JP2001518556A - イミン形成ポリサッカライド、その調製、ならびにアジュバントおよび免疫刺激剤としてのその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、以下を含有するポリサッカライド結合体に関する：抗原呈示細胞に存在する表面レセプターに結合するポリサッカライドであって、直接的または二官能性リンカーを介して共有結合する安定なカルボニル基を有する１つ以上の化合物に結合するポリサッカライド。この結合体は、免疫刺激剤およびアジュバントとして有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

（発明の背景） （発明の分野） 本発明は、新規のポリサッカライド誘導体、その調製、ならびにワクチンおよ
び免疫刺激組成物におけるその使用に関連する。アジュバントは、抗原呈示細胞
（ＡＰＣ）によって認識されるポリサッカライドの誘導体である。

【０００１】 （関連分野） アジュバントは、免疫系を活性化し、予防的および治療的ワクチンの効力を増
加することにおける有用性を有する。免疫アジュバントは、以下の適用を有する
：（１）感染およびガンに対して抵抗性の宿主の非特異的刺激、（２）予防的ワ
クチン免疫原性の増強、および（３）治療的ワクチン免疫原性の増強。これらの
アジュバントは、細胞媒介性免疫応答（Ｔ細胞応答、遅延過敏症）、液性応答（
Ｂ細胞応答、抗体産生）、またはその両方を優先的に増強し得る。液性免疫の刺
激は、細菌感染の予防、いくつかのウイルス感染、ならびに循環系ガンの治療に
おいて重要である。細胞性免疫は、固形腫瘍ガン治療およびいくつかのウイルス
性疾患について主に重要である。

【０００２】 外来の因子または抗原（例えば、ウイルス、細菌、または寄生虫）による初期
の刺激の後に、免疫系は、再度の曝露の際に、通常、促進された応答をともなっ
てその因子を認識しそして反応する。この増強された応答は、疾患の予防のため
のワクチン接種の、非常に大きな成功にとっての基礎を形成する。しかし、外来
抗原に対する初期の免疫応答は、完全な応答のために数日間を必要とする。この
初期の応答は、高度に病原性の生物による感染に対する防御については、十分で
はない。より早い防御免疫応答を達成する方法は、病原（通常、弱毒化または死
滅している）を用いるワクチン接種または免疫による。しかし、多くの場合にお
いて、死滅した微生物または純粋な抗原を用いる免疫は、生成される細胞媒介性
免疫が弱いかまたは全くない、短期間の不十分な免疫応答を励起する。多くの場
合において、この不十分な免疫応答は、抗原調製物に対するアジュバントの添加
によって改変され得る。マンノース（例えば、マンナン）、β（１，３）グルコ
ース（例えば、グルカン）、β（１，４）アセチル化マンノース（アセマンナン
）、β（１，４）Ｎ−アセチルグルコサミン（キチン）のいくつかのポリサッカ
ライド（炭水化物ポリマー）、およびヘテロポリサッカライド（例えば、ラムノ
ガラクツロナン（ペクチン））が、免疫系を刺激することが示されている。抗原
呈示細胞（ＡＰＣ）は、これらのポリサッカライドおよび他のポリサッカライド
の糖部分を認識しそして結合する、特異的細胞表面レセプターを有する。抗原呈
示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞およびいくつかのマクロファージ）は、抗
原の取り込み、およびエンドリソゾームにおけるその抗原の小ペプチドへのプロ
セッシングを担う。プロセスされた抗原は、クラスＩＩ ＭＨＣと共にＡＰＣの
表面に発現する。特に、反応性Ｔ細胞は、抗原とクラスＩＩ ＭＨＣとを同時に
認識し、クラスＩＩ ＭＨＣに限定された免疫応答を生じる。Ｂ細胞は、プロセ
スされた抗原によって刺激され、抗体を産生する。これらＡＰＣ表面レセプター
（例えば、マクロファージマンノースレセプターおよび樹状細胞由来のそのホモ
ログのレセプターＤＥＣ−２０５）は、エンドサイト−シスを媒介する膜貫通タ
ンパク質であり、そして明らかに抗原呈示のプロセスにおいて役割を担う（Ｓｔ
ａｈｌ、Ｐ．Ｄ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｉｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ ４：４９（１９９２）；Ｊｉａｎｇ、Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３７５：
１５１（１９９５））。これらのポリサッカライドのそのようなレセプターへの
結合は、食作用、増殖応答、サイトカインの放出、および他の免疫系の活性にお
ける増加によって示されるように、免疫刺激を明らかに誘導する。この免疫刺激
活性のために、これらのポリサッカライドは、ワクチンアジュバントとして提唱
されている。

【０００３】 ポリサッカライドアジュバントは、サイトカイン産生を改変することにより（
例えば、ＩＬ−１のアップレギュレート）、免疫調節効果を発揮し、そして中程
度のＴｈ１応答を生じる。ＣＤ４⁺Ｔ細胞のＴｈ１サブセットによって生じた免 疫応答は、補体結合抗体ならびに、γ−ＩＦＮ、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２に
関連する強力な遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応を誘導する。ネイティブのタンパク
質のコンフォメーションに対するポリサッカライドの効果は、中程度であり、中
和抗体応答を励起するのに必要なコンフォーメーションのエピトープを保持する
。しかし、これらアジュバントは、外来の抗原が内在性の経路を介してプロセス
されることを許容し得ないので、これら外来の抗原は、細胞傷害性Ｔリンパ球（
ＣＴＬ）応答を誘導し得ない。ＡＰＣは特定の糖部分に対して特異的な細胞表面
レセプターを有するので、これら糖部分に関連する抗原の、これらの細胞への標
的化および送達は、有意に増強され得る。明らかに、抗原送達の標的化における
糖部分の役割は、ポリサッカライドアジュバントに限定されない。例えば、過ヨ
ウ素酸酸化によるキラヤサポニン（ｑｕｉｌｌａｊａｓａｐｏｎｉｎ）糖側鎖の
修飾は、そのアジュバント性の喪失をもたらす。おそらく、この結果は、その標
的化能力の喪失による。

【０００４】 特定のポリサッカライドのアジュバント特性は、しばらく公知であったが、そ
の使用は、専ら研究適用に限定されていた。例えば、グルカンが、マウスにおい
て抗腫瘍応答を誘導し、急性敗血症に対する予防効果を有することが示されてい
る。これらの効果は、グルカンの分子量およびその分岐の程度に依存する。マン
ナンは、アジュバント活性を有する他のポリサッカライドであり、おそらく、マ
クロファージマンノース細胞表面レセプターへの結合の後にその効果を表す。近
年、酸化条件下での、タンパク質抗原のマンナンへの結合が細胞媒介性免疫応答
を生じることが、示されている（Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ、Ｖ．ら、Ｖａ
ｃｃｉｎｅ １４：９３０（１９９６））。しかし、非酸化条件下で（すなわち
、アルデヒド形成をともなわない）マンナンへの結合されたタンパク質抗原は、
液性免疫のみを誘起する（Ｏｋａｗａ、Ｙ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ
．１４２：１２７（１９９２））および（Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ、Ｖ．
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、 ９２：１０１２８（１
９９５））。Ｔ細胞免疫の刺激はまた、実験条件下でガラクトースオキシダーゼ
を用いて、細胞表面ポリサッカライドのガラクトシル残基においてアルデヒドを
生成することによって、達成されている（Ｚｅｎｇ、Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２５６：１５６０（１９９２））。しかし、この免疫刺激は、再現性がなかった
（Ｒｈｏｄｅｓ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １７：４３６（１９９６）
）。これらの結果は、アルデヒドの不安定性および／または酵素的酸化によるア
ルデヒドの不十分な生成に関連する問題を強調する。

【０００５】 新しいそして効果的なアジュバントを有することは、ワクチン産業にとって、
臨床的そして経済的に重要である。抗原呈示細胞を標的し、そしてＴ細胞免疫を
刺激する同時刺激性シグナルを提供する新しいアジュバントの開発は、本願特許
の開示の目的である。

【０００６】 （発明の要旨） 本発明は、：（ｉ）抗原呈示細胞（ＡＰＣ）の細胞表面に結合し得るポリサッ
カライド、および（ｉｉ）安定なカルボニル基を有する１つ以上の分子（すなわ
ち、アミノ基と反応しイミンまたはシッフ塩基を形成し得る、アルデヒド基また
はケトン基）を含む化学結合体（本明細書においてポリサッカライド結合体とい
う）に関し、ここで分子（ｉｉ）は、（ｉｉｉ）直接的共有結合によってか、ま
たは二官能性リンカーを介して共有結合的に、安定なカルボニル基をインタクト
に保つ様式においてを介して、ポリサッカライド（ｉ）に対して結合する。イミ
ン形成カルボニル基を有する分子は、芳香族または非芳香族の環状、芳香族また
は非芳香族の複素環式または非環状化合物であり得る。好ましくは、芳香族また
は複素芳香族ケトンおよびアルデヒドは、分子（ｉｉ）として使用される。

【０００７】 本発明の第２の局面において、安定なカルボニル基（すなわち、アミノ基と反
応しイミンまたはシッフ塩基を形成し得る、アルデヒド基またはケトン基）を有
する１つ以上の分子は、直接的にまたは二官能性リンカー分子を介してのいずれ
かで、非アジュバント糖抗原に対して共有結合し、非アジュバント糖抗原に内在
性のアジュバント性を提供する。安定なカルボニル基を有する１つ以上の分子の
、この糖抗原に対する結合は、非結合性の糖抗原と比較して、予防性ワクチン接
種の増加した効果を有する産物を生じる。

【０００８】 本発明は、哺乳動物における免疫応答の増強の程度を強めることに関し、これ
は、本発明の有効量のポリサッカライド結合体を投与して、１つ以上の抗原に対
する哺乳動物の免疫応答を増強する工程を包含する。

【０００９】 本発明はまた、ワクチン接種の方法に関連し、これは１つ以上の抗原、および
本発明のポリサッカライド結合体を投与する工程を包含する。

【００１０】 本発明はまた、薬学的組成物および獣医学的組成物に関し、これは、本発明の
１つ以上のポリサッカライド結合体、および１つ以上の薬学的に受容可能な希釈
剤、キャリアまたは賦形剤を含有する。これらの組成物は、動物またはヒトにお
ける免疫強化剤として使用され得る。

【００１１】 本発明はまた、１つ以上の抗原、および本発明のポリサッカライド結合体を含
有するワクチンに関する。

【００１２】 （発明の詳細な説明） 本発明は、以下を含む複合ポリサッカライドに関する： （ｉ）抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に結合し得るポリサッカライド；および （ｉｉ）安定なカルボニル基を有する１つ以上の分子（すなわち、「イミン形
成化合物」ともいわれる、イミンまたはシッフ塩基を形成するアミノ基と反応し
得るアルデヒド基またはケトン基）； ここで、ポリサッカライド（ｉ）は、（ｉｉｉ）直接の共有結合を介してか、
または上記１つ以上の分子（ｉｉ）と二官能性リンカーの残基を介して、共有結
合している。イミン形成性カルボニル基を有する化合物は、芳香性環式もしくは
非芳香性環式、芳香性ヘテロ環式もしくは非芳香性ヘテロ環式または非環式化合
物であり得る。好ましくは、芳香環式もしくはヘテロ芳香環式ケトンまたはアル
デヒドが（ｉｉ）として用いられる。

【００１３】 本発明の局面をより明白に説明するために、複合ポリサッカライドは、以下の
式Ｉによって表され得る： Ｐ−（Ｌ−Ｉ）_x Ｉ またはその薬学的に受容可能な塩であって、ここで Ｐは、抗原提示細胞の細胞表面に結合し得るポリサッカライド； 各Ｌは、独立して、共有結合または二官能性連結分子の残基である； 各Ｉは、イミン形成性分子である。好ましいイミン形成性分子は、（ａ）ケト
ン官能基またはアルデヒド官能基；および（ｂ）存在する場合このポリサッカラ
イドもしくはこの二官能性連結分子上に存在する補完性官能基と反応し得る第二
の官能基を有する環式もしくはヘテロ環式の化合物の残基であり；そして ｘは、１以上である。ｘの値は、そのポリサッカライド上で共有結合的に改変
されている反応基の数によって決定される。多数の因子およびストラテジーが、
本明細書においてより充分詳細に記載されるようにｘの値に影響を与える。一般
的に、ｘは、ポリサッカライド上に存在する、反応性ヒドロキシル、末端ヘミア
セタール、カルボキシル、および/またはアミン基の数の関数である。有用なポ リサッカライド（Ｐ）の多様な分子量分布のために、ｘによって表現される改変
の程度は、１００のグリコシル残基あたりに導入されたイミン形成基の数として
表現される。この決まりを用いると、ｘの値は、１００グリコシル残基あたり、
１から１００を超えるイミン形成残基に及び得、好ましくは、１〜約５０のイミ
ン形成残基に及び得る。

【００１４】 イミン形成分子の比は、使用される結合体化ストラテジーに依存して広汎に変
動する。この比の制御を本明細書においてさらに記載する。

【００１５】 このポリサッカライドの遊離のヒドロキシル末端ヘミアセタール、カルボン酸
、またはアミン基を使用して、ポリサッカライド（Ｐ）を（Ｌ）または（Ｉ）の
いずれかに共有結合する。ポリサッカライドに存在する１つ以上のこれらの反応
基は、まず「活性化」（本明細書においてさらに記載されるように）されて、こ
れらの基の反応性を増大させるかまたはポリサッカライドが「活性化」官能基を
有するイミン形成化合物と反応され得る。

