RU2677873C2 - Способ получения гетерогенного препарата на основе папаина - Google Patents
Способ получения гетерогенного препарата на основе папаина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2677873C2 RU2677873C2 RU2017123457A RU2017123457A RU2677873C2 RU 2677873 C2 RU2677873 C2 RU 2677873C2 RU 2017123457 A RU2017123457 A RU 2017123457A RU 2017123457 A RU2017123457 A RU 2017123457A RU 2677873 C2 RU2677873 C2 RU 2677873C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vion
- papain
- buffer
- immobilization
- glycine
- Prior art date
Links
- 239000004365 Protease Substances 0.000 title claims abstract description 39
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 title claims abstract description 38
- 229940055729 papain Drugs 0.000 title claims abstract description 36
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 title claims abstract description 36
- 239000003814 drug Substances 0.000 title abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 17
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title description 12
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims abstract description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 7
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 26
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 26
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 24
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 4,4-diethylpiperidine Chemical compound CCC1(CC)CCNCC1 DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003357 wound healing promoting agent Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 abstract 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 8
- 235000009467 Carica papaya Nutrition 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 240000006432 Carica papaya Species 0.000 description 4
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 108010041102 azocasein Proteins 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 3
- 241000219173 Carica Species 0.000 description 2
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 2
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 206010023330 Keloid scar Diseases 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 206010003074 arachnoiditis Diseases 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 2
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 2
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 2
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 2
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 2
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 2
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010011985 Decubitus ulcer Diseases 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010019909 Hernia Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000003618 Intervertebral Disc Displacement Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 206010029240 Neuritis Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000004210 Pressure Ulcer Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 206010048038 Wound infection Diseases 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000004887 air purification Methods 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 229940064004 antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001877 deodorizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 125000005909 ethyl alcohol group Chemical group 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000256 facial nerve Anatomy 0.000 description 1
- 208000014337 facial nerve disease Diseases 0.000 description 1
- 102000013373 fibrillar collagen Human genes 0.000 description 1
- 108060002894 fibrillar collagen Proteins 0.000 description 1
- 230000001723 fibrinogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003352 fibrogenic effect Effects 0.000 description 1
- -1 for example Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- VPOLVWCUBVJURT-UHFFFAOYSA-N pentadecasodium;pentaborate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-].[O-]B([O-])[O-].[O-]B([O-])[O-].[O-]B([O-])[O-].[O-]B([O-])[O-] VPOLVWCUBVJURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229920002239 polyacrylonitrile Polymers 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L sodium tetrathionate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)SSS([O-])(=O)=O HAEPBEMBOAIUPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 239000003860 topical agent Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине и касается способа получения гетерогенного препарата на основе папаина, обладающего регенерационными свойствами, включающего обработку матрицы ионообменных волокон ВИОН АН-1 или ВИОН КН-1 раствором папаина, инкубирование. Для иммобилизации на ВИОН КН-1 используют ацетатный буфер или боратный буфер с добавлением KCl, а для иммобилизации на ВИОН АН-1 - трис-глициновый или глициновый буфер. Инкубирование проводят в течение 24 часов при комнатной температуре. Образовавшийся осадок промывают использованным при иммобилизации буфером до отсутствия в промывных водах белка. Изобретение обеспечивает сокращение расхода ранозаживляющего средства благодаря высокой стабильности препарата при температурах выше физиологических и его пролонгированному действию. 4 ил., 1 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения иммобилизованных ферментов, и может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности, медицинской и лабораторной практике при изготовлении лекарственных средств, обладающих регенерирующим и ранозаживляющим действием.
Ферментные препараты, применяемые при лечении гнойных осложнений повреждений кожи различного характера, на российском рынке представлены незначительной группой лекарственных средств. Несмотря на разработку и внедрение новых методов лечения гнойных ран, использование фармацевтических препаратов под повязкой является основным благодаря его доступности, простоте применения и экономической выгоде.
Для воздействия на микроорганизмы, вызывающие гнойно-воспалительный процесс, используют средства местного применения с антибиотиками и антисептиками. Однако следует отметить, что массовое, а порой бесконтрольное их применение приводит сначала к появлению, а затем к преобладанию в ране резистентной к ним микрофлоры [Патент RU 2542373, МПК А61K 31/14, А61K 31/4164, А61K 47/34, А61K 47/48, А61K 9/06, А61Р 31/04, А61Р 17/02, опубл. 20.02.2015].
