CN85104164A - 细菌多糖与免疫原蛋白共价结合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
共价修饰的细菌多聚糖和蛋白质;这种共价结合物是通过可以证明其共价性并有利于结合物纯化的双属间隔基把多聚糖和免疫原细菌膜蛋白或其它蛋白联结起来的;这种结合物是细菌疫苗的有用成分,及制备这种多聚糖,蛋白质和结合物的方法,证明多聚糖与蛋白质间共价键的方法。
Description
本发明的内容是关于共价修饰的细菌多糖和免疫原性蛋白质,由一个双属间隔基连接的这种多糖的共价结合物,它有利证明其共价性和生物学上所希望的具有免疫原性的细菌膜或其它蛋白质实体的纯化和浓缩,这些结合物是细菌疫苗的有用成分。本发明亦与这些多糖、蛋白质和结合物的制备方法以及证实多糖和蛋白质之间结合物连接的共价性的方法有关。
纯化的细菌荚膜多糖已被用于制备抗同族细菌的疫苗,但免疫应答的结果常常不像所希望的那样满意,特别是幼儿和免疫系统不成熟或不健全者。如流感嗜血杆菌B型荚膜多糖不能引起婴儿的免疫应答。因此制备这种多糖本身不能保护小儿抵抗由该杆菌所致的严重小儿医疗问题。将其与蛋白质结合常可增纯这些多糖的免疫原性。如可参看Schneerson et al.,“Haemophilus Influenjae Type b Polsaccharide-Profein C onjugates:Model for a New Generation of Capsular Polysac charid Uaccines,”New Dev.with Hum.d Vet.Vaccines,77-94(1980);Schneerson,et al.,J.Exptl.Med.,152,361(1980).,和Anderson,Infection and Immu nity,39,233(1983)。
但必须细心选择与这些多糖结合的蛋白质,某些蛋白质(Pertussinogen)是婴儿免疫系统的非特异性刺激剂。在一定程度上这些蛋白质增强对多糖抗原的免疫应答。但不幸的是这种非特异性激活作用导致一些所不希望的生物学效应(即反应原性)。通过将这些多糖结合到适当蛋白质上如首先由W.F.Goebl和O.T.Avery在1929年所报告的那样能使婴儿增强对这些抗原的很多好的特异性免疫应答(J.Exptl.Medicine 50,521-531(1929))。
多糖与蛋白质结合的方法亦必须细心考虑,假如如所相信的那样,免疫增强是多糖决定簇向蛋白质载体决定簇分子接近的结果,那么这些部位在生物系统中是不易分离开的。由多糖的多阴离子特性和载体蛋白质的阳离子特性所产生的非共价复合物可以刺激免疫应答,但这些复合物是化学上不稳定的,其免疫应答看来是非T细胞依赖的。相反,多糖和蛋白质的共价结合物具有强得多的化学稳定性而且能证明是T细胞依赖的免疫应答。
多糖-蛋白质共价结合物文献中已有所述,但共价连接的精确性质尚未被证明或被定量,因为对于共价性的唯一分析方法是在体内的活性,而文献中所描述的程序难以重复出来。流感嗜血杆菌b型,肺炎链球菌6A型多糖先与溴化氰反应,后与脂肪酸二酰肼反应,最后与破伤风类毒素或鲎蟹血蓝蛋白质结合(Schneerson al.J.Exptl.Med.,152,361(1980)和Infe ction and Immunity,40,245(1983)。肺炎球菌19F型多糖通过从多糖还原端和蛋白质侧胺基(即赖氨酸)形成亚胺(Schiff碱基)而直接结合到牛血清蛋白上,然后用氰硼氢化钠还原这些亚胺(Lin et al.,Immunolo gy,46,333(1982))。
另外,连接到重氮化芳香胺上的多糖结合到蛋白质的酪氨酸上(K.K.Nixdorff et al.,Immunology 29,87(1975)),连接到芳香胺的多糖转换到异硫氰酸盐上,然后连接到蛋白质的赖氨酸侧氨基上(S.B.Svenson and A.A,Lindherg,j.Immunolog.Methods 25,323(1979))。但上述任何一种方法所产生的结合物都仅仅是凭其凝胶渗透层析特性鉴定的。在另一个例子中(S.Nutani et al.,Infection and Immunity 36,971(1982)),多糖,出芽短梗孢糖(Pullulan)用氰尿酰氯(Cyanuric chloride)活化,然后与破伤风类毒素反应。此法所生成的结合物以电泳法而且仅仅表明是不同于开始的物质而鉴定的。
除了用推断聚合分子量以外,这些方法中没有一个能证明其共价性,因此将与分子复合物中多阴离子和多阳离子的相互作用的共价性相混淆,因为这些复合物亦将给出一聚合分子量。
因而本发明的一个目的是将多糖决定簇连接到蛋白质载体决定簇上,这样以使得这些部分的分子接近度在生物系统内能够维持。本发明的另一个目的是将荚膜多糖与载体蛋白质共价连接和建立起一个能证明和定量测定这种连接的共价性质的方法。本发明还有一个目的是获得一些化学上稳定的多糖-蛋白质结合物,它们证明是T细胞依赖的,而且作为菌苗成分是有用的,因为它们能引起对某些细菌,特别是与所用多糖同族的细菌的保护性血清抗体的产生。本发明的一个进一步的目的是建立起一个方法用于制备多糖-蛋白质结合物过程溶解多糖,特别是多阴离子多糖和共价地修饰在制剂中的这些多糖。本发明再有一个目的是建立起一个方法用来纯化和浓缩共价连接的多糖-蛋白质结合物以除去未结合的大分子和过剩的反应剂。本发明还有一目的是建立起一些方法以在免疫学上有效的菌苗中应用这些结合物来治疗脑膜炎和中耳炎。
本发明旨在共价地修饰细菌多糖和这些多糖与共价修饰的免疫原性膜蛋白质、病毒蛋白亚单位、合成多肽、细菌类毒素或其它合适的免疫原性蛋白质形成化学上稳定的结合物,这些结合物是免疫原性细菌菌苗的有用成分。本发明的多糖-蛋白质结合物是通过含有一个共价硫醚基的双属间隔基相结合而成的,其中双属间隔基是连接大分子(如:多糖和蛋白质)的原子链,间隔基的一部分来源于一个修饰的大分子(如共价修饰的多糖),另一部分来源于另一个修饰的大分子(如功能化了的蛋白质)。
根据本发明的程序,以一个或多个步骤共价地功能化多糖使其具有一些侧基亲电子中心或侧巯基。最好是先将多糖溶于一非羟基有机溶剂中,然后在与双亲核试剂反应前与一双功能的激活剂起反应。亲核试剂功能化的多糖或与一能产生侧基亲电子位置的试剂反应或与一能产生侧巯基的试剂反应。通过适当选择双亲核试剂,即它能与活化了的多糖反应成为具有侧基亲电子部位或巯基的共价修饰的多糖,或者选择一适当的亲核试剂,而这种亲核试剂功能化了的多糖无需进一步功能化。
与多糖的共价修饰无关,适当的细菌“载体”蛋白质与能产生侧巯基的试剂或与能产生侧亲电子中心的试剂反应,在任何一种情况下,一或两个步骤即可。适当共价修饰的多糖和蛋白质起反应并形成共价的多糖-蛋白质结合物,除去非结合的大分子和过剩的试剂使其纯化并根据共价连接的多糖测定免疫原性的剂量。
通过从多糖的侧链亲电子或巯基部位裂解(如通过水解)和通过从蛋白质的侧链巯基或亲电子部位来裂解蛋白质,然后分析含硫醚的双属间隔基分子,通过分析蛋白质中决定共价性的标记氨基酸(赖氨酸)来测定此间隔基的浓度,由此可以完全证明和阐述此种连接的共价性本质。
然后就可制备出一些含有免疫学上有效量的多糖-蛋白质结合的免疫原疫苗或它们的衍生物。
本发明的结合物可以是任何稳定的多糖-蛋白质结合物,它们通过含有一硫醚基和基本胺的双属间隔基相结合,从而与多糖和蛋白质形成水解不稳定的共价键。但是,根据本发明,最后的结合物是那些以公式来代表的结合物,PS-A-E-S-B-Pro或PS-A′-S-E′-B′-Pro,其中PS代表一多糖;Pro代表一细菌蛋白质;而A-E-S-B和A′-S-E′-B′构成双属间隔基,这些间隔基含有水解稳定的共价硫醚键和与大分子Pro和PS形成共价键(诸如水解不稳定的酯或酰胺键)。在间隔基A-E-S-B中,S是硫;E是已与巯基起反应了的亲硫基的转化产物而且以
表示,其中R是H或CH3,P是1-3;A是
NH-,其中W是O或NH,m是0-4,n是0-3,Y是CH2,O,S,NR′或CHCO2H,R是H或C1-或C2-烷烃基,因此如果Y是CH2,那么m和n就不能都是O,如果O或S,那m大于1,n大于1;B是-(CH2)p
,其中q是0-2,Z是NH2,
,COOH,或H。R′和P如同上述,D是
,NR′,或
。然而在间隔基A′-S-E′-B′中,S是硫,A′是
,其中a是1-4,R″是CH2,或
,Y′是NH2或NHCOR′,W,P和R′同上所述,E′是与一巯基已起反应了的亲硫基的转化产物,并以
来表示之。其中R如上所述,B′是
或E′是
B′是-(CH)p
,其中P是1-3。更进一步,双
间隔基A-E-S-B和A′-S-E′-B′中E-S-B和A′-S-E′成分是可以测定和定量的,借助这种鉴定反应结合链的共价性,此结合链将来源共价修饰多糖的硫醚硫与来源功能化的蛋白质的间隔基连接起来。
本发明中的多糖可以是任何具有酸基的细菌多糖,但不限于任何特殊的型别。这种细菌多糖的实例包括链球性肺炎(肺炎球菌的)6A、6B、10A、11A、18C、19A、19F、20、22F、和23F型多糖,B族链球菌Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ和Ⅲ型,流感嗜血杆菌b型多糖,脑膜炎奈瑟氏菌(脑膜炎双球菌的)A、B、C、X、Y、W135和29E族多糖以及大肠杆菌K1、K12、K13、K92和K100多糖。但是特别好的多糖是荚膜多糖,它们选自下述细菌,即流感嗜血杆菌b型多糖,诸如在Rosenberg et al,J.Biol.Chem.,203,695-704,(1953)中所描述的;链球菌性肺炎(肺炎球菌的)6B或6A型多糖,如像在Ro bbins et al,Infection and Immunity,26,No.3,1116-1122(Dec,1979)中所介绍的;肺炎球菌19F型多糖,如同C.J.Lee et al,Reviews of Infectious Diseases3,No.2,323-331(1981)所述的以及肺炎球菌23F型多糖,正如O.Larm et al.,Adv.Carbohyd Chem.and Biochem.,33,295-321,R.S.Tipson et al.,et.,Academic Press,1976所报告的。
根据本发明,蛋白质应是证明安全和可以证明免疫原性的那些蛋白质,但不限于任何特殊的类型。适用的蛋白质包括细菌膜蛋白质;任何一种植物蛋白质,如麻仁球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂;病毒蛋白质亚单位,如肝炎A和B,疱疹gD或gC,E-B病毒或水痘带状疱疹病毒亚单位,合成多肽;白喉类毒素或伤风类毒素,但更可取的是奈瑟氏脑膜炎(脑膜炎球菌的)B血清型外膜蛋白质,它们是T细胞刺激剂。这些血清型蛋白质的一个例子已介绍于Helting et al.,“Serotype Determinant Proteins of Neis seria Meningitidis”,Actapath.Microbiol.Scand.Sect.C,89,69-78(1981),和Frasch et al.,J.Bact.,127,973-981(1976)中。
