RU2788455C1 - Способ получения композиционного препарата папаина и альгината натрия в виде густого раствора - Google Patents
Способ получения композиционного препарата папаина и альгината натрия в виде густого раствора Download PDFInfo
- Publication number
- RU2788455C1 RU2788455C1 RU2022121046A RU2022121046A RU2788455C1 RU 2788455 C1 RU2788455 C1 RU 2788455C1 RU 2022121046 A RU2022121046 A RU 2022121046A RU 2022121046 A RU2022121046 A RU 2022121046A RU 2788455 C1 RU2788455 C1 RU 2788455C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- papain
- buffer
- solution
- sodium alginate
- preparation
- Prior art date
Links
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title claims abstract description 74
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 title claims abstract description 69
- 229940055729 Papain Drugs 0.000 title claims abstract description 66
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 title claims abstract description 66
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 229940005550 Sodium alginate Drugs 0.000 title claims abstract description 29
- MSXHSNHNTORCAW-UHFFFAOYSA-M sodium 3,4,5,6-tetrahydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Na+].OC1OC(C([O-])=O)C(O)C(O)C1O MSXHSNHNTORCAW-UHFFFAOYSA-M 0.000 title claims abstract description 29
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 title claims abstract description 29
- 239000002131 composite material Substances 0.000 title claims abstract description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 44
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 32
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 12
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 8
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 claims description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 claims description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 16
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 abstract description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 4
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 12
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 8
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 8
- MAKUBRYLFHZREJ-JWBQXVCJSA-M sodium;(2S,3S,4R,5R,6R)-3-[(2S,3R,5S,6R)-3-acetamido-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5,6-trihydroxyoxane-2-carboxylate Chemical compound [Na+].CC(=O)N[C@@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C([O-])=O)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O MAKUBRYLFHZREJ-JWBQXVCJSA-M 0.000 description 8
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 7
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 6
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 108010041102 azocasein Proteins 0.000 description 6
- 210000004544 DC2 Anatomy 0.000 description 5
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 5
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 5
- 230000002530 ischemic preconditioning Effects 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 5
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K [O-]P([O-])([O-])=O Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960004319 Trichloroacetic Acid Drugs 0.000 description 3
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N Trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 3
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 3
- OSSNTDFYBPYIEC-UHFFFAOYSA-N 1-ethenylimidazole Chemical compound C=CN1C=CN=C1 OSSNTDFYBPYIEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKNCOURZONDCGV-UHFFFAOYSA-N 2-(dimethylamino)ethyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CN(C)CCOC(=O)C(C)=C JKNCOURZONDCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 2
- 238000005020 pharmaceutical industry Methods 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing Effects 0.000 description 2
- 229940086735 succinate Drugs 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 2
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000194102 Bacillus intermedius Species 0.000 description 1
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 1
- 108010004032 Bromelains Proteins 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- 108090000270 Ficain Proteins 0.000 description 1
- POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N Ficin Chemical compound FI=CI=N POTUGHMKJGOKRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 210000002751 Lymph Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 Macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 102000036688 Metzincins Human genes 0.000 description 1
- 108091007007 Metzincins Proteins 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 101710035826 PRKAA2 Proteins 0.000 description 1
- 102100011474 PRKAB1 Human genes 0.000 description 1
- 101710015127 PRKAB1 Proteins 0.000 description 1
- 102000035443 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 206010042674 Swelling Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial Effects 0.000 description 1
- 201000001320 atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 235000019835 bromelain Nutrition 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic Effects 0.000 description 1
- 230000024881 catalytic activity Effects 0.000 description 1
- 238000005039 chemical industry Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 235000019836 ficin Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000578 graft polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 230000000737 periodic Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000000886 photobiology Effects 0.000 description 1
- 200000000002 platelet activation Diseases 0.000 description 1
- 229920000867 polyelectrolyte Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating Effects 0.000 description 1
- KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N sodium Chemical compound [Na] KEAYESYHFKHZAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002522 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения композиционного препарата папаина и альгината натрия в виде густого раствора, включающий иммобилизацию ферментного препарата папаина в буферном растворе с носителем, инкубирование при комнатной температуре в течение 2 часов и промывку. Иммобилизацию папаина проводят путем комплексообразования в густой раствор альгината натрия в соотношении 10 мл раствора папаина в концентрации 20 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г сухого альгината натрия, предварительно растворенного в 10 мл буфера, при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин. В качестве буферного раствора используют 0,05 М фосфатный буфер с рН 6,5, содержащий цистеин в концентрации 0,04 М. Образовавшийся препарат промывают с помощью диализа в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию свежего в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного папаина. Предложенный способ прост в исполнении, не требует предварительной активации носителя и обеспечивает получение композиционного препарата иммобилизованного папаина и альгината натрия в виде густого раствора, включающего только иммобилизованный папаин и полностью отмытого от его нестабилизированной формы. 3 ил.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности, медицинской практике, косметологии и исследовательских целях. Изобретение может применяться при создании гибридных лекарственных препаратов в виде густых растворов ранозаживляющего и противоожогового назначения.
