JPS61118320A - 大食細胞活性化組成物およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は水溶性β−１，３−結合Ｄ−グルカンおよびそ
のグルカンが固定化される非水溶性担体を含有する大食
細胞活性化組成物に関する。

本発明によれば本発明方法で固定化される水溶性グルカ
ンは単核の食細胞（ｆａｇｏｃｙｔ、ｅｓ　）　、いわ
ゆる大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　）を活性化し
うる能力を有することが見出された。

ある種の多糖類がたとえば補体系の活性化および大単核
細旭−大食細胞の機能の刺激によって身体の防御機構を
改善するということは知られている。これらの細胞は内
側からおよび外側からの両方、例えば癌細胞の生長に対
するまたは例えば細菌の攻撃に対する身体の防御にとつ
　　　′て非常に重要である。

以前に１必ずしも可溶性ではないが、ある種のグルカン
特に１．３−結合β−Ｄ−グルコースその物を含有する
ものが生体外において大食細胞を活性化しそしてそれを
細胞毒素性ならしめるということが指摘されたことがあ
る（ｆイｅｒｔ−ｍｓｎｔａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｊ　１３９　（１９８１）　１２１、Ｒ，５ｅ
ｌｊｅｌｉｄ氏、Ｇ、　Ｂ５ｇｗａｌｄ氏および久。

Ｌｕｎｄｗａ　１１氏によるｒ　ＧＩ、ＹＣＡＮ　ＥＩ
ＴＩＭＵＬ、ＡＴＩＯＮ　ＯＦＭＡＣＲＯＰＨＡ（）Ｂ
Ｓ　ＩＮ　ｖｘ’ｌ’ＲＯＪを参照されたい）。

不溶性化合物は生体外および生体内で使用す。

るのにしばしば不適当であるので本発明の主目的は制御
された条件を得ることを可能にした、大食細胞の活性化
を提供しうる能力を有する組成物を提供することにある
。

本発明の別の目的はかかる組成物の製造方法を提供する
ことである。

本発明によれば驚くべきことに、通常非水溶性担体への
固定によシ大食細胞を活性化しない水溶性β−１，３−
結合Ｄ−グルカン類が大食細胞刺激性質を獲得するとい
うことが見出された。

すなわち可溶性だが、それ自体不活性なβ−１，３−結
合Ｄ−グルカン類が適当な表面への固定後に大食細胞を
活性化するのである。かかる表面は医学技術において広
範な有用性をもたらす。

例としては例えばβ−１，３−結合Ｄ−グルカン類で被
覆された表面上を血液が通過する体外循環の種々な形態
を挙げることができる。他の医学的適用は本発明開示の
例示部分で以下に示す。

本発明において有用なβ−１，３−結合Ｄ−グルカン類
の例としては例えば、７ミナラン（ｌａｍｉｎａ−ｒａ
ｎ　）、クルドラン（ｃａｒｄｌａｎ　）、パヒマン（
ｐａｃｈｙｍａｎ　）、酵母グルカン（ｙｅａａｔ　ｇ
ｌｕｃａｎ）およびリケナン（ｌｉｃｈｅｎａｎ　）を
挙げることができる。

本発明開示で使用される「大食細胞」の表現は科学的観
点から考えてより適切な表現である単核の食細胞を意味
する。

すなわち本発明による技術は第一に動物、例えばヒトの
単核の食細胞を活性化させるのに使用されうる。このこ
とは本発明による組成物が特にヒトおよび商業的に有用
な動物をはじめとする動物の、例えば感染および癌に対
する身体防御を改善するのに使用できることを意味して
いる。このような考えられる利用面は本発明開示で以下
に提供する実験試験によって証明される。

グルカンの固定化は適当な担体への共有結合によシもた
らされるのが好ましい。特に好ましいのはグルカンが結
合されるアミン基を含有している担体を使用することで
ある。すなわちこの好ましい方法とは担体の表面が最初
にアミノ基の導入によ）活性化されることを意味する。

