RU2819793C1 - Способ получения гибридного препарата бромелайна и аскорбата хитозана в виде густого раствора - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения гибридного препарата бромелайна и аскорбата хитозана в виде густого раствора. Проводят при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин иммобилизацию бромелайна путем комплексообразования в густой раствор аскорбата хитозана в соотношении 10 мл раствора бромелайна в концентрации 26 мг/мл, на 1 г аскорбата хитозана с молекулярной массой 350 кДа, предварительно растворенного в 10 мл буфера. Образовавшийся препарат в виде густого раствора промывают с помощью диализа против 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5. Для промывки 21 мл полученного препарата используют 200 мл трис-HCl буфера. Диализ ведут в течение 8 ч, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 200 мл. Продолжают диализ еще в течение 16 ч до отсутствия в промывном растворе свободного бромелайна. Изобретение позволяет получать гибридный препарат иммобилизованного бромелайна и аскорбата хитозана в виде густого раствора с вязкостью в диапазоне 200-250 МПа×с, обладающий стабильностью при 37°С, полностью отмытый от неиммобилизованной формы. 4 ил., 1 пр.

Description

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности, медицине, косметологии и исследовательских целях.

Бромелайн - (КФ 3.4.22.4) - протеолитический фермент класса гидролаз, выделяемый из Ananas comosus. Бромелайн имеет одну полипептидную цепь, состоящую из 212 аминокислотных остатков. Его молекулярная масса составляет 26-28 кДа. В активный центр фермента входит Cys и His [Smith-Marshall J., Golden K. D. Characterization of Bromelain from Morinda citrifolia (Noni) / Sci Res. - 2012. V. 4, №2. - P. 445-456].

Оптимальными условиями функционирования энзима является значение рН 6-7 и диапазон температур 50-60°С. Изоэлектрическая точка фермента составляет 9,5 [Панкова С.М., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. Гиалуроновая кислота как стабилизирующий агент для ферментного препарата на основе бромелайна / Вестник ВГУ. Серия: химия, биология, фармация. - 2020. - №4. -С.91-95].

Бромелайн действует как иммуномодулятор, обладая фибринолитическим, противоотечным, антитромботическим и противовоспалительным действиями. Бромелайн вызывает обратимое ингибирование процессов агрегации тромбоцитов, используется при лечении синуситов, последствий хирургических травм, тромбофлебита, пиелонефритической стенокардии и бронхита. Он может применяться для пероральной ферментной терапии пациентов, благодаря тому что он характеризуется повышенной абсорбцией в организме после приема и не имеет значительных побочных эффектов даже при длительном приеме [Hatano K.-L, Takahashi KI., Tanokura М. Bromein, a bromelain inhibitor from pineapple stem: structural and functional characteristics / Protein Pept Lett. - 2018. V. 25, №9. - P. 838-852].

Однако фермент чувствителен к физическим изменениям среды, многим химическим веществам и органическим растворителям. Даже небольшие конформационные изменения могут снижать активность фермента, что ограничивает сферы его использования в медицине и фармакологии [Varilla С, Marcone М, Paiva L., Baptista J. Bromelain, a group of pineapple proteolytic complex enzymes (Ananas comosus) and their possible therapeutic and clinical effects / Foods. - 2021. V. 10, №10. - P. 2249]. Одним из способов повышения стабильности бромелайна является его иммобилизация на различных носителях.

Хитозан является статистическим сополимером, макромолекулы которого состоят из соединенных 1,4-β-гликозидными связями звеньев D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина. Применение хитозана в биомедицинских областях ограничено из-за плохой растворимости в физиологических средах. Это затруднение может быть преодолено посредством химической модификации полимера [Hafsa J., Charfeddine В., Smach М.А., Limem К., Majdoub H., Sonia R. Synthesis, characterization, antioxidant and antibacterial proprieties of chitosan ascorbate / International journal of pharmaceutical, chemical and biological sciences. - 2014. -V. 4, №4. - P. 1072-1081].

Аскорбат хитозана - органическая соль, образующаяся в результате взаимодействия аминополисахарида хитозана с аскорбиновой кислотой в водной среде [Аль Зубейди А.Ф.А., Малинкина О.Н., Чемодурова А.А., Ксенофонтова О.Ю., Зудина И.В. Оценка антибактериальной активности L- и D-изоформ аскорбиновой кислоты и их солей с хитозаном / Современные проблемы науки и образования. - 2016.-№5. - С.298].