Папаин (КФ 3.4.22.2) - протеолитический фермент растительного происхождения класса гидролаз, выделенный из плодов дынного дерева Carica papaya. Его молекулярная масса составляет 23 кДа. Папаин имеет высокую активность в кислых, нейтральных и щелочных средах, в широком диапазоне температур. Изоэлектрическая точка фермента равна 8,75. Папаин применяется во многих отраслях народного хозяйства, таких как пищевая, фармацевтическая промышленности и др. Он используется при лечении воспалений, отеков, аллергий, а также для улучшения пищеварения [Holyavka М., Pankova S., Koroleva V. et al. Influence of UV radiation on molecular structure and catalytic activity of free and immobilized bromelain, ficin and papain // Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. - 2019. V. 201. - P. 111681]. Папаин обладает ранозаживляющими свойствами, антибактериальной активностью и проявляет ингибирующее действие на активацию тромбоцитов и образование моноцитарно-тромбоцитарных агрегатов, снижает степень проявления атеросклероза и перитонеального энтерита [Y.M. Kang, Н.А. Kang, D.C. Cominguez et al. Papain Ameliorates Lipid Accumulation and inflammation in High-Fat Diet-Induced Obesity Mice and 3T3-L1 Adipocytes via AMPK Activation // International Journal of Molecular Sciences. - 2021. V. 22. - P. 16].
Ферменты - это биологические катализаторы, которые ускоряют химические реакции за счет снижения энергии активации. Применение растворов ферментов в ряде отраслей промышленности является дорогостоящим, возможны трудности для повторного использования. Кроме того, энзимы могут иметь нестабильную молекулярную структуру, чувствительную к нефизиологическим температурам и значениям рН среды [Попова Т.Н., Рахманова Т.И., Попов С.С. Медицинская энзимология // Учебное пособие, Воронеж: Издательство ВГУ. - 2008. - С. 64]. Наиболее успешным и эффективным способом преодоления этих проблем является комплексообразование ферментов с различными полимерными носителями. Комплексообразование повышает устойчивость фермента к изменениям окружающей среды, сводит к минимуму или предотвращает загрязнение продукта катализатором и снижает эффекты ингибирования. Кроме того, становится возможным отделять ферменты от реакционных сред для повторного использования, поэтому возможно более экономичное их применение [Z. Ashkan, R. Hemmati, A. Homaei Immobilization of enzymes on nanoinorganic support materials: An update// International Journal of Biological Macromolecules. - 2021. V. 168. - P. 708-721].
Альгинат натрия представляет собой водорастворимый нейтральный линейный полисахарид. Молекулярная масса колеблется от 12 до 18 кДа. Он нетоксичен, биосовместим, биоразлагаем и неиммуногенен, обладает свойствами стабилизирующего характера, высокой вязкостью в воде и способностью к гелеобразованию. Альгикат натрия используется для различных биомедицинских целей, среди которых наиболее перспективными являются доставка лекарств, доставка генов, перевязка ран и их заживление [A. Ahmad, N.M. Mubarak, F.T. Jannat et al. A Critical Review on the Synthesis of Natural Sodium Alginate Based Composite Materials: An Innovative Biological Polymer for Biomedical Delivery Applications // Processes. - 2021. V. 9. - Р.27].