グルカンはかかる方法でアミン化された表面へ共有結合
しうるものとして変性される。担体の性質は臨界的では
なく、種々の型のプラスチックがアミン化したゲルと同
様に使用されるものと考えられる。

前述のようにアミノ基への結合を使用してグルカンを表
面に共有結合させるための技術は固定化にとって好まし
い方法である。例えばβ−１，３−結合Ｄ−グルカンを
適当な酸、好ましくは強酸（例えばぎ酸）中で減成させ
ついでそれをＯ−（２，２’−ジメトキシエチル）基と
置換させるために２−クロルアセトアルデヒドジメチル
アセタールで処理する。ついでこのように置換されたグ
ルカンを酸で処理してアルデヒド基を得、そのアルデヒ
ド置換されたグルカンをシアノボロヒドリドの存在下で
アミノ基含有担体と接触させて担体との共有結合がもた
らされる。

別の例ではエビクロロヒドリンでの活性化によシグルカ
ン中にエポキシ作用基が導入される。

このエポキシ活性化グルカンはアミノ基含有担体と接触
するとこれらのアミノ基がエポキシ基と反応してグルカ
ンは担体に共有結合される。

結合技術に関する詳細は後記の具体的な実施例から明ら
かである。

本発明の適用に話を戻せば、本発明にしたがつて固定さ
れたβ−１，３−結合Ｄ−グルカン類は細胞静止作用お
よび抗菌作用を示すことが見出された。固定化されたβ
−１，３−結合Ｄ−グルカン類が大食細胞を活性化し、
そのために細胞静止作用をもたらすという事実はβ−１
，３−結合クーグルカン類で被覆された組織培養プレー
ト上での培養中に腫瘍の細胞および大食細胞を使用する
ことによる本発明開示において示される。結果は後記実
施例に提供されている。

固定されたβ−１，３−結合Ｄ−グルカン類が抗菌活性
を有することはポリステンン球に結合されたβ−１，３
−結合Ｄ−グルカンが肺炎球菌または連鎖球菌で感染さ
れたマウスにおいて腹膜炎を予防するという事実による
本発明開示に示される。これに関する結果は対照群のす
べての試験動物が死んでしまったのに対しグルカン被覆
ポリスチレン球で処置されたすべての動物が生き残った
ことで明白である。

また、本発明は活性成分としての本発明による固定化グ
ルカンを製薬的に許容しうる担体と組み合わせて含有す
る大食細胞刺激性組成物をも提供する。

本発明による活性な固定化グルカン類は常套手段でヒト
または家畜のための医薬用にｐ４製されうる。組成物ま
たは製剤は投与経路および他の実際上の条件によって固
体、半固体または液体でありうる製薬的に許容しうる担
体と組み合わせて活性成分を含有することができる。ま
た時には生物分解性担体（ｂｉｏ−ｄｅｇｒａｄａｂｌ
ｅ　ｃａｒ−ｒｉｅｒ　）を使用することも適当であり
うる。また、活性成分は担体物質を添加せずにそのまま
で使用してもよい。これら組成物は全〈従来の製薬の方
法に従って製造される。

前述のように単核食細胞の機能は内側および外側からの
両影響における身体の防御にとって非常に重要である。

本発明によって例えば癌細胞の生長、感染等に対する身
体の防御系を一般的に活性化しうる能力を有する組成物
が入手されうるようになる。かかる適用はヒトを包含す
る晴乳類および魚類からなる相異なる種類のを椎動物用
について考慮されうるものである。例えば抑制された条
件下で養殖されるサカナの病気の発現傾向を減少させる
ために、本発明による組成物は養殖が行なわれている水
中に直接あるいは飼料への添加物としてのいずれかでサ
カナの環境に供給するのが有利である。本発明は例えば
サケ、マスま是は類似種のような貴重な魚の養殖に関し
て特に有用である。

以下に本発明を具体例によりさらによく記載する。この
記載は添付図面に関連してなされているが、そこで 第１図はいくつかのプラスチック表面に関する刺激指数
を柱状の形で示しており、 ｆａ２図は種々のプラスチック表面上で生長した大食細
胞との共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　）中に
おけるＬ−９２９細胞の導入を示している。