Аскорбат хитозана обладает уникальными свойствами в качестве носителей для иммобилизации различных ферментов, применяемых в медицинской и фармацевтической промышленностях. Материалы на основе аскорбата хитозана хорошо совместимы с живыми тканями человека и животных, биорезорбируемы, проявляют противовоспалительную, антитоксическую и иммунотропную активности, а также способны стимулировать процессы ранозаживления и регенерации тканей, что делают их крайне востребованными при создании различных ранозаживляющих средств [Аль Зубейди Адавия Фадхел Аббаас. Сравнительная оценка биологического действия L- и D-аскорбатов хитозана в отношении условно-патогенных микроорганизмов: автореф. дис. канд. биол. наук - Казань., 2018. - 23 с].

Аскорбат хитозана обладает более независимым от рН профилем растворимости, чем хитозан, что важно при обработке и изготовлении биоматериалов [Nurgaliev I.N. DFT Study of Chitosan Ascorbate Nanoparticles Structure / Article. - 2011. - V. 107, №3. - P. 218-226]. Входящие в его состав остатки аскорбиновой кислоты придают полимеру антиоксидантный эффект, обеспечивают фотозащиту и повышают иммунитет.

Существует топическая противомикробная дерматологическая композиция [Патент RU 2668827 С2, МПК А61К 38/08, А61К 31/728, А61Р 31/00, А61Р 17/00, А61К 31/722, опубл. 02.10.2018, Бюл. №28], предложенная в качестве лекарственного средства в медицине и ветеринарии, включающая комбинацию по меньшей мере одного положительно заряженного противомикробного пептида, соединенного с липидом, и гиалуроновой кислоты со средним молекулярным весом от 100 кДа до 800 кДа или одной из ее солей, причем противомикробный пептид представляет собой гексапептид, соединенный с пальмитиновой кислотой, содержащий дисульфидные мостики.

Недостатком способа является то, что в качестве действующего вещества используется пептид, который обладает только противомикробным эффектом, в отличие от фермента бромелайна. А также недостатком данного способа является высокая стоимость гиалуроновой кислоты.

Существует способ получения гетерогенного препарата на основе бромелайна, обладающего ранозаживляющими свойствами [Патент RU 2677343 С2, МПК A61L 15/38, А61К 38/56, C12N 11/08, А61Р 17/02, опубл. 16.01.2019, Бюл. №2], включающий обработку матрицы ионообменных волокон ВИОН АН-1 или ВИОН КН-1 раствором бромелайна, инкубирование, отличающийся тем, что для иммобилизации на ВИОН КН-1 используют 0,05 М глициновый буфер (рН 9,0-10,5) или 0,05 М боратный буфер без добавления KCl (рН 8,0), а для иммобилизации на ВИОН АН-1 - 0,2 М ацетатный буфер (рН 5,0) в расчете 20 мл раствора фермента в концентрации 2 мг/мл на 1 г волокон, инкубирование проводится в течение 24 ч при комнатной температуре, образовавшийся осадок промывают использованным при иммобилизации буфером до отсутствия в промывных водах белка.

Известен способ получения гетерогенного биокатализатора на основе бромелайна, иммобилизованного на ионообменных смолах [Патент RU 2770208 С1, МПК C12N 11/10, C12N 9/50, опубл. 14.04.2022, Бюл. №11], включающий адсорбционную иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрицу ионообменной смолы в соотношении 20 мл раствора бромелайна в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя, инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, промывку образовавшегося осадка буфером до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу воздушно-сухой ионообменной смолы АВ-16-ГС, а в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М фосфатный буфер (рН 11,0), инкубацию осуществляют в течение 2 часов, промывку образовавшегося осадка проводят 0,05 М трис-HCl буфером (рН 7,5).

Существует способ получения гетерогенного препарата различной дисперсности на основе бромелайна и хитозана [Патент RU 2677232 С2, МПК А61К 38/48, А61К 47/36, А61Р 17/02 опубл. 10.01.2019, Бюл. №1], включающий адсорбционную иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрицу хитозана в соотношении 20 мл раствора бромелайна в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя, инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, промывку образовавшегося осадка буфером до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу среднемолекулярного хитозана или высокомолекулярного хитозана; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют либо 0,05 М трис-глициновый буфер (рН 8,5-9,0) для среднемолекулярного или 0,05 М трис-глициновый буфер (рН 8,5) для высокомолекулярного хитозана; инкубация проводится в течение 4 часов для среднемолекулярного и 5 часов для высокомолекулярного хитозана.