Папаин (КФ 3.4.22.2) - растительная цистеиновая протеаза, катализирующая гидролиз белков, пептидов, амидов и сложных эфиров основных аминокислот. В значительных количествах этот фермент содержится в дынном дереве - папайе (Carica papaya). Папаин перспективен для применения в клинической практике, например, при обработке трансплантатов для повышения степени их очистки от фибриллярного коллагена и гликопротеинов, определяющих антигенность ткани [Патент RU 2136297, МПК А61K 35/32, A01N 1/02, опубл. 10.09.1999; Патент RU 2136298, МПК А61K 35/32, A01N 1/02, опубл. 10.09.1999]. Папаин также может использоваться при лечении келлоидных рубцов, осложненных форм неврита лицевого нерва, арахноидита головного мозга, при терапии различных патологий, связанных с развитием рубцово-спаечного процесса: при грыже позвоночного диска, травмах, в хирургической косметологии для лечения гипертрофических рубцов [Патент RU 2141359, МПК A61N 1/30, А61 K 35/78, опубл. 20.11.1999].
Использование многих энзимов в свободном состоянии (в растворе) не дает высокого эффекта, т.к. белок нестабилен в таких условиях и может подвергаться протеолизу. В частности, папаин утрачивает свою активность в течение нескольких часов [Патент RU 2174878, МПК В08В 3/08, A61L 12/00, опубл. 20.10.2001]. В этой связи достаточно распространенными стали ферментные таблетки, которые растворяют в дистиллированной воде, изотоническом растворе натрия хлорида или в специальном консервирующем растворе. Таблетированные формы протеаз имеют достаточно длительный срок хранения (1 год и более), однако, характеризуются значительной стоимостью, сложны в изготовлении, а их применение связано с затратами времени и дополнительными манипуляциями по растворению таблеток в используемых растворах [Пат. США 3910296, МПК C11D 3/00, C11D 3/386, G02C 13/00, C11D 17/00, A61L 12/08, опубл. 14.04.1987; Пат. США 4096870, МПК G02C 7/04, C11D 17/00, C11D 3/00, C11D 3/386, опубл. 27.06.1978].
Альтернативными и значительно более удобными для практического применения препаративными формами ферментных средств являются концентрированные растворы, несколько капель которых содержит эквивалентное таблеткам количество соответствующего энзима. Одним из способов длительного сохранения каталитической активности протеолитических ферментов, в том числе папаина, в таких растворах является перевод энзима в инактивированную форму путем обработки тетратионатом натрия или другими соединениями, создающими дополнительные дисульфидные S-S связи в его структуре. Непосредственно перед использованием этого раствора фермент снова переводят в активную форму путем восстановления цистеином или меркаптоэтанолом до соответствующей сульфгидрильной SH-формы. Существенным недостатком данного способа является необходимость использования цикла «дезактивация-активация», что делает этот метод сложным, дорогостоящим и практически непригодным для массового индивидуального применения [Пат. США 4715899, МПК C11D 7/04, C11D 3/00, C11D 3/386, A61L 12/08, опубл. 29.12.1987].
Другим способом сохранения протеолитической активности ферментов в их концентрированных растворах является использование стабилизаторов, например, сульфита натрия и/или пентабората натрия. Указанные стабилизаторы при их содержании в растворе от 1 до 15% (в среднем 4,5-9%) и концентрации фермента от 0,001 до 10% (предпочтительно 0,01-5%) обеспечивают сохранение протеазной активности в течение трех недель при температуре 37°С, что приблизительно соответствует 3-4 месяцам хранения препарата при комнатной температуре. Однако круг энзимов, пригодных для использования с данными стабилизаторами, ограничивается в основном бактериальными протеазами, для которых оптимальный диапазон рабочих значений pH находится в пределах 8-11. Кроме того, период времени, в течение которого ферментный препарат сохраняет свою активность, также недостаточно велик [Пат. США 4404115, МПК C11D 3/386, опубл. 13.09.1983].
Все большее применение в медицине и промышленности находят иммобилизованные ферментные системы. В широком смысле иммобилизация означает любое ограничение числа степеней свободы молекулы или ее фрагментов. Иммобилизованными называют энзимы, искусственно связанные с нерастворимым носителем посредством физических или химических взаимодействий и сохраняющие частично или полностью каталитические свойства.
Известно, что иммобилизация фермента на нерастворимом носителе позволяет решить несколько важных задач для медицины: 1) получение препаратов пролонгированного действия благодаря стабилизации и увеличению времени полужизни фермента, 2) решение проблемы диффузии вещества в организме, 3) направленное регулирование оптимумов функционирования препарата (температурный оптимум, оптимум pH).