Известно применение альгината натрия в косметологии в виде масок для лица, которые оказывают многочисленные косметические эффекты: обладают лифтинговым, моделирующим, заживляющим эффектом, оказывают дренажное действие, улучшая отток крови и лимфы, способствуют рассасыванию застойных пятен, стабилизируют водно-жировые процессы. Альгинатная маска является сильным сорбентом: поглощая влагу с поверхности кожи, она пластифицируется и удаляется вместе с вредными веществами, обеспечивая мощную «расшлаковку» [Патент RU 2 715 231 С1, МПК A61K 8/14, A61K 9/127, А61Р 17/18, опубл. 26.02.2020, Бюл. №6].
Существует способ получения гетерогенного препарата на основе папаина, обладающего регенерационными свойствами [Патент RU 2677873 С2, МПК A61K 38/48, A61K 47/30, А61Р 17/02, опубл. 22.01.2019, Бюл. №3], включающий обработку матрицы ионообменных волокон ВИОН АН-1 или ВИОН КН-1 раствором папаина, инкубирование, отличающийся тем, что для иммобилизации на ВИОН КН-1 используют 0,2 М ацетатный буфер (рН 4,5-5,5) или 0,05 М боратный буфер с добавлением KCl (рН 9,0-9,5), а для иммобилизации на ВИОН АН-1 - 0,05 М трис-глициновый (рН 9,0) или 0,05 М глициновый (рН 10,0) буфер в расчете 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл на 1 г волокон, инкубирование проводится в течение 24 ч при комнатной температуре, образовавшийся осадок промывают использованным при иммобилизации буфером до отсутствия в промывных водах белка.
Известен способ получения гетерогенного биокатализатора на основе папаина, иммобилизованного на ионообменных смолах [Патент RU 2768742 С1, МПК C12N 11/04, C12N 11/10, опубл. 24.03.2022, Бюл. №9], включающий адсорбционную иммобилизацию папаина в буферном растворе на матрицу ионообменной смолы в соотношении 20 мл раствора папаина в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя, инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, промывку образовавшегося осадка буфером до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу воздушно-сухой ионообменной смолы АВ-16-ГС, а в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М фосфатный буфер, рН 11,0, инкубацию осуществляют в течение 2 часов, промывку образовавшегося осадка проводят 0,05 М трис-HCl буфером, рН 7,5.
В обоих способах иммобилизация папаина проводится путем адсорбции на нерастворимых носителях в соотношении 20 мл раствора папаина в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя при периодическом перемешивании, что не позволяет полностью автоматизировать процесс. Кроме того, получается нерастворимая форма фермента, которая, безусловно, имеет свои преимущества, но не дает возможность проводить реакции на твердых субстратах.
Известен способ получения иммобилизованного ферментного препарата на основе папаина, гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами [Патент RU 2 750 378 С1, МПК A61K 8/66, А61К 31/702, A61K 31/728, A61K 31/717, A61K 31/722, А61Р 31/00, А61Р 17/00, C12N 11/04 опубл. 28.06.2021, Бюл. №19], включающий растворение папаина в водном растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты (300 кДа) или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты (500 кДа) или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (800 кДа) в соотношении 10 мг папаина на 2 мл водного раствора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты (300 кДа) или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты (500 кДа) или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (800 кДа) в концентрации 1,5%, при этом осуществляют перемешивание до полного растворения при комнатной температуре; затем ведут иммобилизацию папаина путем добавления к полученной смеси графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) при молекулярной массе полисахарида 50-100 кДа в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля.
Недостатком способа является высокая стоимость гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами. Использование альгината натрия позволит сократить расходы.
Существует способ иммобилизации папаина в губчатый полиэлектролитный комплекс карбоксиметилхитозан/альгинат натрия [CN107254460A]. Недостатком изобретения является использование глутарового альдегида (химическая иммобилизация с использованием сшивающего агента), что ограничивает применение препарата в фармацевтической промышленности и медицине из-за его токсичности. Авторы не отделяли от полученного продукта несвязанный с носителем белок, т.е. получали смесь иммобилизованной и свободной формы папаина, что может отразиться на эксплуатационных свойствах препарата. Кроме того, для достижения губчатой структуры материала авторы предлагают использовать лиофильную сушку, что существенно удорожает производство данного ферментного препарата.
Известен способ стабилизации протеаз для использования в косметологических целях [US 2011/0177052А1]. Авторы стабилизировали 1%-ный раствор папаина 0,1%-ным раствором альгината натрия. Особенностью изобретения является получение препарата протеазы в жидкой фазе. Кроме того, авторы не отделяли от полученного продукта несвязанный с полисахаридом белок, т.е. получали смесь стабилизированной и нестабилизированной формы папаина, что может отразиться на эксплуатационных свойствах препарата.