В данных способах иммобилизация бромелайна проводится путем адсорбции на нерастворимых носителях в соотношении 20 мл раствора бромелайна в концентрации 2 мг/мл и 5 мг/мл на 1 г носителя при периодическом перемешивании, при этом получается нерастворимая форма фермента, которая, безусловно, имеет свои преимущества, но не дает возможность проводить реакции на твердых субстратах.

Известен способ получения препарата полибромелайна с применением глутарового альдегида [Патент RU 2711790 С1, МПК C12N 11/04, C12N 11/10 опубл. 22.01.2020, Бюл. №3], включающий растворение бромелайна в 0,05 М трис-глициновом буфере (рН 9,0) в концентрации 1 мг/мл; затем проводят сополимеризацию с применением глутарового альдегида в качестве сшивающего агента в концентрации 2% или 10% в объеме, равном объему трис-глицинового буферного раствора; инкубация проводится до образования пленки; промывку осуществляли 0,05 М трис-HCl буферным раствором (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка.

Существует способ получения гетерогенного препарата бромелайна, ковалентно связанного с матрицей хитозана [Патент RU 2711786 О, МПК C12N 11/10, C12N 9/50 опубл. 22.01.2020, Бюл. №3], включающий иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрицу среднемолекулярного хитозана (200 кДа) или высокомолекулярного хитозана (350 кДа) в соотношении 18 мл раствора бромелайна в концентрации 1 мг/мл на 900 мг носителя; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М трис-глициновый буфер (рН 9,0) для среднемолекулярного хитозана или 0,05 М трис-глициновый буфер (рН 8,5) для высокомолекулярного хитозана; затем добавляют 10 мл глутарового альдегида с 15% концентрацией для среднемолекулярного или 10% концентрацией для высокомолекулярного хитозана; инкубацию проводят с периодическим перемешиванием в течение 1 часа; далее суспензию центрифугируют при 1500 g в течение 10 мин, промывку образовавшегося осадка проводят 0,05 М трис-HCl буфером (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка.

Недостатком изобретений является использование токсичного глутарового альдегида, что ограничивает применение препарата в фармацевтической промышленности и медицине.

Известен способ стабилизации протеаз для использования в косметологических целях [US 2011/0177052А1]. Авторы стабилизировали 1%-ный раствор папаина 0,1%-ным раствором альгината натрия. Особенностью изобретения является получение препарата протеазы и жидкой фазе. Кроме того, авторы не отделяли от полученного продукта несвязанный с полисахаридом белок, т.е. получали смесь стабилизированной и нестабилизированной формы папаина, что может отразиться на эксплуатационных свойствах препарата.

Известен способ получения иммобилизованного ферментного препарата на основе бромелайна, гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами [Патент RU 2750377 С1, МПК А61К 38/00, А61К 38/56, А61К 47/36, C12N 11/08, А61Р 17/02 опубл. 28.06.2021, Бюл. №19], включающий растворение бромелайна в водном растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в соотношении 10 мг бромелайна на 2 мл водного раствора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в концентрации 1,5%, при этом осуществляют перемешивание до полного растворения при комнатной температуре; затем ведут иммобилизацию бромелайна путем добавления к полученной смеси графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) при молекулярной массе полисахарида 50-100 к Да в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля.

Недостатком способа является высокая стоимость гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами. Кроме того, модификация полисахаридов виниловыми мономерами - трудозатратный процесс, требующий привлечения высоко квалифицированных кадров. Использование аскорбата хитозана методически существенно упрощает и соответственно удешевляет процесс получения гибридного препарата бромелайна.

Предложены способы иммобилизации бромелайна на водорастворимых производных хитозана - iV-малеоилхитозане [Разработка методики сорбционной иммобилизации бромелайна на iV-малеоилхитозане и изучение структурных особенностей полученного комплекса / Ольшанникова С.С, Малыхина Н.В., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Холявка М.Г., Лукин А.Н., Вышкворкина Ю.М., Юдин Н.Е., Артюхов В.Г. // Сорбционные и хроматографические процессы. -2022. - Т. 22, №3. - С.335-346], iV-сукциноилхитозане [Разработка биокатализатора на основе бромелайна, иммобилизованного на N-сукциноилхитозане / Ольшанникова С.С., Малыхина Н.В., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Холявка М.Г., Артюхов В.Г. // Вестник ВГУ. Серия «Химия. Биология. Фармация». - 2022. - №3. - С.113-119], а также на карбоксиметилхитозане, 7У-(2-гидрокси)пропил-3-триметиламмоний хитозане, ацетате хитозана и сульфате хитозана [Novel Biocatalysts Based on Bromelain Immobilized on Functionalized Chitosans and Research on Their Structural Features / Holyavka M.G., Goncharova S.S., Sorokin A.V., Lavlinskaya M.S., Redko Yu.A., Faizullin D.A., Baidamshina D.R., Zuev Y.F., Kondratyev M.S., Kayumov A.R., Artyukhov V.G. // Polymers. - 2022. - 14:5110]. Однако в данных работах, не была доказана стабильность препаратов.