【００１６】 本発明のさらなる局面は、カルボニル基を有する１つ以上の化合物を含む結合
体に関する。ここで、この化合物は、非アジュバント炭水化物抗原に、直接また
は二官能性連結分子の残基を介するかのいずれかによって共有結合してない院生
のアジュバント活性を非アジュバント炭水化物抗原に提供する。この炭水化物抗
原に対するイミン形成分子の結合体は、その炭水化物抗原単独と比較して、予防
ワクチン摂取の効力が増加した生成物を生じる。炭水化物抗原は、ポリサッカラ
イドを含み、これには、ワクチン抗原として使用されるｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、および他の細菌由来のリポポリサッカラ
イドおよびペプチドグリカンが含まれる。

【００１７】 （ポリサッカライド） 本発明の結合体を形成するために使用され得るポリサッカライドは、ＡＰＣ上
の細胞表面レセプターに結合する天然または化学改変された任意のポリサッカラ
イドを含む。本発明の目的のために有用なポリサッカライドは、最小限２つのサ
ッカリド、好ましくは７以上のサッカリドを含み、そして分岐していないかまた
は分岐しており、そして約１０００から数百万ダルトンまでの分子量を有し得る
。好ましいポリサッカライドは、約１，０００から約５００，０００の分子量を
有する。このポリサッカライドは、本明細書において記載されるような化学改変
を有し得る。

【００１８】 用語「抗原提示細胞」または、その略称「ＡＰＣ］は、本発明の目的のために
、抗原を取り込み、それらを小ペプチドへとプロセシングし、そしてクラスＩＩ
ＭＨＣとともにＴ細胞およびＢ細胞に対する提示のためにそれらの表面上にそ
れらを発現することを担う樹状細胞およびマクロファージを意味する。

【００１９】 進化の間、マクロファージおよび樹状細胞は、異なる微生物から炭水化物部分
を認識する細胞表面レセプターを発達させた。これらのレセプターは、食作用お
よび飲作用という、抗原提示に関与する２つのプロセスにおいて重要な役割を果
たす。これらの細胞表面レセプターによって認識されるポリサッカライドは、こ
れらのアジュバントの構築のために適している。なぜなら、このようなポリサッ
カライドは、ＡＰＣ標的化のために有効な機構を提供するからである。いくつか
の場合、細菌、真菌および動物起源の炭水化物配列は、植物ポリサッカライドに
よって共有される。従って、植物ポリサッカライドは、いくつかの場合、出発物
質の実際の供給源を提供し得る。これらのアジュバントは、可溶性または不溶性
のポリサッカライドのいずれかによって調製され得るが、可溶性形態が好ましい
。

【００２０】 本開示の適用は、植物ポリサッカライドに限られるわけでは全くない。これら
は、ＡＰＣ表面レセプターによって認識される、異なる供給源由来の他の炭水化
物含有化合物にまで拡張され得る。これらの他のポリサッカライドの例は、キチ
ンおよびデキストランであって、これらは、それぞれ動物および細菌起源である
。適切な炭水化物含有化合物の例は、細菌のテイコイン酸およびそれらの誘導体
、細菌のリポポリサッカライド、リピドＡおよびそれらの誘導体である。

【００２１】 最後に、イミン形成性カルボニル基を有する化合物と、非アジュバント性の炭
水化物含有産物との結合体は、これらの産物の内因性アジュバント活性を提供す
ることにおいて、および予防免疫の効力を増加するために有用であることが意図
される。これらの産物の例は、ワクチン抗原として使用されている、ｓｔｒｅｐ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、および他の細菌由来のポリ
サッカライドが含まれる。

【００２２】 本発明において有用である好ましいポリサッカライドの中には：βグルカン；
マンナン；ペクチン；および２−アセトアミドグルカンがある。これらのポリサ
ッカライドの水溶性誘導体を含む誘導体もまた有用である。仮特許出願第６０／
０８３，１０６号（これは、本明細書において全体が参考として援用される）を
参照のこと。好ましいポリサッカライドは、下記にてより詳細に記載される。

【００２３】 βグルカン。βグルカンは、（１→６）連結によって結合されたβ−Ｄ−グル
コピラノシル単位を有する、（１→３）連結β−Ｄ−グルコピラノシル単位の骨
格鎖を有する。これらは、いくつかの供給源、例えば、酵母、真菌、藻類、およ
び穀物において見い出されている。それらは、広汎な分子量（すなわち、５，０
００〜５００，０００超）を有し、これは、それらの免疫調節特性に影響を与え
る。一般に、水に比較的不溶性である高分子量のβグルカンは、より高い生物学
的活性を有する。しかし、溶解性のこの欠如は、グルカンの全身投与を不可能に
する。これらのポリサッカライドのアニオン基（例えば、ホスフェート、サルフ
ェート、カルボキシルなど）の導入による改変によって、それらの生物学的活性
を見かけ上維持する可溶性形態が得られている。可溶性グルカンは、以下の手順
の１つによって調製され得る：ｉ）酵母抽出物からの単離（ＨａｈｎおよびＡｌ
ｂｅｒｓｈｅｉｍ、１９７８、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．６６：１０７）、
ｉｉ）グルカン粒子の超音波処理（Ｊａｎｕｚら、１９８６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１３７：３２７、ならびに、ｉｉｉ）スルホン化、リン酸化、カルボキシメ
チル化、または硫酸化による不溶性のグルカンへのアニオン基の導入（（Ｂｏｈ
ｎおよびＢｒＭｉｌｌｅｒ、１９９５、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍ．２８
：３）、（Ｄｉ Ｌｕｚｉｏ、米国特許第４，７３９，０４６、４／１９８８）
）。βグルカンにおいて、唯一の還元性グルコシル残基（３位に結合する）は、
（１→３）連結β−Ｄ−グルコシル残基の骨格鎖の末端に位置する。（１→６）
連結によってこの骨格鎖に結合したグルコシル残基は、遊離の還元基を有さない
。単球グルカンレセプターに結合する最も小さなフラグメントは、（１→３）連
結β−Ｄ−グルカノヘプタサッカリドである。しかし、このオリゴサッカリドは
、免疫刺激活性を有さない。

【００２４】 マンナン。マンナンは、マンノースのみからなる直鎖または分岐ポリサッカラ
イドである。マンナンは、植物、カビ、細菌、および他の生物において見い出さ
れる。特定の植物において、直鎖マンナンは、β−（１→４）連結マンノシル残
基からなる。他方、いくつかの酵母において、マンノース残基は、α（１→２）
およびα（１→６）結合によって結合される。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅ（パン酵母）由来の分岐マンナンにおいて、マンナンは、Ｏ
２原子がα−Ｄ−マンノピラノシル、α−Ｄ−マンノピラノシル−α−（１→２
）−α−Ｄ−マンノピラノシル、およびα−Ｄ−マンノピラノシルα−（１→３
）−α−Ｄ−マンノピラノシル−α−（１→２）−α−Ｄ−マンノピラノシルの
側鎖によって置換されたα（１→６）連結マンノピラノシル骨格構造からなる。
さらに、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅマンナンはまた、リン酸化され得る（Ｂａｒ
ｒｅｔｏ−ＢｅｒｇｔｅｒおよびＰ．Ａ．Ｇｏｒｉｎ、Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙ
ｄｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４１：６７（１９８３）、Ｖｉｎｏｇｒａｄ
ｏｖ、Ｅ．ら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３０７：１７７（１９９８））。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅマンナンが細胞媒介性免疫を刺激する能力は疑問視さ
れているが、それらは、Ｔ細胞応答を刺激するにおいてリポポリサッカライドの
作用を増強する（Ｏｈｔａ、Ｍ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６０：５０３（１
９８７））。マンナンは、マクロファージマンノース結合細胞表面レセプターに
対する結合によってそれらの免疫刺激効果を発揮し得るようである。βマンナン
の誘導体であるアセチル化β（１→４）ポリマンノースは、マンナンに類似の様
式で免疫系を刺激するようである。

【００２５】 ペクチンポリサッカライド。いくつかのペクチンポリサッカライドは、抗補体
性であり、そしてそれらは、異なる程度の免疫賦活活性を有し得る（Ｙａｍａｄ
ａ、Ｈ．ら、Ｐｌａｎｔａ Ｍｅｄｉｃａ ５６：１８２（１９９０））。これ
らのポリサッカライドの過ヨウ素酸での酸化は、古典的経路における抗補体活性
の欠失をもたらすが、代替経路における活性を増加させた（Ｙａｍａｄａ、Ｈ．
およびＫｉｙｏｈａｒａ、Ｈ．、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３（１）：１０４（１９８９））。いくらかの免疫賦活活性
を示し、従って細胞表面レセプターによって認識されるポリサッカライドは、ホ
モガラクツロナン、ラムノガラクツロナン、アラバン、ガラクタン、およびアラ
ビノガラクタンに大まかに分類され得る。しかし、これらの化合物すべてが、生
物学的活性を有するわけではない。多くの場合、この活性は、構造、分子量、凝
集状態および他のパラメーターに依存する。一般に、ペクチンポリサッカライド
は、１，４結合 α−Ｄ−ガラクトシルウロン酸残基と会合する糖ポリマーの基
である。これらのポリサッカライドは、その骨格のガラクトシルウロン酸残基に
連結されたいくつかの分岐オリゴサッカリドを有し得る。サポニンおよび他のポ
リサッカライドを用いた以前の研究から、分岐オリゴサッカリドは、アジュバン
ト活性について関連するようである。

【００２６】 ２−アセトアミドグルカン：キチン、ムレインおよびそれらの誘導体：キチン
は、β（１→４）結合によって結合された線状のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミ
ン（ＮＡＧ）ポリマーである。これは、そのＮＡＧ残基の１６％が脱アセチル化
されている。これは、天然に広範に分布する。これは、節足動物の外骨格および
真菌の細胞壁において見い出されている。このポリサッカライドは、徹底的な分
子間水素結合を形成する鎖を有し、それによって、水および異なる有機溶媒にお
いて不溶性となっている。キチンのＮアセチル基の強アルカリ処理による除去に
よって、キトサン（β（１→４）ポリ−Ｄ−グルコサミン水溶性ポリカチオン）
が得られる。そのＮアセチル基の７０％が除去されたキトサン（脱アセチル化キ
チン）は、有意な免疫刺激活性を示す（Ａｚｕｍａ，Ｉ．Ｖａｃｃｉｎｅ １０
：１０００（１９９２））。この不溶性によって課される限定を回避するために
、水中でより可溶性であるいくつかのキチン誘導体（例えば、グリコールキチン
（Ｓｅｎｚｙｕ、Ｋ．ら、Ｊ Ｊａｐａｎ、Ａｇｒｉ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２３
：４３２（１９５０））、およびこれもまた免疫刺激特性を有し得るカルボキシ
メチルキチン）が開発された。ヘプタマー以上の大きさのＮＡＧオリゴサッカリ
ドから構成される水溶性アルコール不溶性キトデキストリンは、限定された酸加
水分解によって調製された（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｌ．Ｒ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２９：５２２（１９５８））。ムレイン（細菌細胞壁の
主要成分）は、β（１→４）結合ＮＡＧからできたポリサッカライドであり、こ
れは、ＮＡＧ単位の１つが、エーテル結合によってＣ３位においてＯ乳酸基で置
換されて、反復配列ＮＡＧ−ＮＡＭを形成するＮアセチル−Ｄ−ムラミン酸（Ｎ
ＡＭ）を得る。乳酸残基のために、単離されたムレインは水溶性である。細菌細
胞壁において、ムレインは、特定のペプチドに結合して、架橋ペプチドグリカン
を形成する。それらの構造類似性のために、キチンおよびムレインは、酵素であ
るリゾチームによって認識され、そして見かけ上、マクロファージ細胞表面上の
レセプターによってもまた認識される。これらの構造的な類似性は、グリコール
キチンにもまた存在するが、キチンの免疫刺激特性およびその誘導体のいくつか
を説明し得る。

【００２７】 （安定なカルボニル基を有する分子（イミン形成性分子）） 本発明の結合体の第二のエレメントは、安定なカルボニル基を有する１つ以上
の分子（すなわち、アルデヒド基またはケトン基）である。これは、アミノ基と
反応してイミンまたはシッフ塩基を形成し得る。イミン形成性カルボニル基を有
する分子は、芳香性または非芳香性の（飽和または部分的に不飽和の）炭素環、
芳香性または非芳香性の（飽和または部分的に不飽和の）ヘテロ環、または１つ
以上の不飽和結合を有し得る非環状脂肪族化合物であり得る。

【００２８】 カルボニル基を有する特定の芳香族化合物が、特定のＴｈ細胞表面レセプター
上のアミノ基との反応に際してのイミンまたはシッフ塩基の形成において非常に
有効である証拠が存在する。芳香族化合物に結合するカルボニル基がより安定で
ある（が、脂肪族アルデヒドは一般に不安定である）ので、それらの誘導体は、
代表的に、より長い寿命を有する。さらに、カルボニル基を有する環状化合物の
疎水的な特徴は、細胞表面レセプターとポリサッカライド結合体との間の相互作
用を増強する。結果として、ポリサッカライドを改変するために使用される化合
物は、好ましくは、アリールまたはヘテロアリールアルデヒドまたはケトンであ
る。Ｔ細胞上のアミノ基に対するこれらの化合物の接近を容易にするために、そ
れらはまた、いくらかの親水性特徴も有することがより好ましい。