В качестве прототипа служил способ получения гетерогенного препарата папаина в геле на основе пищевого хитозана или сукцината хитозана [Патент RU 2712690 С1, МПК C12N 11/04, C12N 11/10, опубл. 30.01.2020, Бюл. №4], включающий иммобилизацию папаина в буферном растворе на матрицу хитозана в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 1 мг/мл на 1 г носителя; инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; промывку образовавшегося осадка 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу пищевого хитозана с молекулярной массой менее 100 кДа или сукцината хитозана; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М глициновый буфер с рН 10,0 или 0,05 М ацетатный буфер с рН 5,8; инкубация проводится в течение 2 часов.
В отличие прототипа наш способ позволяет получить иммобилизованный папаин в другой форме, т.е. не в виде геля, а в форме густого раствора, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) папаин и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы.
Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке простого в исполнении, не требующего предварительной активации носителя способа получения композиционного препарата иммобилизованного папаина и альгината натрия в виде густого раствора с абсолютной вязкостью 400-500 МПа×с, включающею только иммобилизованный (стабилизированный) папаин и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, при этом в ходе иммобилизации активный центр папаина защищен от окисления путем добавления цистеина в концентрации 0,04 М.
Технический результат достигается тем, что в способе получения композиционного препарата папаина и альгината натрия в виде густого раствора, включающем иммобилизацию ферментного препарата папаина в буферном растворе с носителем, инкубирование при комнатной температуре в течение 2 часов и промывку, согласно изобретению, иммобилизацию папаина проводят путем комплексообразования в густой раствор альгината натрия в соотношении 10 мл раствора папаина в концентрации 20 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г сухого альгината натрия, предварительно растворенного в 10 мл буфера, при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М фосфатный буфер с рН 6,5, содержащий цистеин в концентрации 0,04 М; образовавшийся в процессе инкубирования препарат в виде густого раствора промывают с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины, с диаметром пор 25 кДа против 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, из расчета, что для промывки 21 мл полученного препарата используют 400 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7.5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию свежего в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного папаина.
Фиг. 1. Диаграмма значений содержания белка (в мг на 1 г носителя) в препаратах папаина в густом растворе альгината натрия с использованием следующих буферов: 1 - 0,05 М ацетатный, 2 - 0,05 М фосфатный, 3 - 0,05 М боратный с добавлением (1 М KCl, 4 - 0,05 М трис-глициновый, 5 - 0,05 М глициновый.
Фиг. 2. Диаграмма значений общей активности (в ед на 1 и раствора) папаина в густом растворе альгината натрия с использованием следующих буферов: 1-0,05 М ацетатный, 2 - 0,05
М фосфатный, 3 - 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KCl, 4 - 0,05 М трис-глициновый, 5 - 0,05 М глициновый.
Фиг. 3. Диаграмма значений удельной активности (в ед на 1 мг белка в пробе) папаина в густом растворе альгината натрия с использованием следующих буферов: 1 - 0,05 М ацетатный, 2 - 0,05 М фосфатный, 3 - 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KCl, 4 - 0,05 М трис-глициновый, 5 - 0,05 М глициновый.
Пример реализации способа.
В качестве объекта исследования был выбран папаин фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich». В качестве носителя для комплексообразования применяли альгинат натрия фирмы «100ing», 1%-ный масс. раствор которого в дистиллированный воде при 20°С имеет абсолютную вязкость 400-500 МПа×с.
Комплексообразование папаина и альгината натрия осуществляли следующим образом. К 1 г альгината натрия, предварительно растворенного в 10 мл 0,05 М фосфатного буфера с рН 6,5, содержащего цистеин в концентрации 0,04 М для предотвращения процессов окисления активного центра папаина, добавляли 10 мл раствора папаина в концентрации 20 мг/мл, приготовленного растворением папаина в 0,05 М фосфатном буфере с рН 6,5, инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин. После окончания инкубации образовавшийся препарат в виде густого раствора промывали с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка Spectra/Por 6 Standard RC шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины, изготовленного из регенерированной целлюлозы, с диаметром пор 25 кДа против 400 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5 в течение 8 часов, после чего буфер меняли на 400 мл свежего и продолжали диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного папаина. Для промывки 21 мл полученного препарата использовали 800 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5. По истечении этого времени осуществляли контроль наличия белка в промывных водах с помощью спектрофотометра СФ-2000 при λ=280 нм.
