aminogruppen aufweisende Enzyme mit aldehydgruppenhaltigen
Polysaccharidderivaten in an sich bekannter Weise umsetzt und das erhaltene wasserunlösliche
Reaktionsprodukt anschließend durch Reduktion in ein wasserlösliches Enzymderivat
überführt, in dem mindestens zwei der verfügbaren Aldehydgruppen des Polysaccharidanteils
sowie mindestens zwei der verfügbaren Aminogruppen des Enzymanteils miteinander
vernetzt sind.
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Uberraschenderweise hat sich nämlich gezeigt, daß die auf diese Weise
gewonnenen Enzymderivate sowohl in Wasser ohne Rückstand löslich sind als auch in
wäßriger Lösung länger als die entsprechenden natürlichen Enzyme ihre Aktivität
beibehalten. Darüber hinaus weisen die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewinnbaren
Enzymderivate - verglichen mit den ursprünglichen Enzymen -noch weitere Vorteile
auf. Hier sind zu nennen: Einerseits eine wesentlich verbesserte Temperaturstabilität,
die
auch in alkalischem Milieu erhalten bleibt, sowie andererseits die Löslichkeit in
tensidhaltigen wäßrigen Systemen und eine erhöhte Stabilität der Enzymaktivität
in solchen Systemen.
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Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Enzyme mit
freien primären~Aminogruppen zunächst durch Bindung an ein aldehydgruppenhaltiges
Polysaccharid immobilisiert. Eine Umsetzung dieser Art ist an sich bekannt und wurde
für Papain und Dialdehydstärke von Weakley und Mehltretter in Biotechnology and
Bioengineering", 15. Jahrgang (;97)), Seiten 1189 bis 1192, bereits beschrieben.
Hiernach wird die durch -Perjodatoxidation aus Stärke gewonnene Dialdehydstärke
(DAS) zuerst durch Erwärmen in wäßriger Suspension aktiviert und nach Abkühlen auf
Raumtemperatur mit einer wäßrigen Lösung des Enzyms vereinigt. Die Umsetzung wird
durch Rühren des Reaktionsgemisches für etwa 1,5 Stunden bei Raumtemperatur und
einem pH-Wert von 7 vervollständigt und sodann das erhaltene wasserunlösliche Reaktionsprodukt
durch Zentrifugieren abgetrennt.
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Entsprechend dem vorstehend aufgezeigten Beispiel lassen sich generell
beliebige Enzyme, die freie primäre Aminogruppen aufweisen, mit beliebigen aldehydgruppenhaltigen
Polysacchariden umsetzen. In der Regel werden hierbei die genannten Reaktionsbedingungen
eingehalten, das heißt Raumtemperatur und ein pH-Wert von 7. Jedoch führen auch
Abweichungen von diesen Werten zu den erwünschten immobilisierten Enzymderivaten.
Unter Berücksichtigung der Empfindlichkeit des eingesetzten Enzyms können gewünschtenfalls
auch höhere Temperaturen Anwendung finden. Entsprechendes gilt auch für die Wahl
des pH-Wertes.
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Im Anschluß an diesen ersten Reaktionsschritt wird das gewonnene immobilisierte
Enzymderivat einer Behandlung mit reduzierenden Agentien unterworfen, bei der wasserlösliche
Produkte resultieren. Als reduzierende Agentien für diesen zweiten Reaktionsschritt
sind im allgemeinen mit dem Reaktionsmedium Wasser verträgliche Hydride geeignet,
vorzugsweise komplexe Hydride und insbesondere komplexe Borhydride. Für die Reduktion
in Frage kommende Hydride sind beispielsweise: MgH2, CaH2> KBH4, LiBH4> NaBH4,
Mg(BH4)2, NaBH3CN, LiBH3CN, NaBS3H2 (Natrium-trithiodihydridoborat), LiAL(C4H9O)3H
(Lithiumtert. -butoxyhydridoaluminat) und NaAl(CH702)2 H2 (Natrium-bis(2-methoxy)dihydridoaluminat.