【００２９】 上記の全ての特性をいくらかの程度を具現化する化合物は、ポリサッカライド
の改変のための好ましい薬剤である。好ましい化合物は、モノおよびジ置換Ｃ_{6- 10} アリールアルデヒドおよびＣ_6-10アリール（Ｃ_1-4）アルキルアルデヒド、ア リール基を含む化合物（例えば、フェニルまたはナフチル）を含み、そしてホル
ミルまたはホルミル（Ｃ_1-4）アルキル置換を含む。好ましくは、これらの化合 物は、さらに、ハロ、ヒドロキシル、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_1-4ヒドロキシアルキル
、Ｃ_1-4アルコキシ、トリフルオロメチル、またはベンジルオキシのような１ま たは２のさらなる置換基を含む。適切な値は、１または２のヒドロキシルおよび
ハロによって置換された、ベンズアルデヒドおよびナフトアルデヒドを含む。例
としては、２，３−、２，４−、２，５−および３，４−ジヒドロキシベンズア
ルデヒド、５−クロロ−２−ヒドロキシベンズアルデヒド、バニリン、エチルバ
ニリン、ナリンジェリン（ｎａｒｉｎｇｅｒｉｎ）、３−ヒドロキシベンズアル
デヒドおよび４−ヒドロキシベンズアルデヒド、ならびに４−ヒドロキシフェニ
ルアセトアルデヒドが挙げられる。第二の好ましい基は、ヒドロキシ置換Ｃ_1-4 アルキル（Ｃ_6-10）アリールケトン）（例えば、２−ヒドロキシアセトフェノン
，３−ヒドロキシアセトフェノン、および４−ヒドロキシアセトフェノン）、な
らびにヒドロキシル置換アリールケトン（例えば、６−ヒドロキシ−１，２−ナ
フトキノン）である。第三の好ましい基は、ヘテロアリールアルデヒドおよびヘ
テロアリールケトンを含む。有用なヘテロアリール基は、チオフェン、フラン、
ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、ピリジン、キノリン、ピリダジン、ピリミジ
ン、ピラゾール、イミダゾール、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリ
アゾール、イソオキサゾール、およびオキサゾールであって、これら各々は、ケ
ト、ホルミルまたはホルミル（Ｃ_1-4）アルキル置換基を有し、そして好ましく は、これらが利用可能な環の炭素原子によって収容され得る場合にさらなるハロ
またはヒドロキシル置換基を含む。好ましくは、フラニル、ピリジルおよびイン
ドリルアルデヒドおよびケトンが有用なヘテロアリール核である。有用なヘテロ
アリールアルデヒドおよびケトンの例は、ピリドキサール、２−チオフェンカル
ボキシアルデヒドおよび３−チオフェンカルボキシアルデヒドを含む。

【００３０】 イミン形成性カルボニル基を含む環状化合物の別の比較的安定な基は、ケトン
、ホルミル、またはホルミルアルキル置換を有するトリテルペノイドおよびステ
ロイドである。例としては、アンドロステロン、ホルミルジエノロン、プロゲス
テロン、プレドニゾロン、および他の誘導体が挙げられる。

【００３１】 （二官能性リンカー） 二官能性リンカーは、当該分野において種々の適用について周知である（Ｈｅ
ｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９６）。多数の二官能性リンカーが使用
されて、適切なポリサッカライドと適切なイミン形成性化合物との間の付着を形
成し得る。「二官能性リンカーの残基」とは、その二官能性リンカーの末端がそ
の化合物およびそのポリサッカライドに共有結合した後に、ポリサッカライドに
対して適切なカルボニル化合物を結合する構造をいう。

【００３２】 ポリサッカライドに対して、安定なカルボニル含有化合物を連結させるために
使用され得る安定なリンカー基の非限定的な例は、アルキレンジアミン（ＮＨ₂ −（ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂）、ここで、ｎは２〜１２である；アミノアルコール（Ｈ Ｏ−（ＣＨ₂）_r−ＮＨ₂）、ここで、ｒは２〜１２である；アミノチオール（Ｈ Ｓ−（ＣＨ₂）_r−ＮＨ₂）、ここでｒは２〜１２である；ならびに必要に応じて カルボキシ保護されたアミノ酸；エチレンおよびポリエチレングリコール（Ｈ−
（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂）_n−ＯＨ、ここでｎは１〜４である）である。適切な二官 能性ジアミン化合物は、エチレンジアミン、１，３−プロパンジアミン、１，４
−ブタンジアミン、スペルミジン、２，４−ジアミノ酪酸、リジン、３，３’−
ジアミノジプロピルアミン、ジアミノプロピオン酸、Ｎ−（２−アミノエチル）
−１，３−プロパンジアミン、２−(４−アミノフェニル）エチルアミン、およ び類似の化合物を含む。

【００３３】 ポリサッカライドのカルボキシル基が結合体基として使用される場合、１つ以
上のアミノ酸は、二官能性のリンカー分子として使用され得る。従って、アミノ
酸（例えば、βアラニンまたはγアミノ酪酸）またはオリゴペプチド（例えば、
ジアラニンまたはトリアラニン）が適切な連結分子として使用され得る。

【００３４】 好ましい二官能性連結基は以下を含む： −ＮＨ−（ＣＨ₂）_r−ＮＨ−、ここでｒは２〜５、 −Ｏ−（ＣＨ₂）_r−ＮＨ−、ここでｒは２〜５、 −ＮＨ−ＣＨ₂−Ｃ（Ｏ）−、 −Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−、 −ＮＨ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ₂−、 −ＮＨ−Ｃ（ＣＨ₃）₂−Ｃ（Ｏ）−、 −Ｓ−（ＣＨ₂）_r−Ｃ（Ｏ）−、ここでｒは１〜５、 −Ｓ−（ＣＨ₂）_r−ＮＨ−、ここでｒは２〜５、 −Ｓ−（ＣＨ₂）_r−Ｏ−、ここでｒは１〜５、 −Ｓ−（ＣＨ₂）−ＣＨ（ＮＨ₂）−Ｃ（Ｏ）−、 −Ｓ−（ＣＨ₂）−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−、 −Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ₂−Ｓ−ＣＨ（ＣＯ₂Ｈ）−ＮＨ−、 −Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ₂−Ｓ−ＣＨ（ＮＨ₂）−Ｃ（Ｏ）−、 −Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ₂−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−、 −Ｓ−ＣＨ₂−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−、および、 −ＮＨ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−Ｐ（Ｏ₂Ｈ）−。

【００３５】 ポリサッカライド、イミン形成性化合物、リンカーおよび各々についての比の
好ましい組合せは、以下を含み得るがそれらの限定されない：

【００３６】

【表１】

【００３７】 （^*）Ｉ／ＰおよびＬ／Ｐ比は、１００個の炭水化物残基（Ｎ＝１〜８）あたり に取り込まれたＩまたはＬ分子として表現する。

【００３８】 （イミン形成性ポリサッカライドアジュバントの調製） 本発明はまた、本発明のポリサッカライド結合体の調製のための方法に関する
。アジュバントポリサッカライドおよびサポニンの構造／機能研究は、炭水化物
鎖構造の統合性が、それらのアジュバント活性について重要であることを示して
いる。見かけ上、ＡＰＣ表面レセプターによる炭水化物部分の認識は、その細胞
の標的化およびそれらの免疫刺激効果を発揮するために必須である。トリテルペ
ンサポニンのアジュバント活性はまた、トリテルペノイド部分においてアルデヒ
ド基を必要とする。最近、イミンまたはシッフ塩基を形成し得る有機低分子がＴ
細胞に対して同時刺激性シグナルを提供し得、従って、ＡＰＣに存在するＢ７−
１レセプターによるそれらの刺激についての必要性を除去することが示されてい
る（Ｒｈｏｄｅｓ、Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３７７：７１（１９９５））。（ｉ
）環状またはヘテロ環状芳香性化合物あるいはイミン形成性カルボニル基を有す
る環状化合物の、（ｉｉ）ＡＰＣによって認識され、そして結合される特定のポ
リサッカライドへの付加は、優れたアジュバント特性を有する産物を生じる。こ
れらのアジュバント分子は、免疫調節特性および標的特性を有する。

【００３９】 （Ａ．末端還元グリコシル残基へのイミン形成性化合物の付加） βグルカンおよびβマンナンの末端還元グリコシル残基へイミン形成性化合物
を共有結合させる方法を、本明細書においてスキーム１を参照して記載する。

【００４０】 （スキーム１） （末端ヘミアセタールを介した、β−グルカンへのイミン形成化合物の付加
）

【００４１】

【化１】

【００４２】 β−グルカンおよびβ−マンナンは、グルコシルまたはマンノシル残基のいず
れかを含むので、化学的修飾に利用可能な官能基は、大部分は限られた反応性の
水酸基（−ＯＨ）である。さらに、ポリマー鎖あたり１つの末端還元性グルコシ
ル残基がある。一般に、グルコシル残基の第一級水酸基は、第二級水酸基より反
応性である。しかし、特定のポリサッカライドの構造が、水酸基の反応性に対し
て特定の（立体的または電気的）束縛を課し得る可能性がある。これは、限られ
た反応条件下で特定の優勢な産物の産生を好み得る水酸基の階層を生成する。

【００４３】 グルカンおよびマンナン中の制限された数の末端還元糖は、新たな化学基の導
入のための高度に特異的な部位を提供する。この特異性は、終端の末端グリコシ
ルヘミアセタールを、本発明のための修飾ポリサッカライドアジュバントの商業
的生産のための好適な基にする。

【００４４】 本明細書に記載される化学的修飾は、異なる生物からの可溶性または不溶性グ
ルカンについて用いられ得る。しかし、それらは、利用可能な合成手順の例示と
てのみ提供され、制限として提供されるのではない。これらの新たなアジュバン
トにおける炭水化物成分の役割は、ＡＰＣの標的化であるので、有用な分子量範
囲は、非常に広範、すなわち、約１，０００〜数百万であり得る。本発明では、
約１，０００〜数十万の範囲の分子量の可溶性のオリゴ−およびポリサッカライ
ドが好適である。

【００４５】 オリゴサッカライドの還元末端は、二官能性のジアミン化合物のような、アミ
ノ基をもつ分子の直接共有結合のための選択的かつ都合の良い部位を提供する。
還元的アミノ化手順は、オリゴサッカライド（またはポリサッカライド）中の末
端還元性グルコシル残基を、１つ以上の第一級アミノ基を保持する化合物と、水
素化シアノホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ₃）の存在下で反応することを含む 。この水素化シアノホウ素アニオンは、アルデヒドまたはケトンおよびアミンに
より形成されるイミンまたはシッフ塩基を選択的に還元する。ほんの小パーセン
トの時間、末端グルコシルヘミアセタールは、それらがホルミル形態または開放
形態にあるので、反応は非常に低速度で進行し得る。分子中のイミン形成性カル
ボニルおよび第一級アミンの両方の存在は、大部分が所望されない産物の産生を
生じ得るので、付加は、二段階手順で実施され、以下のように要約される： 工程１．グルカン／マンナンオリゴサッカライドまたはポリサッカライド（１
）を、水性アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ピリジン、また
は第三級アミンを含む水性緩衝液ｐＨ９．０のような適切な溶媒中に懸濁し、そ
して適切なジアミン化合物（２）、ここでｎは約２〜約１２、好ましくは、２〜
４がｐＨを９．０に調節して同じ溶媒中に添加される。［適切な二官能性ジアミ
ン化合物は、エチレンジアミン、１，４−ブタンジアミン、スペルミジン、２，
４−ジアミノ酪酸、リジン、３，３’−ジアミノジプロピルアミン、ジアミノプ
ロピオン酸，Ｎ−（２−アミノエチル）−１，３−プロパンジアミン、２−（４
−アミノフェニル）エチルアミン、および類似の化合物である］。添加されるジ
アミン化合物は、炭水化物中の遊離のアルデヒド基のモル当量に比較して約５〜
１０倍過剰であるべきである（すなわち、炭水化物ポリマー鎖あたり１つの遊離
アルデヒド）。５０％アセトニトリル中に溶解した水素化シアノホウ素ナトリウ
ムを反応混合物に添加し、そして反応を、２５#Ｃで、数日間穏やかに攪拌して 進行させる。ポリサッカライド中に取り込まれるアミン化合物の量は、反応条件
およびグルカン調製物に依存する。したがって、取り込まれたジアミン化合物の
量を毎日測定し、ジアミン取り込みの要求されるレベルに到達するために必要な
反応時間を確立する。ポリサッカライド鎖あたり１モルのジアミンスペーサーを
含む、修飾アミノ化グルカン／マンナン（３）を、６容量のエタノール、または
その他の適切な溶媒を用い，４#Ｃで８時間の沈殿により回収する。沈殿を水に 再溶解し、濾過し、そして５容量のエタノールを用い、４#Ｃで２４時間再沈殿 させる。この物質を水に溶解し、そして凍結乾燥する。