生物学的方法 大食細胞培養 バイブリドＣ３Ｄ２　（Ｃ３Ｈ／Ｔｉｆｘ　ｘ　ＤＢＡ
／２　）　？ウスからの腹膜細胞（７Ｘ１０５細胞／ウ
エル）をコスタ−組織培養プレート（米国マサチューセ
ッツ州ケンブリッジにあるコスタ−社製品）中にある円
形状ウェルのカバーガラス（直径１４ｎ）上に移した。

２時間の培養後ウェルの底に付着しなかった細胞を洗い
落とした。これらの細胞を、血清を添加するかまたは添
加しないで３７℃で空気中５　％　ｖ／ｖ　ＣＯ２にお
いてアール（Ｅａｒｌｅ’ｓ）塩（ＤＭ］Ｉｎ）　（ス
：ｒットランドのＧｉｂｃｏ　Ｂｉｏｃｕｌｔ社製）を
有するイーグル培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ　
）中で培養した。すべての培地はペニシリン（１００１
、Ｕ、／ｒａｔ　）およびストレプトマイシン（１００
μｇ／ゼ）を含有した。

走査電子顕微鏡（Ｓ弧） 大食細胞培養を０．１Ｍカコジル酸塩バッファーｐＨ７
３および０．１Ｍスクロース中の２．５チグルタルアル
デヒド（メルク社製）中において固定した。これらの細
胞を増加する濃度のエタノール中臨界点で脱水しく日立
製ＣＰＩ　）二酸化炭素中で乾燥させた。これらの剤を
マウントし金（Ｐｏ１ａｒｏｎ　ＳＥＭ　：ｒ−ティン
グユニットＥ５０００）で被覆しついで２０　ＫＶおよ
び１５°の傾斜角度で日立ｓｍ　（ＨＩ３１２Ｒ）を用
いて分析した。写真はコグツクトリーＸパン（ＴＸ　Ｐ
−１２０）フィルムに撮られた。

動物 Ｂ１６黒色腫を使用する実験では同系繁殖のＣ５７ＢＬ
マウスが使用された。残）の研究では大食細胞はバイブ
リドＣ３Ｄ２　（Ｃ５ＨＴｉｆ　ｘ　ＣＥＡ／２　）マ
ウスから得られた。すべての動物はデンマークのＧ１．
　Ｂｏｍｈｏｌｔｇｉｒｄ社から得られた。

化学的方法 クルドランは大阪の和光紬薬会社から、アミロースタイ
プ■は米国セントルイスのシグマ社から、ラミナランは
米国クリープランドの米国生化学会社から、重合アミン
化合物であるポリゴンＳＮ（ＰｏｌｙｍｉｎＳＮ、登録
商標）およびポリゴンＰ　、（Ｐｏｌｙｍｉｎ　Ｐ、登
ｆｉ商ｉ）は西独のルドウイツヒシャフエン（Ｌｕｄ−
ｗｉｇｓｈａｆｅｎ）社から得られた。アミノ化ポリス
チレン球はノールウェーのウグルシュタット（Ｕｇｌｅ
ｓｔａｄ）社からそしてアミン化プレートはファルコン
（Ｆａｌｃｏｎ）社から得られた。その他の化学薬品は
西独ダルムシュタットのメルク社から得られた。

糖分析 適切な炭水化物（１０ａｙ）含有物質を１１０℃で１２
時間内標準（ミオ−イノシトール、１ｍｇ）と−緒にし
てトリフルオロ酢酸（０，５Ｍ、　２ｍ／　）で処理し
、中和しく　ＢａＣＯ３で）、−過しついで還元した（
　ＮａＢＨ４，１０ｑで）。２時間後その声を酸イオン
交換体（ダウエックス５０）使用によシ約５に調整しそ
して試料を一過しついでメタノールと共に蒸発乾固させ
た。この試料を１００℃で１５分間無水酢酸（１−）お
よびピリジン（１ａ）を使用してアセチル化した。この
試料を蒸発乾固させついでガスクロマトグラフィーによ
シ分析した。