Известны способ получения композиционного препарата бромелайна и альгината натрия в виде густого раствора [Патент RU 2792785 CI, C12N 11/02 (2023.01); C12N 9/50 (2023.01); А61К 38/48 (2023.01), опубл. 24.03.2023, Бюл. № 9] и способ получения гибридного препарата бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора [Патент RU 2788454 C1, C12N 11/04 (2022.08); C12N 11/12 (2022.08); А61Р 17/02 (2022.08); A61L 15/38 (2022.08), опубл. 19.01.2023, Бюл. №2]. В обоих способах предусмотрена защита активного центра бромелайна от окисления путем добавления цистеина в концентрации 0,04 М.

В случае использования аскорбата хитозана, происходит высвобождение аскорбат-анионов, обладающих мощным восстановительным действием, что приводит к повышению каталитической активности папаиноподобных протеаз [Гончарова С.С, Редько Ю.А., Лавлинская М.С, Сорокин А.В., Холявка М.Г., Кондратьев М.С, Артюхов В.Г. Биокатализаторы на основе ассоциатов папаина с наночастицами хитозана. Конденсированные среды и межфазные границы. 2023; 25(2): 173-181]. Аскорбиновая кислота широко используется в медицине, фармации и косметологии, поэтому использование аскорбата хитозана в качестве носителя фермента позволит достигнуть синергетического эффекта практически значимых свойств хитозана, бромелайна и аскорбиновой кислоты.

Были синтезированы микро- и наночастицы среднемолекулярного и высокомолекулярного хитозанов без и с добавлением аскорбиновой кислоты. Получены ассоциаты бромелайна с микро- и наночастицами хитозана. Показано, что ассоциаты бромелайна с микро- и наночастицами хитозана обладают более высокой стабильностью по сравнению с растворимым ферментом. Снижение протеолитической активности препарата наблюдалось в течение семи суток эксперимента. Каталитическая способность ассоциатов бромелайна с частицами, синтезированными в присутствии аскорбиновой кислоты была выше, чем с частицами обоих типов хитозанов, синтезированными при ее отсутствии: для микрочастиц среднемолекулярного хитозана эта разница составила 17%, для наночастиц среднемолекулярного хитозана - 21%, для микрочастиц высокомолекулярного хитозана - 23%, для наночастиц высокомолекулярного хитозана -26% [Редько Ю.А., Ольшанникова С.С., Холявка М.Г., Лавлинская М.С., Сорокин А.В., Артюхов В.Г. Разработка методики получения ассоциатов бромелайна с микро- и наночастицами хитозана / Химико-фармацевтический журнал. - 2022. - Т. 56, №7. - С.45-49; Holyavka M.G., Goncharova S.S., Redko Y.A., Lavlinskaya M.S., Sorokin A.V., Artyukhov V.G. Novel biocatalysts based on enzymes in complexes with nano and micromaterials / Biophysical Reviews. - 2023. https://doi.org/10.1007/s12551-023-01146-6]. Однако недостатком предложенного способа является низкая стабильность нано- и микроразмерных носителей фермента: в течение менее чем 180 часов происходит их агрегация, в результате чего ухудшаются эксплуатационные свойства биокатализатора и срок его хранения и использования. В случае же использования макрофазы аскорбата хитозана подобных явлений не наблюдается.

В качестве прототипа служил способ получения препарата бромелайна в геле на основе пищевого хитозана и сукцината хитозана [Патент RU 2691611 С1, МПК C12N 11/04, C12N 11/10, опубл. 14.06.2019, Бюл. №17], включающий иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрицу хитозана в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя; инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; промывку образовавшегося осадка 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу пищевого хитозана с молекулярной массой менее 100 кДа или сукцината хитозана; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют либо 0,05 М глициновый буфер с рН 8,6 для пищевого хитозана или с рН 9,0-9,5 для сукцината хитозана; либо 0,05 М ацетатный буфер с рН 5,5 для пищевого хитозана или 5,0 для сукцината хитозана; инкубация проводится в течение 2 часов.

