SE466289B - Makrofagstimulerande komposition jaemte foerfarande foer dess framstaellning - Google Patents

Makrofagstimulerande komposition jaemte foerfarande foer dess framstaellning

Info

Publication number
SE466289B
SE466289B SE8404699A SE8404699A SE466289B SE 466289 B SE466289 B SE 466289B SE 8404699 A SE8404699 A SE 8404699A SE 8404699 A SE8404699 A SE 8404699A SE 466289 B SE466289 B SE 466289B
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
glucan
water
product according
coupling
coupling product
Prior art date
Application number
SE8404699A
Other languages
English (en)
Other versions
SE8404699D0 (sv
SE8404699L (sv
Inventor
James Hoffman
Jarl Boegwald
Karl Olov Peter Larm
Rolf Seljelid
Original Assignee
James Hoffman
Jarl Boegwald
Karl Olov Peter Larm
Rolf Seljelid
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by James Hoffman, Jarl Boegwald, Karl Olov Peter Larm, Rolf Seljelid filed Critical James Hoffman
Priority to SE8404699A priority Critical patent/SE466289B/sv
Publication of SE8404699D0 publication Critical patent/SE8404699D0/sv
Priority to DE8585850286T priority patent/DE3585193D1/de
Priority to EP85850286A priority patent/EP0175667B1/en
Priority to AT85850286T priority patent/ATE71527T1/de
Priority to US06/777,527 priority patent/US4795745A/en
Priority to JP60205498A priority patent/JPH072643B2/ja
Publication of SE8404699L publication Critical patent/SE8404699L/sv
Publication of SE466289B publication Critical patent/SE466289B/sv