実施例　１ アルデヒド作用基の導入によるグルカン類の調製 非水溶性β−１，３−結合Ｄ−グルカンであるクルドラ
ンをｒ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｅｓ。Ｊ　２９　（
１９７３）３９７に記載のケイ、オガワ、アイ、ツルギ
およびティー、ナタナベによるｒ　Ｔｈｅ　ｄｅｐｅｎ
ｄｅｎｃｅｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔ、ｉｏｎ
　ｏｆ　ａ　（１−＋５）−β−Ｄ　−ｇｌｕｃａｎｏ
ｎ　ｃｈａｉｎ　ｌｅｎｇｔｈ　ｉｎ　ａｌｋａｌｉｎ
ｅ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　Ｊの方法にしたがってぎ酸（９
０％水溶液）中で９０℃において２０分間減成させた。

ついでこの部分的に減成されたクルドランを水溶性フラ
クションおよび非水溶性７ランシヨンに分離した。

この水溶性フラクションは水溶液中で水素化硼素ナトリ
ウム（１０８９７１１）を使用して還元し、透析しつい
で凍結乾燥させた。

上記水溶性クルドラン７ラクシヨン、ラミナラン（水溶
性β−１，３−結合Ｄ−グルカン）、アミロース（水溶
性α−１，４−結合Ｄ−グルカン）をｒ　Ｊ、阻ｏ、Ｃ
ｈｅｍ、Ｊ　（東京’＞　５５（１９６４）２０５に記
載のニス、ノーコモ゛すによるｒ　Ａ　ｒａｐｉｄｐｅ
ｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｌｕｃｏｌｉｐｉ
ｄ　ａｎｄ　ｐｏｌｙｓａｃ−ｃｈａｒｉｄｅ　　ｃａ
ｔａｌｙｚｅｄ　　ｂｙ　ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｉｎｙ
ｌ　　ｃａｒ−ｂａｎｉｏｎ　ｉｎ　ｄｉｍｅｔｈｙｌ
　５ｕｌｆｏｘｉｄｅ　Ｊ　　にしたがってアルキル化
した。その多糖（α５Ｉ）を窒素ガス下、血清瓶中の乾
燥ジメチルスルホキシド（２０ａｇ）中に溶解した。注
射器を使用してこれに２Ｍのナトリウムメチルスルフィ
ニルメタニド（８ｄ）を加えた。５０℃で３０分間超前
浴中で振盪後この反応混合物を一夜室温に放置した。注
射器を使用して２−クロルアセトアルデヒドジメチルア
セタール（５ｄ）を徐々に加えた。前音浴中において５
０℃で６０分間振盪後その反応混合物を水中に注ぎそし
て蒸留水に対して透析した。これを凍結乾燥させて〇−
（２，２’−ジメトキシエチル）基で置換された約Ｑ、
４５Ｉのグルカンを得た。置換度は’Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ。

によシ測定された。この第１段階の反応は以下に説明さ
れる通シである。

アミは−ス、部分的に減成されたクルドランおよびラミ
ナランは各単量体グルコース実体当たシそれぞれ平均し
てＣｌ３、Ｑ、５およびＱ、４の０−（２，２１−ジメ
トキシエチル）基を有した。Ｈ−ｎ、ｍ、ｒ、　スペク
トルはＪｅｏｌ　ＦＸ　９０　Ｑ　ｎ、ｍ、ｒ、器を用
いて８５℃においてＤ２０中、９ＱＭＨｚで測定された
。

前記のＯ−（２，２’−ジメトキシエチル）置換された
グルカン（α４．Ｆ）を１００℃で２０分間塩酸（２５
ｊｌｔ、　０．０５Ｍ）で処理し、中和しく０５ＭＮａ
ＯＨで）、蒸留水に対して透析しついで凍結乾燥させた
。アルデヒド基で置換された多糖０．３５ｙが得られた
。第２段階の反応は以下のように説明されうる。

