RU2788454C1 - Способ получения гибридного препарата бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора - Google Patents
Способ получения гибридного препарата бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора Download PDFInfo
- Publication number
- RU2788454C1 RU2788454C1 RU2022121042A RU2022121042A RU2788454C1 RU 2788454 C1 RU2788454 C1 RU 2788454C1 RU 2022121042 A RU2022121042 A RU 2022121042A RU 2022121042 A RU2022121042 A RU 2022121042A RU 2788454 C1 RU2788454 C1 RU 2788454C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bromelain
- buffer
- solution
- carboxymethylcellulose
- immobilization
- Prior art date
Links
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title claims abstract description 70
- 108010004032 Bromelains Proteins 0.000 title claims abstract description 67
- 235000019835 bromelain Nutrition 0.000 title claims abstract description 66
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 title claims abstract description 24
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 title claims abstract description 22
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 45
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 40
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 15
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 10
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 17
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 16
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 claims description 5
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 claims description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 3
- 229940105329 Carboxymethylcellulose Drugs 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 12
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 9
- 210000004544 DC2 Anatomy 0.000 description 8
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 8
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 8
- 230000002530 ischemic preconditioning Effects 0.000 description 8
- MAKUBRYLFHZREJ-JWBQXVCJSA-M sodium;(2S,3S,4R,5R,6R)-3-[(2S,3R,5S,6R)-3-acetamido-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5,6-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C([O-])=O)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O MAKUBRYLFHZREJ-JWBQXVCJSA-M 0.000 description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 7
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 108010041102 azocasein Proteins 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 5
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 102220370181 IGFBPL1 A23L Human genes 0.000 description 4
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 4
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 4
- 229940086735 succinate Drugs 0.000 description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 3
- 229960004319 Trichloroacetic Acid Drugs 0.000 description 3
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N Trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 3
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 3
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000737 periodic Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- -1 wound healing Substances 0.000 description 3
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSSNTDFYBPYIEC-UHFFFAOYSA-N 1-ethenylimidazole Chemical compound C=CN1C=CN=C1 OSSNTDFYBPYIEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKNCOURZONDCGV-UHFFFAOYSA-N 2-(dimethylamino)ethyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CN(C)CCOC(=O)C(C)=C JKNCOURZONDCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000002254 Ananas comosus Species 0.000 description 2
- 235000007119 Ananas comosus Nutrition 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 206010039580 Scar Diseases 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 2
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 2
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 2
- 229940100198 ALKYLATING AGENTS Drugs 0.000 description 1
- 208000006673 Asthma Diseases 0.000 description 1
- 241000194102 Bacillus intermedius Species 0.000 description 1
- 206010012434 Dermatitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 229920002521 Macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 102000036688 Metzincins Human genes 0.000 description 1
- 108091007007 Metzincins Proteins 0.000 description 1
- 102000035443 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 230000036462 Unbound Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory Effects 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000024881 catalytic activity Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000850 decongestant Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying Effects 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 231100000040 eye damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic Effects 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 229920000578 graft polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 238000005020 pharmaceutical industry Methods 0.000 description 1
- 230000036231 pharmacokinetics Effects 0.000 description 1
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 1
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 1
- 231100000152 severe skin burn Toxicity 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 238000011099 tissue engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения гибридного препарата бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора, включающий иммобилизацию ферментного препарата бромелайна в раствор натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы в соотношении 10 мл раствора бромелайна в концентрации 26 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, предварительно растворенной в 10 мл буфера, при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М глициновый буфер с рН 8,6, содержащий 0,04 М цистеин; препарат промывают с помощью диализа против 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7 до отсутствия в промывном растворе свободного бромелайна. Изобретение обеспечивает расширение арсенала способа получения иммобилизованного бромелайна ранозаживляющего и противоожогового назначения. 3 ил., 1 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой и химико-фармацевтической промышленности, медицинской практике, косметологии и исследовательских целях. Изобретение может применяться при создании лекарственных препаратов в виде густого раствора ранозаживляющего и противоожогового назначения, рекомендованного для предотвращения образования шрамов и рубцов.