根据本发明,结合物Ps-A-E-S-B-Pro可以含有间隔基,它们成分包括一些衍生物,特别是:二氧化碳,1,4-丁烷二胺和S-羧甲基-N-乙酰高半胱氨酸;二氧化碳1,5-戊烷二胺和S-羧甲基-N-乙酰高半胱氨酸;二氧化碳,3-氧杂-1,5-戊烷二胺,和S-羧甲基-N-乙酰高半氨酸;二氧化碳,1,4-丁烷二胺,和S-羧甲基-N-乙酰半胱氨酸;二氧化碳,1,3-丙烷二胺,和S-羧甲基-N-苯高半胱氨酸;二氧化碳,3-氮杂-1,5-戊烷二胺,和S-羧甲基-N-乙酰半胱氨酸;及二氧化碳,1,2-乙二胺,甘氨酸,和S-(琥珀-2酰)-N-乙酰高半胱氨酸。根据本发明,结合物Ps-A′-S-E′-B′-Pro,可含有一些间隔基,它们的成分包括一些衍生物,尤其是:二氧化碳和S-羧甲基巯基乙胺;二氧化碳和S-(α-羧乙基)巯基乙胺;二氧化碳和S-羧甲基高半胱胺;二氧化碳,S-(琥珀-2-酰-)半胱胺,和甘氨酸;及二氧化碳和S-羧甲基半胱氨酸。
在本发明的方法中,多糖按下述方法被共价修饰:(a)将多糖溶于一非羟基的有机溶剂中,(b)用一双功能试剂将其活化,(c)此活化的多糖与双-亲核试剂反应,最后如必要则进一步(d)用下述任一反应功能化此已修饰的多糖,(ⅰ)与一个能产生亲电子(如亲硫的)部位的试剂,(ⅱ)与一个能产生硫醇基的试剂反应。蛋白质则相反地(ⅰ)与一个能产生硫醇基或(ⅱ)与一个能产生亲硫部位的试剂反应,然后共价修饰的多糖和已功能化的蛋白质一起反应形成稳定的共价键的结合物,最后的混合物步骤是除去来反应的多糖和蛋白质。
本发明的程序亦包括选择一个亲核试剂或双亲核试剂,它将与已活化的多糖反应形成一具有侧部亲电子部位或侧硫醇基的共价修饰的多糖,因而在共价修饰多糖与共价修饰蛋白质反应之前免去了进一步功能化双亲核试剂修饰多糖的必要。根据所选择的反应剂,一个以上的步骤即可完成蛋白质两个部位中任一部位的功能化。
A.多糖的制备
在共价修饰多糖的第一步中,必须将固体多糖溶解。
用多糖的亲核乙醇羟基不能与水溶液的羟基化学上竞争亲电子的试剂,因此多糖必须溶于不含水的(非羟基的)溶剂中。适合的溶剂包括二甲基甲酰胺,二甲基亚砜,二甲基乙酰胺,甲酰胺,N,N′-二甲基咪唑啉酮(N,N-dimethyimidazolidinone),和其它类似的极性的、对质子有惰性的溶剂,最好的是二甲基甲酰胺。
除了应用这些溶剂外,申请者们已发现,他们所发明的多糖(例如流感嗜血杆菌b型荚膜多糖,它们一种核糖-核糖醇磷酸盐聚合物,和肺炎球菌6B、19F、23F型荚膜多糖),它们有可解离成酸的氢,如磷酸酯和磷酸二酯,转变成适当的盐的形式后,这些多糖则易溶于上述溶剂中。这些大分子中的可解离成亲离子的氢可被大量的疏水阳离子所置换,如3-或4-(C1-C-5)烷基铵,1-氮杂双环[2,2,2]正辛烷,1,8-二氮杂双环[5,40]+-烷-7-烯或类似阳离子,特别是3-或4-(C1-C5-)烷基铵,结果磷酸化多糖的3-或4烷基铵或类似盐在约17-50℃,和搅拌1-60分钟就易溶于上述溶剂中。
部分水解的流感嗜血杆菌b型多糖已转变成了丁胺盐,然后溶于二甲基亚砜中(Eganet al,J.Amer.Chem.Soc.,104,2898(1982)),但其产物不再具有抗原性,因此不能用于制备疫苗。相反,申请者们完成了一个完整的未水解多糖的溶解,其方法是将多糖通过一强酸性阳离子交换树脂,以四烷基胺的形式或用四烷基氢氧化铵小心地中和多糖。前一方法较好,因为多糖的活性得以保存,有利免疫原性疫苗的应用。后来的步骤旨在克服对多糖形成共价的其它有意义的理化局限性,此类共价键是除了普通的试剂或特别是用来产生作为功能化的单位同所希望产生结合作用的那些试剂足以起反应的羟基。在制备结合物中,活化多糖使其形成一活化的多糖,再与双亲核试剂反应形成一亲核试剂功能化了的多糖以及用一些能产生亲电子部位或硫醇基的试剂功能化,所有这些都是为了共价地修饰多糖和在多糖上产生一些功能基团。
下一步是将已溶解的多糖与一双功能试剂在约0-50℃,搅拌10-60分钟条件下反应而被活化,活化剂与多糖的关键性重量之比的范围是1∶5-1∶12。过去,此活化作用是通过多糖与溴化氰反应来完成的。但是用溴化氰活化的衍生物有连位二醇(vicinal diols)的倾向,已证明在用磷酸缓冲液透折期间仅有短暂的稳定性。因此,虽然用溴化氰活化根据本发明是可能的,但该试剂在多糖的活化中已很少被应用,或宁可不用它。为活化多糖比较好的双功能试剂包括碳酸衍生物,
,其中R2和R3可以是相互无关的azolyl,诸如咪唑基;卤化物;或苯酯如对一硝基苯,或多盐苯基。
碳酰二咪唑,是一个特别好的试剂,它将与羟基反应形成多糖的咪唑氨基甲酸乙酯和芳基氯甲酸酯,包括像硝基苯氯甲酸酯,从而产生多糖的混合碳酸盐。在上述每种情况下,活化的多糖对亲核试剂如胺都很敏感,因而就转变成了各自的氨基甲酸乙酯。
下一步是活化的多糖与亲核试剂如胺,特别是二胺反应,如
其中m是0-4,n是0-3,Y是CH2、O、S、NR′、CHCO2H。这里R′是H或-C1-或C2-烷基如Y是CH2,那么m和n二者不可能都是O,如Y是O或S,那么m大于1,n大于1。反应在胺明显过剩条件下进行(即例如胺比所用的活化剂过剩50-100倍克分子),此反应在冰浴中进行15-60分钟,然后在约17-40℃进行15-60分钟。
一个活化了的多糖,当与一个二胺,例如1,4-丁二胺反应结果将成为带有侧基胺的氨基甲酸乙酯形式的多糖,然后它可进一步被酰化作用而功能化。混合的碳酸盐亦易于与二胺反应形成侧胺基。
另外一个方法是,活化的多糖可以与亲核试剂诸如二氨基烷属烃的一囟乙酰胺基,例如4-溴替乙酰胺丁胺反应(见W.B.Lawson et al.,Hoppe Seyler's Z.Physiol.Chem.,349,251(1968)),产生一个带有侧基亲电子的部位的共价修饰的多糖。或者,活化的多糖可以与一氨基硫(Aminothiol),如半胱胺(氨基乙硫醇)或半胱氨酸反应,其衍生物的实例众所周知在肽合成工艺中能产生一具有侧硫醇基的多糖。在这两种情况下,在将共价修饰的多糖结合到修饰的细菌“载体”蛋白质上之前无需再功能化。
在制备多糖中的最后一步,如果需要,则进一步功能化多糖,所采用的方式可以是将亲核试剂功能化的多糖与一能产生亲电子(即亲硫的)部位的试剂反应,或与一能产生硫醇基的试剂反应。
适用于产生亲电子部位的试剂包括如适用于酰化成α-卤乙酰或α-卤丙酰的那些试剂,产生衍生物如
(此处R是H或CH3;X是Cl,Br或I,X′是硝基苯氧基、二硝基苯氧基、五氟苯氧基、囟化物、O-(N-羟基丁二酰亚胺基)或叠氮基,特别是氯醋酸或α-溴丙酸。反应在PHS-11(如必要,加入碱以维持PH在此范围内)和约0-35℃条件下进行10-60分钟。一个多聚糖的氨基衍生物可以用活化的(Maleimido)顺丁烯二酰亚胺氨基酸酰化(见O.Keller et al,Helv.Chim.Acta.,58,531(1975))以产生顺丁烯二酰亚胺基,
适用于产生硫醇基的试剂包括例如酰化作用的试剂,诸如硫内酯,
此处R4是C1-C4-烷基或单一或二环芳基,如C6H5或C10H13,P是1-3;
其中m是0-4,R5是C1-C4-烷基或C6H5,X′同上述,接着用HS′CH2CH2OH或C2H5-S-S-CH2(CH2)m
处理,其中m,R5和X′同刚才所述。然后又用二硫苏糖醇(Dithiothreitol)处理。这些反应在约0-35℃,PH8-11(必要时加入碱以维持PH在此范围内)的氮气环境中进行1-24小时。例如,氨基衍生物多糖可以
应产生一适当地功能化了的多糖。
B.蛋白质的制备
单独功能化与多糖结合的蛋白质包括蛋白质与一个或一个以上的试剂反应以产生硫醇基,或将蛋白质与一个或一个以上的试剂反应以产生亲电子(即亲硫的)中心。
在制备与亲电子的功能化了的多糖结合物中,蛋白质以1-2个步骤与1或1个以上的试剂反应以产生硫醇基,如为产生多糖上硫醇基所用的酰化剂,具体同第15-17页所讨论的。硫醇酯蛋白质亦可通过胺化羧基活化的蛋白质来制备,诸如在Atassietal,Biochem et Biophys.Acta,670,
300(1981)中所证明的那些,用氨基硫醇(Aminothiols)以产生硫醇基蛋白质。本程序一个最好的实施包括用N-乙酰高半胱氨酸硫内酯(N-Acetyl-homocysteinethiolactone),在约0℃-35℃、PH8-11、应用等量的各反应剂直接酰化蛋白质的侧氨基(诸如:赖氨酰基)5分钟-2小时。当E′B′是
时,用于制备功能化的蛋白质的条件和方法与通过用活化的顺丁烯二酰亚胺酸(Maleimido acids)的反应来制备相对应的多糖相同。
的那些蛋白质或通过用二胺的-卤乙酰衍生物反应羧基活化的蛋白质所制备的那些蛋白质。在上述两种制备方法中,温度是0℃-35℃,PH8-11,时间5-60分钟。
C.结合物的形成
结合物的形成只不过是将有侧基视电子中心的、共价修饰的任何多糖与有侧硫醇基的任何蛋白质以大约等量的比例在PH7~9,温度约17~40℃,于氮气环境中反应6~24小时以产生一共价结合物的过程。这些反应的实例包括:
其中一个已与4-溴替乙酰丁基胺反应了的活化多糖和已与N-乙酰高半胱氨酸硫内酯反应了的蛋白质相互反应,从而形成一结合物,和:
(此处Y是一C2~C8烷基),其中一个已与活化的顺丁烯二酰亚胺酸反应了的氨基衍生多糖与一个已用氨硫醇胺化了的羧基活化的蛋白质相互反应,从而形成结合物。
同样地,具有侧硫醇基的任何共价修饰的多糖可以与具有侧亲电子中心的任何蛋白质反应而产生一共价结合物。这种反应的一个例子是:
其中一个已与氨硫醇反应了的活化多糖和一个已与二胺的一囟乙酰衍生物反应了的羧基活化的蛋白质起反应,从而形成一结合物。
过剩卤乙酰基的亲电子活化应被排除,结合物与一低分子量的硫醇,诸如n-乙酰半胱胺反应将可达到此目的。n-乙酰半胱胺这个试剂的应用也使人们能对所用囟乙酰部分作确定的计算(见D节),因为所形成的S-羧甲基半胱胺唯一能用Spackman,Moore和Stein的方法测定出来。
这些结合物然后在约1~20℃,用一固定角度的转头和约100,000Xg下离心约2小时,或用其它纯化方法中的任何一种,包括凝胶渗透作用,离子排斥层析,梯度离心,或其它差异吸收层析以除去非共价键的多糖和蛋白质,应用共价性分析双属间隔基(见下面)作为观察所希望的生物学活性的一个方法。
各试剂的进一步分离可在一柱内用大小排除层析法来完成,对于分子量很大的非溶性蛋白质如脑膜炎双球菌B血清型外层膜蛋白质可用超速离心法分离。
D.证实共价性的分析
申请者们应用水解结合物(最好用6NHCl在110℃水解20小时),然后定量地分析含有硫醚键和蛋白质构成氨基酸的水解稳定的间隔基来完成证实结合物共价性和稳定性的分析。蛋白质中氨基酸的影响可以被除去,如果必需的话,可将一对于有关蛋白质是适当的氨基酸标准与反映结合物共价性的其余氨基酸值进行比较,或使间隔基的氨基酸出现在分析中蛋白质的氨基酸标准的外面。共价性分析对监测纯化程序以指示生物学上活性