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Description

466 289 10 15 20 25 30 35 2 tion, där blod bringas att passera över ytor belagda med ß-1,3-bundna Q-glukaner. Andra medicinska applikationer redovisas i det följande i framställningens exempeldel.
Genom föreliggande uppfinning åstadkommas sålunda en makrofagstimulerande kopplingsprodukt som kännetecknas av att den består av en vattenlöslig ß-1,3-bunden glukan el- ler den vattenlösliga fraktionen av en syradegraderad vat- tenolöslig ß-1,3-bunden glukan jämte en vattenolöslig bä- rare innehållande aminogrupper, till vilken glukanen är immobiliserad genom kovalent koppling.
Som exempel på ß-1,3-bundna Q-glukaner användbara vid föreliggande uppfinning kan nämnas laminaran, kurdlan och pachyman.
Med uttrycket "makrofag" såsosm det användes i före- liggande framställning avses mononukleära fagocyter, vil- ket är ett ur ventskaplig synpunkt mer adekvat uttryck.
Tekniken enligt föreliggande uppfinning kan sålunda primärt användas för aktivering av mononukleära fagocyter hos djur innefattande människan. Detta innebär att kopp- ~lingsprodukten enligt föreliggande uppfinning kan användas för förbättring av kroppsförsvaret hos djur t.ex. mot in- fektioner och cancer, speciellt människor och kommersiellt utnyttjningsbara djur. Sådana tilltänkta användningsområ- den verifieras genom de experimentella försök som redovi- sas fortsättningsvis i föreliggande framställning.
Glukanens immobilisering åstadkommas företrädesvis genom kovalent koppling till en lämplig bärare. Speciellt föredraget är användning av bärare, vilka innehåller ami- nogrupper, till vilka glukanen är kopplad. Den föredragna tekniken innebär sålunda att bärarens yta först aktiveras genom införande av aminogrupper. Glukanen modifieras på ett sådant sätt, att den kovalent kan bindas till den ami- nerade ytan. Bärarens karaktär är icke kritisk och använd- ning av olika typer av plaster är tänkbar liksom även an- vändning av aminerade geler eller proteiner. 's 10 15 20 25 30 35 466 289 3 Tekniken för kovalent koppling av en glukan till en yta under utnyttjning av bindning till amingrupper är så- som tidigare antytts teknik för immobilisering. Som exem- pel kan en ß-1,3-bunden Q-glukan degraderas i en lämplig syra, företrädesvis en stark syra, exempelvis myrsyra och 'behandlas sedan med 2-kloracetaldehyddimetylacetal för substitution med Q-(2,2'-dimetoxietyl)-grupper. Sålunda substituerad glukan behandlas därefter med syra till bild- ning av aldehydgrupper, varefter den aldehydsubstituerade glukanen bringas i kontakt med en bärare innehållande ami-.h nogrupper i närvaro av cyanoborhydrid, varvid åstadkommes kovalent koppling till bäraren. I ett annat exempel in- föres epoxifunktioner i en glukan genom aktivering med epiklorhydrin. När den epoxiaktiverade glukanen bringas i kontakt med en bärare innehållande aminogrupper reagerar dessa med epoxigrupperna varvid glukanen bindes kovalent till bäraren. Detaljer beträffande kopplingstekniken fram- går i följande konkreta exempel. Återkommande till uppfinningens tillämpning har det konstaterats, att i enlighet med uppfinningen immobili- serade ß-1,3-bundna Q-glukaner uppvisar cytostatisk effekt ooh antibakteriell effekt. Det förhållandet att immobili- serade ß-1,3-bundna Q-glukaner aktiverar makrofager så att de åstadkommer cytostatisk effekt visas i föreliggande framställning genom användning av tumörceller och makro- fager i kultur på vävnadsodlingsplattor överdragna med ß- l,3-bundna D-glukaner. Resultaten redovisas nedan i exemp- len.
Det faktum att immobiliserade ß-1,3-bundna makrofager uppvisar antibakteriell aktivitet visas i framställningen genom att ß-1,3-bundna Q-glukaner kopplade till polysty- renkulor förhindrar peritonit hos möss infekterade med pneumokocker eller streptokocker. Resultaten i anslutning härtill är entydiga i det att alla försökdsdjur i kon- trollgruppen avled,.medan samtliga djur behandlade med glukanöverdragna polystyrenkulor överlevde. 466 289 10 15 20 ~=25 30 35 4 Den makrofagstimulerande kopplingsprodukten enligt uppfinningen kan lämpligen ingå som aktiv beståndsdel i en komposition i kombination med en farmaceutiskt acceptabel bärare.
Den makrofagstimulerande kopplingsprodukten enligt föreliggande uppfinning kan på konventionellt sätt formu- leras för användning inom human- eller veterinärmedicinen.
Kompositionen eller den farmaceutiska beredningen kan in- nehålla de aktiva beståndsdelarna i förening med en farma- ceutiskt acceptabel bärare, som kan vara fast, halvfast eller flytande beroende på administrationssättet och andra aktuella förhållanden. Det kan även ibland vara lämpligt att använda en bionedbrytbar bärare. De aktiva bestånds- delarna kan även användas som sådana utan tillsats av bä- rarmaterial. Kompositionerna framställes helt i enlighet med konventionell farmaceutisk praxis.
Såsom tidigare antytts är de mononukleära fagocyter- nas funktion av central betydelse för kroppens försvar både vid påverkan inifrån och utifrån. Genom föreliggande uppfinning tillhandahålles kopplingsprodukter, vilka har förmåga att helt allmänt aktivera kroppens försvarssystem, exempelvis mot tillväxt av cancerceller, infektioner etc.