Бромелайн (КФ 3.4.22.32) - протеолитический фермент растительного происхождения класса гидролаз, выделенный из ананаса (Ananas comosus). Бромелайн присутствует почти во всех надземных частях растения - в кожуре, листьях, стеблях и плодах, но только плоды и стебли богаты бромелайном. Бромелайн состоит из одной полипептидной цепи длиной 212 аминокислотных остатков, в активном центре присутствуют цистеин и гистидин. Его молекулярная масса составляет 23 кДа, изоэлектрическая точка (pI) - 9,5. Применение бромелайна в медицине и фармакологии набирает обороты, и причина такого высокого интереса в клинической сфере связана с его противовоспалительными, противоотечными, ранозаживляющими, фибринолитическими, противоопухолевыми, антикоагулянтными и антитромботическими свойствами. Кроме того, этот фермент используется в других сферах промышленности, включая косметологию, пивоварение, переработку и тендеризацию мяса и текстильную промышленность [A. Colletti, S. Li, М. Marengo et al. Fecent advances and insights into bromelain processing, pharmacokinetics and therapeutic uses // Applied Sciences. - 2021. V. 11. - P. 20].
Ферменты являются весьма универсальными биокатализаторами, имеющими потенциал для использования в различных технологиях. Однако свойства свободных энзимов сильно зависят от микроокружения молекул. Иммобилизация ферментов приводит к улучшению их каталитических свойств, термической стабильности и стабильности при хранении, также становится возможным повторно использовать ферменты в каталитических процессах [S. Aggarwal, A. Chakravarty, S. Ikram A comprehensive review on incredible renewable carriers as promising platforms for enzyme immobilization & thereof strategies // International Journal of Biological Macromolecules. - 2021. V. 167. - P. 962-986].
При выборе носителя для иммобилизации важно обращать внимание на его характеристики, такие как биосовместимость, нетоксичность, доступность реакционных групп. Кроме того, они должны обладать уникальными физико-химическими свойствами, включая высокую удельную поверхность, гидрофобность или гидрофильность (в зависимости от задач технолога), селективность, что делает их подходящими носителями для иммобилизации ферментов. Одним из множества полимеров, обладающих данными характеристиками, является карбоксиметилцеллюлоза.
Карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) представляет собой водорастворимое производное целлюлозы, полученное химическим воздействием алкилирующих реагентов на активированные некристаллические участки целлюлозы. Это первое производное целлюлозы, которое может подвергаться желаемым химическим модификациям. Подобно целлюлозе, КМЦ также находит применение в бумажной, текстильной, фармацевтической, косметической и пищевой промышленности. Однако КМЦ предпочтительнее целлюлозы из-за ее загущающих, суспендирующих, связывающих и эмульгирующих свойств. Эти функциональные свойства делают ее полезной в фармацевтической, пищевой и других видах промышленности. КМЦ используют в качестве покрытия или суспендирующего агента в различных лекарственных формах, таких как таблетки, капсулы, инъекции, суспензии, пасты и гели. Кроме того, КМЦ чувствительна к ионной силе и рН среды из-за своей полиэлектролитной природы, следовательно, она обладает совместимостью при смешивании с другими полимерными растворами. Это свойство очень важно для приготовления каркасов из биоматериалов, гидрогелей и наночастиц для инкапсуляции лекарств [A. Zennifer, P. Senthilvelan, S. Sethuraman, О. Sundaramurthi Key advances of carboxymethyl cellulose in tissue engineering & 3D bioprinting applications // Carbohydrate Polymers. - 2021. V. 256. - Р. 18].
В пищевой промышленности известно использование КМЦ в качестве загустителя в продуктах на фруктовой основе. Она способна улучшать желирующие свойства, текучесть и стабильность продукта. Кроме того, КМЦ растворима как в горячей, так и в холодной воде. Это выгодно по сравнению, например, с пектином, поскольку КМЦ растворяется без дополнительного нагревания, что приводит к значительной экономии энергии и к уменьшению, связанных с этим, затрат [Патент RU 2322085 С2, МПК A23L 1/0534, A23L 1/212, A23L 2/02, A23L 1/06, опубл. 24.04.2008, Бюл. №11].
Существует способ получения гетерогенного препарата на основе бромелайна, обладающего ранозаживляющими свойствами [Патент RU 2677343 С2, МПК A61L 15/38, A61K 38/56, C12N 11/08, А61Р 17/02, опубл. 16.01.2019, Бюл. №2], включающий обработку матрицы ионообменных волокон ВИОН АН-1 или ВИОН КН-1 раствором бромелайна, инкубирование, отличающийся тем, что для иммобилизации на ВИОН КН-1 используют 0,05 М глициновый буфер (рН 9,0-10,5) или 0,05 М боратный буфер без добавления KCl (рН 8,0), а для иммобилизации на ВИОН АН-1 - 0,2 М ацетатный буфер (рН 5,0) в расчете 20 мл раствора фермента в концентрации 2 мг/мл на 1 г волокон, инкубирование проводится в течение 24 ч при комнатной температуре, образовавшийся осадок промывают использованным при иммобилизации буфером до отсутствия в промывных водах белка.