结果释放出S羧甲基高半胱氨酸,
结果释放出S-羧甲基半胱胺,H2NCH2CH2SCH2CO2H,这是因为在肽连接处裂开PS-A-E-S-B-Pro分子和其它水解不稳定键的结果。层析方法,诸如Spackman,Moore和Stein的方法可常规地应用,氨基酸成份的比例可被测定。
E.申请
本发明的一个或更多个结合物可用于哺乳类主动的或被动的,予防性的或治疗性的保护抵抗由同族细菌所引起的菌血症,如本发明中最好的实施是流感嗜血杆菌b型.链球菌性肺类6B、19F、或23F型。通过注射一有效量(一个能产生可测定的抗体量的剂量为2~50μg)的多糖(以结合物的形式),然后从注射过结合物的动物取得整个抗血清或这些抗血清的球蛋白或其它含有抗体的分离物,在有或没有药学上可接受的载体如无菌盐溶液的方法可以达到主动保护作用。这种球蛋白用层析法,盐或乙醇分馏法或电泳法从全抗学清中分离出。用标准单克隆抗体程序或免疫适合的哺乳类宿主可以达到被动保护的目的。应用一个配料(如明矾)也包括在本发明的范围之内。
在本发明的一个最好的实施中是将该结合物用于人的主动免疫原性的予防接种,特别是婴儿和儿童。为了更稳定起见,在用前,可以将这些结合物在乳糖的存在下冷冻干燥(例如20微克/毫升流感嗜血杆菌多糖/4毫克/毫升乳糖或50微克/毫升肺炎球菌多糖/10毫克/毫升乳糖)。
最好的剂量水平是所要注射的结合物衍生物相当于该结合物中25微克的肺炎球菌多糖成份和10微克的流感嗜血杆菌b型多糖一次注射。如必要,也可再注射一或二次流感嗜血杆菌b型多糖结合物或其衍生物,剂量相当于结合物中10微克的多糖。
此发明将参照下面要说明但并无限制的例子进一步被明确。
例1
流感嗜血杆菌b型荚膜多糖(PRP)的制备接种物及其繁殖
步骤A:将从纽约州立大学得到的菌株为ROSS 768所培养的流感嗜血杆菌b型的冷冻干燥物,悬浮于1毫升无菌的嗜血杆菌接种培养基(见下)。将此悬液涂散在19个巧克力琼脂平板培养皿(BBL)上,在厌氧内于37℃恒温培养20小时后,将每个培养皿表面的生长物再悬浮于1~2毫升流感嗜血杆菌接种培养基中并进行混合。
流感嗜血杆菌接种培基*
大豆胨 10克/升
Na Cl 5克/升
Na H2PO 3.1克/升
Na2H PO413.7克/升
K2HPO42.5克/升
蒸馏水加至所需之体积
*将此溶液的PH调至指标值7.2±0.1(典型值是PH7.23)。将此溶液用高压灭菌器在121℃高压灭菌25分钟以达到无菌。
步骤B:2升无隔板的(non-baffled)锥形瓶中培养
将上述“A阶段”重新悬浮的细菌的1/3接种到3个2立升锥形瓶中,每一个瓶中含有约1升的完全流感嗜血杆菌种子和生产培养基(见下)。然后将这些锥形瓶置于一摇床中以每分钟200转及37℃条件下恒温培养约5小时,培养期结束时一个典型的波长为660毫微米时的光密度值(OD)是0.37。
完全流感嗜血杆菌种子和生产培养基
Na H PO 3.1克/升
Na H PO 13.7克/升
大豆胨 10克/升
酵母提取液透析过滤液(1) 10毫升/升
K HPO 2.5克/升
Na Cl 5.0克/升
葡萄糖(2) 5.0克/升
尼克酰胺腺嘌呤
二核苷酸(辅酶I)(NAD)(3) 2毫克/升
氯高铁血红素(4) 5毫克/升
这些盐类和大豆胨用小量的无发热物质的热水溶解。再用无发热源的热水加至准确的体积。然后将这些发酵罐或锥形瓶于121℃高压灭菌25分钟,冷却后在接种前将酵母提取液的透析过滤液(1),葡萄糖(2),辅酶I(3)和氯高铁血红素(4)以无菌操作加到这些锥形瓶或发酵罐中。
(1)酵母提取液的透析过滤液:将100克布鲁尔氏酵母提取(Amber)溶于1升蒸馏水中,以Amicon DC-30带有H10X50过滤器芯子的空心纤维进行超滤以去除分子量为50,000的分子,收集过滤液并通过直径为0.22微米的滤膜作为无菌的产物。
(2)用玻璃器制备的蒸馏水将葡萄糖配成25%的无菌溶液。
(3)含有20毫克/毫升的辅酶I的贮存液通过一Millipore滤器(0.22微米)过滤以灭菌,在接种前以无菌操作加入。
(4)三倍的氯高铁血红素的原液的制备是通过将200毫克的氯高铁血红素溶液在10毫升0.1M Na OH中并用无菌蒸馏水将体积调至100毫升。此溶液在121℃灭菌20分钟。在接种前以无菌操作加入最后的培养基中。
步骤C:70升菌种发酵罐中发酵:把3升步骤B的产物用来接种一70升发酵罐,此罐中含有41.4升上述制备的完全流感嗜血杆菌种子和生产培养基和17毫升UCONB625防泡剂。起始PH为7.4。
发酵作用维持在37℃,每分钟转动100次的条件下并通过光密度和PH测定监测,直至达到典型的光密度值0.39为止,(大约在恒温培养5.5小时后)。
步骤D:800升生产发酵罐中发酵
把约40升步骤C的产物接种到一个800升发酵罐中,此罐含有570升上述制备的生产培养基,调节到所需容积并加入72毫升UCON LB625防泡剂。
发酵在37℃进行,每分钟转动100次的条件,大约每2小时检测一次光密度和PH水平,直至光密度值在两小时内没明显变化时,此时终止发酵作用(一个最终的典型的光密度值是在12小时后为0.54)。
收获和灭活
每批约600升的产物通过收获到一个含有12升1%硫柳汞(thimero-sal)的“杀死罐”中而进行灭活。
澄清
在4℃,灭活后18小时,此批产物放入4英寸碗形Sharples离心机将流速调整到维持产物清晰情况下离心(变化于1.3和3.0升/分之间)。在离心(每分钟15,000转)后所获得的上清液用来回收产物。
通过超滤进行分离和浓缩
来自两次生产发酵的上清液混合起来,于2~8℃在具有十个中空纤维膜片(将分子是为50,000道尔顿的切掉)的一个Romicon超滤装置进行浓缩(此膜的面积为4.5平方米,气流为2.0英寸/分钟压力为20磅/英寸;浓缩大约4.5小时然后;1200升被浓缩或32.5升,取出滤出液。
48%和61%的酒精沉淀
30升95%的酒精在1小时内于4℃搅拌下逐滴加到32.5升的Romi-con超滤液中,使酒精的最终浓度按体积计算达到48%。混合物于4℃再搅拌2小时以保证完全沉淀。上清液通过一单个的4英寸sharples离心机在15,000转/分下离心收集(流速=0.27升/分)去不溶性沉淀物,将已澄清的液体在1小时内再加入20.8升95%酒精,酒精终浓度为61%。此混合物再搅拌3小时以保证完全沉淀。
第二次沉淀物的回收
把在48%的酒精可溶而在61%酒精中不溶的沉淀在4英寸Shar-ples离心机以每分钟15,000转进行离心收集,(流速=0.62升/分)除去61%的乙醇上清液,粗制产物的产量是0.377公斤的湿糊状物。
氯化钙萃取
把377克在61%酒精不溶物质在一个Daymax分散管中于2~8℃下与6.5升冷的玻璃器制备的蒸馏水相混合。6.5升冷的2M Ca Cl2·H2O加到次混合物中,(最终浓度=1.0M Ca Cl),在4℃萃取15分钟,然后用2升1M Ca Cl2·H2O漂洗,终体积为15升。
23%酒精沉淀
由上面步骤而得到的15升Ca Cl萃取物中逐滴加入4.48升的95%酒精,在4℃下搅拌30分钟,酒精终浓度为23%,再搅拌17小时,其混合物通过K2超速离心机以每分钟25,000转(流速=165毫升/分)于4℃下离心6.5小时。此上清液用干酪色布过滤以除去类脂样的悬浮物,并除去不溶性沉淀物。
用37%酒精沉淀和收集糊状制品
23%酒精上清液,在30分钟内在搅拌下逐滴加入4.33升95%酒精而得到终浓度为37%的乙醇。将此混合物搅动1小时,然后不搅动放置14小时以保证完全沉淀。再将此混合物用4英寸Sharples离心机以每分钟15,000转(流速=0.2升/分)离心收集沉淀的粗制多糖。
研碎
将离心后的沉淀物转移到一个含有1升无水酒精容积为1加仑的Waring混拌器中,以最高的速度混合30秒钟。混合作用持续30秒然后停止30秒直到出现坚硬、白色的粉末为止。将此粉末收集到带有一聚四氯乙烯的滤片的布氏漏斗上,随后在原位用1升的无水酒精洗两次,再用2升的丙酮洗两次。然后将此物质于4℃下,真空干燥24小时得到68克干重的产品。
酚萃取
将研碎阶段所得到的68克干物质借助于Daymax分散管再悬浮于PH6.9,12升,0.488M乙酸钠溶液中。此乙酸钠溶液立即用4.48升新鲜酚的水溶液提取,其方法如下:将900毫升PH6.9,0.488M的乙酸钠加到一个内含5磅酚的瓶(Mallinckrodt结晶)中,连接一个20升压力管,进行混合直到完全溶解为止。每次酚提取液用K超速离心机以每分钟30,000转离心2个半小时打碎此乳状剂。把水相以类似的方式用3.2升新鲜的酚的水溶液再萃取3次,弃去酚相。
透析过滤:
将上述酚提取阶段所得到的水相17.6升用300升冷的玻璃器蒸馏的蒸馏水稀释,并在一个Amicon DC-30超滤装置中于4℃下用HTO P10滤器芯子塞进行超滤。冲洗此Amicon装置,并将漂洗液加到超滤液中,以使其最终容积为17.5升,弃去超滤液。
67%酒精沉淀
将0.438升的2M Ca Cl加到上述17.5升的透析液中(最终Ca Cl的浓度是0.05M),在1小时内向此溶液逐滴加35.88升95%酒精快速搅拌下制成67%的酒精液。搅动4小时后,在4℃下放置12小时,将此清晰的上清液吸出,其沉淀物用4英寸Sharples离心机,以每分钟15,000转在4℃下离心45分钟。所产生的多糖沉淀物于一个1加仑的Waring混合中用2升无水酒精搅动30秒,停止30秒的方法进行研碎。将此混合液收集于一个带有一聚氯乙烯的滤片的布氏漏斗,然后在原位用无水酒精洗4次,每次1升,再用丙酮洗两次,每次1升。将此样品放在一个已称重的碟中在4℃下真空干燥20小时,其产物是39克的干粉。
在20%酒精中的超速离心及终产物的收集
将上述39克干粉溶于15.21升蒸馏水中,加入0.39升0.05M Ca Cl2·H2O,使此溶液成为0.05M的Ca Cl,其总容积15.6升(2.5毫克多糖/毫升),此混合液在30分钟内逐滴加4.93升95%酒精以制成24%酒精。此混合液用含有一个Ktitanium和一个K11 Noryl core的K超速离心机于4℃以每分钟30,000转离心3.5小时使混合物立即澄清,弃去沉淀物。而清晰的上清液(19.8升)通过加入4.23升95%酒精搅拌30分钟使成为37%的酒精液。再搅拌30分钟后,将此混合液放置在4℃17小时,然后通过一个4英寸Sharples离心机以每分钟15,000转离心进行收集(需要45分钟)。
将所产生的糊状物转移到1个含有2升无水酒精的1加仑的Waring混合器中,以最高的速度搅动30秒钟,停止30秒钟的这样4~5个周期进行混合直到形成一种坚硬、白色粉末为止。此粉末被收集到带有一个Zitex聚四氯乙烯滤片的布氏漏斗中,然后在原位用新鲜无水酒精漂洗每次0.5升,然后用1升无水酒精漂洗一次,再用丙酮漂洗2次,每次1升。从布氏漏斗中取出此产物并转移到一个已称重的碟中,在真空,4℃下干燥25.5小时,其最终产量是34.7克干重,它的特性如下:
表1-1 H Ib多糖化学测定数据
试验 结果
湿度(TG) 13.5%
蛋白质 0.0%
核酸 1.3%
核糖(戊糖) 35.1%
磷 7.8%
KD(葡聚糖4B) 0.05 0.35
KD(葡聚糖2B) 0.43 0.60
下述的方法被用于进行这些试验:
1.湿度-使用Perkin-Elmer湿度平衡TSG-1的标准湿度重量分析法(达到100℃时的重量丢失)。
2.蛋白质-Lowuy法;Lowuy等人,生物化学杂志,193∶265,(1951)。
3.核酸-紫外光谱法;Warburg和Christian,生物化学杂志,310∶384(1942)。
4.核糖-Bial法Dische和Schwartz,Mickorochim Acta 2∶13(1937)。
5.磷-钼酸盐法,Chen等人,分析化学28∶1756(1956)。
6.KD-使用屈光指数对葡聚糖4B进行测定。
表1-2
发热物质试验(H Ib多糖)
浓度 最大的温度升高*
(微克/毫升/千克) 0℃(3只家兔)
0.1(多糖) 0.2,0.2,0.1
*1.0毫升/千克量
多糖进一步用琼脂扩散进行鉴定如下:用Hyland D式板进行琼脂双扩散(Ouchterlony)。将抗流感嗜血杆菌的Ross 768株的抗血清放入中央孔,其浓度为50,25,12.5,6.2和3.1微克/毫升的多糖放入外周孔,将板保温在20~25℃湿盒中24小时。在多糖浓度为50,25和12.5微克/毫升时,多糖和特异性抗血清之间可观察到沉淀带。
例2
脑膜炎双球菌B11血清型2膜蛋白质的制备
A.发酵作用
1.脑膜炎双球菌B11组
将含有冻干的脑膜炎双球菌培养物(由华盛顿特区Walter Reed陆军研究所(WRAIR)的M.Artenstein博士提供)的干燥管打开,加入Eugonbroth(Eugon肉汤)(BBL)。将培养物划线接种到巧克力琼脂培养基(BBL)上,在37℃,5% CO2条件下保温培养36小时,在此时,生长物被收获到10%脱脂乳培基(Difco),分装,在-70℃冻干,其微生物通过用WRAIR所提供的特异性抗血清或通过Difco公司提供的配型血清进行凝集试验来进行肯定性鉴定。
第一次所培育的培养物被划线接种到巧克力琼脂培养皿上,于37℃,5% CO2保温培养18小时,此时的培养物被收获到10%脱脂乳培养基,分装或1毫升的量,于-70℃冰冻,此微生物通过用WRAIR提供的特异性抗血清和通过Difco公司所提供的定型血清进行凝集试验再次进行肯定性鉴定。
一瓶第二次培育的培养物被融解,将其划线接种于10个哥伦比亚绵羊血琼脂培养皿上(CBAB-BBL)。将此培养皿在37℃,5% CO2保温培养18小时,然后将此生长物收获于100毫升10%脱脂乳培养基,分装成0.5毫升/份,在-70℃冰冻。用特异性抗血清作凝集试验,糖酵解和革兰氏染色对此微生物进行肯定性鉴定。
一瓶上述培养物被融解,用Mueller-Hinton肉汤稀释,将其划线接种于40个Mueller-Hinton琼脂培养皿中。将这些培养皿于37℃,6%CO保温培养18小时,此后,其生长物被收获到17毫升10%脱脂乳培养基,以每管0.3毫升分装,于-70℃冰冻。此微生物通过革兰氏染色、特异性抗血清的凝集作用和氧化酶试验得到肯定的鉴定。
2.发酵作用和细胞糊状物的收集
a.接种物的产生:接种物来自2瓶冰冻的脑膜炎双球菌B组,即上述第四次培育的B-11。接种在4个Mueller-Hinton琼脂Blake瓶中,在约18小时后收获并且被用作接种物在PH7.29的5升Gotschlich氏酵母透析液培养基中接种。在波长为660毫微米处将光密度调至0.065(用Perkin Elmer)。将此微生物生长于5个2升的锥形瓶(每个含1升培养基,见下),将这些锥形瓶放在37℃的一个摇床上。在45,75和120分钟后检测光密度。在波长为660毫微米时光密度=0.81(Spectronic 20)时产生约4升的肉汤培养物。
一个3毫升的样品进行革兰氏染色,划线接种到CBAB,Mueller,Hinton和酵母提取物右旋糖培养皿并进行凝集试验的检查,所有反应是满意的。
b.70升菌种发酵罐:约3600毫升菌种培养物被用来接种一个无菌的70升发酵罐,其中含有42.6升完全生产培养基(见下)。
70升的发酵条件是在37℃下,以每分钟10升的空气喷雾,每分钟185转,恒定控制PH为7.0发酵5.5小时。
将此培养物接种到Mueller-Hinton琼脂培养皿上,酵母提取物右旋糖和兔血琼脂培养皿(Merck),在37℃培养。用脑膜炎双球菌B族抗血清进行凝集作用的试验,在Mueller-Hinton琼脂培养皿,酵母提取物右旋糖培养皿兔血琼脂培养皿上的生长物是正常的,凝集作用反应是阳性的。对于此批,5.5小时后最终光密度在660毫微米时是0.840。
C.800升的生产发酵罐:大约46.2升的菌种培养物被用来接种一个无菌的800升发酵罐,其中含有568.2升的完全生产培养基(见下)。此批被保温培养在37℃,每分钟100转的产生每分钟60升的空气喷雾,恒定的PH控制在7.0。
在此批被灭活之前,其培养物在37℃条件下被接种到Mueller-Hinton琼脂培养皿(Merck),酵母提取液右旋糖培养皿和兔血琼脂培养皿。用脑膜炎双球菌B族的抗血清进行凝集作用的试验,在Mueller-Hinton琼脂培养皿,酵母提取物右旋糖培养皿和兔血琼脂培养皿上的生长物是正常的,凝集反应是阳性,对于此批在接种后13小时其最终光密度是2.24。
3.在比浊计烧瓶中和70-及800升发酵罐用的完全培养基
A组分
左旋-谷氨酸 1.5克/升
Na CL 6.0克/升
无水Na2HPO42.5克/升
NH4CL 1.25克/升
KCL 0.09克/升
左旋-半胱氨酸盐酸 0.02克/升
B组分(Gotschlich氏酵母透析液)
将1280克Difco的酵母提取液溶于6.4升蒸馏水中,此溶液在2个带有3个HIOSM滤器芯子的Amicon DC-30中空纤维带有3个HIOSM
(滤器芯子)的透析装置中透析。将透析液和384克Mg SO 7HO和3200克右旋糖混合在一起,加蒸馏水使总体积为15升。用Na OH将PH调至7.4。通过Millipore(直径=0.22微米)过滤灭菌,将此加到含有A组分的发酵罐中。
用于比浊计烧瓶:加入1升的A组分和25毫升的B组分,将PH用NaOH调至7.0-7.2。
用于70升的发酵罐:加入41.8升的A组分和900毫升的B组分,将PH用Na OH调至7.0-7.2。
用于800升的发酵罐:加入553升的A组分和15升的B组分,将PH用Na OH调至7.0-7.2。
d.收获和灭活:
在发酵作用完成后,将0.5%(V/V)的酚加入到一单独的管中,然后将细胞肉汤转移到此管中,将此物质放于室温进行轻微搅拌直到培养物不再存活为止(大约24小时)。
e.离心:
B.分离在4℃下,大约24小时后,614.4升灭活的培养物通过sharples离心机离心。在酚加入后细胞糊状物的重量是3.875千克。
步骤1.细菌细胞的洗涤:
为了每次的分离,将上述0.5%酚灭活的糊状物200克悬浮在800毫升无菌蒸馏水中,用磁棒搅拌成颗粒悬液,此悬浮的细胞在20.000Xg,5℃下,离心60分钟(Beckman 19 Ti转头,每分钟14,500转)。
步骤提取2:提取
将已洗过的细胞悬浮于2000毫升PH8.5,含有0.5%脱氧胆酸钠(溶于TED缓冲液)的0.1M Tris-0.01MEDTA缓冲液中,用一sorvall 2 quart omnimixer混合器在位置3处混合60秒。
将此均质的悬浮液转移到16个500毫升锥形烧瓶中,于56℃在一个摇动的水浴中提取15分钟。
将此提取液在20,000Xg于5℃离心60分钟(Beckman 19 Ti转头,每分钟14.500转),然后将此粘滞的上清液倾倒出(总容积=1980毫升),贮存于4℃。
已提取的细胞沉降物被再次悬浮于上述的2000毫升TED缓冲液中,此悬浮液在56℃下提取15分钟并进行上述的离心,将此上清液轻轻倾倒出(容积=2100毫升),贮存于4℃。
步骤3.用超滤法浓缩
将步骤2所获得的提取上清液混合起来(总容积=4005毫升)。将2升的混合液分散在一个2升的新Brunswick发酵管中,此管联接到一个Millipore Pellicon过滤装置上,此装置有2个0.45微米的微孔膜(表面积为1/2平方英尺)。将在整个90分钟浓缩过程中,提取的上清液一直放在25℃的发酵管中平均转膜压是27.5psi(磅/英寸),样品被浓缩10倍。
步骤4:收集和洗涤血清型蛋白
把205毫升上述浓缩液以160,000Xg转速,5℃下,离心2小时以沉淀血清型蛋白(Beckman 45 Ti转头,37,000rpm)。将上清液倾倒出,弃去。
将蛋白沉淀物称重(8.12克),然后将其悬浮于TED缓冲液中(190毫升缓冲液,每克沉淀物加20毫升缓冲液),用一玻璃棒和一Dounce均浆器混匀,此悬液在56℃下,在500毫升锥形瓶中摇动提取15分钟。此后于5℃下在160,000Xg离心2小时(Beckman 45 Ti转头,37,000rpm)。将上清液倾出,(190毫升),将沉淀物按上述方法在190毫升TED缓冲液中进行第二次洗涤。
步骤5:产物的回收
将步骤4已洗过的蛋白沉淀物用一玻璃棒和Dounce匀浆器悬浮在0毫升水中以保证完全悬浮。该悬液的lowry蛋白数值为每毫升17毫克。将200毫升的悬液保存作试验用。剩余的悬液(91毫升)用玻璃器制备的蒸馏水102.4毫升把其稀释成8.0毫克/毫升,此悬液在12,000Xg离心15分钟以清除聚合物(Beckman 45 Ti转头,10,000rpm)。
将上清产物用吸管仔细地吸出以避免吸出松散的沉淀聚合物。此产物被标记(容积=182.5毫升),分装的每一份用作消毒和发热原检验(其结果为无菌产物,无发热原)。此产物贮存于4℃作为一个无菌体直到用于结合反应,同时被定性。其产量是每克原始细胞糊状物含有9.5毫克Lowry蛋白。
表2-1
脑膜炎球菌B血清型2的蛋白溶液
化学测定数据
试验 结果
蛋白质(Lowry法测定) 4.1毫克/毫升
核酸*
RNA(核糖核酸)(Bial法测定) 1.8%
中性糖*
蒽酮 1.05
唾液酸* 3.0%
分子量
(SDS-PAGE法测定) 40,000道尔顿
*根据Lowry法测定的蛋白的百分率计算
用于进行测定的方法如下:
1.蛋白质:如例1。
2.核酸:用5-甲基间苯二酚反应(Bial)观察颜色的产物,此反应相当于按蛋白浓度的百分率计算的1.8%的RNA。DNA的三苯胺试验指明在整个溶液中按蛋白质的百分比计算0.6%为DNA的含量。
3.中性糖:使用酮比色试验找出按蛋白质的百分比计算的中性糖的含量。(scott and melvin,分析化学 25,1656,1953)。
4.唾液酸:使用间苯二酚-HCL法检测唾液酸的含量(svennerholm,Bilchem.Biophys.Acta.24,604,1957).