【００４６】 工程２．イミン形成性カルボニル基（４）、および４−ヒドロキシベンズアル
デヒド、２，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、バニリン、エチルバニリン、
ナリンゲニンのような１つ以上の水酸基をもつ芳香族環状化合物またはヘテロ環
状化合物、およびその他の類似の化合物が、アミノ化ポリサッカライドへの付加
に好適である。しかし、ステロイド誘導体およびトリテルペノイド誘導体のよう
なカルボニル基を有するその他の化合物もまた用いられ得る。１０ｍｌのジオキ
サンまたはアセトン中に溶解した、４−ヒドロキシベンズアルデヒド（１．２ｇ
）、バニリン（１．５ｇ）、または５−クロロ−２−ヒドロキシベンズアルデヒ
ド（１．６ｇ）のいずれかの１０ｍｍｏｌの小アリコートを、１０ｍｌの無水ジ
オキサンまたはアセトン中に溶解した１０ｍｍｏｌ（１．６ｇ）の１，１’−カ
ルボニルジイミダゾール（カルボジイミダゾールまたはＣＤＩ）またはＮ，Ｎ’
−カルボニルジイミダゾールに添加する。この混合物を、大気湿度から保護しな
がら、混合して室温で６〜８時間反応する。反応産物は、高度に反応性の中間体
イミダゾールカルバメート（５）であり、これは、芳香族アルデヒド誘導体から
のヒドロキシル、プラスイミダゾールで形成される。

【００４７】 工程３．この反応混合物を、アミノ化ポリサッカライドに、中間体イミダゾー
ルカルバメートを先に単離することなく、添加し得る。カルバメートは、修飾さ
れたポリサッカライドのアミノ基とカップリングし、安定なカルバメート結合を
生じる。（イミダゾールカルバメート誘導体は、クロマトグラフィー、差別抽出
、またはその他の手順により単離され得る）。ポリサッカライドの水酸基の、イ
ミダゾールカルバメート中間体との反応を最小にするため、カップリング反応は
、アミノ基およびイミダゾールカルバメート基の等モル量の存在下で行われるべ
きである。アミノ化ポリサッカライド中のアミノ基の量は、トリニトロベンゼン
スルホン酸（ＴＮＢＳ）を用いて測定されるか、または元素分析により測定され
るとき、Ｃ、Ｎ、Ｈ、およびＯのその含量から推定される。アミノ化グルカンま
たはマンナンは、ＤＭＦ、ジオキサン、またはピリジンのような、適切な無水有
機溶媒中に懸濁され、そしてｐＨを、トリエチルアミンで約９．５〜１０に調整
する。ポリサッカライド調製物のアミノ基に等価な量を含むカルバメート中間体
のアリコートを添加し、そして反応を、湿度から保護して室温で１２〜１８時間
進行させる。約６〜８容量の冷エタノールを反応物に添加し、ポリサッカライド
−芳香族アルデヒド結合体（６）を沈殿させ、濾過により回収する。この結合し
たポリサッカライドを、水に再溶解し、そして再び６〜８容量のエタノールまた
はその他の適切な溶媒で再沈澱させる。カップリングの効能は、以下の方法の１
つで測定される：ｉ）調製物中の残存アミノ基をＴＮＢＳで測定するか、ｉｉ）
調製物中に存在する芳香族化合物の量を分光学的に測定するか、またはｉｉｉ）
シッフ試薬を用いてか、もしくは分光学的にＮ−メチルベンゾチアゾレンヒドラ
ゾン（ＭＢＴＨ）を用いてのいずれかでアルデヒド基の直接推定による（Ｐａｚ
、Ｍ．Ａ．ら、Ａｒｃｈｉｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１０９：５４
８（１９６５））。ポリサッカライド−芳香族アルデヒド結合体を、水に溶解し
、そして凍結乾燥する。

【００４８】 過ヨウ素酸を用いた穏和な酸化によりポリサッカライド鎖中に新たなアルデヒ
ド基を作成することもまた可能である。酸化の後、さらなるアルデヒド基をもつ
ポリサッカライドをアルコールで沈澱し、そして上記のように還元的アミノ化に
供する。

【００４９】 （Ｂ．ポリサッカライドの水酸基を介するイミン形成性化合物の付加） カルボニルをもつ化合物に結合したグルカンまたはマンナンを調製する別の方
法は、結合形成のためにポリサッカライドの水酸基を用いることである。この方
法はスキーム２を参照して示される。グリコシル残基あたりの多くの水酸基のた
めに、この方法は、より高い密度のカルボニル基をもつ結合体の調製を可能にす
る。ポリサッカライドの水酸基を活性化し得、そしてカルボニルをもつ分子と反
応させる。

【００５０】 （スキーム２） （−ＯＨ基を介した、β−グルカンへのイミン形成化合物の付加）

【００５１】

【化２】

【００５２】 ポリサッカライドの水酸基へのカルボニル基をもつ化合物の結合は、Ｎ，Ｎ’
−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）を用いて作成され得る。ＤＳＣで
活性化される水酸基は、ほぼ排他的に第一級アミンと反応し、ポリサッカライド
の−ＯＨ基を介するそれらの架橋を避ける。β−１，３グルカンの水酸基は、Ｄ
ＳＣで活性化され、次いでエチレンジアミンと反応させ、グルカン中にアミノ基
を導入する。次いでこれらのアミノ基は以下のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（
ＮＨＳ）エステルの１つと反応し得：３−または５−ホルミルサリチル酸、４−
ホルミルケイ皮酸、および３−または４−カルボキシベンズアルデヒド、芳香族
アルデヒド−グルカン結合体を形成する。３つのグルコース単位ごとに単一のβ
−１，６結合したＤ−グルコース分岐をもつβ−１，３グルカンであり、そして
約１３０，０００の分子量のスクレログルカン（７）を、水に溶解し（２〜５％
溶液）、そして凍結乾燥し、有機溶媒に容易に懸濁される粉末産物を得る。２ｇ
の凍結乾燥スクレログルカン（１２ｍｍｏｌｅグルコシル残基）を、０．８ｇの
ＤＳＣ（３ｍｍｏｌｅ）を含む４０ｍｌのＤＭＦ中に懸濁する。この懸濁物に、
１時間かけて、０．７５ｍｌの無水トリエチルアミン（５．５ｍｍｏｌｅ）を含
む２０ｍｌの乾燥ピリジンを添加し、そして室温でさらに４時間反応させる。こ
の反応物に１容量のアセトンを添加し、そして不溶性の活性化スクレログルカン
スクシンイミジルカーボネート（８）を集めそして濾過により洗浄する。２０ｍ
ｌの水に溶解または懸濁した活性化スクレログルカンを、攪拌しながらゆっくり
と、２ｍｌのエチレンジアミンを含む１００ｍｌの０．２ＭＫ重炭酸カリウム（
３０ｍｍｏｌｅまたは最大のポリサッカライドの活性化−ＯＨ基に対し１０倍過
剰）に添加し、そしてｐＨ８．５に調整する。室温で４時間後、反応物を濃縮し
、そして水に対して透析し、アミノ化スクレログルカン誘導体（９）から過剰の
反応体を除去し、そして凍結乾燥する。次いでアミノ化ポリサッライドを、スク
シンイミジル−３−ホルミルサリチル酸エステルと反応させる。

【００５３】 スクシンイミジル−３−ホルミルサリチル酸エステルは以下のように調製され
る：１０〜１５ｍｌのＤＭＦ中に溶解した０．４９ｇの３−ホルミルサリチル酸
（３ｍｍｏｌｅ）および０．４２ｇのＮＨＳ（３．５ｍｍｏｌｅ）に、１．２８
ｇのＣＭＣまたは１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジ
イミドｐ−トルエンスルホネート（３ｍｍｏｌｅ）を添加し、そして湿気から保
護して室温で５時間反応させる。この反応混合物に、２．１ｍｌの２−メルカプ
トエタノール（３０ｍｍｏｌ）を添加して未反応のＣＭＣをクエンチし、混合し
室温で１０分間反応させ、そして直ちにスクシンイミジル−３−ホルミルサリチ
ル酸エステル（１０）を用いる。（この３−ホルミルサリチル酸は、等モル量の
５−ホルミルサリチル酸、４−ホルミルフェノキシ酢酸または３−カルボキシベ
ズアルデヒドにより置き換えられ得る。） ０．１ＭのＭＯＢＳ（４−［Ｎ−モルホリノ］ブタンスルホン酸）緩衝液、ｐ
Ｈ７．６の２５ｍｌ中に溶解したアミノ化スクレログルカン（約２ｇ）に、攪拌
しながら、スクシンイミジル３−ホルミルサリチル酸エステルおよびメルカプト
エタノールを含むＤＭＦを添加し、そして攪拌しながら室温で４〜６時間反応さ
せる。３−ホルミルサリチル酸−スクレログルカン誘導体（１１）を６〜８容量
のエタノールで沈澱し、そして集めてエタノールで洗浄し、過剰の反応体を取り
除く。沈澱したスクレログルカン誘導体を、５０ｍｌの水に溶解し、水に対して
透析し、そして凍結乾燥する。スクレログルカン誘導体の３−ホルミルサチリル
酸含量は、そのＨ、Ｃ、Ｎ、およびＯ元素組成から決定され得る。スクレログル
カン誘導体中の芳香族アルデヒド残基の含量はまた、分光学的に以下のように測
定され得る：５〜８ｍｇのスクレログルカン誘導体を４ｍｌの０．０５Ｍ ＫＯ
Ｈ中に溶解し、そして２２０〜３２０ｎｍのＵＶスペクトルを、０．０５Ｍ Ｋ
ＯＨ中同濃度の非修飾スクレログルカンの溶液をブランクとして用いて読む。０
．０５Ｍ ＫＯＨ中で測定したこの化合物の消光率を用いて取り込まれた３−ホ
ルミルサリチル酸を計算する。アルデヒド含量はまた、シッフ試薬を用いて比色
法によるか、またはＭＢＴＨを用いて分光学的によるかのいずれかで測定され得
る。

【００５４】 カルボニル基および水酸基の両方をもつ化合物の、マンナンのようなポリサッ
カライドへの結合は、ポリサッカライド水酸基をｐ−トルエンスルホニル（トシ
ル）クロライドで活性化することにより実施され得る（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｋら、
Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎ．３５：１９（１９８１）；Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｋ
ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０４：５６−６９（１９８４））。ス
キーム３−ａを参照のこと。

【００５５】 （スキーム３−ａ） （マンナンへのイミン形成化合物の付加）

【００５６】

【化３】

【００５７】 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのマンナン中のいくつかの第一級水酸基は、リ
ン酸化されているか、またはホスホエステルに連結しているかのいずれかであり
、そしてトシル化には利用できないので、還元条件下でアルカリ加水分解により
ホスフェートを取り除く必要がある。４〜５ｇのパン酵母マンナンを、１％の水
素化ホウ素ナトリウムを含む２００ｍｌの１５Ｍ ＫＯＨ中に溶解し、そして１
００℃で２時間の間一定の攪拌で還流する。１００℃で２時間後、溶液を約５０
℃に冷却し、そしてそれを約１８ｍｌの酢酸で中和する。中和したマンナン溶液
を、攪拌しながら１．５リットルの冷エタノールに添加し、そしてこの混合物を
４時間放置してマンナンを沈澱させる。沈澱したマンナンを濾過により集め、水
に溶解し、水に対して透析して塩を除きそして凍結乾燥する。

【００５８】 ピリジン中の懸濁により乾燥しそして共沸混合物を除去した１ｇの凍結乾燥マ
ンナン（１２）（約６ｍｍｏｌｅマンノース）を、１５ｍｌのＤＭＦ中に再懸濁
し、そして５ｍｌのＤＭＦ中に溶解した２．５ｇのトシルクロライド（２．１５
ｍｍｏｌｅ）と混合する。この混合物に、５ｍｌのピリジンを加え、そして攪拌
しながら１８時間室温で反応させ、２０〜２５マンノシル残基ごとに１トシル基
をもつトシル化マンナン（１３）を得る。トシル化の程度は、沈澱しそして以下
のように洗浄したた活性化マンナン試料中で測定される。８ｍｇの沈澱したマン
ナンを４ｍｌの０．１Ｎ ＫＯＨ中に溶解し、そしてそのＵＶ吸収スペクトル（
２２０〜３６０ｎｍ）を非修飾マンナン（４ｍｌの０．１Ｎ ＫＯＨ中８ｍｇ）
のブランクに対して測定する。２６１ｎｍで４８０Ｍ−１ｃｍ−１のトシルに対
する消光率を用いることによりトシル基の含量を測定する。２０ｍｌの０．５Ｍ
重炭酸Ｋ中に再懸濁したトシル化マンナン（１３）調製物（約０．９ｇ）に、２
ｇの２−システアミンＨＣｌ（１８ｍｍｏｌｅ）を添加し、そしてｐＨを１Ｎ
ＫＯＨで９．５〜１０に調整する。攪拌しながらかつ窒素雰囲気下で４０℃で２
４時間反応させ、トシル化−ＯＨあたり約１システアミン残基を導入する。反応
物を水に対して透析し、過剰の反応体および塩を取り除き、そしてマンナン−シ
ステアミン誘導体（１４）を凍結乾燥する。トシル化マンナンに結合したシステ
アミンの量は、誘導体のＨ、Ｃ、Ｓ、ＯおよびＮ元素組成から測定され得る。シ
ステアミン取り込みはまた、２ｍｇのアミノ化マンナンを含む１０ｍｌの０．０
５Ｍの重炭酸Ｋ緩衝液を、１ｍｌの水性ＴＮＢＳ（７．２ｍｇ／ｍｌ）と混合し
、そして４０℃で２時間反応することにより推定され得る。３６３ｎｍにおける
吸光度を、緩衝液プラスＴＮＢＳのブランクに対して測定し、そして１１，００
０Ｍ−１ｃｍ−１のモル消光率を用いて取り込まれた−ＮＨ２を測定する。