Известен способ получения гетерогенного биокатализатора на основе бромелайна, иммобилизованного на ионообменных смолах [Патент RU 2770208 С1, МПК C12N 11/10, C12N 9/50, опубл. 14.04.2022, Бюл. №11], включающий адсорбционную иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрицу ионообменной смолы в соотношении 20 мл раствора бромелайна в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя, инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, промывку образовавшегося осадка буфером до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу воздушно-сухой ионообменной смолы АВ-16-ГС, а в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М фосфатный буфер (рН 11,0), инкубацию осуществляют в течение 2 часов, промывку образовавшегося осадка проводят 0,05 М трис-HCl буфером (рН 7,5).
Существует способ получения гетерогенного препарата различной дисперсности на основе бромелайна и хитозана [Патент RU 2677232 С2, МПК A61K 38/48, A61K 47/36, А61Р 17/02 опубл. 10.01.2019, Бюл. №1], включающий адсорбционную иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрицу хитозана в соотношении 20 мл раствора бромелайна в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя, инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, промывку образовавшегося осадка буфером до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу среднемолекулярного хитозана или высокомолекулярного хитозана; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют либо 0,05 М трис-глициновый буфер (рН 8,5-9,0) для среднемолекулярного или 0,05 М трис-глициновый буфер (рН 8,5) для высокомолекулярного хитозана; инкубация проводится в течение 4 часов для среднемолекулярного и 5 часов для высокомолекулярного хитозана.
В данных способах иммобилизация бромелайна проводится путем адсорбции на нерастворимых носителях в соотношении 20 мл раствора бромелайна в концентрации 2 мг/мл и 5 мг/мл на 1 г носителя при периодическом перемешивании, что не позволяет полностью автоматизировать процесс. Кроме того, получается нерастворимая форма фермента, которая, безусловно, имеет свои преимущества, но не дает возможность проводить реакции на твердых субстратах.
Известен способ получения препарата полибромелайна с применением глутарового альдегида [Патент RU 2711790 С1, МПК C12N 11/04, C12N 11/10 опубл. 22.01.2020, Бюл. №3], включающий растворение бромелайна в 0,05 М трис-глициновом буфере (рН 9,0) в концентрации 1 мг/мл; сополимеризацию с применением глутарового альдегида в качестве сшивающего агента в концентрации 2% или 10% в объеме, равном объему трис-глицинового буферного раствора; инкубация проводится до образования пленки; промывку осуществляют 0,05 М трис-HCl буферным раствором (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка.
Существует способ получения гетерогенного препарата бромелайна, ковалентно связанного с матрицей хитозана [Патент RU 2711786 С1, МПК C12N 11/10, C12N 9/50 опубл. 22.01.2020, Бюл. №3], включающий иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрицу среднемолекулярного хитозана (200 кДа) или высокомолекулярного хитозана (350 кДа) в соотношении 18 мл раствора бромелайна в концентрации 1 мг/мл на 900 мг носителя; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М трис-глициновый буфер (рН 9,0) для среднемолекулярного хитозана или 0,05 М трис-глициновый буфер (рН 8,5) для высокомолекулярного хитозана; затем добавляют 10 мл глутарового альдегида с 15% концентрацией для среднемолекулярного или 10% концентрацией для высокомолекулярного хитозана; инкубацию проводят с периодическим перемешиванием в течение 1 часа; далее суспензию центрифугируют при 1500 g в течение 10 мин, промывку образовавшегося осадка проводят 0,05 М трис-HCl буфером (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка.
Недостатком изобретений является использование глутарового альдегида, что ограничивает применение препарата в фармацевтической промышленности и медицине.
Известен способ стабилизации протеаз для применения в косметологических целях [US 2011/0177052]. Недостатком способа является использование 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, который вызывает серьезные ожоги кожи и повреждение глаз, может приводить к аллергическим кожным реакциям, при вдыхании может вызывать аллергию, симптомы астмы или затруднение дыхания, что ограничивает применение препарата в косметологии.