5.分子量:巯基乙醇变性蛋白的分子量用SDS-PAGE(+=烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)进行测定。(自然[Nature]227∶680(1970),Lk B申请备忘录306)。
例3
流感嗜血杆菌乙型多糖和脑膜炎双球菌血清型B的外膜蛋白结合物的制备
Ⅰ.以4-正丁胺形式的DOWEX 50 X8(200-400目)的制备:
将360毫升新鲜的DOWEX 50 X8(200-400目)强酸阳离子交换树脂(Bio-Rad)装入一无菌的层析柱中,用1500毫升无菌蒸馏水(sd)冲洗并在800毫升无菌蒸馏水中浸泡过夜,然后将此树脂按顺序用1升60∶40-无菌蒸馏水∶甲醇,1升40∶60-无菌蒸馏水∶甲醇以及1升无菌蒸馏水冲洗,然后将此树脂浸泡在650毫升3N HCL(200毫升HCL用水稀释到800毫升)消毒,将此酸性树脂平衡9.5小时,然后用水洗去过剩的酸。
此后,将700毫升的水∶40%丁胺氢氧化物为1∶1的混合物加到此柱。此混合物通过树脂柱,直到流出液呈碱性(PH-10),然后用约2升的水洗去此树脂过剩的碱基,再转移到一个无菌罐中,最终的流出液是无菌和无发热原的。
Ⅱ流感嗜血杆菌乙型多糖(简称H Ib)的4-正丁胺盐的制备:
向装有一个磁性搅拌器的250毫升园底烧瓶中加入3.29克的H Ib和84毫升水,将混合物搅拌20分钟,然后再加入15毫升水,再搅拌30分钟直到所有H Ib溶解为止。然后将此H Ib溶液加到150毫升Dowex 50X8(200-400目,4-丁胺型)的45毫米X 270毫米的柱上。用10毫升水作为漂洗液,此柱的顶端加入水,压力用一手泵提供(通过一个Millex FG 0.22毫米滤器)。
50毫升的组分收集于无菌Nalgene离心管(50毫升),每一管进行有机物的测定,用一无菌的融点毛细管把约10微升的流出液加到一块二氧化硅胶板上,此板用Ce IV(SO4)/H2SO4溶液喷射(1% Ce IV(SO4)2溶在10%液体硫酸中),在一个热盘上加热,含“有机”物质的则出现黑点。把2,3,4和5管的190毫升液体合并到一无菌的250毫升离心管中,混合,然后等量地分装到6个已称重量的250毫升园底烧瓶中,这些烧瓶分别标记成A-F。测定发现是无菌和无发热原的。
6个烧瓶的内含物在干冰-丙酮中冰冻,将这些烧瓶接到两个可调式阀门和3个出气口的多功能真空干燥机上进行冷冻干燥。此多功能真空干燥机被移到层流罩上,移去这些烧瓶并用无菌的纸袋密封。将这些烧瓶贮存在-20℃并放在一个含有P2O5的干燥器(dessicator)中以达到高度真空。一份干燥样品被测定,具有和开始H Ib相同的Kd。
Ⅲ.多糖-丁二胺加合物(H Ib-Bu A)的制备:
步骤A:1,4-丁二胺溶液的制备:
将1.46克1,4-丁二胺二氢氯化物加入一个100毫升的园底烧瓶并溶解于58毫升水中,加入5毫升2.5N NAOH调节PH至10.35。此溶液通过0.22微米的sybron-nalge滤器过滤,把其置于一旁。
步骤B:H Ib的激活和与1,4-丁二胺的反应
将一个磁性搅拌棒和17.5毫升二甲基甲酰胺(DMF)加到含有0.64克PRP的4-正-丁胺盐A烧瓶中(来自第二部分)。混合物在室温下搅拌25分钟,此时几乎所有的物质看来都已溶解。
将80毫克的碳酰二咪唑加到一无菌的6毫升血清小瓶中,然后将此加到DMF溶液中,将烧瓶加盖。在室温搅拌35分钟。在此期间,将步骤A所制备的丁二胺溶液32毫升加到一含有磁性搅拌棒的100毫升圆底烧瓶中,在冰浴中搅拌约5分钟。
搅拌35分钟后,用一吸管将DMF溶液加到冷的1,4-丁二胺溶液中。在冰浴中继续搅拌15分钟,此后移去冰浴,再继续搅拌17分钟。
步骤C:透析和冷冻干燥
将此溶液转移到高压灭菌过的2个spectropor透析管中(此管的圆桶容积为0.21毫升/毫米,17时)在4℃冷室中透析。首先,将此溶液对8升0.01M磷酸盐缓冲溶液PH7.0透析5小时,然后对新鲜的8升磷酸盐缓冲液透析两次,第一次5小时,第二次11小时,最后,将此溶液对18升水透析6小时。
无菌和发热原的检验(结果:无菌和无发热原)后将大约125毫升的透析液分装入2个250毫升圆底烧瓶中。这两个烧瓶内含物在干冰-丙酮中冰冻,然后按上述第Ⅱ部分的方法进行冷冻干燥。所得冻干产物共480毫克。
萤光测胺试验表明每毫克含有468毫微克分子的NH。
Ⅳ.多糖-丁二胺-溴乙胺(H Ib-Bu A-Br AC)的制备。
步骤A:对硝基苯溴乙酸盐的制备:
将6.30克(45毫微克分子)的溴乙酸和6.25克(45毫微克分子)的对硝基苯加到-250毫升圆底烧瓶中,再溶于50毫升二氯甲烷(CH CL)。此溶液在冰浴中搅拌10分钟,然后把溶于10毫升CH2CL2中的10.3克(50毫微克分子)二环己基碳二亚胺加入其中,此后将反应混合物于4℃搅拌17.25小时。将沉淀的二环己脲过滤,滤液在真空中浓缩干燥,将黄色的干燥物加到35毫升的1-氯丁烷中,然后重结晶,得到6.5克的产物,熔点为85-87℃,将此产物加到100毫升的环己烷中,再重结晶得到4.59克对硝基苯溴乙酸盐的产物,熔点86-87℃。C8H6NO4Br的计算是:C 36.92;H,5.83;Br,30.77试验结果:C,37.66;H,2.48;N,5.28;Br,30.57.
此结果与′H核磁共据(NMR)谱是一致的
步骤B:H Ib-Bu A的反应
将上述第Ⅲ部分在两个烧瓶中制备的380毫克H Ib-Bu A溶于37毫升PH9.15的缓冲液,溶液置于一磁性搅拌棒的250毫升圆底烧瓶中。将上述步骤A得到的346毫克的对硝基苯溴乙酸盐加入此溶液中,将此混合物在4℃下,搅拌24小时,然后转移到18寸的透析管中(spectropor 2,见第Ⅲ部分)。将此溶液用18升水透析5.25小时,继而对新鲜的18升水透析
17.25小时(两者均在4℃条件下进行)。
将此100毫升的透析液依次通过0.45微米sybron nalge滤器和0.20微米滤器过滤。此后将其等量地分装到6个100毫升园底烧瓶中,并按第Ⅱ部分的方法冰冻和冻干。共得到0.28克的H Ib-Bu A-Br Ac。萤光测胺试验表明每毫克含有128毫微克分子的NH2。每毫克含有340毫微克分子溴乙酰基团。比浊法测定的速率表明它与起始的多糖具有相同的抗原性。
Ⅴ.将H Ib-Bu A-Br Ac结合到功能化的脑膜炎双球菌的膜蛋白上(NMP)
步骤A:用-乙酰高半胱氨酸硫代内酯使NMP功能化
将5毫升PH11.3的硼酸盐缓冲液加到含有42毫克乙二胺四乙酸(EDTA)和8毫克二硫苏糖醇的一个6毫升血清小瓶中,将上述溶液3.8毫升加到-50毫升园底烧瓶中,也加入11.5毫升脑膜炎双球菌的外膜蛋白(NMP)溶液,所得混合物的PH用40-50微升2.5NNaoH调至11.39。
将烧瓶用一蘑菇型血清瓶塞塞住,用耐火粘土阀(ACE Glass CO.)充氮替换空气。在一个氮气盒中加入53毫克的N-乙酰高半胱氨酸硫代内酯。将所得溶液在氮气中于室温下,稳定16.7小时,然后将此溶液加到含有120毫升葡聚糖G25(细)的柱上,操作是在氮气盒中进行的。用PH8.0的磷酸盐缓冲液洗脱,每管收集5毫升,并用Ellman试验检测硫醇类,从低分子量物质中基线分离高分子量(例如蛋白质)的硫醇是有效的。
步骤B:结合作用
将高分子量的组分合并,加入一含有0.06克H Ib-Bu A-Br Ac如第Ⅳ部分)的50毫升烧瓶中,此溶液在N2盒中于室温放置6小时,然后将其装入一无菌的spectropor透析管中,在4℃对18升水透析15小时,继而对新鲜的18升水透析24小时。
步骤C阶段:离心作用
用一吸管将大约32毫升的透析液以25毫升和7毫升的组分分别转移到2个多聚碳酸酯离心管中,于4℃下以每分钟37,000转(100,000xg)在Beckman Ti60转头,离心2小时。将上清液倒出,将沉淀转移到含有约8毫升水的Dounce匀浆器进行匀浆,然后转移回到一个离心管中,并用水加至25毫升,有效而完全地重悬浮后,将此管于每分钟37,000转(100,000xg),于4℃下再离心2小时,倒出第二次上清液,其沉淀物于8毫升水中用Dounce匀浆器匀浆化,将匀浆转移到一个无菌的15毫升nalge离心管中,用水稀释至15毫升。
在4℃稳定过夜后,出现少量絮状固体物,用临床用离心机以每分钟约2500转短时间(5分钟)离心将此絮状物除去。
上述的激活、结合和离心的步骤以同样的方式重复两次,对其进行蛋白质、多糖含量,S-羧甲基高半胱氨酸(SCMHC)、精氨酸比率、无菌和发热原性的分析。所有样品均是无菌和无发热原的,其它结果表示于下表。
多糖 蛋白质
操作次数 微克/毫升 微克/毫升 比率 SCMHC/赖氨酸
1 105 1210 0.09 0.011
2 154 1700 0.09 0.019
3 166 1800 0.09 0.027
鉴定结合物中多糖与蛋白的比率的一致性肯定于此过程的可重复性。S-羧甲基高半胱氨酸与赖氨酸的比率是表示反应效率的一个象征。其结果大于0则证明共价地修饰多糖和蛋白质之间键的共价性。
为临床上成批的使用,将此溶液合并,并在有乳糖存在下冷冻干燥(2微克/毫升多糖/4毫克/毫升乳糖。)
例4
在N-乙酰半胱胺内戴帽的流感嗜血杆菌b型多糖和脑膜炎双球菌血清型B外膜蛋白的结合物的制备。
功能化的多糖,H Ib-Bu A2-Br Ac的制备如同例3(第Ⅰ-Ⅳ部分),功能化的NMP的制备如同例8(步骤B[第Ⅲ部分]-NMP结合物的制备)第Ⅳ节A。
将59毫升H Ib-Bu A2-Br Ac(按其差别计算为300毫微克分子的溴乙酰基)加入含有4毫升硫醇化蛋白(通过Ellman试验测得5.6微克分子的SH)的烧瓶中。用一隔膜将其封上,抽气再充氮,将此溶液稳定18.5小时。加入6毫升水,将此溶液转移到一10毫升的多聚碳酸酯的离心管中,于4℃用一Beckman 75 Ti转头,每分钟43,000转离心2小时。除去上清液,沉淀物用一个Dounce匀浆器重新悬浮于含有106毫克N-乙酰半胱胺的10毫升PH8,0.1M,磷酸盐缓冲液中,将此溶液抽气并于室温下稳定19.5小时。