Zur Reduktion wird das im ersten Reaktionsschritt erhaltene immobilisierte Enzymderivat
erneut in Wasser dispergiert, beispielsweise mit einem der vorstehend genannten
Hydride versetzt und bis zur Bildung einer klaren Lösung - gegebenenfalls unter
Zusatz von weiterem Hydrid - gerührt.
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Die Isolierung des im ersten Reaktlonsschrittes anfallenden Produktes
ist jedoch nicht unbedingt erforderlich, gewünschtenfalls kann die Reduktion mit
der erhaltenen Suspension des immobilisierten Enzymderivats direkt durchgeführt
werden. Die Wahl der Reaktionsbedingungen hinsichtlich Temperatur und pH-Wert richtet
sich hierbei nach der Empfindlichkeit des jeweiligen Enzyms. Im allgemeinen kann
die Temperatur im Bereich von -5°C bis +600 C und der pH-Wert im Bereich von 7 bis
12 liegen.
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Bevorzugt wird die Reduktion jedoch bei Raumtemperatur und einem pH-Wert
von 7 bis 7,5 durchgeführt.
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Die Isolierung der erhaltenen wasserlöslichen Enzymderivate kann gewünschtenfalls
nach an sich bekannten Standardverfahren der präparativen Biochemie erfolgen, beispielsweise
durch Ultrafiltration oder Gelchromatographie und anschließender Gefriertrocknung.
Eine solche
Isolierung kann jedoch unterbleiben, da sich die nach
erfolgter Reduktion anfallende klare Lösung auch direkt zu dem gewünschten Verwendungszweck
einsetzen läßt.
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Von wesentlicher Bedeutung für eine ausreichende Fixierung des Enzyms
an den Träger - das heißt an das aldehydgruppenhaltige Polysaccharid - ist die Vernetzung
oder Verbindung von mindestens zwei der verfügbaren Aminogruppen des Enzymanteils
mit mindestens zwei der verfügbaren Aldehydgruppen des Polysaccharidanteils. Insofern
sind die Mengenverhältnisse von Enzym zu Polysaccharid bei der Umsetzung im ersten
Reaktionsschritt nur von untergeordneter Bedeutung, solange die vorstehende Bedingung
hierbei erfüllt wird. Diese Bindung darf auch bei der Reduktion des beim ersten
Reaktionsschritt anfallenden immobilisierten Produktes nicht zerstört werden, um
die geschilderten guten Eigenschaften des wasserlöslichen Enzymderivates nicht zu
beeinträchtigen. Zur Bestimmung der freien beziehungsweise der gebundenen Aminogruppen
- sowohl in den immobilisierten Produkten als auch in den erfindungsgemäßen Enzymderivaten
- kann das von Habeeb in "Analytical Biochemistry"> .Jahrgang 14 (1966), Seiten
328 bis 336, beschriebene Verfahren mit Hilfe von 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure
Anwendung finden. Die gebundenen Carbonylgruppen lassen sich nach der von Fleche
in Die Stärke", Jahrgang 20 (1968), Seiten 50 bis 54, beschriebenen Methode bestimmen.
Hierbei werden zuvor die vorliegenden Iminogruppen mittels Natriumcyanohydridoborat
nach Borch, Bernstein und Durst, "Journal of the American Chemical Society">
Jahrgang 93 (1971)> Seiten 2897 bis 2904, reduziert.
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Die für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten aldehydgruppenhaltigen
Polysaccharide lassen sich beispielsweise nach den von Fleche in "Die Stärke", Jahrgang
20 (1968), Seiten 50 bis 54, sowie von Goldstein, Hamilton, Montgomery und Smith
in "Journal of the American Chemical Society", Jahrgang 79 (1957)> Seiten 6469
bis 647), angegebenen Verfahren gewinnen. Hierbei werden Stärke bzw. Cellulose mit
Hilfe von Perjodat zu Dialdehydstärke (DAS) beziehungsweise Dialdehydcellulose (DAC)
oxidiert. In entsprechender Weise können auch andere Polysaccharide - zum Beispiel
Pektine, Guargum, Alginate sowie partiell substituierte Cellulosen wie Carboxymethylcellulose,
Hydroxyethylcellulose oder Methylcellulose - durch selektive Oxidation in die der
DAS beziehungsweise der DAC analogen aldehydgruppenhaltigen Verbindungen überführt
werden.