Sådana tillämpningar är aktuella på ryggradsdjur av olika slag, innefattande däggdjur jämte människan och fiskar.
För att minska benägenheten till uppkomst av sjukdomar hos exempelvis fiskar som odlas under kontrollerade förhållan- den, kan kopplingsprodukterna enligt föreliggande uppfin- ning med fördel tillföras fiskarnas miljö, antingen direkt i vattnet där odlingen utföres eller som tillsats till fö- dan. Uppfinningen är speciellt användbar i anslutning till odling av ädelfisk, såsom lax, forell_eller liknande ar- ter. _ _ Uppfinningen kommer i det följande att beskrivas närmare genom konkreta exempel. Beskrivningen sker i anslutning till bilagda ritning där gi 10 15 20 466 289 I fíg. 1 visar i stapelform stimuleringsindex för några plastytor; .V fíg. 2 visar införlivníng av L-929-celler i samodling med makrofager odlade pá olika plastytor.
BIOLOGISK METODIK.
Makrofagkulturer Peritoneala celler från hybrid C302 (CSH / Tifx x DBA / 1 möss (7 x 105 celler/brunn) överfördes på täckglas (diameter 14 mm) till cirkulära brunnar i Costar-plattor för vävnadsod- ling (Costar, Cambridge, Mass. USA). Efter tvâ timmar i kultur sköljdes celler som ej fastnat på botten av brunnen bort. Celleu na hölls i kultur i Eagles medium med Earles salt (DME) (Gibco Biocult Ltd. 3 Washington Road, Paisley, Scotland) i 5% v/v C02 i luften och 37°C med eller utan tillsatt serum. Alla media in- nehöll penicillin (100 I.U./ml) och streptomycin (100 /ug/ml).
Scanning electron microscopy (SBM) Makrofagkulturer fixerades i 2,S% glutaraldehyd (Merck) i 0,1 M cacodylat buffert pH 7,3 och 0,1 M sucrose. Cellerna de- hydrerades i ökande koncentrationer av etanol "critical point" torkades i (Hitachi, CPI, Tokyo, Japan) koldioxid. Preparation- erna monterades, täcktes med guld (Polaron SEM Coating Unit 1: sooo) och anaiyserades i en Hitachi sm (Husum med zo kv f 466 289 10 15 20 25 30 35 och en lutningsvínkel pà 15°. Bilderna togs med en Kodak tri-X pan (TX P-120)film. 212 _ I experimenten med B16 melanoma användes inavlade C57BLmöss. I resten av studierna erhölls makrofagerna från hybrid C3D2 (C3H Tíf x DBA / 2)möss. Alla djur erhölls från Gl. Bom- holtgárd Ltd. Ry, Danmark.
KEMISK METODIK.
Curdlan erhölls från Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan, amylosetyp III från Sigma, St. Louis, USA, lamina- ran från United States Biochemical Corp., Cleveland, USA, poly- mera aminoföreningar Polymín SN® och Polymin P® från Ludwigs- hafen, Västtyskland. Amínerade polystyrenkulor erhölls från Uglestad, Norge och aminerade plattor från Falcon. Uvriga ke- mikalier erhölls från Merck, Darmstadt, Västtyskland.
Sockeranalys Substanser innehållande aktuella kolhydrater (10 mg) behandlades tillsammans med intern standard'(my3-inositol, 1 mg) med trifluorättíksyra (0,5 M, 2 ml) under 12 tim. vid 100°C, neutraliserades (BaC03), filtrerades och reducerades (NaBH4, 10 mg). Efter 2 tim. justerades pH till ca 5 med sur jonbytare (Dowex S0) och provet filtrerades samt índunstades till torrhet tillsammans med metanol (3x2S ml). Provet acetyle- rades med ättiksyraanhydrid.( 1ml) och pyridín ( 1 ml) under 15 min. och 100°C. Provet índunstades till torrhet och analy- serades gaskromatografiskt.
EXEMPEL 1, Modifieringéav glukaner genom införande av aldehyd- funktion.
Kurdlan, som är en vattenolöslig ß-1,3-bunden Q-glukan, degraderades i myrsyra (90%, aq) 90°C under 20 min. enligt K.
Ogawa, I. Tsurugi och T. Natanabe, The dependence of the conforma tion of a (1+3)-B-Q-glucan on chain length in alkaline solution, Carbohydr. Res. 29 (1973) 397. Den partiellt degraderade kurd- lanen separerades i_en vattenlöslíg och en vattenolöslig frak- tion. Den vattenlösliga fraktionen reducerades med natriumbor- hydrid (10 mg/g) í vattenlösníng, dialyserades och frystorkades.
Den vattenlösliga kurdlanfraktíonen, laminaran (en vatten- löslíg B-1,3-bunden Q-glukan), amylose (en vattenlöslíg a-1,4- 10 15 20 25 30- 35 466 289 bunden Q-glukan) alkylerades enligt S. Hakomori, A rapid per- I methylation of glucolipid and polysaccharide catalyzed by metylsulfinyl carbanion in dímethylsulfoxide, I. Biochem., (Tokyo) 55 (1964) 205. Polysackariden (0,5 g) löstes i torr edimetylsulfoxid (20 ml) i en serumflaska under kvävgas. Med hjälp av en injektionsspruta tillsattes 2 M natriummetylsufinyl- methanide (8 ml). Efter omrörning i ett ultraljudbad vid S0°C under 30 min. fick reaktíonsblandníngen stå í rumstemperatur över natt. 2-kloracetaldehyddímetylacetal (5 ml) tillsattes gradvis med injektionsspruta. Efter omrörning i U-bad vid 50°C och 60 min. hälldes reaktíonsblandníngen i vatten och dialyse- rades mot destillerat vatten. Frystorkning gav ca 0,45 g av gly- kan substituerad med Q-(2,21-dimetoxietyl)-grupper. Substitu-- _ tionsgraden bestämdes med 1H-n.m.r. Reaktionsförloppets första steg illustreras nedan. ocfls ”'29” çnzocuz--cizn ° 0 1. sas 0 Low, \ 0\ Ho 9°"3 H _ 2. c1-cH -cH ° OH 2 | 0 ocH3 H Amylose, partie1lt.degraderad curdlan och lamínaran, hade ett genomsnitt av 0,7, 0,5 resp. 0,4 Q-(2,21-dimetoxietyl)grupper på varje monomer glukosenhet. H-n.m.r. spektra kördes vid 90 MHz i D20 vid 8S°C í ett Jeol FX 90 Q n.m.r.-instrument.