Ионообменные волокна ВИОН - новые высокоэффективные материалы для очистки воздуха от ряда токсичных и агрессивных газов, а также аэрозолей. Основные преимущества волокон ВИОН заключаются в следующем: степень очистки ионита 98%, скорость сорбции и регенерации в 10-15 раз выше, чем для зернистых материалов, высокая объемная емкость, селективность, гидролитическая устойчивость к действию кислот, щелочей, регенерирующих агентов (сохранение обменной емкости после 100 и более циклов сорбция-регенерация).
Волокно ВИОН КН-1, использующееся в качестве дезодорирующего и ранозаживляющего материала, представляет собой слабокислотное катионнообменное хемосорбционное карбоксилсодержащее волокно с трехмерной сеткой. Этот материал характеризуется высокой скоростью сорбции, высокоразвитой поверхностью, высокой гигроскопической устойчивостью, гидрофильностью. Волокно ВИОН КН-1 очищает и дезинфицирует рану путем нейтрализации токсических веществ в полости раны, нормализации pH, выводит фиброгнойный экссудат, адсорбирует гнойноспецифический запах, не прилипает к раневой поверхности, не вызывает аллергии и раздражения, что благоприятно сказывается на росте грануляций и эпителизации, сокращает расход перевязочного материала и лекарственных препаратов. Применение материала эффективно при терапии пролежней и гнойных ран, позволяет сократить сроки лечения. ВИОН КН-1 обладает антибактерицидными и антигрибковыми свойствами [Патент RU 2229311, МПК A61L 15/00, A61L 15/16, A61L 15/22, опубл. 27.05.2004; Патент RU 2150877, МПК А43В 17/10, опубл. 20.06.2000].
Некоторые разновидности волокон ВИОН регенерируют ткань за счет окислительно-восстановительного процесса, очищают рану путем окисления токсических веществ в области раневой поверхности, выводят фибриногнойный экссудат за счет дренажных свойств, благоприятствуют эпителизации и грануляции тканей [Патент RU 2238760, МПК A61L 15/16, A61L 15/22, опубл. 27.10.2004].
Технология синтеза ВИОН КН-1 и ВИОН АН-1, тканых и нетканых прошивных полотен из него известна и легко осуществима на заводах по производству полиакрилонитрильного волокна [Патент RU 2102544, МПК D01F 11/04, C08J 5/20, опубл. 20.01.1998; Патент RU 2054481, МПК C12N 11/08, опубл. 20.02.1996]. Сочетание недорогих компонентов позволит сделать доступным этот технологичный метод для отечественных лабораторий.
В качестве прототипа был выбран способ получения иммобилизованных ферментов по патенту RU 2054481 (МПК C12N 11/08, опубл. 20.02.1996), согласно которому водным раствором фермента обрабатывали хемесорбционное волокно на основе сополимера акрилонитрила с 2,5-винилпиридином. В частности, в рамках способа-прототипа для иммобилизации папаина на матрице ВИОН АН-1 авторами были апробированы следующие методики:
1) 72,2 мг волокна ВИОН АН-1 обрабатывали 1 мл раствора папаина с концентрацией 0,833 мг/мл, выдерживали 30 мин при 20°С. Количество адсорбированного папаина составило 11,54 мг/г волокна.
2) 72,2 мг волокна ВИОН АН-1 обрабатывали 1 мл раствора папаина с концентрацией 2,5 мг/мл, выдерживали 30 мин при 20°С. Количество адсорбированного папаина составило 17 мг/г волокна.
Недостатком способа является то, что количество иммобилизованного фермента было достаточно низким - не более 20 мг/г носителя. Кроме того, авторы не осуществили промывку иммобилизованных образцов, в которых могли находиться несорбированный или необменно сорбированный белок.
Целью настоящего изобретения является получение гетерогенного препарата иммобилизованного папаина на матрице ионообменных волокон ВИОН-синтетических полимеров, которые как носители для иммобилизации ферментов способны не только повысить их стабильность по отношению к действию различных денатурирующих факторов (что необходимо для достижения возможности пролонгированного действия лекарственных средств), но и сами обладают ранозаживляющими свойствами, что может повысить клиническую эффективность действия препаратов. Введение волокон ВИОН в основу лекарственного средства придает ему более высокую устойчивость к микробной деградации по сравнению с ферментными препаратами в растворе, что позволяет снизить в готовых формах лекарственного средства концентрацию химических консервантов, обеспечивая тем самым повышение его биосовместимости.