実施例　２ エポキシ作用基の導入によるグルカン類の調製ラミナラ
ン（５１）を６０１１１蒸留水中に溶解した。これにエ
ビクロロヒドリン（ｊ　Ｏａｇ）、２Ｍ水酸化ナトリク
ム水溶液（５０Ｍ）および水素化硼素ナトリウム（２０
０ｊＩｇ）を加えた。この混合物を一夜室温で攪拌しな
がら放置し、酢酸（１ａ係、１１）および蒸留水（５７
）に対して透析し、蒸発させて容量を少なくＬ（５０Ｉ
Ｉｌ）ついで凍結乾燥させた。エポキシ活性化ラミナラ
ンの収量は４．５Ｉであった。この反応は以下に説明の
通シである。

実施例　３ アミロースの過沃素酸塩酸化 アミロースは以下のように過沃素酸塩（ＮａＩＯ４）に
よシ酸化される線状のα−１，４−結合Ｄ−グルカンで
ある。アミロース（１６，１）を水（２００ａ）中に溶
解しついで水（５ａＩＩｌ）中のＨａ　ＩＯ４（２，ｏ
ｙ）の溶液を加える。こうして得られた溶液を攪拌しな
゛がら一夜、放置する。その物質を透析しついで凍結乾
燥させる。収量１４．５．Ｆ。

この反応は以下の通シである。

Ｊｋｉ 実施例　４ アミロースのスルファチド化 アミロース（ａｓｙ　＞ｔジメチルスルホキシド（４μ
）中に溶解する。三酸化硫黄−ピリジン錯体（３１）を
加え、その混合物を４０℃で６０分間攪拌する。砕氷（
１０，１および水（５ｄ）を加える。ついでこの混合物
を水酸化ナトリウム（２Ｍ）を使用して中和し、−７に
する〇生成物をエタノール中で沈殿させ、透析しついで
凍結乾燥させる。収ｉ１０．４　Ｎ。

実施例　５ プラスチック表面の調製 ポリ　ミｙ　ＳＮ　（Ｐｏｌｙｍｉｎ　ＳＮ　、　　登
録商標）（ｏ、ｏｏｓ％、ｗ／ｗ）および実施例６のよ
うにして製造された過沃素酸塩酸化されたアミロース（
０，５％、ｗ／ｖ　）の水溶液を−９に調整しくＩＭＮ
ａＯＨで）ついでこれを組織培養用プレート中の各ウェ
ルに加える。それらのウェルを蒸留水で洗浄し、これに
実施例４で製造されたアミロース硫酸塩水溶液（０，０
２％、ｖ／ｖ　、　ｐＨ３）を５０℃において加える。

５分後それらのウェルを水洗する。

この操作を２回繰り返し、アミロース硫酸塩の最終添加
後に−３においてボリミンＳＮの０．０１チ水溶液を加
える。５分後それらのウェルを蒸留水で洗浄する。

実施例　６ 実施例５により調製された組織培養用プレートへの、実
施例１によるアルデヒドグルカンの結合 実施例１により製造されたアルデヒド基置換グルカン（
４Ｑ　）を２Ｍのシん酸塩バックアー（ｐＨ７，０，０
，２Ｍ）中に溶解する。実施例５による組織培養用プレ
ートの各ウェルに前記グルカン溶液（０，１Ｍ、　０．
１Ｍ）、シん酸塩バッファー（２，６ｔ、ｐＨ７，０）
およびナトリウムシアノボロヒドリド（１００μｇ）を
加える。それらのプレートを一夜、室温に放置し、蒸留
水で洗浄しついで室温で乾燥させる。糖分析は１０１１
ｇのグルカンが各ウェルに結合されていることを示した
。結合順序は以下のように式で示される。

実施例　７ アミノ化ポリスチレンプレートへの、実施例１によるア
ルデヒドグルカンの結合 実施例１にしたがってアルデヒド基で置換されたグルカ
ン（ｔａｐ）を実施例６による組織培養用の商業的に入
手しうるアミノ化ポリスチレンプレート（ファルコン（
Ｆａｉｃｏｎ　）　、（登鎌商ＩＮ）３８４７　ＰＲＩ
ＭＡＲＩＡ　ＣＵＬＴＵＲＩＩ　ＰＬＡＴｇ８　）　＋
７）ウェルに結合させる。糖分析は約αｏｏ５ＩＩ９の
グルカンが各ウェルに結合されたことを示した。