然后按上述方法离心(43,000rpm,4℃,2小时,75Ti转头)。将沉淀物悬浮(但不匀浆)于9.7毫升水中并按上法再离心。所获得的沉淀物进行匀浆,再悬浮于25毫升水中,然后用水稀释至30毫升制成一种“戴帽”产物的悬浮液。
结合物的分析如下
多糖 蛋白质 HIB/蛋白质
浓度 浓度 比率
188微克/毫升 1200微克/毫升 0.157
spinco:SCMHC/赖氨酸=0.096
S-羧甲基半胱胺/赖氨酸=0.20
例5
用流感嗜血杆菌b型多糖和脑膜炎双球菌血清型B外膜蛋白的结合物进行动物的抗体应答试验
将按照例3的方法制成冻干的流感嗜血杆菌b型多糖和脑膜炎双球菌血清型B外膜蛋白的结合物,用不同年龄的ICR/Ha小鼠和恒河猴进行免疫原应答试验,其结果列于表2和表3中。
结合物的分析如下
多糖 蛋白质 多糖/蛋白质 产量
浓度 浓度 比率 多糖
276微克/毫升 2.38毫克/毫升 0.12 6.1%
表5-1
不同年龄的ICR/Ha小鼠用流感嗜血杆菌b型多糖和蛋白质的结合物进行免疫的血清抗体应答反应
放射免疫试验滴度(GMT)
样品 毫微克 抗体/毫升
小鼠年龄,天*
7 21 28 35
流感嗜血杆菌b型多糖 282** 2111 8645 15860
蛋白质结合物 201**
*第一次注射时的年龄,小鼠在0,14天皮下注射2微克/0.1毫升,在21天放血。
**来自不同窝的小鼠,每组均为7-8只小鼠。
用小鼠进行流感嗜血杆菌b型多糖结合物的活性试验,其结果见表2。此结合物证明具有高度的免疫原性。
表5-2
用流感嗜血杆菌b型多糖-蛋白质结合物免疫去胸腺小鼠的胸腺依赖性研究
剂量 放射免疫试验滴度(GMT)
样品 毫微克 毫微克 抗体/毫升
NU/NU NU/+
多糖 小鼠* 小鼠*
流感嗜血杆菌 (1) 2.5 1,802 11,362
脂多糖-蛋白质
结合物 (2) 1,304 8,712
盐水对照 (1) - 50
(2) 55
*小鼠在0,14天进行皮下注射,21天放血。
NU/NU小鼠应答的平均值约为NU/f小鼠应答的15%,表明该结合物是一种依赖胸腺的抗原。
表5-3
用流感嗜血杆菌b型多糖-蛋白质的结合物免疫恒河猴的血清抗体应答
恒河猴 放射免疫试验(GMT)毫微克抗体/毫升
剂量 天
年龄* 多糖 0 14 28 42
2-3月 20微克 50 116 195 3036
4月 20微克 50 414 437 1548
18月 20微克 124 5858 4785 7447
*每组3只猴
如表2所示,流感嗜血杆菌b型多糖结合物在各种年龄的恒河猴中也可诱导一个高免疫原性的应答反应。
例6
肺炎双球菌19F型多糖和脑膜炎双球菌的外膜蛋白质的结合物
Ⅰ:肺炎双球菌19F型多糖的4-正丁铵盐的制备
将50毫克的19F型多糖(Merck公司)和5毫升水加入一装配有磁性搅拌器的25毫升园底烧瓶中,搅拌20分钟,然后将此溶液加到一个3毫升的Dowex 50×8的柱上(200-400目,4丁胺型)用水洗脱,收集于一25毫升的锥型并中。
此溶液在二氧化硅胶板上用Ce Iv(SO)/H2SO4溶液喷射以检测多糖含量,然后放在一个热盘上加热,此产物含有可根据黑点进行检测的多糖。将含有19F型多糖的溶液冻干和回收得到52毫克的产品。
Ⅱ.肺炎球菌19F型的四丁铵盐与碳酰二咪唑的反应,再与1.4-丁二胺反应(19F-Bu A)
步骤A:1.4丁二胺溶液的制备
40毫克1.4丁二铵二盐酸盐溶于1毫升水中,用2.5N NaoH调PH至9.15。
步骤B:19F型多糖的激活以及与1.4-丁二胺的反应
将一个磁性搅拌棒和4毫升二甲基亚砜(DMSO)加到含有20毫克四丁胺形式的19型多糖的25毫升园底烧瓶中,在室温搅拌20分钟,此时所有物质均已溶解。再加入5毫克碳酰二咪唑,于室温搅拌30分钟。在此时间内,将在步骤A制备的1.4-丁二胺溶液加到带有一磁性搅拌棒的25毫升园底烧瓶中,在冰浴中搅拌约5分钟。再搅拌30分钟后,将上述制备的DMSO溶液用一吸管加到此冷的1,4-丁二胺溶液中,在冰浴中继续搅拌15分钟,然后除去冰浴,继续在室温下再搅拌15分钟。
步骤C:透析和冷冻干燥
把溶液转移到Spectiopor 2透析管,在4℃下透析,用磁棒搅拌透析液。先对4升0.01M,PH7.0的磷酸缓冲液透析8小时,换同样缓冲液再以同样时间透析一次。最后对水透析6小时。把透析过溶液冷冻干燥,最后得到19毫克的19F型多糖的丁二胺衍生物(19F-Bu A2)荧光测胺实验(Fluorescaminas-ay)测得该物质含胺(NH)100毫微克分子/毫克。
Ⅲ.19F-Bu A2反应
步骤A:19F-BUA2反应
把Ⅱ中制备的19F-Bu A215毫克放在25毫升的园底烧瓶中,102毫升PH9.15的缓冲液,用磁棒搅拌10分钟,直到所有19F-Bu A2全部溶化。把溶在0.2毫升乙腈中的对一硝基苯溴乙酸盐加到该溶液中。在4℃搅拌该混合液24小时,把它转移到Spectiopor 2透析管中,对4升水透析两次。冷冻干燥样品,最后得到9毫克的19F-Bu A的N-溴乙酰化的衍生物,19F-Bu A-Br Ac。荧光测胺试验测得该物质含胺(NH)57毫微克分子/毫克,导致每毫克含溴乙酰基43毫微克分子。
Ⅳ.19F-Bu A Br Ac对功能化的脑膜炎球菌外膜蛋白(简称NMP)的结合,
步骤A:NMP与N-乙酰高半胱氨酸丙硫酮的功能化;
把43毫克的乙二胺四乙酸和8毫克的二硫苏糖醇溶在5毫升的PH11.30的饱和硼酸缓冲液。把0.4毫升的上述溶液置于15毫升的离心管中,再加入1毫升(13.7毫克)的脑膜炎双球菌外膜蛋白(NMP)。给该溶液抽气,并在室温下稳定在氮气中16小时。加1.1毫升PH8.0的磷酸缓冲液使其稀释到2.5毫升。把该溶液通过一个PD柱(葡聚糖凝胶G25M)。进柱前该柱在氮气中用PH8.0的磷酸缓冲液预平衡。进柱后样品用3.5毫升PH为8.0的磷酸缓冲洗脱。用Ellman试验测定硫含量为1.89微克分子/样品。把2.5毫升该样品再过第二个P10柱,同用PH8.0的磷酸缓冲预平衡该柱。然后用3.5毫升PH8.0的磷酸缓冲液洗脱。用Ell-man试验测定硫含量为0.44微克分子/样品。
步骤B:结合
把9毫克的Ⅲ中得到的19F-Bu A-Br Ac加到含有蛋白溶液的15毫升容积的派热克斯玻璃(pyrx)离心管。将该溶液在室温下置于氮手套箱6小时。然后把它放到Spectiopor 2透析管中,在4℃下对4升水透析8小时,再重复对4升水透析8小时。将其冷冻干燥备用作氨基酸分析。
结果:赖氨酸0.141微克分子/毫克
SCMHO0.0062微克分子/毫克,这个值大于氧提供的共价键的值。
步骤C:离心
把透析液(大约10毫升)用一个移液管转移到一个聚碳酸酯离心管,在4℃下以37,000转/分(100,000×g)转速用Beckma Ti 60转头离心2小时。除去上清液,把沉淀转移到另一个离心管。加10毫升水,再以37,000转/分(100,000×g)转速在4℃下离心2小时。第二次的上清液仍除去,沉淀用8毫升水均浆。把其贮存在一个15毫升容积的塑料离心中,备用作免疫学试验。
表6-1
用肺炎球菌19F-脑膜炎球菌B血清型外膜蛋白结合物简称PS19F-Pro结合物)免疫了的ICR/Ha鼠的血清抗体反应:
用量(微克) 放射免疫试验滴度
样品 葡萄糖 (GMT)毫微克抗体/毫升
PS19F-Pro
结合体 0.5 17,338
鼠腹腔注射,分别在0,7,28天时注射,35天放血
如表6-1所示结合物是有高度免疫性的。
例7
肺炎球菌多聚糖型结合
19F和很纯的大麻种子球蛋白(麻仁球蛋白Edestin)
Ⅰ:用四-(正)丁铵盐制备肺炎球菌型19F多聚糖:
在配有一磁棒的容积为50毫升的园底烧瓶内加入105毫克19F型多聚糖(Merck产品)和6毫升的水。搅拌混合液20分钟,把该液通过一个6毫升的离子交换树酯柱(Dowex 50×8)(200-400日),以四-(正)丁铵盐形式。用水洗脱柱,把洗脱液收集在50毫升锥形瓶中。在喷洒了CeIv(SO)/H SO的硅胶盘上测定多聚糖。然后将其放在电热盘上加热。含多聚糖的部分出现黑斑点。把含多聚糖19F的溶液冷冻干燥最后得到112毫克19F的四-(正)丁铵盐。
Ⅱ:肺炎球菌19F型四-(正)丁铵盐与1.1-碳酰二咪唑反应,然后与1,4-丁二胺溶液反应:
步骤A:1.4-丁二胺的制备
把175毫克的1.4-二胺二氯化物溶解在7毫升的水中,将溶液PH用2.5克当量的氢氧化钠调至9.5。
步骤B:19F多聚糖的活化及与1.4丁二胺反应
在容积为50毫升的园底烧瓶内加入112毫克以四-丁铵盐形式的19F型多聚糖和5毫升的二甲基亚砜(DMSO),内加一个磁搅拌棒。混合液在室温下搅拌,直至多聚糖完全溶解。再加13毫克碳酰二咪唑,反应液在室温下搅拌35分钟。这时将在步骤A中制备的1.4-丁二胺溶液置于另一个50毫升的园底烧瓶内有一磁搅拌棒,溶液在水浴中搅拌大约5分钟。然后把搅拌了35分钟的DMSO溶液用吸管加入到冷1.4-丁二胺溶液。在搅拌15分钟,除去冰浴,再在室温下搅拌15分钟。
步骤C:透析和冷冻干燥
溶液置于Spectropor2透析管,在4℃,搅拌透析。先对4升的0.01M的磷酸缓冲液,PH7.0透析8小时,然后对4升0.01M的磷酸缓冲液PH7.0,再透析8小时,最后对4升水透析4小时。然后把该溶液冷冻干燥,得到80毫克的19F型多聚糖的丁二胺衍生物(19F-Bu A)。荧光测胺结果是含胺77毫微克分子/毫克。
Ⅳ,19F Bu A2与对一硝基苯溴乙酸盐的反应
步骤A:19F Bu A2的反应