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Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden als aldehydgruppenhaltige
Polysaccharidderivate bevorzugt Dialdehydstärke und/oder Dialdehydeellulose, die
durchschnittlich mindestens 0,9, insbesondere 1,8, Aldehydgruppen pro Monosaccharideinheit
aufweisen, eingesetzt.
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Vor der Umsetzung mit einem Enzym ist eine Aktivierung der DAS und/oder
DAC durch eine Wärmebehandlung erforderlich. Im allgemeinen ist hierfür ein kurzzeitiges
Erhitzen der wäßrigen Suspension der Polysaccharidderivate auf beispielsweise 900
C ausreichend.
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Für das erfindungsgemäße Verfahren kommen - wie bereits ausgeführt
- generell alle Enzyme in Frage die freie primäre Aminogruppen aufweisen. Beispiele
für solche Enzyme sind nachstehend angeführt:
Oxidoreduktasen,
beispielsweise Uricase 1.7.3.3, Catalase 1.11.1.6, Lipoxidase 1.13.11.12; Transferasen,
beispielsweise Hexokinase 2.7.1.1; Hydrolasen, beispielsweise Esterase ).1.1.1,
Lipase 3.1.1.), Ribonuclease I 3.1.4.22,α-Amylase p.2.1.1, Amylase 3.2.1.2,
Amyloglucosidase 3.2.1.3, Cellulase ).2.1.4, Dextranase 3.2.1.11, Urease 3.5.1.5
und insbesondere Proteasen wie beispielsweise Subtilisin 3.4.21.14; Lyasen, beispielsweise
Aspartase 4.3.1.1; Isomerasen, beispielsweise Glucose-Isomerase 5.).1.18; sowie
Ligasen, beispielsweise Glutaminsynthetase 6.3.1.2. Hierbei ist zu berücksichtigen,
daß handelsübliche Enzymprodukte meist nicht rein sind, sondern nur gewisse Anteile
der entsprechenden Enzyme enthalten.
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Enzyme, die funktionelle Cystin-Brücken aufweisen, können gleichfalls
nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in die entsprechenden Derivate überführt werden,
wenn man dem immobilisierten Produkt vor Durchführung des Reduktionsschrittes an
sich bekannte Schutzreagentien wie Mercaptoethanol oder Dithiothreitiol zusetzt.
Ohne einen solchen Zusatz besteht die Gefahr einer reduktiven Spaltung dieser Cystin-Brücken.
Beispiele derartiger Enzyme sind: Glucoseoxidase 1.1.3.4, Trypsin 3.4.21.4 und Glucose-Isomerase
5.3.1.18.
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Die genannten Enzyme können sowohl in Form der technisch anfallenden,
wäßrigen Lösungen als auch in weiterverarbeiteter Form zur Herstellung der erfindungsgemäßen
Enzymderivate verwendet werden. So lassen sich beispielsweise die wäßrigen Lösungen,
die als Organsekrete oder nach Abtrennung enzymbildender Mikroorganismen anfallen,
direkt
für das erfindungsgemäße Verfahrens einsetzen.
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Vorzugsweise werden jedoch diese Lösungen mit Hilfe an sich bekannter
Verfahren, zum Beispiel durch Ultrafiltration oder Ionenaustausch, gereinigt und
konzentriert. Geht man von festen Enzympräparaten aus, so werden diese in Wasser
gelöst.