実施例　８ アミノ化したポリメタクリレート球への、実施例１によ
るアルデヒドグルカンの結合 実施例１にし九がってアルデヒド基で置換されたグルカ
ン（４ｍｙ　）を２５Ｍシん酸塩バッファー（ｐＨ７Ｏ
１（１２Ｍ）中に溶解する。この溶液Ｉｃ、　ｒ　Ａｄ
ｙ、　Ｃｏ１１ｏｉｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　８ｃｉ、
　Ｊ　１３（１９８ｏ）１ｏ１に記載のＪ、　Ｕｇｌｅ
ｇｔａｄ氏、ｐ、ｃ。

Ｍ６ｒｋ氏、Ｋ、　Ｍ、　Ｋａｇｇｅｒｕｄ氏、Ｔ、　
Ｋｌｌｉｎｇｓｅｎ氏およびＡ、　Ｂｅｒｇｅ氏による
ｒ　５ＷＥＬＬＩＮＧ　ＯＦ　ＯＬＩＧＯＭＥＲ−ＰＯ
ＬＹＭＥＲＰＡＲＴＩＣＬＥＳ　Ｊ、「Ｎ７避ＴＨＯＤ
Ｓ　０ＦＰＲＥＰＡＲＡＴ工ＯＮ　　ＯＦ　　ＥＭＵＬ
８ＩＯＮＳ　　ＡＮＤ　　ＰＯＬＹＭＥＲＤＩＳ−ＰＥ
Ｒ８ＩＯＮＳ　Ｊの方法による、２．３−二ボキシプロ
ピルメタクリレートとエチレングリコールメタクリレー
トとの共重合によシ製造された２、４μｍの直径を有す
るアミノ化プラスチック球（０，２，？）を加える。さ
らにナトリウムシアノボロヒドリド（０，００５Ｆ）を
加える。この反応混合物を一夜室温で振盪し、ガラスフ
ィルター上に濾過しついで蒸留水で繰り返し洗浄する。

それらの球を室温で風乾させる。

実施例　９ 実施例５によるプラスチック表面への、実ｍ例２による
エポキシグルカンの結合 実施例２によシ製造されたエポキシ活性化ラミナランの
１％溶液をりん酸塩バッファー（０，２Ｍ５ｆｌｆ（７
，０）中に溶解しついでこれを実施例５によシ調製され
た組織培養用プレートの各ウェルに加えた。これらのプ
レートを一夜室温に放置し、蒸留水で洗浄しついで室温
で乾燥させた。

糖分析はα００５ｑのグルカンが各ウェルに結合されて
いることを示した。この結合のための反応は以下に式で
説明される〇 ＯＨＯＨ 実施例　１０ 実施例の６．７および９による固定化グルカンで被覆さ
れた表面を有する大食細胞の刺激固定されたβ−１，３
−結合Ｄ−グルカンの添加されたないしは添加されてい
ない組織培養プレートのウェルにある大食細胞培養に１
４０ラベルされたＤ−グルコースアミンを加える。大食
細胞中の糖蛋白質におけるＤ−グルコースアミンの増加
した混入が大食細胞のための活性化因子である。２４時
間後これらの細胞を５％トリクロロ酢酸中に溶解しそし
て混入されなかった放射性Ｄ−グルコースアミンを洗浄
して除く。

これらの洗浄された細胞を水酸化ナトリウム（１Ｍ）中
に溶解する。すべての細胞物質が溶解されたらその溶液
をメスキュベツトに移しついで放射能をシンチレーショ
ンカウンター中で測定する。活性化度は以下の式の商に
よって表される。