Den Q-(2,21-dimetoxietyl)substituerade glukanen (0,4g) behandlades med saltsyra (25 ml, 0,05 M) vid 100°C under 20 min., neutraliserades (0,5 M NaOH), dialyserades mot destille- rat vaten och frystorkades. Utbyte 0,35 g. polysackarid substi- tuerad med aldehydgrupper. Reaktionsförloppets andra steg kan illustreras enligt följande: 9cH3 _ V cflzocnz-En cH2pcH¿cHo' °“ °°"3 Hc1 (aq) Û Ho Ho OH OH 466 289 8 10 15 20 25 30 35 EXEMPEL 2, Modifiering av glukaner genom införande av epoxi- funktion.
Laminaran (S g) löstes i 60 ml destíllerat vatten. Epi- klorhydrin (10 ml), 2 M natriumhydroxidlösning aq (30 ml) och natríumborhydrid (200 mg) tillsattes. Blandningen fick stå un- Eder omrörning vid rumstemperatur över natt, dialyserades mot ättiksyra (10%, 1 liter) och destíllerat vatten (S 1) indunsta- des till en mindre volym (50 ml) och frystorkades. Utbyte av epoxiaktiverad laminaran 4,5 g. Reaktionen illustreras nedan: CH2°OH cHZocHZcH-ÉHZ 1. Bas 0 °\ _r_i °\ /'\ H0 z. cHZ-cH-cnzcï _ H0 ou OH EXEMPEL 3, Periodatoxídation av amylose.
Amylos är en linjär u-1,4-bunden Q-glukan, som oxideras av periodat (NaIO4) enligt följande. Amylos (16,2 g) löses i vatten (200 ml) varefter en lösning av NaIO4 (2,0g) i vatten (S0 ml) tillsättes. Den sålunda erhållna lösningen får stå ö- ver natt under omrörning. Materialet dialyseras och frystorkas.
Utbyte 14,5 g. Reaktionen illustreras nedan: °"2°" cHZoH 9 Na1o4 0 .. ____> >L ._ Û Û _' H 0_ - o cHo cHo on EXEMPEL 4, Sulfatering av amylose.
Amylose (0,5 g) löses i dimetylsulfoxid (4 ml). Ett sva- veltrioxid-pyridin komplex (3 g) tillsätts och blandningen om- röres vid 40°C under 60 min. Krossad is tillsättes (10 g) och vatten (5 ml). Därefter neutraliseras blandningen till pH 7 med natriumhydroxid (2 M). Produkten fälls i etanol, dialyseras och frystorkasl Utbyte 0,4 g.
EXEMPEL 5, Modifiering av plastytor.
En vattenhaltig lösning av polymin SN® (0,005%, w/w) och periodatoxiderad amylose (0,S%, w/w), framställd som i Exempel 10 15 20 9 _ 466 289 3, justeras till pH 9 (IM NaOH) och sättes till varje brunn i en platta för vävnadsodling. Brunnarna tvättas med destillerat vatten och en vattenlösning av amylossulfat (0,02%, w/w, pH3) framställd som i Exempel 4 tillsättes vid 50°C. Efter 5 min. tvättas brunnarna med vatten. Proceduren upprepas två gånger och efter den sista tillsatsen av amylossulfat adderas en 0,01% vattenlösning av Polymin SN vid pH 3. Efter 5 min. tvättas brun narna med destillerat vatten.
EXEMPEL 6, Koppling av aldehydoglukan enligtÅExempe1 1 till pla' för vävnadsodling_modífierad enligt Exempel 5.
Glukan (4 mg) substituerad med aldehydgrupper, framställ< som i Exempel 1, löses i 2 ml fosfatbuffert (pH 7,0, 0,2 M). Til varje brunn hos plattan för vävnadsodling ënligt Exempel 5 sätte glukanlösningen (0,1 ml, 0,1 M), fosfatbuffert (2,6 ml, pH7,0) och natríumcyanoborhydrid (100/ug). Plattorna får stå í rumstem- peratur över natt, tvättas med destillerat vatten och torkas i rumstemperatur. Sockeranalys visade att 0,01 mg glukan bundits till varje brunn. Kopplíngsförloppet visas schematiskt nedan: CH ZOCOCHZCHO 0Q\ _ NH NaBH3CN ZNH / 0 CHZOCHZCH \\ OH 466 289 1” 10 15 20 25 30 EXEMPEL 7, Koppling av aldehydoglukan enligt Exempel 1 till aminerade)polystyrenplattor.
Glukan (4 mg), substituerad med aldehydgrupper enligt Exempel 1 kopplas till brunnarna i kommersiella aminerade po- lystyrenplattor för vävnadsodling enligt Exempel 6. (FalconR " '3847 PRIMARIA cuLruRE PLATEs). sockemnnys visade atv-0,005 mg glukan bundits till varje brunn.
EXEMPEL 8, Koppling av aldehydoglukan enligt Exempel 1 till aminerade polymetakrylatkulor.
Glukan (4 mg), substítuerad med aldehydgrupper enligt Exempel 1 löses i 25 ml fosfatbuffert (pH 7,0, 0,2M). Till denna lösning sättes aminerade plastkulor (0,2 g) med en dia-' meter av 2,4/um framställda genom copolymerísering av 2,3- epoxipropylmetakrylat och etylenglykoldimetakrylat enligt J.
Uglestad, P.C. Mörk, K.M. Kaggerud, T. Ellingsen och A. Berge 'SWELLING OF OLIGOMER-POLYMER PARTICLES. NEW METHODS OF PREPA- RATION OF EMULSIONS AND POLYMER DISPERSIONS. §§v.Co1loid Inter- face §gi. lå (1980) 101. Därjämte tillsättes natriumcyanobor- hydrid (0,005 g). Reaktionsblandningen skakas vid rumstempera- itur över natt, filtreras på glasfilter och tvättas upprepade gånger med destillerat vatten. Kulorna lufttorkas i rumstempera- tur .
EXEMPEL 9, Koppling/av epoxiglukan enligt Exempel 2 till plast- ytor enligt Exempel 5.
En 1% lösning av epoxiaktiverad laminaran, framställd som i Exempel 2, löstes i fosfatbuffert (0,2 M, pH 7,0) och sattes till varje brunn hos en platta för vävnadsodling modi- fíerad som i Exempel 5. Plattorna fick stå i rumstemperatur ö- ver natt, tvättades med destillerat vatten och torkades i rums- temperatur. Sockeranalys visade att 0,005 mg glukan bundits till varje brunn. Reaktionen för kopplingen illustreras sche- matiskt nedan: A (ä: cH NH R CHZocHZcH-cnz cnzocnz 2 - 0 R-N 0 o\ H2 0\ H0 H0 OH OH 10 15 20 25 30 35 11 466 289 EXEMPEL 10. Stimulering av makrofager med ytor klädda med immobiliserade glukaner enligt Exemplen 6, 7 och 9.