Существует способ получения иммобилизованного ферментного препарата на основе бромелайна, гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами [Патент RU 2750377 С1, МПК A61K 38/00, A61K 38/56, A61K 47/36, C12N 11/08, А61Р 17/02 опубл. 28.06.2021, Бюл. №19], включающий растворение бромелайна в водном растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в соотношении 10 мг бромелайна на 2 мл водного раствора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в концентрации 1,5%, при этом осуществляют перемешивание до полного растворения при комнатной температуре; затем ведут иммобилизацию бромелайна путем добавления к полученной смеси графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) при молекулярной массе полисахарида 50-100 кДа в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля.
Недостатком способа является высокая стоимость гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами. Использование карбоксиметилцеллюлозы позволит сократить расходы.
В качестве прототипа служил способ получения препарата бромелайна в геле на основе пищевого хитозана и сукцината хитозана [Патент RU 2691611 С1, МПК C12N 11/04, C12N 11/10, опубл. 14.06.2019, Бюл. №17], включающий иммобилизацию бромелайна в буферном растворе на матрицу хитозана в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя; инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; промывку образовавшегося осадка 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу пищевого хитозана с молекулярной массой менее 100 кДа или сукцината хитозана; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют либо 0,05 М глициновый буфер с рН 8,5 для пищевого хитозана или с рН 9,0-9,5 для сукцината хитозана; либо 0,05 М ацетатный буфер с рН 5,5 для пищевого хитозана или 5,0 для сукцината хитозана; инкубация проводится в течение 2 часов.
В отличие от прототипа наш способ позволяет получить иммобилизованный бромелайн в другой форме, т.е. не в виде геля, а в форме густого раствора, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) бромелайн и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы. Заявляемое и обретение предназначено для расширения числа полисахаридов, используемых для стабилизации препаратов бромелайна. Кроме того, карбоксиметилцеллюлоза является водорастворимым носителем, что позволяет работать с ней в широком диапазоне значений рН среды.
Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке способа получения гибридного препарата иммобилизованного бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора с абсолютной вязкостью 200-220 МПа×с, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) бромелайн и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, при этом в ходе иммобилизации активный центр бромелайна защищен от окисления путем добавления цистеина в концентрации 0,04 М.
Технический результат достигается тем, что в способе получения гибридного препарата бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора, включающем иммобилизацию ферментного препарата бромелайна в буферном растворе с носителем, инкубирование при комнатной температуре в течение 2 часов и промывку, согласно изобретению, иммобилизацию бромелайна проводят путем комплексообразования в густой раствор натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы в соотношении 10 мл раствора бромелайна в концентрации 26 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, предварительно растворенной в 10 мл буфера, при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М глициновый буфер с рН 8,6, содержащий цистеин в концентрации 0,04 М; образовавшийся в процессе инкубирования препарат в виде густого раствора промывают с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины, с диаметром пор 25 кДа против 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, из расчета, что для промывки 21 мл полученного препарата используют 400 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию свежего в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного бромелайна.
Фиг. 1. Диаграмма значений содержания белка (в мг на 1 г носителя) в гибридных препаратах в виде густого раствора бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы с использованием следующих буферов: 1 - 0,05 М ацетатный, 2 - 0,05 М фосфатный, 3 - 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KCl, 4 - 0,05 М трис-глициновый, 5 - 0,05 М глициновый.
Фиг. 2. Диаграмма значений общей активности (в ед на 1 мл раствора) гибридных препаратов в виде густого раствора бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы с использованием следующих буферов: 1 - 0,05 М ацетатный, 2 - 0,05 М фосфатный, 3 - 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KCl, 4 - 0,05 М трис-глициновый, 5 - 0,05 М глициновый.
Фиг. 3. Диаграмма значений удельной активности (в ед на 1 мг белка в пробе) гибридных препаратов бромелайна в виде густого раствора с использованием следующих буферов: 1 - 0,05 М ацетатный, 2 - 0,05 М фосфатный, 3 - 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KCl, 4 - 0,05 М трис-глициновый, 5 - 0,05 М глициновый.
Пример реализации способа.
В качестве объекта исследования был выбран бромелайн фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich». В качестве носителя для комплексообразования применяли натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы фирмы «Sigma-Aldrich» с молекулярной массой 90 кДа и степенью замещения 0,7.