Действующим веществом предлагаемого нами средства является папаин, который ускоряет процессы репарации тканей. Папаин (КФ 3.4.22.2) - растительный протеолитический фермент. В значительных количествах содержится в дынном дереве - папайе (Carica papaya). Папаин принадлежит к группе цистеиновых протеиназ. Хорошо растворим в воде, водных солевых растворах и в 70% метиловом и этиловом спиртах. Активен не только в кислых, но и в нейтральных и щелочных средах (оптимум pH 6-7), сохраняет активность в широком температурном диапазоне (до 50-60°С), характеризуется относительно широкой субстратной специфичностью. Папаин обладает противовоспалительными свойствами. Не действуя напрямую на очаг воспаления, фермент стимулирует метаболизм, что ускоряет процессы регенерации воспаленных тканей. Папаин увеличивает приток крови и разрушает токсичные вещества в очаге воспаления. Кроме того, он нейтрализует токсины, выделяемые многими болезнетворными микроорганизмами. Папаин может использоваться при лечении келлоидных рубцов, осложненных форм неврита лицевого нерва, арахноидита головного мозга, при терапии различных патологий, связанных с развитием рубцово-спаечного процесса: при грыже позвоночного диска, травмах, в хирургической косметологии для лечения гипертрофических рубцов [Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. - М.: Наука, 1971. - 404 с.].
Технический результат заключается в разработке способа получения нового ранозаживляющего материала на основе папаина, позволяющего сократить расход ранозаживляющего средства благодаря высокой стабильности препарата при температурах выше физиологических и его пролонгированному действию.
Технический результат достигается тем, что в способе получения гетерогенного препарата на основе папаина, обладающего регенерационными свойствами, включающем иммобилизацию ферментного препарата в буферном растворе, инкубирование и промывку, согласно изобретению, иммобилизацию папаина проводят на матрицу ионообменных волокон ВИОН КН-1 или ВИОН АН-1 в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл на 1 г волокон; в качестве буферного раствора для иммобилизации на ВИОН КН-1 используют 0,2 М ацетатный буфер (pH 4,5-5,5) или 0,05 М боратный буфер с добавлением KCl (pH 9,0-9,5), а для иммобилизации на ВИОН АН-1 - 0,05 М трис-глициновый (pH 9,0) или 0,05 М глициновый (pH 10,0) буфер; инкубация проводится в течение 24 часов при комнатной температуре; образовавшийся осадок промывают использованным при иммобилизации буфером до отсутствия в промывных водах белка.
Фиг. 1. Структура элементарного звена катионита ВИОН КН-1 (а) и анионита ВИОН АН-1 (б). Фиг. 2. Приведены диаграммы содержания белка (в мг на 1 г носителя) в препаратах папаина, иммобилизованных на волокнах ВИОН. Фиг. 3. Приведены диаграммы общей каталитической активности (в ед на 1 мл раствора) препаратов папаина, иммобилизованных на волокнах ВИОН. Фиг. 4. Приведены диаграммы удельной каталитической активности (в ед на 1 мг белка в пробе) препаратов папаина, иммобилизованных на волокнах ВИОН.
В качестве объекта исследования был выбран папаин фирмы «AppliChem», носителями для иммобилизации - ионообменные волокна ВИОН КН-1 и ВИОН АН-1 (фиг. 1А и 1Б, соответственно).
Для подготовки ионообменных волокон к иммобилизации их помещали в дистиллированную воду. После набухания обрабатывали растворами HCl переменной концентрации (0,5; 1,0; 1,5; 1,0; 0,5 моль/л), процесс проводили в статических условиях. После отмывки дистиллированной водой осуществляли попеременную четырехкратную обработку 1 моль/л растворами NaOH и HCl с промежуточной промывкой дистиллированной водой. Каждый этап составлял не менее 20 мин.
Иммобилизацию папаина на волокнах осуществляли адсорбционным методом. К 1 г волокон ВИОН добавляли 20 мл буферного раствора фермента (применяли различные буферные системы, изменяя их pH и ионную силу), инкубировали в течение 24 часов. После окончания инкубации образовавшийся осадок промывали 50 мМ трис- HCl буфером (pH 7,5) до отсутствия в промывных водах белка (контроль этого факта осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 при λ=280 нм).