Till makrofagkulturer, i brunnar av vävnadsodlingsplat- tor med och utan immobilíserad B-1,3-bunden Q-glukan, sättes 14C-märkt D-glukosamin. En ökad inkorporering av D-glukosamin i glykoproteiner i makrofager är en aktiveríngsparameter för makrofager. Efter ett dygn löses cellerna i 5% triklorättiksyra och icke inkorporerat, radioaktivt Q-glukosamin tvättas bort.
De tvättade cellerna löses i natríumhydroxid ( 1M). När allt cellmateríal är löst överföres lösningen till mätkyvetter och radioaktiviteten mäts i en scintillationsräknare. Aktiverings- graden uttrycks genom kvoten: cpm 14C glukosamin polysackaridstimulerade makrofz Stimulering = 14 cpm C glukosamin enbart makrofager De bästa resultaten erhölls från plattor aktiverade enligt Exempel 6. Resultaten redovisas i Figur 1, som förklaras nedan.
EXEMPEL 11. Cytostatisk effekt av makrofager aktiverade på platt för vävnadsodling, klädda med B-1,3-bundna D-glukane Målceller (2 x 104 celler/brunn) behandlades med trypsin och sattes till makrofagkulturerna i närvaro av glukanklädda plastytor enligt Exempel 6, 7 och 9. Efter olika tider tillsat- tes 0,5 /uCi/ml radioaktivt thymidin (metyl - 3H, New England Nuclear, Dreieich, Västtyskland) till kulturerna. Inkorporering- en mättes efter en inkubationsperiod av 24 timmar. Efter skörd a kulturerna fälldes det högmolekylära materialet med 1 M perklor- syra och tvättades noggrannt före upplösning i 1 M natriumhyd- roxidlösning. Det upplösta materialet överfördes till mätceller och analyserades_i en scintillationsräknare (Packard Instruments International, Zürich, Schweiz). De bästa resultaten erhölls från plattor modifierade enligt Exempel 6. De övriga gav godtag- bara resultat. Resultaten redovísas í Fig. 2 som förklaras ne- dan. .
EXEMPEL 12. Försök avseende antibakteriell effekt.
För undersökning av den antíbakteriella effekten in vivo injicerades intraperitonealt-106 virulenta pneumokocker på möss som i förväg behandlats med endera B-1,3-bundna glukanbesatta 466 10 15 20 25 _30 35 12 289 polymetakrylatkulor enligt Exempel 8 eller koksaltlösning.
I koksaltlösningsgruppen (4 djur) blev samtliga möss sjuka efter 24 timmar och avled efter 48 timmar, medan i den glu- kanbehandlade gruppen (8 djur) inget av djuren uppvisade syn- liga tecken på sjukdom och inga avlidit en vecka senare.
Försöket upprepades under injicering av virulent strep- tococcus viridans och med polymetakrylatkulor behandlade med B-1,3-bundna Q-glukaner och djuren uppvisade inga tecken på sjukdom. Försöken har upprepats tre gånger med samma resultat.
Graden av stimulering av makrofager bestämdes genom mor- f010gí (SEN), ínförlívning av C-glukosamin och genom cytosta- tisk verkan på màlceller av typen L-929.
Makrofager odlade på aminerad plast (mikrotiterplatta enligt Exempel 5) eller plast med immobiliserad amylos inför- livade något mer 14C-glukosamin än celler odlade på obhandlad plast. Däremot erhölls en tiofaldig förhöjning i införlivning- en av 14C-glukosamin när makrofager odlades på ytor innehållan- de immobiliserad laminaran eller kurdlan. Detta förhållande framgår av bilagda Pig. 1, som visar införlivníngen av radio- aktiv 14 C-glukosamin i makrofager odlade i 48 timmar på mikro- titerplattor av modifierad plast. I Pig. 1 avser stimulerings- iindex införlivning (cpm) i stimulerade makrofager dividerade med införlivning i normala ostimulerade makrofager.
I figuren avser stapel 1 aminerad plast, stapel 2 avser plast med immobiliserad amylos, medan staplarna 3 och 4 avser plast med immobiliserad kurdlan resp. immobiliserad laminaran, där koppling av glukanen utförts enligt Exempel 5. Resultaten i figuren avser medelvärde f standarddeviation.
Q Som framgår-av Fig. 1 innebär tillämpning av tekniken enligt föreliggande uppfinning en väsentlig förhöjning av mak- rofagernas stimulering.
Den cytostatiska effekten av makrofager studerades ge- nom uppmätning av införlivningen av radioaktivt 3H-tymidin i L-929-celler under samodling. Ostimulerade makrofager har viss cytostatisk effekt på L-929-celler, och i ett typiskt experi- ment införlivade odling av enbart L-929-celler ca 55 000 cpm.
I närvaro av ostimulerade makrofager införlivade en motsvarande odling av L-929-celler ca 15 000 cpm. 100% i Fig. 2 L-929-cel- 13 - 466 289 ler i samodlíng med makrofager på aminerad plast införliva- de ca 50% mindre SH-tymídin än L-929-celler i samodling med ostimulerade makrofager. Detta illustreras i bilagda Pig. 2, där införlívningen av radioaktivt tymidin visas för ett antal odlingar av L-929-celler med makrofager. Stapel 1 visar od- ling i plattor av omodifíerad plast, stapel 2 visar motsva- 'rande pd1ing~utförd i plattor av aminerad plast, medan stap- larna 3, 4 och 5 visar odling utförd i plattor av plast med immobilíserad amylos, kurdlan resp. laminaran. Tillämpning av tekniken enligt föreliggande uppfinning ger som synes en dras- tisk tillväxthämmande effekt genom den stimulering av makro- fagerna som ástadkommes.