В отличие от прототипа наш способ позволяет получить иммобилизованный бромелайн в другой форме, т.е. не в виде геля, а в форме густого раствора на основе аскорбата хитозана, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) бромелайн и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы. Препарат не требует защиты активного центра бромелайна от окисления какими-либо дополнительными агентами (например, путем добавления цистеина), т.к. в качестве восстановителя выступает сам аскорбат-анион. Кроме того, заявляемое изобретение предназначено для расширения числа полисахаридов, используемых для стабилизации препаратов бромелайна.

Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке способа получения гибридного препарата иммобилизованного бромелайна и аскорбата хитозана в виде густого раствора с вязкостью в диапазоне 200-250 МПа×с, обладающего большей стабильностью при 37°С, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) бромелайн и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, не требующего дополнительной защиты активного центра бромелайна в ходе иммобилизации какими-либо дополнительными реагентами.

Технический результат достигается тем, что в способе получения гибридного препарата бромелайна и аскорбата хитозана в виде густого раствора, включающем иммобилизацию ферментного препарата бромелайна в буферном растворе с носителем, в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М глициновый буфер с рН 8,6, инкубирование при комнатной температуре в течение 2 часов и промывку 50 мМ трис-HCl буфером с рН 7,5, согласно изобретению, иммобилизацию бромелайна проводят путем комплексообразования в густой раствор аскорбата хитозана в соотношении 10 мл раствора бромелайна в концентрации 26 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г аскорбата хитозана с молекулярной массой 350 кДа, предварительно растворенного в 10 мл буфера, при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин; образовавшийся в процессе инкубирования препарат в виде густого раствора промывают с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины, с диаметром пор 25 кДа против трис-HCl буфера, из расчета, что для промывки 21 мл полученного препарата используют 200 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 200 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного бромелайна.

Фиг.1. Диаграмма значений содержания белка (в мг на 1 г носителя) в гибридных препаратах в виде густого раствора бромелайна и аскорбата хитозана.

Фиг. 2. Диаграмма значений общей активности (в ед на 1 мл раствора) гибридных препаратов в виде густого раствора бромелайна и аскорбата хитозана.

Фиг. 3. Диаграмма значений удельной активности (в ед на 1 мг белка в пробе) гибридных препаратов бромелайна и аскорбата хитозана в виде густого раствора.

Фиг. 4. Диаграмма значений остаточной каталитической активности бромелайна, свободного и иммобилизованного на аскорбатах хитозана после инкубации образцов при 37°С (в % от первоначального уровня, в легенде представлены наименования носителя и его молекулярная масса). Протеолитическую активность образцов, наблюдаемую без их предварительной инкубации и при оптимальных условиях гидролиза, принимали за 100%

Пример реализации способа.

В качестве объекта исследования был выбран бромелайн фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich».

Для синтеза аскорбата хитозана были использованы хитозаны фирмы «Биопрогресс» со средними молекулярными массами 200, 350 и 600 к Да и степенью деацетилирования 0.85 и аскорбиновую кислоту квалификации «ч.д.а.» производства «Вектон».

Аскорбат хитозана получали по следующей методике: навеску хитозана с определенной молекулярной массой (200, 350 или 600 кДа) массой 1,00 г растворяли в 100 мл 5%-ного мае. раствора аскорбиновой кислоты при постоянном перемешивании со скоростью 400 об/мин, после чего полученный раствор выдерживали в течение суток при температуре 25°С и постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин. По истечении времени продукт реакции выделяли путем осаждения в 500 мл ацетона (ч.д.а.), после чего отделяли на воронке Бюхнера, снабженной бумажным фильтром, трижды промывали порциями по 150 мл изопропилового спирта и сушили в вакуумном сушильном шкафу при 55°С до постоянной массы.

Комплекс образование бромелайна осуществляли следующим образом. К 1 г аскорбата хитозана, предварительно растворенного в 10 мл 0,05 М глицинового с рН 8,6 буфера, добавляли 10 мл раствора фермента в концентрации 26 мг/мл, полученного растворением в 0,05 М глициновом буфере с рН 8,6; инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин. После окончания времени инкубации образовавшийся препарат в виде густого раствора очищали от несвязанного фермента с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка Spectra/Por 6 Standard RC, шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины, изготовленного из регенерированной целлюлозы, с диаметром пор 25 кДа против 200 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5 в течение 8 часов, после чего буфер меняли на 200 мл буфера и продолжали диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного бромелайна. Для промывки 21 мл полученного препарата всего использовали 400 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5. По истечении этого времени осуществляли контроль наличия белка в промывных водах с помощью спектрофотометра СФ-2000 при λ = 280 нм.