Содержание белка в иммобилизованных препаратах определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275]. Определения протеолитической активности иммобилизованного папаина проводили спектрофотометрически с использованием азоказеина (Fluka) в качестве субстрата. К 50 мг образца добавляли 200 мкл трис- HCl буфера, pH 7,5, 800 мкл азоказеина (0,5% в 50 мМ трис-HCl буфере, pH 7,5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее приливали 800 мкл ТХУ (5%), инкубировали 10 минут при -4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 13000 об/мин для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 3% NaOH для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 1 см кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл трихлоруксусной кислоты, 50 мг образца и 200 мкл буфера (без предварительной инкубации с субстратом). За единицу каталитической активности принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ субстрата за 1 мин. Удельную протеолитическую активность папаина рассчитывали по формуле:
ПA=D*1000/120/200/С,
где ПА - протеолитическая активность, мкМ/мин на 1 мг белка, D - оптическая плотность при 410 нм, С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури, 120 - время инкубации в минутах, 200 - объем пробы, 1000 - пересчет в мкМ.
Статистическую обработку результатов проводили при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
Для получения гетерогенных биокатализаторов на основе папаина, адсорбированного на матрице ионообменных волокон ВИОН КН-1 и ВИОН АН-1 в качестве иммобилизационной среды использовали следующие буферные растворы: 0,05 М глициновый (pH 8,6-10,0), 0,2 М ацетатный (pH 4,0-5,0), 0,1 М фосфатный (pH 6,0-8,0), 0,05 М боратный буфер с добавлением KCl (pH 8,0-10,0) и 0,05 М трис-глициновый буфер (pH 8,5-9,0).
Содержание белка, выраженное в мг на 1 г носителя, в препаратах папаина, иммобилизованных на матрице волокон ВИОН, отражено на фиг. 2. Наиболее высокую общую активность (в ед на мл раствора) показали образцы фермента, адсорбированного на катионите ВИОН КН-1 с использованием в качестве среды 0,2 М ацетатного буфера (диапазон pH 4,5-5,5) и 0,05 М боратного буфера с добавлением KCl (pH 9,0-10,0). Примерно равные значения каталитической активности были характерны для энзима, иммобилизованного на матрице анионита ВИОН АН-1 с применением 0,05 М трис-глицинового буфера (pH 9,0) и 0,05 М глицинового буфера (pH 10,0) (фиг. 3).
Максимальная удельная активность (в ед на мг белка) гетерогенного биокатализатора на основе папаина, адсорбированного на матрице волокна ВИОН КН-1, наблюдается при использовании в качестве иммобилизационной среды 0,2 М ацетатного буфера (pH 4,5-5,5) и 0,05 М боратного буфера с добавлением KCl (pH 9,0-9,5). Для ВИОН АН-1 оптимальными по данному параметру оказались 0,05 М трис-глициновый и 0,05 М глициновый буфер с pH 9,0 и 10,0 соответственно (фиг. 4).
Таким образом, была разработана методика получения гетерогенного препарата ветеринарного и медицинского назначения на основе папаина, иммобилизованного на матрице ионообменных волокон ВИОН КН-1 и ВИОН АН-1. Предлагаемый нами продукт - современная безопасная альтернатива антибиотикам и химиопрепаратам при лечении ран и раневых инфекций, в том числе устойчивых к действию антибиотиков.