Claims (8)

.W 466 289 PATENTKRAV
1. Makrofagstimulerande kopplingsprodukt, k ä n n e t e c k - n a d därav, att den består av en vattenlöslig B-1,3-bunden glukan eller den vattenlösliga fraktionen av en syradegraderad vattenolös- lig B-1,3-bunden glukan jämte en vattenolöslig bärare innehållande aminogrupper, till vilken glukanen är immobiliserad genom kovalent koppling. _
2. Kopplingsprodukt enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k - n a d därav, att glukanen är utvald ur gruppen bestående av lami- naran, kurdlan och pachyman.
3. Kopplingsprodukt enligt kravet 1 eller 2, k ä n n e t e c k- n a d därav, att glukanen är kurdlan eller laminaran.
4. Kopplingsprodukt enligt något av de föregående kraven för användning till aktivering av mononukleära fagocyter.
5. Kopplingsprodukt enligt något av kraven 1-3 för användning till att hämma tillväxten av cancerceller.
6. Kopplingsprodukt enligt något av de föregående kraven för användning till att förbättra kroppsförsvaret hos djur , speciellt människor och kommersiellt utnyttjningsbara djur.
7. Kopplingsprodukt enligt något av de föregående kraven, k ä n - n e t e c k n a d därav, att bäraren utgöres av en plast, en amine- rad gel eller ett protein.
8. Förfarande för framställning av en kopplingsprodukt enligt något av de föregående kraven bestående av en vattenlöslig ß-l,3- bunden glukan eller den vattenlösliga fraktionen av en syradegrade- rad vattenolöslig B-1,3-bunden glukan jämte en vattenolöslig bärare till vilken glukanen är immobiliserad genom kovalent koppling, k ä n n e t e c k n a t därav, att en olöslig 3-1,3-bunden glukan degraderas i syra och att den vattenlösliga fraktionen därav eller en vattenlöslig B-lfïïbunden glukan behandlas med 2-kloracetalde- hyddimetylacetal för substitution med Q-(Z,2'-dimetoxiety1)gruppen, och att substituerad glukan behandlas med syra till bildning av al- dehydsubstitufion'varefter den aldehydsubstituerade glukanen bringas i kontakt med en aminogrupper innehållande bärare i närvaro av cya- noborhydrid under kovalent koppling till bäraren.
SE8404699A 1984-09-19 1984-09-19 Makrofagstimulerande komposition jaemte foerfarande foer dess framstaellning SE466289B (sv)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE8404699A SE466289B (sv) 1984-09-19 1984-09-19 Makrofagstimulerande komposition jaemte foerfarande foer dess framstaellning
DE8585850286T DE3585193D1 (de) 1984-09-19 1985-09-17 Macrophage aktivierende zusammensetzung und ein verfahren zu ihrer herstellung.
EP85850286A EP0175667B1 (en) 1984-09-19 1985-09-17 Macrophage-activating composition and a process for its manufacture
AT85850286T ATE71527T1 (de) 1984-09-19 1985-09-17 Macrophage aktivierende zusammensetzung und ein verfahren zu ihrer herstellung.
US06/777,527 US4795745A (en) 1984-09-19 1985-09-19 Macrophage-activating composition and a process for its manufacture
JP60205498A JPH072643B2 (ja) 1984-09-19 1985-09-19 大食細胞活性化組成物およびその製造方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE8404699A SE466289B (sv) 1984-09-19 1984-09-19 Makrofagstimulerande komposition jaemte foerfarande foer dess framstaellning