При использовании аскорбата хитозана, полученного из хитозана со средней молекулярной массой 200 кДа, получали препарат в виде густого раствора с вязкостью 150-180 МПа×с, при использовании аскорбата хитозана, полученного из хитозана со средней молекулярной массой 350 кДа - получали препарат в виде густого раствора с вязкостью 200-250 МПа×с, а при применении аскорбата хитозана, полученного из хитозана со средней молекулярной массой 600 кДа, получали препарат в виде густого раствора с вязкостью 590-640 МПа×с.

Содержание белка в гибридных препаратах бромелайна определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent / J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275].

Определение протеазной активности бромелайна проводили на субстрате азоказеине (Sigma, США) [Sabirova A.R., Rudakova N.L., BalabanN.P., Ilyinskaya O.N Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Rudenskaya G.N., Sharipova M.R. A novel secreted metzincin metalloproteinase from Bacillus itermeius / FEBS Lett. - 2010 - V. 584, №21 - P. 4419-4425]. К 50 мг образца добавляли 200 мкл 0,05 М трис-HCl буфера с рН 7,5, 800 мкл азоказеина (0,5% масс, в 0,05 М трис-HCl буфере, рН 7,5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее добавляли 800 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (5% масс), инкубировали 10 минут при 4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 11700 g для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл раствора NaOH (3% масс.) для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 10 мм кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 50 мг образца и 200 мкл буфера (комплексообразованный фермент в контрольную пробу вносили последним, остальные операции для нее делали аналогично опытным пробам).

Единицей протеазной активности служило количество бромелайна, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ азоказеина за 1 мин.

Удельную протеолитическую активность бромелайна рассчитывали по формуле:

HA = D* 1000/120/200/Ср,

где ПА - протеолитическая активность, мкМ/мин на 1 мг белка,

D - оптическая плотность пробы при 410 нм,

Ср - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,

120 - время инкубации в минутах,

200 - объем пробы в мкл,

1000 - пересчет в мкМ.

Все экспериментальные исследования осуществляли минимум в 8-кратной повторности. Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.

Для получения гибридных препаратов бромелайна и аскорбата хитозана с разными молекулярными массами в качестве среды для комплексообразования мы использовали 0,05 М трис-глициновый буфер с рН 8,6. Результаты отражены на фиг.1, 2, 3.

Анализ содержания белка в гибридных препаратах показал, что наибольшее количество бромелайна (в мг на г носителя) связывается с аскорбатом хитозана с молекулярной массой 200 кДа (фиг.1).

Общая активность (в ед на мл раствора) и удельная активности бромелайна (в ед на мг белка) оказались выше при его комплексообразовании с аскорбатом хитозана с молекулярной массой 350 кДа (фиг.2, 3).

Оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя), общей активности (в ед на мл раствора) и удельной активности (ед на мг белка) выявлено при включении бромелайна в густой раствор аскорбата хитозана с молекулярной массой 350 кДа.

В ходе хранения при 37 DC иммобилизованный бромелайн был более стабилен, чем его форма в растворе, вероятно, за счет присутствия в системе такого мощного восстановителя, как аскорбат-анион (фиг.4).

Claims (1)

1. Способ получения гибридного препарата бромелайна и аскорбата хитозана в виде густого раствора, включающий иммобилизацию ферментного препарата бромелайна в буферном растворе с носителем, в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М глициновый буфер с рН 8,6, инкубирование при комнатной температуре в течение 2 ч и промывку 50 мМ трис-HCl буфером с рН 7,5, отличающийся тем, что иммобилизацию бромелайна проводят путем комплексообразования в густой раствор аскорбата хитозана в соотношении 10 мл раствора бромелайна в концентрации 26 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г аскорбата хитозана с молекулярной массой 350 кДа, предварительно растворенного в 10 мл буфера, при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин; образовавшийся в процессе инкубирования препарат в виде густого раствора промывают с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины, с диаметром пор 25 кДа против трис-HCl буфера, из расчета, что для промывки 21 мл полученного препарата используют 200 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, диализ ведут в течение 8 ч, после чего буфер меняют на порцию буфера в объеме 200 мл и продолжают диализ еще в течение 16 ч до отсутствия в промывном растворе свободного бромелайна.