【００５９】 （スキーム３−ｂ） （マンナンへのイミン形成化合物の付加）

【００６０】

【化４】

【００６１】 スキーム３−ｂは、マンナン−システアミンへのイミン形成性化合物の結合を
図示する。２０ｍｌのピリジン中に凍結乾燥マンナン−システアミン（０．８〜
０．９ｇ）を懸濁し、共沸混合物を減圧下で除去して水を脱離させ、そして４０
ｍｌのピリジン：テトラヒドロフラン（１０：１）中にマンナン−システアミン
残基（１４）を再懸濁する。この懸濁物に、０．３７ｇのＤＣＣ（ジシクロヘキ
シルカルボジイミド）（１．８ｍｍｏｌｅ）、０．３ｇのｐ−カルボキシベンズ
アルデヒドおよび０．２１ｇのＮＨＳ（１．８ｍｍｏｌｅ）を添加し、インサイ
チュ(ｉｎ ｓｉｔｕ)でｐ−カルボキシベンズアルデヒド−ＮＨＳエステル中間
体（１０）を形成する。反応を攪拌しながら室温で２４時間進行させる。この混
合物に１００ｍｌの水を添加することにより反応を停止し、ＤＣＵの形成を促進
する。３０分後、追加の４００ｍｌの水を添加し、ｐ−カルボキシベンズアルデ
ヒド−マンナン誘導体（１５）を溶解する。室温で６時間攪拌した後、ジシクロ
ヘキシル尿素（ＤＣＵ）を一晩沈降させ、そしてデカンテーションにより取り出
す。上清液を濾過し、それを減圧下で濃縮し、水に対して透析しそしてｐ−カル
ボキシベンズアルデヒド−マンナン誘導体（１５）を凍結乾燥する。マンナンに
取り込まれた芳香族アルデヒドは、以下のように分光学的に測定され得る。５〜
８ｍｇのマンナン誘導体を４ｍｌの０．０５Ｍ ＫＯＨ中に溶解し、そして２２
０〜３２０ｎｍのＵＶスペクトルを、０．０５Ｍ ＫＯＨ中の同濃度の非修飾マ
ンナンの溶液をブランクとして用い読みとる。ｐ−カルボキシベンズアルデヒド
濃度を計算するため、０．０５Ｍ ＫＯＨ中で測定されたその消光率を用いる。
アルデヒド含量はまた、シッフ試薬を用いて比色法によるか、またはＭＢＴＨを
用いて分光学的によるかのいずれかにより測定され得る。

【００６２】 （Ｃ．ペクチンポリサッカライドのカルボキシル基へのイミン形成性化合物
の付加） ガラクチュロン酸、グルクロン酸、酢酸、ケドまたは３−デオキシ−Ｄ−マン
ノ−オクチュロゾン酸、およびその他の酸のような、ペクチンポリサッカライド
（ホモガラクチュロナン、ラムノガラクチュロナン、アラビノガラクタン、アラ
バン、またはガラクタン）からのカルボキシル基は、ペクチンを、カルボニルを
もつ（イミン形成性）化合物にカップルするために用いられ得る反応基である。
カルボキシル基は、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）およびＮ−ヒド
ロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いることによりアミンに特異的にカップル
され得る。スキーム４を参照のこと。

【００６３】 （スキーム４） （ペクチンポリサッカライドへのイミン形成化合物の付加）

【００６４】

【化５】

【００６５】 この反応は、ジオキサン、ＤＭＦ、ピリジン、アセトニトリル、またはそれら
の混合物のような有機溶媒中で実行され得る。カップリング反応はまた、水性ま
たは準水性の媒質中で、１−エチルー３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル
ボジイミド（ＥＤＣ）またはＣＭＣのような水溶性のカルボジイミドの１つを、
Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホＮＨＳ）またはＮＨＳのどちらか
と組み合わせて使用して実行され得る。グリコシル残基あたりのアミノ基の数は
、過剰量のジアミンリガンドの存在下においてＣＭＣの限定する量を使用するこ
とにより選択され得る。このアプローチを、スキーム４に図示する。１つの実施
例において、５０ｍｌの熱水に溶解した２．０〜２．２ｇの低メトキシルＮａ⁺ ペクチン酸塩（＜１１ｍｍｏｌガラクツロン酸）に、１５ｍｌのＨ⁺型の固定さ れた強カチオン交換ポリスチレンスルホン酸樹脂（Ｄｏｗｅｘ、５０−Ｘ８）を
添加し、そして２時間攪拌する。その懸濁液を、樹脂を取り除くするためにろ過
し、そしてその樹脂を、２０ｍｌの温水で洗浄する。ペクチン（Ｈ⁺型）（１６ ）溶液を、部分的凍結乾燥、低圧回転エバポレーション、または逆浸透法により
体積を約４０ｍｌに減少させる。ペクチン溶液（Ｈ⁺型）へ、ｐＨ約７．６にす るためにピリジンを添加する。この溶液へ１０ｍｌのピリジンおよび２ｍｌのエ
チレンジアミン（３０ｍｍｏｌ）に溶解した１ｇＣＭＣ（２．３５ｍｍｏｌ）お
よび０．４１ｇＮＨＳ（３．４ｍｍｏｌ）を攪拌しながら添加し、そしてその混
合液を、一定の攪拌をしながら室温で１晩反応するために放置する。他の反応物
由来のアミノ化ポリサッカライド（１７）の分離を、６〜８容積のエタノールで
沈殿することにより成し遂げる。エタノールで洗浄し、沈殿した、アミノ化ペク
チンを、水に溶解させ、透析し、そして凍結乾燥をして水に容易に溶解する粉末
状の産物を生成し、そしてそのアミノ基含量を、ＴＮＢＳで決定する。次に、ア
ミノ化ペクチンを、以下のように調製されたスクシンイミジル−３−ホルミルサ
リチル酸エステルと反応させる。１０〜１５ｍｌのＤＭＦに溶解した０．４９ｇ
の３−ホルミルサリチル酸（３ｍｍｏｌ）および０．４２ｇＮＨＳ（３．５ｍｍ
ｏｌ）に、１．２８ｇのＣＭＣ（３ｍｍｏｌ）を添加し、そして水分から保護し
室温で５時間反応させるために放置する。この反応混合物へ、２．１ｍｌ ２−
メルカプトエタノール（３０ｍｍｏｌ）を、反応を起こしていないＣＭＣをクエ
ンチするために添加し、そして室温で１０分後、形成されたスクシンイミジル−
３−ホルミルサリチル酸エステル（１０）をすぐに使用する。（３−ホルミルサ
リチル酸を、等モル量の３−カルボキシベンズアルデヒド、４−ホルミル−フェ
ノキシ酢酸、または４，５−ジオキソヘプタノン酸により置換し得る） ３０ｍｌの０．１Ｍ ＭＯＢＳ（４−［Ｎ−モルホリノ］ブタンスルホン酸）
緩衝液、ｐＨ７．６に溶解した２ｇのアミノ化ペクチンに、スクシンイミジル３
−ホルミルサリチル酸エステルおよびメルカプトエタノールを含むＤＭＦ中の反
応混合物を添加し、そして室温で６時間、攪拌し反応を行う。３−ホルミルサリ
チル酸−ペクチン誘導体（１８）を、６〜８容積のエタノールで沈殿させ、次に
、回収し、そして過剰反応物を除くためにエタノールで洗浄する。沈殿したペク
チン誘導体を、最少量の水に溶解し、水に対して透析し、そして凍結乾燥する。
アミノ化ペクチンはまた、４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、６−ヒド
ロキシ−２−ナフトキノン、４−ヒドロキシベンズアルデヒド、２，４−ジヒド
ロキシベンズアルデヒド、ホルミルジエノロン、プロゲステロン、アンドロステ
ロン、プレドニソロン、またはピリドキサルのようなヒドロキシル化されたカル
ボニル基を含む化合物のスクシンイミジルカルボン酸塩中間体と反応し得る。６
容積のエタノールとの反応物を混合した後、次に、アルデヒドを含むペクチンポ
リサッカライド誘導体を、ろ過により回収し、水に溶解し、水に対して透析し、
そして凍結乾燥する。

【００６６】 あるいは、アミノ化ペクチン（１７）は、テレフタルアルデヒドモノジエチル
アセタールのような遊離および保護されたアルデヒド基の両方を含む化合物と反
応し得る。アミノ化ペクチンは、まず、安定な結合を形成するために遊離アルデ
ヒド基と反応し、そして続いて保護されたアルデヒド基は、本明細書中に記載し
たように、温和な酸加水分解によって放出される。３０ｍｌの水性のテトラヒド
ロフランまたは他の適した溶媒に懸濁した２ｇアミノ化ペクチンに、０．４３ｇ
のテレフタルアルデヒドモノジエチルアセタール（２ｍｍｏｌ）、０．１８ｇの
シアノボロヒドリドナトリウム（３ｍｍｏｌ）を添加し、そしてペクチンのテレ
フタルアルデヒドモノジエチルアセタール誘導体（１９）を生成するために４０
℃で１晩攪拌して反応させる。ペクチン誘導体を、６容積のエタノールで沈殿さ
せ、回収し、そしてさらなるエタノールでろ過により洗浄する。テレフタルアル
デヒドモノジエチルアセタールペクチン誘導体を、最少量の０．０５Ｍ ＨＣｌ
に溶解し、そして１００℃で１５〜２０分間加熱してアセタールを、アルデヒド
型に変換する。加水分解後、フェニルアセトアルデヒドペクチン誘導体（２０）
の溶液は、ＮａＯＨで中性に導き、水に対して透析し、そして凍結乾燥する。ペ
クチン誘導体の芳香族アルデヒドの含量を、以下のように、分光光度的に決定す
る。３ｍｌの０．０５Ｎ ＮａＯＨ中に５〜８ｇの結合させたペクチンを溶解し
、そして等量の非修飾ペクチンを含むブランク溶液に対して２２０と３２０ｎｍ
との間でＵＶスペクトルを走査する。ペクチン誘導体の芳香族アルデヒドの濃度
を、０．０５Ｍ ＮａＯＨ中で決定されたように遊離芳香族アルデヒドの吸光係
数を使用して計算する。アルデヒド含量もまた、ＭＢＴＨを用いて分光光度的に
またはシッフ試薬を用いて比色学的に決定し得る。

【００６７】 あるいは、ペクチンポリサッカライドへのカルボニルを含む化合物の導入を、
有機溶媒中で実行し得る。１つの実施例において、ＣＭＣ、ＮＨＳ、およびＣＭ
Ｃに対して１０倍過剰のジアミンを、ＤＭＦ−ピリジン（６：４、ｖ／ｖ）に懸
濁した凍結乾燥した無水ペクチン（Ｈ⁺型）に添加し、そして混合物を、室温で １晩攪拌しながら放置させた。グリコシル残基あたりのアミン基の数を、過剰量
のジアミンリガンドの存在下で限定した量のＣＭＣを使用することによって選択
し得る。他の反応物からのアミノ化ポリサッカライドの分離を、６〜８容積のエ
タノールで沈殿させることにより成し遂げる。エタノール洗浄し、沈殿した、ア
ミノ化ペクチンを、水に溶解させ、そしてＤＭＦ−ピリジンに容易に再懸濁する
ために粉末状の産物を生成するために凍結乾燥する。アミノ化ペクチンは、以下
のどちらかとＤＭＦ−ピリジン中で反応する。（ｉ）４，５−ジオキソへプタン
酸、３−または５−ホルミルサリチル酸、４−ホルミル桂皮酸、または３−もし
くは４−カルボキシベンズアルデヒドのようなカルボキシル化カルボニルを含む
化合物のスクシンイミジルエステル、あるいは（ｉｉ）２，４−ジヒドロキシベ
ンズアルデヒド、４−ヒドロキシベンズアルデヒド、４−ヒドロキシフェニルア
セトアルデヒド、４’−ヒドロキシアセトフェノン、６−ヒドロキシ−２−ナフ
トキノン、ホルミルジエノロン、プロゲステロン、アンドロステロン、プレドニ
ソロン、ピリドキサルのようなヒドロキシル化されたカルボニルを含む化合物の
スクシンイミジルカルボン酸塩中間体。次に、アルデヒドを含むペクチンポリサ
ッカライド誘導体は、６容積のエタノールと反応物を混合した後、ろ過により回
収し、水に溶解し、水に対して透析し、そして凍結乾燥する。