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Bevorzugt werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Proteasen in
die entsprechenden wasserlöslichen Enzymderivate überführt, in denen mindestens
die Hälfte der verfügbaren Aldehydgruppen des Polysaccharidantcils sowie mindestens
die Hälfte der verfügbaren Aminogruppen des Enzymanteils miteinander vernetzt sind.
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Insbesondere ist hierfür die Protease P500 geeignet, die in der DE-OS
20 63 988 näher beschrieben ist. Der höhere Vernetzungsgrad in derartigen Proteasederivaten
bedingt deren verbesserte Stabilität in wäßrigen Lösungen sowie bei höheren Temperaturen
und gegenüber Tensiden.
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Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind die nach dem vorstehend
beschriebenen Verfahren gewinnbaren wasserlöslichen Enzymderivate.
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Zur Charakterisierung der erfindungsgemäßen Enzymderivate können die
vorstehend angeführten Methoden zur Bestimmung der gebundenen Amino- sowie Aldehydgruppen
nach Habeeb und Fleche dienen. Die Bestimmung der Enzymaktivitäten der proteolytischen
Enzyme - sowohl die der ursprünglichen Enzyme als auch die der erfindungsgemäßen
Derivate - kann beispielsweise nach der von van Raay, Saran und Verbeek in " "Tenside-Detergents",
7. Jahrgang (1970), Seiten 125 bis 172, angegebenen Methode erfolgen; die Bestimmung
der Amylasen, Lipasen und weiterer Enzyme ist beispielsweise beschrieben in H.U.
Bergmeyer, "Methoden der enzymatischen Analyse", Verlag Chemie, 1970. Zur Proteinbestimmung
kommt das von Lowry in "Journal of Biological Chemistry",
Jahrgang
195 (1951)> Seiten 265 bis 275> beschriebene Verfahren in Frage.
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Aufgrund der bereits erläuterten, gegenüber den nativen Enzymen verbesserten
Stabilitätseigenschaften lassen sich die erfindungsgemäßen wasserlöslichen Enzymderivate
mit Vorteil auf all den Gebieten einsetzen, auf denen bislang native Enzyme in wäßriger
Lösung Verwendung fanden. Beispiele solcher Verwendungsmöglichkeiten liegen auf
medizinischem Sektor, in der chemischen Technik (Bioreaktoren), in der Nahrungsmittelindustrie
sowie in flüssigen Wasch-, Spül- und Reinigungsmitteln. Besonders vorteilhaft erweist
sich die Verwendung der erfindungsgemäßen Produkte - und insbesondere des reduzierten
DAS/P500-Derivates - als Zusatz zu tensidhaltigen wäßrigen Lösungen, wie beispielsweise
in den zuletzt genannten Mitteln, da hierin der Einsatz der entsprechenden natürlichen
Enzyme - bedingt durch deren Labilität - bislang nicht im erwünschten Umfang möglich
ist.
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In den nachfolgenden Beispielen wird die Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens näher erläutert. In den beigefügten Tabellen werden die vorteilhaften
Stabilitätseigenschaften der erfindungsgemaen Enzymderivate gegenüber den entsprechenden
natürlichen Enzymen aufgezeigt.
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Beispiel 1 Als aldehydgruppenhaltiges Polysaccharid wurde bei diesem
Beispiel Dialdehydstärke (DAS) mit einem Aldehydgruppengehalt von 90 % (SUMSTAR-190
der Firma Miles Laboratories Inc., Elkhart, Indiana, USA, entsprechend dem Firmenprospekt
No. 2522-8/1175) eingesetzt; als Enzym die Protease P300 (entsprechend DE-OS 20
63 988).
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5 g DAS wurden in 45 ml Wasser unter Rühren 15 Minuten lang auf 900
C erhitzt und anschließend auf 250 C abgekühlt. Die erhaltene Suspension wurde mit
einer zuvor filtrierten Lösung von 25 g P300 in 800 ml Wasser verreinigt, mittels
0>1 N-NaOH auf den pH-Wert 7,2 eingestellt und 90 Minuten lang bei Raumtemperatur
vorsichtig gerührt. Das erhaltene Reaktionsprodukt wurde anschließend abgesaugt,
erneut in 800 ml Wasser suspendiert und wieder abgesaugt. Dieser Reinigungsschritt
wurde nochmals wiederholt und anschließend das abgesaugte Produkt gefriergetrocknet.