Publications (3)

Publication Number Publication Date
SE8404699D0 SE8404699D0 (sv) 1984-09-19
SE8404699L SE8404699L (sv) 1986-03-20
SE466289B true SE466289B (sv) 1992-01-27

Family

ID=20357069

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE8404699A SE466289B (sv) 1984-09-19 1984-09-19 Makrofagstimulerande komposition jaemte foerfarande foer dess framstaellning

Country Status (6)

Country Link
US (1) US4795745A (sv)
EP (1) EP0175667B1 (sv)
JP (1) JPH072643B2 (sv)
AT (1) ATE71527T1 (sv)
DE (1) DE3585193D1 (sv)
SE (1) SE466289B (sv)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5223491A (en) * 1989-11-09 1993-06-29 Donzis Byron A Method for revitalizing skin by applying topically water insoluble glucan
WO1992013896A1 (en) * 1991-02-01 1992-08-20 Bioglucans, L.P. Soluble glucans
DE4109282A1 (de) * 1991-03-21 1992-09-24 Stihl Maschf Andreas Schneidgeraet, insbesondere fuer graeser
JPH05262654A (ja) * 1992-03-18 1993-10-12 Kaken Pharmaceut Co Ltd 慢性疲労症候群治療剤
US5292513A (en) * 1992-05-18 1994-03-08 Anthony G. Gristina Method for nonspecific cellular immune stimulation
US5972717A (en) * 1995-05-10 1999-10-26 The Blood Center Research Foundation, Inc. Method and kit for detecting heparin induced thrombocytopenia
AU1672397A (en) * 1996-02-15 1997-09-02 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Brain activators
US5972718A (en) * 1996-02-28 1999-10-26 The Blood Center Research Foundation Method of detecting heparin-induced thrombocytopenia
US5843186A (en) * 1996-12-20 1998-12-01 Implemed, Inc. Intraocular lens with antimicrobial activity
GB2325233B (en) * 1997-05-16 2001-07-18 Norsk Hydro As Substrates having bound polysaccharides and bacterial nucleic acids
SE522410C2 (sv) * 1997-06-06 2004-02-10 Biotec Pharmacon Asa Beta 1-3-glukanderivat med immunomodulerande verkan
IL135148A0 (en) * 1997-10-03 2001-05-20 Galenica Pharmaceuticals Inc A polysaccharide conjugate and pharmaceutical compositions containing the same
GB0112649D0 (en) * 2001-05-24 2001-07-18 Isis Innovation Macrophage receptor
GB0211118D0 (en) 2002-05-15 2002-06-26 Polonelli Luciano Vaccines
KR100563616B1 (ko) * 2004-05-20 2006-03-22 그린텍이십일 주식회사 베타글루칸 유도체, 그의 제조방법 및 베타글루칸유도체를 이용한 유착방지제, 그의 제조방법
US20060172438A1 (en) * 2004-10-04 2006-08-03 David Milunic Methods and kits for detecting heparin/platelet factor 4 antibodies
MX2007013725A (es) * 2005-05-05 2008-04-09 Sensient Flavors Inc Produccion de beta-glucanos y mananos.
JP2007297322A (ja) * 2006-04-28 2007-11-15 Toyobo Co Ltd サイトカイン産生の促進方法
CN119530153B (zh) * 2024-12-18 2025-08-15 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 β-葡聚糖诱导巨噬细胞分泌的非炎性微囊泡在治疗炎症中的应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2560532C2 (sv) * 1974-11-26 1988-11-10 Takeda Chemical Industries, Ltd., Osaka, Jp
FR2360310A1 (fr) * 1976-08-03 1978-03-03 Ajinomoto Kk Solution antitumorale aqueuse et son procede de preparation
US4156066A (en) * 1977-06-23 1979-05-22 Tyndale Plains - Hunter Ltd. Polyurethane polymers characterized by lactone groups and hydroxyl groups in the polymer backbone
JPS56115727A (en) * 1980-02-19 1981-09-11 Kuraray Co Ltd Carrier for immobilizing physiologically active substance
JPS5747493A (en) * 1980-09-02 1982-03-18 Fuji Photo Film Co Ltd Method of determining a trace amount of enzyme
JPS5840301A (ja) * 1981-09-03 1983-03-09 Takara Shuzo Co Ltd 抗腫瘍活性を有するβ−１，３−グルカン
SE456911B (sv) * 1983-12-19 1988-11-14 Olle Larm Vattenloeslig, aminerad beta-1,3-bunden d-glukan och makrofagstimulerande komposition innehaallande densamma