【００６８】 （Ｄ．キチン誘導体のアミノ基へのイミンを形成する化合物の付加） ほとんどの溶媒におけるキチンの不溶性は、キチンへのイミンを形成する化合
物の付加を妨げる。しかし、水溶性キトサン中へ化合物を運ぶカルボニルの導入
は、おそらくグルコサミンのアミン基と異なったポリサッカライド鎖由来のカル
ボニル基との間のシッフ塩基によって架橋した結果である水に不溶性のゲルを生
じた。約８５％のアミン基が、グルコサミンの一級ヒドロキシル基がヒドロキシ
エチル化されているグリコールキチン（６−ｏ−ヒドロキシプロピルキチンまた
は６−ｏ−ヒドロキシエチルキチン）のようなＮ−アセチル化されている水溶性
キチン誘導体の使用により、これらの障壁は無効にされる。スキーム５はこの過
程を図示する。

【００６９】 （スキーム５） （グリコールキチンへのイミン形成化合物の付加）

【００７０】

【化６】

【００７１】 １つの実施態様において、グリコールキチンを、以下のように調製する。３０
ｍｌの４２％ＮａＯＨに２時間室温で懸濁した５ｇの微細な状態のキチン（２２
）（２１．２５ｍｍｏｌのＮ−アセチルグルコサミンおよび３．７５ｍｍｏｌの
グルコサミンに等しい）に、７０ｍｌの氷水混合物を攪拌しながら添加して、ア
ルカリ性のキチンの高度に粘稠性の分散を得る。この分散のために、５ｇの酸化
エチレン（１４４ｍｍｏｌ）を、３０〜３５℃で１〜２時間攪拌する間溶液中に
、通気（ｂｕｂｂｌｉｎｇ）により添加する。次に、グリコールキチン（２３）
を、６容積の８０％エタノールで沈殿させ、８０％エタノールでガラスフィルタ
ー紙上を洗浄し、水に溶解し、水に対して透析し、凍結乾燥し、そしてＴＮＢＳ
を用い比色学的に遊離アミノ基の含量を決定する。４０ｍｌの水に溶解／懸濁し
た１．７〜２ｇの凍結乾燥したグリコールキチン（約１．５ｍｍｏｌのグルコサ
ミン）に、１．６０ｇのテレフタルデヒドモノジエチルアセタール（７．５ｍｍ
ｏｌ）、０．４ｇシアノボロヒドリドナトリウム（６ｍｍｏｌ）を含む４０ｍｌ
のピリジンを添加し、そして室温で４時間反応させた。４〜６容積のエタノール
を用いてグリコールキチンのテレフタルデヒドモノジエチルアセタール誘導体（
２４）を沈殿させ、沈殿を再懸濁し、そしていくらか過剰の反応物を除去するた
めに８０％エタノールを用い洗浄する。４０〜５０ｍｌの０．０５Ｍ ＨＣｌに
グリコールキチン誘導体（２４）を溶解し、そしてアルデヒド基を放出するため
に２０〜３０分間１００℃で加熱して、グリコールキチンのベンズアルデヒド誘
導体（２５）を得る。グリコールキチン誘導体のベンズアルデヒド含量を、以下
のように分光光度的に決定する。４ｍｌの０．０５Ｍ ＫＯＨに５〜８ｍｇのグ
リコールキチン誘導体を溶解し、そして０．０５Ｍ ＫＯＨ中に等濃度のグリコ
ールキチンの溶液をブランクとして使用し、２２０〜３２０ｎｍの間でのＵＶス
ペクトルを読む。０．０５Ｍ ＫＯＨ中で決定されたこの化合物の吸光係数を使
用し、取り込まれたベンズアルデヒドを計算する。アルデヒド含量もまた、ＭＢ
ＴＨを用い分光光度学的に、またはシッフ試薬を用い比色学的に、のどちらかで
決定し得る。

【００７２】 他の実施態様において、スキーム６に示した、上記に記載したように形成され
たグリコールキチン（２３）を、以下のように調製されるスクシンイミジル−５
−ホルミルサリチル酸エステル（１０）と反応させる。１０〜１５ｍｌのＤＭＦ
に溶解した０．５ｇの３−ホルミルサリチル酸（３ｍｍｏｌ）および０．４２ｇ
のＮＨＳ（３．５ｍｍｏｌ）に、１．２８ｇのＣＭＣ（３ｍｍｏｌ）を添加し、
そして水分から保護し、５〜６時間室温で反応させる。この反応混合物に、反応
していないＣＭＣをクエンチするために２．１ｍｌのｐ−メルカプトエタノール
（３０ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１０分間混合および反応させ、そしてスクシ
ンイミジル−５−ホルミルサリチル酸エステルをすぐに使用する。５−ホルミル
サリチル酸を、４，５−ジオキソヘプタノン酸、４−ホルミル桂皮酸、３−カル
ボキシベンズアルデヒドまたは４−ホルミルフェノキシ酢酸のような等モル量の
他のカルボキシル化カルボニル含有化合物によって置換し得る。４０ｍｌの０．
１Ｍ ＭＯＢＳ緩衝液（ｐＨ７．６）に溶解したグリコールキチン（１．７〜２
ｇ）に、スクシンイミジル−５−ホルミルサリチル酸エステルおよびメルカプト
エタノールを含むＤＭＦを攪拌しながら添加し、そして４〜６時間室温で攪拌し
ながら反応させる。グリコールキチンの３−ホルミルサリチル酸誘導体（２６）
を、６容積のエタノールで沈殿させ、そして過剰量の反応物を除去するために８
０％エタノールで洗浄する。沈殿したグリコールキチン誘導体を、５０〜６０ｍ
ｌの水に溶解し、水に対して透析し、凍結乾燥する。グリコールキチン誘導体の
３−ホルミルサリチル酸含量を、以下のように分光光度学的に決定する。５〜８
ｍｇのグリコールキチン誘導体を４ｍｌの０．０５Ｍ ＫＯＨに溶解し、０．０
５Ｍ ＫＯＨ中に等濃度の非修飾グリコールキチンの溶液をブランクとして使用
し２２０〜３２０ｎｍの間のＵＶスペクトルを読む。０．０５Ｍ ＫＯＨにおい
て決定されたこの化合物の吸光計数を用い、取り込まれた３−ホルミルサリチル
酸塩を計算する。アルデヒド含量もまた、シッフ試薬を用い比色学的に、または
ＭＢＴＨを用い分光光度学的に、のどちらかで決定し得る。

【００７３】 （スキーム６） （グリコールキチンへのイミン形成化合物の付加）

【００７４】

【化７】

【００７５】 本明細書で記載した過程に加えて、グリシジルエーテル、活性化ハロゲン、お
よびその他を使用するような他の方法は、カルボニルを含んでいる化合物をポリ
サッカライドのグリコシル残基へ結合するために使用し得る。例えば、Ｍａｒｏ
ｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ２７８：２４３（１９７２
）およびＥｒｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２８：７１３（１９
５７）を参照のこと。

【００７６】 ＡＰＣ表面レセプターにより認識される他の有用な炭水化物含有化合物は、そ
れぞれ動物および細菌起源のキチンおよびデキストランを含む。適した炭水化物
含有化合物の例は、細菌性のタイコ酸およびそれらの誘導体、細菌リポポリサッ
カライド、脂質Ａ、およびそれらの誘導体である。

【００７７】 非アジュバント炭水化物含有産物への、イミンを形成するカルボニル基を保有
する化合物の結合は、それらの産物に内因性のアジュバント活性を提供すること
において有用であり、そして予防的な免疫化の効果を増加させることが意図され
る。これらの産物の例は、連鎖球菌、ぶどう球菌、およびワクチンの抗原として
使用される他の細菌由来のポリサッカライドである。

【００７８】 （薬学的および獣医学的組成物ならびに使用方法） さらなる局面において、本発明の結合体、例えば化学式Ｉの化合物またはその
生理学的に受容可能な塩は、免疫系における欠損および／または効果のない宿主
防御機構が存在する疾患の処置に使用され得るか、または正常レベルより上の免
疫系まで活性を高めるために使用され得る。

【００７９】 本発明の化合物またはその生理学的に重要可能な塩は、免疫不全哺乳動物の処
置または予防のために、単独で、または他の治療薬剤（例えば、他の抗ウイルス
剤、もしくは他の抗ガン剤）と組み合わせて投与され得る。

【００８０】 本発明の結合体、例えば、化学式Ｉの化合物およびその生理学的に受容可能な
塩は、免疫不全哺乳動物の処置または予防のために、単独で、または他の治療薬
剤（例えば、他の抗ウイルス剤、もしくは他の抗ガン剤）と組み合わせて投与さ
れ得る。

【００８１】 免疫アジュバントは、個体に投与されるか、またはインビトロで試験される場
合に、抗原が投与される被験体または試験系において抗原に対する免疫応答を増
加させる化合物である。

【００８２】 「有効量」によって、感染を除去するために、免疫機能を実質的に正常レベル
まで回復させるか、または正常レベルより上に免疫機能を増加させる、本発明の
結合体の量が意味される。

【００８３】 免疫応答の増強によって、低下した免疫機能の回復、正常な免疫機能の増強、
またはその両方が意味される。免疫機能は、体液性（抗体媒介）免疫、細胞性（
Ｔ−細胞媒介）免疫、またはマクロファージおよび顆粒球媒介耐性の発生および
発現として定義される。

【００８４】 本明細書中において、用語「免疫不全患者」が、欠乏したまたは欠損した免疫
系を有する患者を記載するために利用される。免疫不全患者は、Ｔリンパ球増殖
アッセイによって特徴付けられる。このアッセイを使用して、免疫不全患者は、
マイトジェンによる刺激に応答するＴ細胞の活性の減少によって特徴付けられる
。このアッセイにおいて一般的に使用されるマイトジェンの例は、フィトヘマグ
ルチニン（ＰＨＡ）である。

【００８５】 免疫不全および免疫抑制は、リンパ球、特に免疫応答を調整するＴ細胞へのシ
グナル伝達において傷害が存在する、多くの臨床的状況において生じると考えら
れる。Ｔ細胞は、効果的な免疫応答を開始するために２つのシグナルを必要とす
る： （ｉ）抗原に対する特異的Ｔ細胞レセプターの占有、および （ｉｉ）同時刺激レセプターを通しての刺激。

【００８６】 シグナル（ｉｉ）の非存在下において、Ｔ細胞は応答し損い、そして慢性的に
麻痺し得るか、またはアネルギー性になり得る。持続性のウイルス性および細菌
性感染ならびに腫瘍性疾患は、種々の方法において、第２のシグナルの送達を妨
害することによってＴ細胞応答性低下を生じ得、そしてこのようにして免疫応答
を回避し得る。本発明の結合体は、Ｔ細胞に対する欠乏した同時刺激シグナルを
置換するか、さもなくば補償することによって働くようである。

【００８７】 最近の研究（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １７
：４３６（１９９６））は、外来性のシッフ塩基形成化合物がカルボキシル基の
天然の供与体の代用となり得、そしてＣＤ４ Ｔ ヘルパー（Ｔｈ）細胞への同
時刺激シグナルを提供し得ることを示した。関連する研究（Ｚｈｅｎｇ，Ｂ．ら
、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６：１５６０（１９９２））において、ガラクトースオ
キシシダーゼを用いる、新規なアルデヒド基を形成するためのＡＰＣの処理は、
マウスに対する抗原を投与する場合にアジュバント効果を生じる。

【００８８】 これらの知見は、免疫系の刺激物としてのシッフ塩基形成化合物の役割を強調
する。ＡＰＣとＴｈ細胞との間の相互作用の間に、まだ未同定の細胞表面レセプ
ターに局在する特定化されたＡＰＣのカルボキシル基とＴｈ細胞のアミノ基との
間のシッフ塩基の一過性の形成が存在する。シッフ塩基形成の結果は以下である
：Ｔｈ細胞中でＩＬ−２およびＩＦＮ−γ産生の増加に伴って、免疫系をＴｈｌ
型応答に偏らせること、ならびにＣＴＬ応答の増強。シッフ塩基形成化合物は、
Ｔｈ細胞上のＣＤ−２８レセプターおよびＡＰＣ上に存在するＢ７−１レセプタ
ーを含む、同時刺激経路をバイパスすることによって働くようである。

【００８９】 免疫系が欠乏または欠損し得る種々の環境が存在する。例えば、免疫系不全は
、未成熟または成熟前乳児（新生児）において一般的である。それはまた特定の
薬物による抑制から生じ得、例えば、ガン化学療法の副作用として熟考され得る
。免疫系の１つ以上の構成部分の発達の障害（例えば、ガンの特定の形態におけ
るような）はまた、免疫不全を生じ得る。免疫不全はまた、ヒト免疫不全ウイル
ス（ＨＩＶ）を含むウイルス感染によって引き起こされ得る。

【００９０】 本発明のさらなる局面は、免疫不全患者を処置する方法を提供し、これは哺乳
動物に有効量の本発明の結合体、例えば、化学式Ｉの化合物、またはその生理学
的に受容可能な塩を投与する工程を含む。

【００９１】 本発明のさらなる局面は、急性および慢性ウイルス感染の処置および／または
予防のための本発明の結合体、例えば、化学式Ｉの化合物、またはその生理学的
に受容可能な塩の使用を提供する。