Комплексообразование бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы осуществляли следующим образом. К 1 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, предварительно растворенной в 10 мл буфера, добавляли 10 мл раствора фермента в концентрации 26 мг/мл, полученного растворением в 0,05 М глициновом буфере с рН 8,6, содержащем цистеин в концентрации 0,04 М для предотвращения процессов окисления активного центра бромелайна; инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин. После окончания инкубации образовавшийся препарат в виде густого раствора очищали от несвязанного фермента с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка Spectra/Por 6 Standard RC, шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины, изготовленного из регенерированной целлюлозы, с диаметром пор 25 кДа против 400 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5 в течение 8 часов, после чего буфер меняли на 400 мл свежего и продолжали диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного бромелайна. Для промывки 21 мл полученного препарата использовали 800 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5. По истечении этого времени осуществляли контроль наличия белка в промывных водах с помощью спектрофотометра СФ-2000 при λ=280 нм.
Содержание белка в гибридных препаратах бромелайна определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V.193. - P. 265-275.].
Определение протеазной активности бромелайна проводили на субстрате азоказеине (Sigma, США) [Sabirova A.R., Rudakova N.L., Balaban N.P., Ilyinskaya O.N., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Rudenskaya G.N., Sharipova M.R. A novel secreted metzincin metalloproteinase from Bacillus intermedius // FEBS Lett. - 2010 - V. 584 (21), P. 4419-4425]. К 50 мг образца добавляли 200 мкл 0,05 М трис-HCl буфера с рН 7,5, 800 мкл азоказеина (0,5% масс. в 0,05 М трис-HCl буфере, рН 7,5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее добавляли 800 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (5% масс.), инкубировали 10 минут при 4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 11700 g для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл раствора NaOH (3% масс.) для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 10 мм кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 50 мг образца и 200 мкл буфера (комплексообразованный фермент в контрольную пробу вносили последним, остальные операции для нее делали аналогично опытным пробам).
Единицей протеазной активности служило количество бромелайна, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ азоказеина за 1 мин. Удельную протеазную активность рассчитывали по формуле:
A=D*1000/120/200/С,
где А - протеазная активность препарата, мкМ/мин на 1 мг белка,
D - оптическая плотность раствора при 410 нм,
С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по метод) Лоури,
120 - время инкубации в минутах,
200 - объем пробы, мкл,
1000 - коэффициент для пересчета в мкМ.
Все экспериментальные исследования осуществляли минимум в 8-кратной повторности. Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
Для получения гибридных препаратов на основе бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы, в качестве среды для комплексообразования мы использовали следующие буферы: 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KCl с рН 8,0-10,0, 0,05 М ацетатный с рН 4,0-5,8, 0,05 М глициновый с рН 8,6-10,5, 0,05 М трис-глициновый с рН 8,5-9,0, 0,05 М фосфатный с рН 5,8-7,5. Результаты отражены на фиг. 1-3.
Анализ содержания белка в гибридных препаратах показал, что наибольшее количество бромелайна (в мг на г носителя) наблюдается при использовании 0,05 М ацетатного буфера с диапазоном рН 4,0-5,8 (фиг. 1).
Общая активность (в ед на мл раствора) бромелайна оказалась выше при применении 0,05 М ацетатного буфера с рН 4,5 (фиг. 2).
Наибольшую удельную активность показали препараты бромелайна, полученные при использовании 0,05 М фосфатного буфера с рН 5,8-7,5 и 0,05 М глицинового с рН 8,6 (фиг. 3).
Мы сравнили полученные результаты по определению каталитической активности и содержания белка для препаратов бромелайна в густом растворе карбоксиметилцеллюлозы. Оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя), общей активности (в ед на мл раствора) и удельной активности (в ед на мг белка) получено при стабилизации бромелайна путем включения в густой раствор натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы при использовании 0,05 М глицинового буфера с рН 8,6.
Таким образом, была разработана методика получения гибридного препарата на основе бромелайна и карбоксиметилцеллолозы в виде густого раствора с абсолютной вязкостью 200-220 МПа×с, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) бромелайн и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, т.к. после диализа 21 мл препарата против 800 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5 исключается переход фермента из фазы носителя в раствор, что позволяет проводить реакции, получая продукт, не "загрязненный" ферментом. Кроме того, в ходе иммобилизации активный центр бромелайна защищен от окисления путем добавления цистеина в концентрации 0,04 М.