Содержание белка в композиционных препаратах папаина определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. -1951.-V.193.-P. 265-275].
Определение протеазной активности папаина проводили на субстрате азоказеине (Sigma, США) [Sabirova A.R., Rudakova N.L., Balaban N.P., Ilyinskaya O.N., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Rudenskaya G.N., Sharipova M.R. A novel secreted metzincin metalloproteinase from Bacillus intermedius // FEBS Lett. - 2010 - V. 584 (21), P. 4419-4425]. К 50 мг комплексообразованного образца добавляли 200 мкл 0,05 М трис-HCl буфера с рН 7,5, 800 мкл азоказеина (0,5% масс.в 0,05 М трис-HCl буфере, рН 7,5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее добавляли 800 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (5% масс.), инкубировали 10 минут при 4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 11700 g для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 3%-ного масс.раствора NaOH для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 10 мм кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 50 мг образца и 200 мкл буфера
(фермент в комплексе с носителем в контрольную пробу вносили последним, остальные операции для нее делали аналогично опытным пробам).
Единицей протеазной активности служило количество папаина, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ азоказеина за 1 мин. Удельную протеазную активность рассчитывали по формуле:
A=D*1000/120/200/С,
где А - протеазная активность препарата, мкМ/мин на 1 мг белка,
D - оптическая плотность раствора при 410 нм,
С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,
120 - время инкубации в минутах,
200 - объем пробы, мкл,
1000 - коэффициент для пересчета в мкМ.
Все экспериментальные исследования осуществляли минимум в 8-кратной повторности. Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
Для получения композиционного препарата папаина в виде густого раствора альгината натрия, в качестве среды для комплексообразования мы использовали следующие буферы: 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KCl с рН 8,0-10,0, 0,05 М ацетатный с рН 4,0-5,8, 0,05 М глициновый с рН 8,6-10,5, 0,05 М трис-глициновый с рН 8,5-9,0, 0,05 М фосфатный с рН 5,8-7,5. Результаты отражены на фиг. 1-3.
Анализ содержания белка в композиционных препаратах показал, что наибольшее количество папаина (в мг на г носителя), наблюдается при использовании 0,05 М трис-глицинового буфера с рН 8,5 и 9,0 в качестве среды для комплексообразования (фиг. 1). Общая активность (в ед на мл раствора) папаина оказалась выше при использовании 0,05 М ацетатного буфера с рН 4,5 и 5,0 (фиг. 2). Наибольшую удельную активность показали препараты папаина, полученные при использовании 0,05 М фосфатного буфера с рН 6,5 фиг. 3).
Метод получения композиционного препарата папаина и альгината натрия в виде густого раствора имеет свои преимущества. Благодаря комплексообразованию, фермент защищен от неблагоприятных условий среды, повышается его стабильность, биокатализатору можно придавать различные конфигурации, возможна его адресная доставка в организм.
Мы сравнили полученные результаты по определению аталитической активности и содержания белка для композиционных препаратов папаина и альгината натрия в виде густого раствора. Оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя), общей активности (в ед на мл раствора) и удельной активности (в ед на мг белка) получено при создании препарата папаина и альгината натрия в виде густого раствора при использовании 0,05 М фосфатного буфера с рН 6,5.
Таким образом, была разработана методика получения композиционного препарата папаина и альгината натрия в виде густого раствора с абсолютной вязкостью 400-500 МПа×с, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) папаин и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, т.к. после диализа 21 мл препарата против 800 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5 исключается переход фермента из фазы носителя в раствор, что позволяет проводить реакции, получая продукт, не "загрязненный" ферментом. Кроме того, в ходе иммобилизации активный центр папаина защищен от окисления путем добавления цистеина в концентрации 0,04 М.