【００９２】 本発明の結合体、例えば、化学式Ｉの化合物、またはその生理学的に受容可能
な塩を用いる免疫賦活治療が、好ましくは抗ウイルス剤とともにそれに対して使
用され得る、急性ウイルスの例は： ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ア
デノウイルス、コクサッキー（ｃｏｘｓａｋｉｅ）ウイルス、ピコルナウイルス
、ロタウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、
麻疹ウイルス、ポックスウイルス、ＲＳウイルス、パピローマウイルス、および
エンテロウイルス、アレナウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、ニュー
カッスル病ウイルス、狂犬病ウイルス、およびアルボウイルスである。

【００９３】 本発明の結合体を用いる免疫賦活治療が、それに対して使用され得る、慢性ウ
イルス感染の例は、持続性ヘルペスウイルス感染、エプスタイン‐バーウイルス
感染、持続性風疹ウイルス感染、パピローマウイルス感染、肝炎ウイルス感染、
およびヒト免疫不全ウイルス感染である。

【００９４】 本発明の結合体は、単独で、または上記の感染もしくは状態の処置のための他
の治療剤と組み合わせて使用され得る。本発明に従う組み合わせ治療は、少なく
とも１つの本発明の結合体、例えば、化学式Ｉの化合物またはその生理学的に受
容可能な塩、および少なくとも１つの他の薬学的活性成分の投与を含む。本発明
の薬学的に活性な成分および化合物を一緒にまたは別個に投与し得、そして別個
に投与された場合に、これは同時にまたは任意の順番で逐次的に行われ得る。薬
学的に活性な成分および本発明の化合物の量、ならびに投与の相対的なタイミン
グは、所望の組み合わせた治療効果を達成するために選択される。好ましくは、
組み合わせ治療は、本発明の１つの化合物および本明細書中以下に言及される薬
剤の１つの投与を含む。

【００９５】 このようなさらなる治療薬剤の例は、ＨＩＶ感染または関連する状態の処置に
有効な薬剤を含み、これらは例えば、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（
ジドブジン）、他の２’，３’−ジデオキシヌクレオシド（例えば、２’，３’
−ジデオキシシチジン、２’，３’−ジデオキシアデノシン、および２’，３’
−ジデオキシイノシン）、カルボビル（ｃａｒｂｏｖｉｒ）、非環式のヌクレオ
シド（例えば、アシクロビル）、２’，３’−ジデヒドロチミジン、プロテアー
ゼインヒビター（例えば、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−デカヒドロ−２−[−２（Ｒ ）−ヒドロキシ−４−フェニル−３（Ｓ）−［[Ｎ−２−キノリルカルボニル） −Ｌ−アスパルギニル]ブチル]−（４ａＳ，８ａＳ）−イソキノリン−３（Ｓ）
−カルボキサミド （Ｒｏ３１−８９５９）、オキサチオラン（ｏｘａｔｈｉｏ
ｌａｎ）ヌクレオシドアナログ（例えば、シス−１−（２−ヒドロキシメチル）
−１，３−オキサチオラン−５−イル）−シトシン、またはシス−１−（２−ヒ
ドロキシメチル）−１，３−オキサチオラン−５−イル）−５−フルオロ−シト
シン、３’−デオキシ−３’−フルオロチミジン、２’，３’−ジデオキシ−５
−エチニル−３’−フルオロウリジン、５−クロロ−２’，３’−ジデオキシ−
３’−フルオロウリジン、リバビリン、９−[４−ヒドロキシ−２−（ヒドロキ シメチル）ｂｕｔｌ−イル]グアニン（Ｈ２Ｇ）、ＴＡＴインヒビター（例えば 、７−クロロ−５−（２−ピリル（ｐｙｒｒｙｌ））−３Ｈ−１，４−ベンゾジ
アゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎ）−２（Ｈ）−オン（Ｒｏ５−３３３５
）、または７−クロロ−１，３−ジヒドロ−５−（１Ｈ−ピロール−２−イル）
−３Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−アミン（Ｒｏ２４−７４２９））、イ
ンターフェロン（例えば、α−インターフェロン）、腎排泄インヒビター（例え
ば、プロベネシド）、ヌクレオシド輸送インヒビター（例えば、ジピリダモール
（ｄｉｐｙｒｉｄａｍｏｌｅ））、ペントキシフィリン、Ｎ−アセチルシステイ
ン、プレセッション、α−トリコサンチン（ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ）、ホ
スホノホルミック酸、ならびに免疫調節剤（例えば、インターロイキンＩＩ）、
顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、可溶性ＣＤ４、な
らびに遺伝子操作されたそれらの誘導体である。ＨＢＶ感染の処置に有効なこの
ようなさらなる治療薬剤の例は、カルボビル、オキサチオラン、ヌクレオシドア
ナログ（例えば、シス−１−（２−ヒドロキシメチル）−１，３−オキサチオラ
ン−５−イル）シトシンまたは、シス−１−（２−ヒドロキシメチル）−１，３
−オキサチオラン−５−イル）−５−フルオロシトシン、２’，３’−ジデドキ
シ（ｄｉｄｅｄｏｘｙ）−５−エチニル−３’−フルオロウリジン、５−クロロ
−２’，３−ジデドキシ−３’−フルオロウリジン、１−（β−Ｄ−アラビノフ
ラノシル）−５−プロピニルウラシル、アシクロビル、およびインターフェロン
（例えば、α−インターフェロン）を含む。

【００９６】 別の局面において、本発明は、哺乳動物におけるＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ
ｃａｒｉｎｉｉ感染の処置および／または予防のための医薬品の製造のための、
本発明の結合体、例えば、化学式Ｉの化合物、またはその生理学的に受容可能な
塩の使用を提供する。

【００９７】 なおさらなる局面において、本発明は、相対的なＴ細胞欠乏から生じる状態（
例えば、ディ・ジョージ症候群、真菌感染、マイコプラズマ感染、結核、らい病
、および全身性エリテマトーデス）を処置するための、本発明の結合体、例えば
、化学式Ｉの化合物、またはその生理学的に受容可能な塩の使用を提供する。

【００９８】 別の局面において、本発明は、哺乳動物におけるガンの処置および／または予
防のための医薬品の製造のための、本発明の結合体、例えば、化学式Ｉの化合物
、またはその生理学的に受容可能な塩の使用を提供する。

【００９９】 本発明の化合物を用いる処置に特に適切なガンの型の例は：黒色腫、乳ガン、
結腸ガン、頭部および頚部のガン、胃ガン、腎臓ガン、喉頭ガン、直腸ガン、お
よび非ホジキンリンパ腫である。腫瘍特異的抗原、またはまれにしか発現されな
い抗原もしくは正常細胞で非常に低密度で発現される抗原を発現するガンは、治
療の標的になりそうである。アネルギー性の、または他の点では効果のない腫瘍
特異的な細胞傷害性のＴ細胞を含むガンは、治療の標的になりそうである。高い
再発の危険性のある外科的に切除された腫瘍もまた、本発明の化合物を用いる治
療に適切である。

【０１００】 本発明のさらなる局面は、本発明の結合体、例えば、化学式Ｉの化合物、また
はその生理学的に受容可能な塩のワクチンアジュバントとしての使用のための、
の使用を提供する。従って、ワクチンは、本発明の結合体を用いて抗原性成分を
処方することによって調製され得る。

【０１０１】 本発明の化合物は、経口、非経口（皮下、皮内、筋肉内、および静脈内）、直
腸、および吸入から選択される経路によってヒトレシピエントに投与され得る。
化合物の有効な用量のサイズは、レシピエントの主体性、関与する賦活の型、処
置される状態の重篤度、および投与の経路を含む多くの要因に依存し、そして最
終的には担当医の裁量にある。

【０１０２】 有効用量は、一般的には個体あたり０．０３〜２５０ｍｇの範囲にあり、そし
て最も好ましくは、用量あたり約０．０５と約１００ｍｇとの間にある。免疫刺
激物は、好ましくは１週間に１回または２回のみ投与され、そしていくつかの場
合においては、より頻度を低くする。処置の頻度および長さは、種および個体間
で変動する。

【０１０３】 本発明の化合物は、未処理の化学物質として投与されることが可能であるが、
それらを薬学的処方調製物として提供することが好ましい。本発明の処方物は、
そのための１つ以上の受容可能なキャリアおよび必要に応じて他の治療成分とと
もに、本発明の化合物を含む。キャリアは、処方物の他の成分と適合可能であり
、かつそのレシピエントに有害ではないという意味で受容可能でなくてはならな
い。

【０１０４】 免疫アジュバントは、個体に投与した場合、またはインビトロで試験した場合
に、抗原が投与される被験体または試験系において抗原に対する免疫応答を増加
させる化合物である。いくつかの抗原は、単独で投与した場合に弱く免疫原性で
あり、または被験体において有用な免疫応答を惹起する濃度で被験体に対して毒
性である。免疫アジュバントは、抗原をより強力に免疫原性にさせることによっ
て、抗原に対する被験体の免疫応答を増強し得る。そのアジュバント効果はまた
、被験体において有用な免疫応答を達成するためにより少ない用量の抗原を投与
する能力を生じ得る。

【０１０５】 本発明の化合物および組成物の免疫原誘導活性は、多数の公知の方法によって
決定され得る。本発明の組成物の投与の際の特定の抗原に対する抗体の力価の増
加は、免疫原性活性を測定するのに使用され得る。（Ｄａｌｓｇａａｒｄ，Ｋ．
Ａｃｔａ Ｖｅｔｅｒｉｎｉａ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ ６９：１−４０（
１９７８））。１つの方法は、１つ以上の外来性抗原を含む試験組成物を、ＣＤ
−１マウスに皮内で注射する工程を必要とする。２週間後血清がマウスから収集
され、そして抗免疫原抗体についてＥＬＩＳＡによって試験される。

【０１０６】 本発明の組成物は、被験体において抗原に対する活性な免疫を誘導するための
ワクチンとして有用である。任意の動物が、処置され得る被験体の範囲内で、本
発明の組成物の有益な効果を経験し得る。被験体は、好ましくは哺乳動物、より
好ましくはヒトである。

【０１０７】 本発明の結合体は単一のアジュバントとして使用され得るか、あるいは他のア
ジュバントとともに投与され得る。本発明を用いる、このような有用なアジュバ
ントは、オイルアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントおよび不完
全アジュバント）、サポニン、修飾サポニン、リポソーム、無機塩（例えば、Ａ
ｌＫ（ＳＯ₄）₂、ＡｌＮａ（ＳＯ₄）₂、ＡｌＮＨ₄（ＳＯ₄）、シリカ、ミョウバ
ン、Ａｌ（ＯＨ）₃、Ｃａ₃（ＰＯ₄）₂、カオリン、および炭素）、ポリヌクレオ
チド（例えば、ポリＩＣおよびポリＡＵ酸）、および特定の天然基質（例えば、
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のワックスＤ、な
らびにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ
ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、およびＢｒｕｃｅｌｌａ属のメンバーに見出される基質
）、ウシ血清アルブミン、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、エデスチ
ン、キーホールリンペットヘモシアニン、シュードモナストキシンＡ，コレラゲ
ノイド、コレラトキシン、百日咳トキシン、ウイルスタンパク質、ならびに真核
生物タンパク質（例えば、インターフェロン、インターロイキン、または腫瘍壊
死因子）を含む。このようなタンパク質は、当業者に公知の方法に従って、天然
または組換えの供給源から得られ得る。組換え供給源から得られる場合、非サポ
ニンアジュバントは、少なくとも分子の免疫原性部分を含むタンパク質フラグメ
ントを含み得る。本発明の実施において使用され得る他の公知の免疫原性巨大分
子は、ポリサッカライド、ｔＲＮＡ、代謝不可能な合成ポリマー（例えば、ポリ
ビニルアミン）、ポリメタクリル酸、ポリビニルピロリドン、４’，４−ジアミ
ノジフェニル−メタン−３，３’−ジカルボン酸および４−ニトロ−２−アミノ
安息香酸（Ｓｅｌａ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １６６：１３６５−１３７４（１
９６９）を参照のこと）の混合ポリ縮合物（相対的に高分子量を有する）、また
は糖脂質、脂質もしくは炭水化物を含むがこれらに限定されない。

【０１０８】 本発明の結合体は、広い範囲の用量、および投与される１つ以上の特定の抗原
に対する広い範囲の割合にわたって投与された場合にアジュバント効果を示す。

【０１０９】 この結合体は、個別に、または抗原に対する免疫応答の増強を達成するための
、他の実質的に純粋なアジュバントと混合されて投与され得る。

【０１１０】 本発明の結合体は、１つ以上の抗原に対する免疫応答を増強するために利用さ
れ得る。免疫応答を引き起こす本発明の組成物に適切な代表的な抗原は、以下の
いずれかに由来する抗原を含む：ウイルス（例えば、インフルエンザ、ネコ白血
病ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、狂犬病、麻疹、
Ｂ型肝炎、もしくは口蹄疫）；または細菌（例えば、炭疽、ジフテリア、ライム
病、もしくは結核）；または原生動物（例えば、Ｂａｂｅｏｓｉｓ ｂｏｖｉｓ
もしくはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ）。抗原はタンパク質、ペプチド、ポリサッカラ
イド、またはその混合物であり得る。タンパク質およびペプチドは、天然の供給
源から精製され得、固相合成の手段により合成され、または組換え遺伝学の手段
により得られ得る。