最良の結果は実施例６によシ活性化されたプレートから
得られる。これらの結果は後記で説明される第１図に示
されている。

実施例　１１ β−１，３−結合Ｄ−グルカン類で被覆された組織培養
用プレート上で活性化された大食細胞の細胞静止作用効
果 的状赤血球（２Ｘ１０４細胞／ウエル）をトリプシンで
処理しついでそれらを実施例の６．７および９によるグ
ルカン被覆されたプラスチック表面の存在下で大食細胞
培養に加えた。相異なる時間の経過後これらの培養に０
．５μＣＬ／ａｔの放射性チミジン（メチル−５Ｈ，西
独のドライアイヒにあるＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕ
ｃｌｅａｒ社Ｉｆりを加えた。

２４時間の培養後に混入を測定した。培養菌を収穫後そ
の高分子物質を１Ｍ過堪素酸で沈殿させ、完全に洗浄し
ついで１Ｍ水酸化ナトリウム溶液中に溶解した。この溶
解された物質をメスセルに移しそしてシンチレーション
カウンター（スイスのチューリッヒにあるＰａｃｋａｒ
ｄ　Ｉｎｓｔｒｕ−ｍｅｎｔｓ、　ｆｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａ１社の製品）中で分析した。

最良の結果は実施例６によシ調製されたプレートから得
られた。その他のものは許容しうる結果を与えた。これ
らの結果は後記で説明される第２図に示されている。

実施例　１２ 抗菌効果に関する実験 生体内における抗菌効果を調査するために、実施例８に
よるβ−１，３結合グルカン被覆のポリメタクリレート
球または塩水のいずれかで前処理されたマウスに１０６
ウイルス性肺炎球菌を腹腔内注射した。塩水グループ（
４匹の動物からなる）においてすべてのマウスは２４時
間後に病気にな夛そして４８時間後に死んだのに対して
グルカン処置グループ（８匹の動物からなる）ではどの
動物もいずれか目に見える病気の症状を全く示さなかっ
たし、しかも１週間後に死ななかった。

ウィルス性連鎖球菌ビリダンス（Ｖｉｒｉｄａｎｓ　）
を注射し、β−１，３−結合Ｄ−グルカン類で処理され
たポリメタクリレート球を用いてこの実験を繰シ返した
が、それらの動物は全く病気の兆候を示さなかった。実
験は３回縁シ返されたが、結果は同じであった。

大食細胞の刺激度は１４Ｃ−グルコースアミンの導入に
よる形態学（ｓｍ）およびＬ−９２９型の的状赤血球に
おける細胞静止効果によｐ決定された。

アミン化プラスチック（実施例５によるミクロタイター
プレート）または固定化アミロースを有するプラスチッ
ク上で生長した大食細胞は未処理プラスチック上で生長
した細胞よシもい〈分か多い１４０−グルコースアミン
を混入した。

しかしながら、大食細胞が、固定されたラミナランまた
はクルドランを含有する表面上で生長した場合には１０
倍の１４０−グルコースアミンの混入増加が得られた。

このことはＮｉｌされたプラスチックのミク冒タイター
プレート上で４８時間培養された大食細胞中における放
射性１４Ｃ−グルコースアミンの導入を示す添付第１図
から明らかである。第１図における刺激指数は刺激され
た大食細胞中における導入（ｃｐｍ）を通常の刺激され
なかった大食細胞における導入で割った値に関するもの
である。

第１図において柱１はアミノ化プラスチックに関し、柱
２は固定化アミロースを有するプラスチックに関するも
のであるが、柱の３および４は実施例５にしたがってグ
ルカンの結合がなされている、それぞれ固定化クルドラ
ンおよび固定化ラミナランを有するプラスチックに関す
るものである。図に表された結果は平均力標準偏差に関
するものである。

第１図から明らかなように、本発明技術を使用すること
は実質的に大食細胞の刺激を増加させることになる。

大食細胞の細胞静止効果は共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉ−
ｖａｔｉｏｎ）に関するＬ−９２９−細胞中の放射性！
Ｈ−チミジンの導入を測定することによシ研究された。