Also Published As

Publication number Publication date
ATE71527T1 (de) 1992-02-15
JPH072643B2 (ja) 1995-01-18
EP0175667A2 (en) 1986-03-26
SE8404699D0 (sv) 1984-09-19
EP0175667B1 (en) 1992-01-15
DE3585193D1 (de) 1992-02-27
JPS61118320A (ja) 1986-06-05
EP0175667A3 (en) 1986-12-17
US4795745A (en) 1989-01-03
SE8404699L (sv) 1986-03-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SE466289B (sv) Makrofagstimulerande komposition jaemte foerfarande foer dess framstaellning
Walvoort et al. Automated solid-phase synthesis of hyaluronan oligosaccharides
Maeda et al. Denaturation and renaturation of a β-1, 6; 1, 3-glucan, lentinan, associated with expression of T-cell-mediated responses
Coombe et al. Heparan sulfate-protein interactions: therapeutic potential through structure-function insights
US4707471A (en) Water-soluble aminated β-1,3-bound D-glucan and composition containing same
US12539311B2 (en) Short-acting heparin-based anticoagulant compounds and methods
Gabius et al. Chemical biology of the sugar code
Osborn et al. Recent developments in polymer supported syntheses of oligosaccharides and glycopeptides
Sharon et al. Lectins as cell recognition molecules
Perez et al. Crystal and molecular structure of a histo-blood group antigen involved in cell adhesion: the Lewis x trisaccharide
Kelemen et al. Three-dimensional molecular models of bacterial cell wall mucopeptides (peptidoglycans)
US6642050B1 (en) Three-dimensional cell culture material having sugar polymer containing cell recognition sugar chain
AU7106998A (en) Molecules presenting a multitude of active moieties
YOSHIOKA et al. Conformation-dependent change in antitumor activity of linear and branched (1→ 3)-β-D-glucans on the basis of conformational elucidation by carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy
WO1993005167A1 (en) Cell-type specific heparan sulfate proteoglycans and their uses
Liu et al. Glycan assembly strategy: from concept to application
Descroix et al. Recent progress in the field of β-(1, 3)-glucans and new applications
US20100093659A1 (en) Polyvalent bioconjugates
DE10261986A1 (de) Hämokompatibel beschichtete Oberflächen
Cao et al. Synthesis of glycopolymers containing GM3-saccharide
CN105688221B (zh) Ha/rgd双受体介导多靶点给药系统的制备方法
KR20030047878A (ko) 대장균에서 추출된 지방질 다당류
DE69713514T2 (de) Festphasenträgeroberfläche die toxin-bindende oligosaccharide enthalten
Hensel γ-Propoxy-sulfo-lichenin, an antitumor polysaccharide derived from lichenin
US6406894B1 (en) Process for preparing polyvalent and physiologically degradable carbohydrate-containing polymers by enzymatic glycosylation reactions and the use thereof for preparing carbohydrate building blocks

Legal Events

Date Code Title Description
NUG Patent has lapsed

Ref document number: 8404699-4

Effective date: 19930406

Format of ref document f/p: F