Zur Reduktion wurden 0,5 g des trägergebundenen Enzyms in 20 mi Wasser suspendiert
und bei Raumtemperatur mit 0,2 g NaBH4 versetzt. Der pH-Wert der Suspension betrug
7.0 Nach 30-minütigem Rühren war die Reduktion unter Bildung einer klaren Lösung
beendet.
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Die erhaltene Lösung wurde analysiert und verschiedenen Tests hinsichtlich
Temperaturstabilität bei verschiedenen pH-Werten, Tensidlöslichkeit und Tensidstabilität
unterworfen. Die mit der auf die vorstehende Weise erhaltenen Lösung ermittelten
Ergebnisse finden sich in den nachfolgenden Tabellen 1, 2, 3, 4 und 5 unter Beispiel
la.
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In gleicher Weise wurde DAS mit P300 in unterschiedlichen Gewichtsverhältnissen
umgesetzt und anschließend reduziert. Die entsprechenden Analysendaten sind in Tabelle
1 unter lb, lc und 1d wiedergegeben.
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Tabelle 1: Analysendaten von DAS/P300-Derivaten nach Reduktion
| Beispiel Gewichts- mg Protein/ spez. Akti- % vernetzte % vernetzte |
| Nr. verhältnis g Produkt vität (Enzym- Aminogruppen Aldehyd- |
| DAS: P300 einheiten/ gruppen |
| mg Protein) |
| 1 a 1 : 5 420 317 65 51 |
| 1 b 1 : 10 520 353 58 66 |
| 1 c 1 : 2,5 45 110 64 6,3 |
| 1 d 1 : 1 32 50 65 4,6 |
| Vergleichs- freis P300 734 892 - - |
| versuch |
Tabelle 2: Temperaturstabilität von DAS/P300-Derivaz nach Reduktion
erhalten nach Beispiel la bei 55°C in 2,5 %iger Lösung im Vergleich zu freim P300
(PE = Proteaseinheit, nach van Raay, Saran und Verbeek)
| reduziertes DAS/P300-Derivat P300 |
| Min. PE/g % Aufangsaktivität Min. PE/g % Anfangsaktivität |
| a) gemessen bei pH 7 |
| 0 79000 100 0 49600 100 |
| 60 65500 83 60 38400 77 |
| 135 48500 61 135 25500 5 |
| 165 40500 51 165 21000 4 |
| 225 22750 29 225 14000 3 |
| b) gemassen bei pH 8,5 |
| 0 182000 100 0 724000 100 |
| 60 151000 83 60 60000 8 |
| 135 134000 74 135 50000 7 |
| 165 122000 67 165 29000 4 |
| 225 107500 59 225 21000 3 |
| 285 66500 37 285 - - |
Tabelle 3: Tensidlöslichkeit von DAS/P300-Derivat nach Reduktion
erhalten nach Beispiel la bei 20°C in 2,5 %iger Lösung Die Tensidlöslichkeit wurde
in Tensidlösungen steigender Konzentration der folgenden Zusammensetzung untersucht:
50 Gew. -% C12-Alkylbenzolsulfonat-Natriumsalz, 25 Gew. -% Anlagerungsprodukt von
10 Mol Ethylenoxid an Oleylalkohol, 25 Gew. -% Anlagerungsprodukt von 5 Mol Ethylenoxid
an Oleylalkohol.