Claims (1)
- Способ получения гибридного препарата бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора, включающий иммобилизацию ферментного препарата бромелайна в буферном растворе с носителем, инкубирование при комнатной температуре в течение 2 ч и промывку, отличающийся тем, что иммобилизацию бромелайна проводят путем комплексообразования в густой раствор натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы в соотношении 10 мл раствора бромелайна в концентрации 26 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, предварительно растворенной в 10 мл буфера, при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М глициновый буфер с рН 8,6, содержащий цистеин в концентрации 0,04 М; образовавшийся в процессе инкубирования препарат в виде густого раствора промывают с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины с диаметром пор 25 кДа против 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5 из расчета, что для промывки 21 мл полученного препарата используют 400 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, диализ ведут в течение 8 ч, после чего буфер меняют на порцию свежего в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 ч до отсутствия в промывном растворе свободного бромелайна.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2788454C1 true RU2788454C1 (ru) | 2023-01-19 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2819793C1 (ru) * | 2023-10-31 | 2024-05-24 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Способ получения гибридного препарата бромелайна и аскорбата хитозана в виде густого раствора |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2678435C2 (ru) * | 2017-07-03 | 2019-01-29 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Способ получения гетерогенного препарата на основе коллагеназы и хитозана |
| RU2691611C1 (ru) * | 2018-12-04 | 2019-06-14 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Способ получения препарата бромелайна в геле на основе пищевого хитозана и сукцината хитозана |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2678435C2 (ru) * | 2017-07-03 | 2019-01-29 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Способ получения гетерогенного препарата на основе коллагеназы и хитозана |
| RU2691611C1 (ru) * | 2018-12-04 | 2019-06-14 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Способ получения препарата бромелайна в геле на основе пищевого хитозана и сукцината хитозана |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ДОСАДИНА Э.Э., БЕЛОВ А.А. "Иммобилизация бромелайна на целлюлозные носители"; Успехи химии и химической технологии", 2016, т.3, N 9, с.7-9. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2819793C1 (ru) * | 2023-10-31 | 2024-05-24 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Способ получения гибридного препарата бромелайна и аскорбата хитозана в виде густого раствора |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Balakrishnan et al. | Self-cross-linking biopolymers as injectable in situ forming biodegradable scaffolds | |
| US4613502A (en) | Proteolytic, dry biopolymeric composition for treatment of wounds, and method of using same | |
| US4636524A (en) | Cross-linked gels of hyaluronic acid and products containing such gels | |
| Chiou et al. | Immobilization of Candida rugosa lipase on chitosan with activation of the hydroxyl groups | |
| Polk et al. | Controlled release of albumin from chitosan-alginate microcapsules | |
| EP1855544B1 (en) | Gelation of anionic polysaccarides using protein hydrolysates | |
| JPH0353321B2 (ru) | ||
| EP1113827A1 (en) | Polymer immobilized living cells and applications thereof | |
| IL45103A (en) | Fibrinolytic pharmaceutical compositions comprising a proteolytic enzyme | |
| JP2005529191A (ja) | バイオマスからの細胞壁誘導体及びその調製法 | |
| Tapdigov | The bonding nature of the chemical interaction between trypsin and chitosan based carriers in immobilization process depend on entrapped method: A review | |
| Magnin et al. | Immobilization of enzymes into a polyionic hydrogel: Chitoxan | |
| Anna et al. | Pharmacological and biological effects of chitosan | |
| Kim et al. | Curdlan gels as protein drug delivery vehicles | |
| Muzzarelli | Depolymerization of methyl pyrrolidinone chitosan by lysozyme | |
| JPH02219571A (ja) | 修飾プロテアーゼ及びその製造法 | |
| RU2788454C1 (ru) | Способ получения гибридного препарата бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора | |
| RU2303984C2 (ru) | Сверхразветвленный амилопектин для применения в способах хирургического или терапевтического лечения млекопитающих, или в диагностических методах, особенно для применения в качестве объемного плазмозаменителя | |
| Kurokawa et al. | Formation and use in enzyme immobilization of cellulose acetate-metal alkoxide gels | |
| RU2795425C1 (ru) | Способ получения гибридного препарата папаина и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора | |
| RU2792785C1 (ru) | Способ получения композиционного препарата бромелайна и альгината натрия в виде густого раствора | |
| RU2819793C1 (ru) | Способ получения гибридного препарата бромелайна и аскорбата хитозана в виде густого раствора | |
| RU2712690C1 (ru) | Способ получения препарата папаина в геле на основе пищевого хитозана и сукцината хитозана | |
| RU2788455C1 (ru) | Способ получения композиционного препарата папаина и альгината натрия в виде густого раствора | |
| RU2771183C1 (ru) | Способ получения препарата фицина в геле на основе карбоксиметилцеллюлозы |