刺激されていない大食細胞はＬ−９２９−細胞上に一定
の細胞静止効果を有しそして単なるＬ−９２９−細胞だ
けの代表的な態培養では約５５０００ｃｐｍが混入され
た。刺激されていない大食細胞の存在下におけるＬ−９
２９−細胞の相当する培養では約１５０００ｃｐｍが混
入された。アミノ化プラスチック上での大食細胞と一緒
の共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ　）における
第２図中の１００−〇Ｌ−９２９−細胞は前記の規定さ
れていない大食細胞を使用しての共培養におけるＬ−９
２９−細胞よりも約５０チ少をい５Ｈ−チミジンを混入
した。これは添付第２図に説明されておシ、そこでは放
射性チミジンの導入が大食細胞と一緒のＬ−９２９−細
胞の多数の培養について示されている。柱１は未調製プ
ラスチックのプレート中での培養、柱２はアミン化プラ
スチックのプレート中で実施された相当する培養を示し
ているのに対して柱の３．４および５はそれぞれ固定化
されたアミロース、クルドランおよびラミナランを有す
るプラスチックのプレート中で実施された培養を示して
いる。本発明による技術の適用が大食細胞によシ提供さ
れる刺激によって顕著な生長阻害効果をもたらすことは
明らかである。

【図面の簡単な説明】

第１図は大食細胞に対する刺激指数をアミノ化プラスチ
ック、固定化アミロースおよび実施例５に従ってグルカ
ンの結合がなされたものＫついて測定した結果を柱状グ
ラフで示すものであ）、第２図は放射性チミジンを導入
して大食細胞と一緒にＬ−９２９細胞を培養した場合に
ついての未調製プラスチックプレート中での培養、アミ
ノ化プラスチックプレート中での培養、および固定化さ
れたアミロースクルドランおよびラミナランを有するプ
ラスチックプレート中での培養結果を示すものである。 特許出願人　　カール・オロヴ・ベーテル・ラルム同　
　　　ヤメス・ホフマン 同　　　　　ロルフ・セイエリード 同　　　　ヤール・ボエーグヴアルド 外２名 刺激指数 第１図 第２図 イエン ′国ニスー１１５　３５　　ストックホルム、リント１
エン−９００１トロムシヨー、ボルグトンヴ工Ｉエン−
９０００トロムシヨー、ルンドヴアネットＩエンー９０
００トロムシヨー、ルンドヴアネ゛ント手続補正書 昭和６０年１０月２１日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）非水溶性β−１，３−結合グルカンおよびそのグル
   カンが固定されている水溶性担体を含有する大食細胞刺
   激組成物。 ２）グルカンがラミナラン（ｌａｍｉｎａｒａｎ）、ク
   ルドラン（ｃｕｒｄｌａｎ）、パヒマン（ｐａｃｈｙｍ
   ａｎ）、酵母グルカン（ｙｅａｓｔ　ｇｌｕｃａｎ）お
   よびリケナン（ｌｉｃｈｅｎａｎ）からなる群より選択
   される特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ３）グルカンがクルドランまたはラミナランである特許
   請求の範囲第１項または第２項に記載の組成物。 ４）単核食細胞を活性化させるのに使用するための特許
   請求の範囲第１項記載の組成物。 ５）癌細胞の生長を抑制するのに使用するための特許請
   求の範囲第１〜３項の各項に記載の組成物。 ６）その際にグルカンが担体に共有結合されていること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ７）その際に担体がグルカンの結合されるアミノ基を含
   有することを特徴とする特許請求の範囲第５項記載の組
   成物。 ８）特にヒトおよび商業的に利用性のある動物をはじめ
   とする動物の身体防御を改善するのに使用するための特
   許請求の範囲第１項記載の組成物。 ９）その際に担体がプラスチック、アミノ化ゲルまたは
   蛋白質からなることを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の組成物。 １０）不溶性β−１，３−結合グルカンを酸中で減成さ
   せて溶解しついでそれをＯ−（２，２′−ジメトキシエ
   チル）基と置換させるために２−クロルアセトアルデヒ
   ドジメチルアセタールで処理しそして置換されたグルカ
   ンを酸で処理してアルデヒド置換を得、ついでそのアル
   デヒド置換されたグルカンをシアノボロヒドリドの存在
   下でアミノ基含有担体と接触させて担体との共有結合を
   生成させることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
   の組成物の製造方法。