Claims (1)
- Способ получения композиционного препарата папаина и альгината натрия в виде густого раствора, включающий иммобилизацию ферментного препарата папаина в буферном растворе с носителем, инкубирование при комнатной температуре в течение 2 часов и промывку, отличающийся тем, что иммобилизацию папаина проводят путем комплексообразования в густой раствор альгината натрия в соотношении 10 мл раствора папаина в концентрации 20 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г сухого альгината натрия, предварительно растворенного в 10 мл буфера, при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М фосфатный буфер с рН 6,5, содержащий цистеин в концентрации 0,04 М; образовавшийся в процессе инкубирования препарат в виде густого раствора промывают с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины, с диаметром пор 25 кДа против 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, из расчета, что для промывки 21 мл полученного препарата используют 400 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию свежего в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного папаина.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2788455C1 true RU2788455C1 (ru) | 2023-01-19 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011091084A2 (en) * | 2010-01-19 | 2011-07-28 | Basf Corporation | Stabilized proteases for use in skin care |
| RU2677873C2 (ru) * | 2017-07-03 | 2019-01-22 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Способ получения гетерогенного препарата на основе папаина |
| RU2712690C1 (ru) * | 2019-03-07 | 2020-01-30 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Способ получения препарата папаина в геле на основе пищевого хитозана и сукцината хитозана |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011091084A2 (en) * | 2010-01-19 | 2011-07-28 | Basf Corporation | Stabilized proteases for use in skin care |
| RU2677873C2 (ru) * | 2017-07-03 | 2019-01-22 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Способ получения гетерогенного препарата на основе папаина |
| RU2712690C1 (ru) * | 2019-03-07 | 2020-01-30 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Способ получения препарата папаина в геле на основе пищевого хитозана и сукцината хитозана |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| VEYMAR G.TACIAS-PASCACIO et al., Immobilization of papain: A review, International Journal of Biological Macromolecules, 2021, Volume 188, pp.94-113. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Altun et al. | Immobilization of pepsin on chitosan beads | |
| Nikolic et al. | Sodium periodate oxidized cotton yarn as carrier for immobilization of trypsin | |
| US4004979A (en) | Preparation of active proteins cross-linked to inactive proteins | |
| Chiou et al. | Immobilization of Candida rugosa lipase on chitosan with activation of the hydroxyl groups | |
| Ilyina et al. | Enzymic preparation of acid-free-water-soluble chitosan | |
| Singh et al. | Glutaraldehyde-activated chitosan matrix for immobilization of a novel cysteine protease, procerain B | |
| WO2000015272A1 (en) | Polymer immobilized living cells and applications thereof | |
| CN107254460B (zh) | 一种羧甲基壳聚糖/海藻酸钠复合海绵固定化木瓜蛋白酶及其应用 | |
| Monier et al. | Evaluation of the potential of polymeric carriers based on photo-crosslinkable chitosan in the formulation of lipase from Candida rugosa immobilization | |
| Hearn et al. | Poly (methylene co-guanidine) coated alginate as an encapsulation matrix for urease | |
| RU2711786C1 (ru) | Способ получения гетерогенного препарата бромелайна, ковалентно связанного с матрицей хитозана | |
| RU2788455C1 (ru) | Способ получения композиционного препарата папаина и альгината натрия в виде густого раствора | |
| RU2677858C2 (ru) | Способ получения гетерогенного ферментного препарата на основе фицина, обладающего ранозаживляющими и регенерирующими свойствами | |
| Iyengar et al. | Urease bound to chitin with glutaraldehyde | |
| Ozmen et al. | Pretreatment of Candida rugosa lipase with soybean oil before immobilization on β-cyclodextrin-based polymer | |
| RU2712690C1 (ru) | Способ получения препарата папаина в геле на основе пищевого хитозана и сукцината хитозана | |
| Kennedy et al. | Immobilisation of biocatalysts by metal-link/chelation processes | |
| RU2771183C1 (ru) | Способ получения препарата фицина в геле на основе карбоксиметилцеллюлозы | |
| RU2822736C1 (ru) | Способ получения гибридного препарата папаина и аскорбата хитозана в виде густого раствора | |
| RU2792785C1 (ru) | Способ получения композиционного препарата бромелайна и альгината натрия в виде густого раствора | |
| RU2795425C1 (ru) | Способ получения гибридного препарата папаина и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора | |
| JP5859984B2 (ja) | 試験構造体 | |
| RU2788454C1 (ru) | Способ получения гибридного препарата бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора | |
| RU2792783C1 (ru) | Способ получения гибридного препарата фицина и ацетата хитозана в виде густого раствора | |
| RU2822735C1 (ru) | Способ получения гибридного препарата фицина и аскорбата хитозана в виде густого раствора |