| % wäßrige Tensidlösung Löslichkeit des Enzymderivates |
| 20 % nach 14 Tagen keine Trübung |
| 30 % nach 12 h geringe Ausflockung, nahm nicht weiter zu |
| 40 % nach 12 h deutliche Ausflockung |
| 50 % " |
| 60 % nach 12 h Abscheidung |
| 70 % " |
| 80 % Beurteilung nicht möglich, zu hohe Viskosität |
| 90 % " |
Tabelle 4: Tensidlöslichkeit von DAS/P300-Derivat nach Reduktion
erhalten nach Beispiel la bei 20°C Die Tensidlöslichkeit wurde in Tensidlösungen
steigender Konzentration, enthaltend ein Anlagerungsprodukt von 10 Mol Ethylendioxid
an Oleyaklkohol, untersucht. Es wurden jeweils 0,05 g Enzymderivat in 9,95 g Tensidlösung
eingebracht:
| % wäßrige Trensidlösung Löslichkeit des Enzymderivates |
| 10 % klare Lösung |
| 20 % klare Lösung |
| 30 % klare Lösung, die auch nach 4 Stunden er- |
| halten blieb |
Tabelle 5: Tensidstabilität von DAS/P300-Derivat nach Reduktion
erhalten nach Beispiel la bei 20°C in 2,5 % iger Lösung im Vergleich zu freiem P300
Die Tensidstabilität wurde in Tensidlösungen unterschiedlicher Konzentration untersucht;
als Tensid wurde hierzu ein geradkeittiges C12-Alkylbenzolsulfonat-Natriumsalz (LAS)
verwendet.
| Zeit % Restaktivität des % Restaktivität des |
| Enzymderivates freien Enzyms |
| a) 0,5 % LAS |
| 0 h 100 100 |
| 1 h 100 98 |
| 3 h 100 96 |
| 24 h 100 48 |
| 5 Tage 71,9 10,2 |
| 4 Wochen 35,3 3,2 |
| 8 Wochen 14 2,0 |
| b) 5 % LAS |
| 0 h 100 100 |
| 1 h 100 88 |
| 3 h 100 87,1 |
| 24 h 100 76,5 |
| 5 Tage 68,6 9,2 |
| 4 Wochen 29,9 5,4 |
| 8 Wochen 2,7 - |
Beispiel 2 Isolierung des nach Beispiel la hergestellten Enzymderivates.
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10 ml der nach Beispiel la erhaltenen Lösung des reduzierten DAS/P500-Derivates
wurden mit Hilfe einer Sephadex-G75-Säule chromatographisch getrennt, wobei eine
0,1 M Trishydroxymethylaminomethan-hydrochloridlösung mit einem pH-Wert von 9,6
als Puffer diente. Durch Verfolgung der W-Absorption bei 20 nm konnten verschiedene
proteinhaltige Zonen identifiziert werden, deren größte die höchste Proteaseaktivität
aufwies.
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Gefriertrocknung des zu diesem peak gehörigen Eluats führte zu 220
mg eines Produkts, das folgende Charakteristik aufwies: Proteaseaktivität: 216450
PE/g Protein: 450 mg/g spez. Aktivität: 481 PE/mg Protein gebundene NH2-Gruppen:
47 % gebundene CHO-Gruppen: 68 %.
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Beispiel 7 Als aldehydgruppenhaltiges Polysaccharid wurde bei diesem
Beispiel die auch in Beispiel 1 verwendete DAS eingesetzt; als Enzym eineOC-AmXlase,
gewonnen aus Bacillus subtilis (Firma Merck, Darmstadt). Die Umsetzung der Amylase
mit DAS sowie die nachfolgende Reduktion erfolgte analog Beispiel la.
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Die erhaltene Lösung des Enzymderivates wies die folgenden Analysendaten
auf - im Vergleich hierzu die Analysendaten der freien Amylase:
| reduzierte freie α- |
| DAS/Amylase Amylase |
| mg Protein/g Produkt 9 306 |
| spez. Aktivität |
| (Enzymeinheiten/mg Protein) 14 205 |
| % vernetzte Aminogruppen 75 - |
| % vernetzte Aldehydgruppen 7 7 - |
Die Temperaturstabilität der reduzierten DAs/Amylase bei 60 °C im Vergleich zum
freien Enzym ist in der nachfolgenden Tabelle 6 wiedergegeben.