取Ⅱ中制备的19F-BUA250毫克置于25毫升园底烧瓶中,将其悬浮在4毫升PH9.15的缓冲液中,用磁搅拌棒搅拌10分钟直至19F-BuA2全部溶解。把50毫克的对-硝基苯溴乙盐酸溶解在0.5毫升的乙腈中。把19F-Bu A2溶液与其混合。混合液在4℃下搅拌24小时,然后转移到Spectropor 2透析管,把它对4升的水透析两次。把样品冷冻干燥,最后得到干燥,最后得到44毫克的19F-Bu A2的N-溴乙酰衍生物(19F-Bu A2-Br Ac)。荧光测胺结果含胺7.5毫微分子/毫克,不同的是含溴乙酰基69.5毫微分子/毫克。
Ⅳ,19F-Br Ac与功能化的纯麻仁球蛋白(Edestin)结合
步骤A:高效液相色谱法提纯麻仁球蛋白
把从大麻种子(Sigma)分离的麻仁球蛋白二重结晶240毫克溶于4毫升的3M的胍中(PH7.0)。具烈摇动样品,在加0.1毫升的巯基乙醇,再摇动,生成大量泡沫。
样品置于室温1小时,在台式离心机中离心以除去泡沫,再通过一个Millex-GV0.22微孔过滤器(Milljpore)过滤。然后把样品的一半(2毫升,120毫克)注入到予制的TSK3000分子筛柱,该柱有关参数如下∶流速∶1毫升/分;波长最大值280毫微米;溶剂为3M的胍;紫外光吸收值范围2.0;记录纸移动速度0.25厘米/分。
收集通过紫外光检测所得合适的样品部分,置于Spectropor 2透析管,对30升水透析16小时透析过程水替代了3M的胍使纯的麻仁球蛋白沉淀出来。
把整个样品由透析管转移到离心管,在台式离心机离心5分钟。收集含纯麻仁球蛋白的沉淀,在含五氧化二磷的干燥器中真空干燥。另一半原始样品(2毫升,120毫克)以同样步骤过柱、透析、离心提纯。最后得到110毫克纯麻仁球蛋白。然后把这纯麻仁球蛋白溶在2.0毫升的3M胍中,离心过滤,再以同样步骤层析两次。经过三次提纯,得到18毫升纯物质,在通过分析性B TSK3000柱时只呈现一个单一的峰。
步骤B:经过三次提纯的麻仁球蛋白的功能化。
把3毫克的乙二胺四酸和5微克的巯基乙醇加到1毫升3克分子的胍中。该溶液中加入14毫克如上面步骤A所述三次提纯的麻仁球蛋白。用2.5克分子氢氧化钠溶液把PH调至9.5,给核溶液抽气,置于氮气中,把13毫克N-乙酰高半胱氨酸丙硫酮加到氮气箱,使溶液在室温下于氮气中稳定16小时。
然后加1.4毫升3克分子的胍使溶剂稀释到最后体积为2.5毫升。再将其装入一个PD10柱(葡聚糖胶G25M,Pharnacia),进柱前,柱在氮气下用3克分子的胍预平衡,装柱后,用3.5毫升3克分子的胍洗脱样品。用Ellman试验测定硫含量,发现大约是4.38毫微克分子/样品。再取2.5毫升样品进第二个PD10柱,它仍用3克分子的胍预平衡,然后用3.5毫升3克分子的胍洗脱。Ellman试验测得硫含量为3.24毫微克分子/样品。
步骤C:结合
把7毫克的溴乙酰19F型多聚糖(19F-BUA-BRAc)(第Ⅲ部分)加到含有麻仁球蛋白的离心管。把该溶液放氮气箱中在室温下稳定6小时。然后将其转到SPectropor 2透析管透析两次,每次都对4升水透析8小时。整个样品冷冻干燥,其中一小部分备用作氨基酸分析。
结果:赖氨酸0.105毫微克分子/毫克;
SCMHC 0.003毫微克分子/毫克,它提供在蛋白和多糖间的一个共价结合。
例8
无乳链霉菌(STREPTOCCS·AGALACTIAE)(STREPB-TYPEⅢ)多聚糖-脑膜炎双球菌B血清型外膜蛋白结合物的制备。
Ⅰ:步骤B(Ⅲ)四一(正)丁铵盐的制备
把步骤B(Ⅲ)多聚糖(基本上根据Carlo等人的美国专利号4.413.057所述方法制备)溶在4毫升水中,通过一个7毫升的以四丁铵盐形式的Dowex50x8(200-400目)的阳离子交换树脂柱。用水洗脱柱,用Ceiv(so)/H SO法检测每3毫升收集液中有机物质的含量。选择适当收集液,将其冷冻干燥,最后得到100毫克的步骤B(Ⅲ)多聚糖的四-(正)丁铵盐。
Ⅱ:多聚糖-丁二胺加合物(Strep B(Ⅲ)-Bu A2)的制备
把50毫克的Strep B(Ⅲ)四丁铵盐悬浮在2.5毫升的干二甲基酰胺,搅拌约10分钟,直至全部溶解。把5毫克的1.1-碳酰二咪唑一次加入,该液在室温下保存35分钟。然后再加入3毫升的含8毫克1.4-丁二铵二氯化物的溶液,该溶液加入前用2.5克当量氢氧化钠调PH至10.3,并在冰浴中冷却。得到的混合液放置在冰浴中15分钟,再在室温下放置15分钟。
把混合液在4升0.1M的磷酸盐缓冲液(PH7)中透析三次,分别透析5小时,17小时和7小时。最后再在4升水中透析18小时,然后冷冻干燥,最后得到32毫克的Strep B(Ⅲ)丁二胺加合物(Strep B(Ⅲ)-Bu A2)。荧光测胺结果含胺212毫微克分子/毫克。
Ⅲ.多聚糖一丁胺溴乙酰胺(Strop B(Ⅲ)-Bu A-Br Ac)的制备:
把26.8毫克Strep B(Ⅲ)Bu A2溶解在2.5毫升的PH9的硼酸缓冲液,把溶在0.4毫升乙腈的28毫克对一硝基苯溴乙酸加入。在4℃下搅拌该混合液23.5小时,然后在30升水中,4℃下透析17小时。再在水中透析6小时。冷冻干燥得到27毫克的Strep B(Ⅲ)-Bu A2-Br Ac。荧光测胺结果含胺35毫微克分子/毫克而含溴乙基177毫微克分子/毫克。通过速率比浊法测定所得物质完全是抗原性的。
Ⅳ,Strep B(Ⅲ)-Bu A2-Br Ac与功能化的脑膜炎双球菌膜蛋白(NMP)结合
A.NMP的功能化:
把10毫升NMP溶液(5毫克/毫升)装入聚碳酸酯防漏离心管,在4℃下,用BecKman 75Ti转头,以43.000转/分的转速,离心2小时。除去上清液,把沉淀重悬在4毫升的PH为11.3的硼酸缓冲液。缓冲液内含33.6毫克的乙二胺四乙酸二钠盐,6.4毫克的二硫苏糖醇。悬浊液用Dounce均浆器均浆,然后将其放在离心管中,用血清封住,抽气,注氮,再加入55毫克N-乙酰高半胱氨酸丙硫酮。将这混合液于室温在氮气中稳定18小时。用2.6毫升1克分子的磷酸二氢钾和2.6毫升0.1克分子的磷酸缓冲液把PH调至7.25(在氮气条件下),再把其转移到离心管(氮气下),然后如上述离心(4℃,用Ti 75转头,以43.000转/分离心2小时)。除去上清液后把沉淀悬浮在10毫升的PH8的0.1克分子的磷酸缓冲液。(如上在Dounce均浆器中均浆)。再如上述离心一次,把沉淀在悬浮在4毫升PH8的缓冲液中,得到的溶液通过硫滴定证实其含有5.6微克分子的-SH。一个对照试验表明这是由于其中含硫的蛋白和其它小分子,例如:水解了的硫内酯)不存在了。
B,结合和纯化:
在上述得到的4毫升悬液中加入24毫升Strep B(Ⅲ)-Bu A2-Br Ac和室温条件下,在氮气中稳定的混合液。把其转移到容积10毫升的聚碳酸酯离心管,用水封顶。按上述条件离心后,沉淀再重悬在10毫升水中,再离心一次,最终沉淀重悬在15毫升水中,悬液含蛋白2.7毫克/毫升,多聚糖0.263毫克/毫升。
SCMHC/赖氨酸为0.044
例9
大肠杆菌K1,夹膜多聚糖的制备:(Escherichia Coliki)
按种和种子培养
把一小瓶大肠杆菌K,株(Escherichia Coli K)(从约翰·卢宾斯博士Dr John Robbins处得到,BOB)化开,用大约1毫升胰酶解酪蛋白-hysoy-葡萄糖(THG)介质将其稀释。在进行发酵前一天把菌种在胰酶解酪蛋白-大豆-琼脂斜面上划线接种,在37℃保温培养一夜,把这段时间产生的生长物取出,悬浮在1升的THG培养介质中。
THG培养介质如下步骤制备:取9.5升A溶液在121℃下高压灭菌90分钟,然后使其冷却,加入500毫升B溶液,B溶液在加入前也要在121℃下单独高压灭菌30分钟。
A溶液
a.胰酶解酪蛋白-大豆-肉汤(BBL) 300克
b.Hysoy(Sheffield) 100克
c.酚红 90毫克
d.UCON LB-625防泡沫剂(Union Carbide) 10毫升
c.蒸馏水
使其总体积为9.5升。
B溶液
a.葡萄糖(脱水) 50克
b.蒸馏水。 加的量使溶液最后体积达500毫升
发酵:
从琼脂斜面取菌种到1升的THG培养液,将其放在2升的锥形瓶中,37℃下以200转/分速度摇动培养(细胞生长期间检测)。然后把这1升培养物接种到10升THG,在14升容积的New Brunswick Scient-ific发酵罐中发酵。培养条件:气流为2升/分钟;摇速200转/分。用10%氢氧化钠调整PH至6.8-7.4,并使其保持6个小时。这时光密度将达到与种液同样的读数。
收获和澄清:
上述的发酵肉汤转移到含六癸基三甲胺溴化物的容积为5加仑的塑料瓶(肉汤中六癸基三甲胺溴化物最终浓度为0.3%重量/体积),在4℃下静置4小时后,六癸基三甲胺溴化物沉淀的多聚糖出现。肉汤可作为样品纯化贮存,将其放在实验室用Sharples离心机以大约30,000转/分速度离心20分钟,除去上清液细胞沉淀(大约66克)备用作以后的分离。
制备悬液和萃取:
把三批发酵产生的沉淀物分别悬浮在400毫升1.0克分子的氯化钙溶液中,然后放置在omnimixez混合器中萃取。把它们浸在冰-水浴中30分钟,把混合器速度放置2处,把三份合起来。
用25%酒精沉淀除杂质:
把373毫升的无水酒精逐滴加入到前步得到的1130毫升的氯化钙悬液(终浓度为25%酒精),搅拌。混合液在4℃下静置过夜。在Beckman J-21 B离心机中以11,000×g转速,在4℃下离心30分钟以得到沉淀,除去该沉淀。
用75%酒精沉淀法收集多聚糖提取物:
把2560毫升无水酒精逐滴加入1280毫升前一步得到的上清液,搅拌。混合液在4℃下静置过夜以保证多聚糖提取物能充分沉淀。
回收粗多聚糖:
把过夜后产生沉淀的混合液在Beckman-21 Bunit离心机以11,000×g转速,在4℃下离心30分钟以回收不溶的沉淀物。用大约200毫升无水酒精洗一次,再用大约200毫升的丙酮洗一次。除去洗液,把不溶性产物在内装脱水氯化钙的真空干燥器中在4℃下干燥,得产物4.6克。
酚萃取和透析:
把4.6克粗多聚糖悬浮在400毫升0.488克分子的醋酸钠中,PH6.9,用Dounce均浆器使其完全溶解,溶液浓度为11.5毫克/毫升将该溶液分别用200毫升酚的水溶液萃取三次。酚水溶液如下程序制备:把180毫升的0.488克分子的醋酸钠(PH6.9)加到容积1磅的一瓶马林克罗特结晶酚中去(Mallincrodt),直至酚完全在溶液中溶解。第一次酚萃取后将其放在离心机中以11,000×g,4℃下离心30分钟,吸出水相,放入酚溶液,进行第二次,第三次采取。酚相(油相)除去。
将水相在4℃下透析24小时,随着玻璃蒸馏水的变化最后透析比率大于1∶100,000。
用75%酒精沉淀法收集多聚糖:
把7.6毫升2克分子的氯化钙加入305毫升的上述透析液中,溶液中氯化钙终浓度为0.05摩尔。再把938毫升的无水酒精逐滴加入溶液,加入过程快速搅动(最后酒精浓度为75%)。在4℃下静置过夜,用Beckm-an unit离心机在11,000×g和4℃下离心30分钟。然后用大约200毫升的无水酒精洗一次,再用200毫升丙酮洗一次,在装有无水氯化钙的真空干燥器中4℃下干燥,得产物1.7克。
超速离心:
把这1.7克多聚糖溶在170毫升的0.05克分子的氯化钙溶液中,18.9毫升无水酒精在搅动条件下逐滴加入,把该溶液在100,000×g,4℃离心两小时。
收集产品:
把得到的180毫升上清液除去,逐滴加入468毫升无水酒精(终浓度75%),滴入时搅动从而使多聚糖更好地沉淀。把其在4℃下静置过夜以保证沉淀完全,4℃下以11,000×g离心30分钟收集产品,用200毫升无水酒精洗一次,再用200毫升丙酮洗一次。在装有无水氯化钙的真空干燥器中4℃下真空干燥,得产品1.46克。
超速离心:
把1.46克上述多聚糖溶解在150毫升的0.05克分子的氯化钙溶液中,用50毫升无水酒精在快速搅动下逐滴加入该溶液(酒精终浓度为25%),把该液在4℃下以100,000×g离心两小时。
收集最终产品:
把得到的190毫升上清液除去,190毫升无水酒精边搅动边逐滴加入(酒精终浓度为50%)。将其在4℃下静置过夜以保证沉淀完全。在Beck-man J-21B离心机中4℃下以11.000×g离心30分钟。用200毫升酒精洗一次,再用200毫升丙酮洗一次,在装有无水氯化钙真空干燥器中,4℃下干燥,得到1.2克终产品。
例10
制备大肠杆菌K1(E Coli K1)荚膜多聚糖-脑膜炎双球菌(N·Meningitidis)B-血清型外膜蛋白结合物。
Ⅰ.制备大肠杆菌K1多糖的四-正-丁铵盐:
把103毫克大肠杆菌K1多糖(例9方法制备出的)溶解在2毫升水中,把该溶液装进一个4毫升的Dowex 50×8柱(200-400目,以四-正-丁胺形式。)用水洗脱柱,每3毫升收集一瓶样品,用Ce(Ⅳ)(So4)/H2SO4法测定其有机物含量。收集有用样品,将其冷冻干燥,产品在装有P2O5的干燥器中干燥得到134毫克与前述制备相似的四丁铵盐,用氢核磁共振(HNMR)分析,得到四-正-丁铵离子的粗略化学计算量。
Ⅱ.制备多聚糖-丁二胺加合物(E·Coli Kl-Bu A):
把134毫克在Ⅰ中制备的盐溶解在3毫升干燥,抽气了的二甲酰胺,搅拌12分钟。再加12.7毫克的1,1-碳酰二咪唑,搅动该溶液30分钟再加6毫升含145毫克1.4-丁二胺二氯化物的用冰冷却的水溶液,用2.5克当量氢氧化钠把PH调至10.35,在冰浴中搅动该溶液15分钟,再在室温下搅动20分钟。然后在4升0.1克分子的磷酸缓冲液(PH=7)中透析三次,分别透析5.5小时,16小时和3.75小时。最后在4升水中透析4.5小时。冷冻干燥,得到73毫克的E·Coli Kl-Bu A2。荧光测胺试验结果含胺180毫微克分子/毫克。
Ⅲ.制备多聚糖-丁二胺-溴乙酰胺(E·Coli Ki-Bu A-Br Ac)
把68毫克E·Coli-Kl-Bu A2溶解在6.7毫升PH9的硼酸缓冲液,再加70毫克溶在1.5毫升乙腈中的对一硝基苯溴乙酸盐。混合液静置在4℃下19小时,在32升水中透析8小时,再在4升水中透析13小时。然后将其冷冻干燥得74毫克的E·Coli Ki-Bu A2-Br Ac。荧光测胺试验结果含有胺50毫微克分子/毫克,而含溴乙酰基120毫克分子/毫克。
Ⅳ.E·Coli K-BuA2-Br Ac与功能化的脑膜炎双菌膜蛋白(NMP)结合
功能化的NMP制备方法与例8第Ⅳ-A部分一样。向含4毫升硫醇化NMP蛋白(Ellman试验含9微克分子-SH)的离心管加入25毫克E·Col Ki-Bu A2-Br Ac(溴乙酰含量为120毫微克分子/毫克)。离心管用清蛋白封住,抽气,加氮气,稳定18.5小时。然后用6毫升PH8的缓冲液稀释,在4℃下,43,000转/分用Ti75转头离心2小时。除去上清液。把沉淀重悬在10毫升的pH8缓冲中用Dounce均浆器均质,再如上述离心一次。把这次离心后所得沉淀悬浮在10毫升水中,如上述进行第三次离心。沉淀再重悬在20毫升水中。
分析这结合物结果是:
多聚糖浓度 蛋白质浓度 多聚糖/蛋白质
336微克/毫升 1000微克/毫升 0.34
SCMHC/赖氨酸为0.015
Claims (28)
1、把有酸性基团的细菌荚膜多聚糖和免疫原蛋白通过含如下式的硫醚键双属间隔基结合制备多聚糖-蛋白质结合物的方法,A-E-S-B其中E是
,R是H或-CH3;A是
Y(CH2)nNH-;这m是0到4;n是0到3;W是0或NH;Y是CH2,O,S,NR′或CHCO2H;这里R′是H或C1-或C2-的烷基;如果Y是CH2,那么m和n二者不能都为O或S,n也是大
该方法包括下列步骤:
(1)有酸性基团的细菌荚膜多聚糖通过下列步骤加溶:
(i)用大的疏水阳离子取代多聚糖的酸性基中的氢,生成多聚糖的盐;然后
(ii)把多聚糖的盐溶在不含水,极性的质子惰性溶剂;
(2)用一种双功能试剂活化多聚糖;
(3)把这种活化的多聚糖与一个双一亲核试剂反应;
(4)把这已与一种双-亲核试剂反应了的活化的多聚糖与一种产生亲电子部位的试剂反应,从而与侧面亲电子部位生成一种多聚糖。
(5)使免疫蛋白单独地与一种产生硫醇基的试剂反应,与侧面硫醇基生成一种蛋白;然后
(6)通过超速离心法把含有侧硫醇基的蛋白中分子量低的硫醇除去;然后
(7)使具侧面亲电子部位的多聚糖与具侧面硫醇基的蛋白质反应,生成一种多聚糖-蛋白质结合体,它是通过共价的硫醚键使二者连接的,然后
(8)把混合液离心,以除去非共价联结的多聚糖和蛋白质。
2、根据权利要求1所述方法,其中所用具酸性基团的细菌荚膜多聚糖是从流感嗜血杆菌(Haemophilus influonzae)b型多聚糖和肺炎球菌(Streptococcus pnenmoniae)6B型,19F型和23F型多聚糖中选择的。
3、根据权利要求1所述方法,其中所用免疫原蛋白是脑膜炎双球菌B血清型外膜蛋白或麻仁球蛋白。
4、根据权利要求1所述方法,其中所用含酸性基团的细菌荚膜多聚糖是流感嗜血杆菌b型多聚糖,免疫原蛋白是脑膜炎双球菌B血清型外膜蛋白,它们是通过下式双属间隔基联结的:
8、一种加溶含有酸性基团的多阴离子多聚糖的方法,它包括:
(1)用大的疏水阳离子代替多聚糖中酸性基团的氢,以使多聚糖呈盐的形式,然后
(2)把以盐形式的多聚糖溶在不含水的极性的质子惰性溶剂。
9、一种根据权利要求8所述的方法,其中大的疏水阳离子是从含有三或四(C-C)烷基-铵,1-氮杂双环(2.2.2)辛烷和1,8-二氮杂双环(5.4.0)十一烷-7-烯的一组物质中选择的。
10、一种根据权利要求9所述的方法,其中的不含水的极性的质子惰性溶剂是从含有二甲基甲酰胺,二甲基亚砜,二甲基乙酰胺,甲酰胺和N,N′-二甲基咪唑啉酮的一组物质中选择的。
11、一种根据权利要求9所述的方法,其中大的疏水阳离子是四-正-丁胺;而不含水,极性的质子惰性溶剂是二甲基甲酰胺。
12、一种共价修饰多阴离子多聚糖的方法,它包括:
(1)把多聚糖加溶到不含水,极性的质子惰性溶剂之中;
(2)用双功能剂活化多聚糖,然后(3)把这个活化了的多聚糖与一个双-亲核试剂反应。
13、一种根据权利要求12所述的方法,也包括把一个已经与一个双-亲核试剂反应了的活化的多聚糖再与一些能产生侧部亲电子部位的试剂反应。
14、一种根据权利要求13所述的方法,其中不含水,极性的质子惰性溶剂是从含有二甲基甲酰胺,二甲基亚砜,二甲基乙酰胺和N,N′-二甲基咪唑酮的一组物质中选择的。
15、一种根据权利要求14所述的方法,其中不含水的,极性的质子惰性溶剂是二甲基甲酰胺。
17、一种根据权利要求16所述的方法,其中双功能试剂是碳酰二咪唑。
18、一种根据权利要求13所述的方法,其中的双-亲核剂是具H2N(CH2)mY(CH2)nNH式的二胺,其中m是0到4,n是0到3,Y是CH2,O,S,NR′,CHCO2H,这里R′是H或一个C1-或C2-烷基,如果Y是CH2,那么m和n不能都是零,如果Y是O,S,那么m大于1,n也大于1。
19、一种根据权利要求19所述的方法,其中双-亲核剂是1,4-丁二胺。
21、一种根据权利要求20所述的方法,其中产生亲电子部位的试剂是对一硝基苯酚溴乙酸盐。
22、一种根据权利要求1所述方法;其中大的疏水阳离子是四-正-丁胺,不含水极性的质子惰性溶剂是二甲基甲酰胺,双功能试剂是碳酸二咪唑,双-亲核试剂是1,4-丁二胺,产生亲电子部位试剂是溴乙酸盐。
23、一种根据权利要求1或22或所述的方法,其中产生硫醇基试剂是N-乙酰基高半胱氨酸硫内酯。
24、一种证实在多聚糖-蛋白结合物的多聚糖和蛋白之间含有一个硫醚键的间隔基的双属部分间存在一个共价键的方法。其步骤包括:
(1)水解结合物,在肽键和其它水解不稳定键切断该结合物。
(2)定量测定对水解稳定的,含硫醚的间隔基。
27、一种根据权利要求1所述方法,其中为了消除结合物质过分的亲电子活性,多聚糖-蛋白结合物与小分子量硫醇反应。
28、一种根据权利要求27所述的方法,其中低分子量的硫醇是n-乙酰半胱胺。
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