【０１１１】 本発明の結合体はまた、慢性感染疾患、とりわけ免疫無防備状態の患者におけ
る処置のために免疫系を強化するために単独で投与され得る。本発明の結合体が
治療的または予防的処置のために利用され得る、感染疾患の例は、米国特許第５
，５０８，３１０号に記載される。サポニン結合体による免疫系の強化はまた、
院内感染および／または手術後感染のリスクを制限するための予防措置として有
用であり得る。

【０１１２】 本発明の方法において有用な化合物の投与は、非経口的、静脈内、筋肉内、皮
下、鼻内、または任意の他の適切な手段によってなされ得る。投与される用量は
、年齢、体重、併用される処置の種類、もしあれば、投与される抗原の性質に依
存し得る。一般的に、サポニン／抗原結合体は、広い範囲の用量および投与され
る抗原に対する広い範囲の割合にわたって投与され得る。最初の用量の後に、免
疫原性応答を増強するために約４週間の期間後に追加免疫用量が続き得る。さら
なる追加免疫用量がまた、投与され得る。

【０１１３】 本発明の結合体は、経口投与のためのカプセル、液体溶液、エマルジョン、懸
濁液、もしくはエリキシルのような形態で、または滅菌液体形態（例えば、溶液
、エマルジョン、もしくは懸濁液）で利用され得る。任意の不活性キャリア（例
えば、生理食塩水、もしくはリン酸緩衝化生理食塩水）が、好ましくは使用され
るか、または化合物がその中で本発明の方法において使用される、任意のそのよ
うなキャリアは、本発明の方法における使用のために適切な可溶性の性質を有す
る。

【０１１４】 ここで本発明を十分に記載したが、当業者は、本発明の範囲またはその任意の
実施態様に影響することなく、条件、処方、および他のパラメーターの広範かつ
等価な範囲内で本発明を実施し得ることを認識する。本明細書中に引用されたす
べての特許および刊行物は、その全体が本明細書中に参考として十分に援用され
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０８Ｂ 37/06 Ｃ０８Ｂ 37/06 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C085 AA03 AA38 FF14 FF17 GG02 GG03 GG04 4C090 AA05 AA09 BA23 BA41 BA50 BA97 BB66 BD31 DA09 DA23

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポリサッカライド結合体であって、以下： （ｉ）抗原呈示細胞（ＡＰＣ）の細胞表面に結合し得るポリサッカライド；およ
   び （ｉｉ）安定なカルボニル基を有する１つ以上の分子であって、ここで該１つ以
   上の分子が芳香族アルデヒド、芳香族ケトン、シクロアルキルアルデヒド、シク
   ロアルキルケトン、シクロアルケニルアルデヒド、シクロアルケニルケトン、複
   素環式アルデヒド、複素環式ケトン、複素芳香族ケトン、複素芳香族アルデヒド
   、アルキルアルデヒド、アルキルケトン、アルケニルアルデヒド、およびアルケ
   ニルケトンからなる群から選択される、１つ以上の分子を含み、 ここで、ポリサッカライド（ｉ）が、（ｉｉｉ）直接的共有結合によってか、
   または二官能性リンカーを介して共有結合的に、安定なカルボニル基をインタク
   トに保つ様式において、分子（ｉｉ）に付着する、ポリサッカライド結合体。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のポリサッカライド結合体であって、ここで
   、前記安定なカルボニル基を有する分子が、直接的共有結合を介して前記ポリサ
   ッカライドに結合する、ポリサッカライド結合体。
3. 【請求項３】 請求項１に記載のポリサッカライド結合体であって、ここで
   、前記安定なカルボニル基を有する分子が、二官能性リンカー分子の残基を介し
   て前記ポリサッカライドに結合する、ポリサッカライド結合体。
4. 【請求項４】 請求項１に記載のポリサッカライド結合体であって、ここで
   、前記ポリサッカライドが、最低限２つの糖類を含有する、ポリサッカライド結
   合体。
5. 【請求項５】 請求項１に記載のポリサッカライド結合体であって、ここで
   、前記ポリサッカライドが、β−グルカン；マンナン；ペクチンポリサッカライ
   ド；および２−アセトアミドグルカンポリサッカライドからなる群から選択され
   る、ポリサッカライド結合体。
6. 【請求項６】 請求項１に記載のポリサッカライド結合体であって、ここで
   、前記安定なカルボニル基を有する分子が、一置換および二置換Ｃ_6-10アリール
   アルデヒド、Ｃ_6-10アリール（Ｃ_1-4）アルキルアルデヒド、およびこれらの混 合物からなる群から選択される、ポリサッカライド結合体。
7. 【請求項７】 請求項１に記載のポリサッカライド結合体であって、ここで
   、前記安定なカルボニル基を有する分子が、ホルミルまたはホルミル（Ｃ_1-4） アルキル置換基によって置換された、フェニルまたはナフチルであり、そして必
   要に応じて、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ_1-4アルキル、Ｃ_1-4アルコキシ、トリフルオ
   ロメチル、およびベンジルオキシからなる群から独立して選択される１つまたは
   ２つのさらなる置換基を含む、ポリサッカライド結合体。
8. 【請求項８】 請求項１に記載のポリサッカライド結合体であって、ここで
   、前記安定なカルボニル基を有する分子が、１つまたは２つのヒドロキシおよび
   ハロによって置換された、ベンズアルデヒドおよびナフトアルデヒドである、ポ
   リサッカライド結合体。
9. 【請求項９】 請求項１に記載のポリサッカライド結合体であって、ここで
   、前記安定なカルボニル基を有する分子が、２，３−、２，４−、２，５−、お
   よび３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド、５−クロロ−２−ヒドロキシベン
   ズアルデヒド、バニリン、エチルバニリン、ナリンゲニン、３−および４−ヒド
   ロキシベンズアルデヒド、または４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドであ
   る、ポリサッカライド結合体。
10. 【請求項１０】 請求項１に記載のポリサッカライド結合体であって、ここ
    で、前記安定なカルボニル基を有する分子が、ヒドロキシ置換Ｃ_1-4アルキル（ Ｃ_6-10）アリールケトン、およびヒドロキシ置換アリールケトンからなる群から
    選択される、ポリサッカライド結合体。
11. 【請求項１１】 請求項１に記載のポリサッカライド結合体であって、ここ
    で、前記安定なカルボニル基を有する分子が、２−ヒドロキシアセトフェノン、
    ３−ヒドロキシアセトフェノン、４−ヒドロキシアセトフェノン、および６−ヒ
    ドロキシ−１，２−ナフトキノンからなる群から選択される、ポリサッカライド
    結合体。
12. 【請求項１２】 請求項１に記載のポリサッカライド結合体であって、ここ
    で、前記安定なカルボニル基を有する分子が、ヘテロアリールアルデヒドおよび
    ヘテロアリールケトンからなる群から選択される、ポリサッカライド結合体。
13. 【請求項１３】 請求項１に記載のポリサッカライド結合体であって、ここ
    で、前記安定なカルボニル基を有する分子が、チオフェン、フラン、ベンゾチオ
    フェン、ベンゾフラン、ピリジン、キノリン、ピリダジン、ピリミジン、ピラゾ
    ール、イミダゾール、１，２，３−トリアゾール、１，２，４−トリアゾール、
    イソオキサゾール、またはオキサゾールであって、これらの化合物の各々が、ケ
    ト、ホルミルまたはホルミル（Ｃ_1-4）置換基を有し、好ましくはさらなるハロ またはヒドロキシ置換基が利用可能な環状炭素原子によって収容され得る場合に
    該これらの化合物の各々が該さらなるハロまたはヒドロキシ置換基を含む、ポリ
    サッカライド結合体。
14. 【請求項１４】 請求項１に記載のポリサッカライド結合体であって、ここ
    で、前記安定なカルボニル基を有する分子が、ピリドキサール、２−チオフェン
    カルボキシアルデヒド、および３−チオフェンカルボキシアルデヒドの１つであ
    る、ポリサッカライド結合体。
15. 【請求項１５】 請求項１に記載の結合体であって、ここで、前記二官能性
    リンカー分子の残基が、以下： Ｈ₂Ｎ−（ＣＨ₂）_r−ＮＨ₂、ここでｒは、２〜１２； ＨＯ−（ＣＨ₂）_r−ＮＨ₂、ここでｒは、２〜１２； ＨＳ−（ＣＨ₂）_r−ＮＨ₂、ここでｒは、２〜１２； 必要に応じて炭素保護されたアミノ酸；および、 Ｈ−（Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂）_n−ＯＨ、ここでｎは１〜４、 からなる群から選択される、結合体。
16. 【請求項１６】 請求項４に記載の結合体であって、ここで、前記二官能性
    リンカー分子が、以下： エチレンジアミン、１，４−ブタンジアミン、スペルミジン、２，４−ジアミノ
    酪酸、リジン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸、ジアラニン、トリアラニン、３
    ，３’−ジアミノジプロピルアミン、ジアミノプロピオン酸、Ｎ−（２−アミノ
    エチル）−１，３−プロパンジアミン、および２−（４−アミノフェニル）エチ
    ルアミン、 からなる群から選択される、結合体。
17. 【請求項１７】 請求項１に記載の結合体であって、ここで、前記二官能性
    リンカー分子が、以下： −ＮＨ−（ＣＨ₂）_r−ＮＨ−、ここでｒは２〜５、 −Ｏ−（ＣＨ₂）_r−ＮＨ−、ここでｒは２〜５、 −ＮＨ−ＣＨ₂−Ｃ（Ｏ）−、 −Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−、 −ＮＨ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ₂−、 −ＮＨ−Ｃ（ＣＨ₃）₂−Ｃ（Ｏ）−、 −Ｓ−（ＣＨ₂）_r−Ｃ（Ｏ）−、ここでｒは１〜５、 −Ｓ−（ＣＨ₂）_r−ＮＨ−、ここでｒは２〜５、 −Ｓ−（ＣＨ₂）_r−Ｏ−、ここでｒは１〜５、 −Ｓ−（ＣＨ₂）−ＣＨ（ＮＨ₂）−Ｃ（Ｏ）−、 −Ｓ−（ＣＨ₂）−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−ＮＨ−、 −Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ₂−Ｓ−ＣＨ（ＣＯ₂Ｈ）−ＮＨ−、 −Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ₂−Ｓ−ＣＨ（ＮＨ₂）−Ｃ（Ｏ）−、 −Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ₂−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−、 −Ｓ−ＣＨ₂−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−、および、 −ＮＨ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｏ−Ｐ（Ｏ₂Ｈ）−、 からなる群から選択される、結合体。
18. 【請求項１８】 請求項１に記載の結合体であって、ここで、前記ポリサッ
    カライドが、以下： β−グルカン；マンナン；ペクチンポリサッカライド；キチンおよびその誘導体
    ；ムレイン；細菌のフルクタン；キサンタン；細菌のヘテロ多糖；真菌のプルラ
    ン；ならびにこれらのエステル、スルホナート、サルフェート、ホスフェート、
    エーテルおよび架橋誘導体、 からなる群から選択される、結合体。
19. 【請求項１９】 請求項１に記載の結合体であって、ここで、前記ポリサッ
    カライドが、（１→３）結合β−Ｄ−グルコピラノシル単位の骨格を有し、そし
    て（１→６）結合によって結合するβ−Ｄ−グルコピラノシル単位を有し、分子
    量が約５，０００〜約５００，０００の間である、β−グルカンであって、ここ
    で、該β−グルカンが、必要に応じて１つ以上の陰イオン性基、陽イオン性基、
    または非イオン性基の付加によって修飾される、結合体。
20. 【請求項２０】 請求項１に記載の結合体であって、ここで、前記ポリサッ
    カライドが、末端の還元マンノシル残基またはそのアセチル化産物を有する、（
    １→４）ポリマンノースを含む、β−マンナンである、結合体。
21. 【請求項２１】 請求項１に記載の結合体であって、ここで、前記ポリサッ
    カライドが、ヘモガラクツロナン、ラムノガラクツロナン、アラバン、ガラクタ
    ン、およびアラビノガラクタンからなる群から選択されるペクチンポリサッカラ
    イドであって、ここで前記ペクチンポリサッカライドが、免疫強化活性を有する
    、結合体。
22. 【請求項２２】 薬学的組成物であって、以下、 請求項１に記載のポリサッカライド結合体、および、 薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤、 を含有する、薬学的組成物。
23. 【請求項２３】 請求項２２に記載の薬学的組成物であって、さらに前記ポ
    リサッカライド結合体との混合物中の抗原を含有する、薬学的組成物。
24. 【請求項２４】 ワクチンであって、以下： （ａ）請求項１に記載のポリサッカライド結合体； （ｂ）免疫学的有効量の抗原；および （ｃ）薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤、 を含有する、ワクチン。
25. 【請求項２５】 動物において免疫応答を増強するための方法であって、該
    方法が、そのような増強の必要な動物に対して、該動物の免疫応答を増強する有
    効量の請求項２２に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
26. 【請求項２６】 動物において、抗原に対する免疫応答を増強するための方
    法であって、該方法が、該動物の該抗原に対する免疫応答を増強する有効量の請
    求項２４の組成物を投与する工程を包含する、方法。
27. 【請求項２７】 動物をワクチン接種する方法であって、該方法が、該動物
    に請求項２４に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。