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Tabelle 6: Temperaturstabilität des reduzierten DAS/ Amylase-Derivates
bei 60 0C
| reduzierte DAS/ freie Amylase |
| <-Amylase |
| Min. % Anfangsaktivität Min. % Anfabgsaktivität |
| 0 100 0 100 |
| 30 48 30 3 |
| 120 30 120 0,8 |
| 180 11 180 |
| 300 5 300 |
Beispiel 4 Als aldehydgruppenhaltiges Polysaccharid wurde wiederum
DAS analog Beispiel 1 verwendet; als Enzym eine Lipase (Lipase SAIKEN-2A der Firma
NAGASE).
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5 g dieser Lipase wurden in 400 ml Wasser gelöst und mit 1 g aktivierter
DAS - analog Beispiel la - bei Raumtemperatur und pH 7,2 90 Minuten vorsichtig gerührt.
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Unmittelbar anschließend wurden der erhaltenen Suspension .2 g NaBH4
zugegeben und diese 30 Minuten bei Raumtemperatur bis zur Bildung einer klaren Lösung
weiter gerührt.
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Die erhaltene Lösung des Enzymderivates wies die folgenden Analysenwerte
auf: mg Protein/g Produkt: 120 spez. Aktivität (Enzymaktivität/ mg Protein): , 500
% vernetzte Aminogruppen: 67 % vernetzte Aldehydgruppen: 53.
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Zur Bestimmung der LipaseAktivität wurde die vom G.
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Näher in H.U. Bergmeyer, "Methoden der enzymatischen Analyse", Verlag
Chemie, 1970, Seiten 781 - 786 beschriebene Methode berangezogen.
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Die Temperaturstabilität der reduzierten DAS/Lipase bei 50°C im Vergleich
zum freien Enzym ist in der nachfolgenden Tabelle 7 wiedergegeben: Tabelle 7i Temperaturstabilität
des reduzierten DAS/ Lipase-Derivates bei 50°C
| % der Ausgangsaktivität |
| in. DAS-Lipase Lipase |
| 0 100 100 |
| 40 40 20 |
| 120 30 - |
| 180 25 - |
| 300 10 t |
Beispiel 5 Anstelle von DAS wurde in diesem Beispiel Dialdehydcellulose
(DAC) zusammen mit der Protease P300 eingesetzt.
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Zur Gewinnung der DAC wurden 5 g Cellulosepulver in 250 ml einer 0,4-M
Natriumperiodatlösung eingetragen und anschließend im Dunklen bei Raumtemperatur
48 Stmden gerührt. Das in Wasser unlösliche Ox.idationsprodukit wurde anschließend
abgesaugt und solange mit Wasser gewaschen, bis kein Periodat mehr im Waschwasser
nachgewiesen werden konnte. Anschließend erfolgte Gefriertr<ocknung.
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1 g der so erhaltenen DAC wurde in eine Lösung von 1 g P300 in 250
ml Wasser eingetragen und bei 25 OC und einem pH-Wert von 7,2 90 Minuten gerührt.
Das erhaltene wasserunlösliche Reaktionsprodukt wurde abgesaugt, erneut in 250 ml
Wasser suspendiert und wieder abgesaugt. Dieser Reinigungsschritt wurde nochmals
wiederholt und anschließend das abgesaugte Produkt gefriergtrocknet.
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Die Reduktion erfolgte analog Beispiel 1.
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Die nach erfolgter Reduktion erhaltene klare Lösung des Enzymderivates
wies die folgenden Analysenwerte auf: Aktivität: 3800 PE/g mg Protein/g Produkt:
117 spez. Aktivität (Enzymaktivität/mg Protein) 316 % vernetzte Aminogruppen 64,5
% vernetzte Aldehydgruppen 28,6.