Claims (1)
- Способ получения гетерогенного препарата на основе папаина, обладающего регенерационными свойствами, включающий обработку матрицы ионообменных волокон ВИОН АН-1 или ВИОН КН-1 раствором папаина, инкубирование, отличающийся тем, что для иммобилизации на ВИОН КН-1 используют 0,2 М ацетатный буфер (рН 4,5-5,5) или 0,05 М боратный буфер с добавлением KCl (рН 9,0-9,5), а для иммобилизации на ВИОН АН-1 - 0,05 М трис-глициновый (рН 9,0) или 0,05 М глициновый (рН 10,0) буфер в расчете 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл на 1 г волокон, инкубирование проводится в течение 24 ч при комнатной температуре, образовавшийся осадок промывают использованным при иммобилизации буфером до отсутствия в промывных водах белка.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017123457A RU2677873C2 (ru) | 2017-07-03 | 2017-07-03 | Способ получения гетерогенного препарата на основе папаина |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017123457A RU2677873C2 (ru) | 2017-07-03 | 2017-07-03 | Способ получения гетерогенного препарата на основе папаина |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2017123457A RU2017123457A (ru) | 2019-01-10 |
| RU2017123457A3 RU2017123457A3 (ru) | 2019-01-10 |
| RU2677873C2 true RU2677873C2 (ru) | 2019-01-22 |
Family
ID=64977329
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017123457A RU2677873C2 (ru) | 2017-07-03 | 2017-07-03 | Способ получения гетерогенного препарата на основе папаина |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2677873C2 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2768742C1 (ru) * | 2021-05-26 | 2022-03-24 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе папаина, иммобилизованного на ионообменных смолах |
| RU2788455C1 (ru) * | 2022-08-01 | 2023-01-19 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Способ получения композиционного препарата папаина и альгината натрия в виде густого раствора |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2054481C1 (ru) * | 1993-02-16 | 1996-02-20 | Химический факультет МГУ им.М.В.Ломоносова | Способ получения иммобилизованных ферментов |
| RU2229311C2 (ru) * | 2001-11-22 | 2004-05-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Айтуар -НП" | Ранозаживляющий материал |
| RU2238760C2 (ru) * | 2002-01-16 | 2004-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Айтуар-НП" | Ранозаживляющий материал |
| CN102716684A (zh) * | 2012-07-06 | 2012-10-10 | 北京师范大学 | 一种采用聚乳酸纤维膜固定化复合酶技术对富营养化水污染治理的方法 |
-
2017
- 2017-07-03 RU RU2017123457A patent/RU2677873C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2054481C1 (ru) * | 1993-02-16 | 1996-02-20 | Химический факультет МГУ им.М.В.Ломоносова | Способ получения иммобилизованных ферментов |
| RU2229311C2 (ru) * | 2001-11-22 | 2004-05-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Айтуар -НП" | Ранозаживляющий материал |
| RU2238760C2 (ru) * | 2002-01-16 | 2004-10-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Айтуар-НП" | Ранозаживляющий материал |
| CN102716684A (zh) * | 2012-07-06 | 2012-10-10 | 北京师范大学 | 一种采用聚乳酸纤维膜固定化复合酶技术对富营养化水污染治理的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KHORUNZHINA SI., et al., [Papain immobilization on a fibrous polymer of polyvinyl alcohol].Prikl Biokhim Mikrobiol.[Article in Russian] 1978 Jan-Feb;14(1):11-4. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2768742C1 (ru) * | 2021-05-26 | 2022-03-24 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе папаина, иммобилизованного на ионообменных смолах |
| RU2788455C1 (ru) * | 2022-08-01 | 2023-01-19 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Способ получения композиционного препарата папаина и альгината натрия в виде густого раствора |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2017123457A (ru) | 2019-01-10 |
| RU2017123457A3 (ru) | 2019-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Baidamshina et al. | Anti-biofilm and wound-healing activity of chitosan-immobilized Ficin | |
| CN103356692B (zh) | 一种复合抗菌凝胶剂及其制备方法 | |
| US20070148215A1 (en) | Therapeutically active dressings, their manufacture and use | |
| JP5989723B2 (ja) | タンパク質からエンドトキシンを除去するための方法 | |
| US20020156437A1 (en) | Removal of targeted proteases with proteinaceous wound dressings containing growth factors | |
| JP3736916B2 (ja) | 含水性ソフトコンタクトレンズの消毒用組成物とその用途 | |
| RU2677858C2 (ru) | Способ получения гетерогенного ферментного препарата на основе фицина, обладающего ранозаживляющими и регенерирующими свойствами | |
| McGucken et al. | Studies on the mode of action of glutaraldehyde on Escherichia coli | |
| RU2677873C2 (ru) | Способ получения гетерогенного препарата на основе папаина | |
| RU2437681C1 (ru) | Раневое покрытие с лечебным действием | |
| ES2423730T3 (es) | Uso de una composición sinérgica como agente terapéutico o agente de desinfección | |
| JP2011512394A (ja) | 慢性創傷の治療 | |
| JPH01238534A (ja) | エンドトキシンの除去方法 | |
| RU2677343C2 (ru) | Способ получения гетерогенного препарата на основе бромелайна, обладающего ранозаживляющими свойствами | |
| RU2712690C1 (ru) | Способ получения препарата папаина в геле на основе пищевого хитозана и сукцината хитозана | |
| EP0338173B1 (en) | Ionic dressing for topical administration of drugs to wounds and burns | |
| RU2769243C1 (ru) | Способ получения гетерогенного ферментного препарата на основе фицина и низкомолекулярного хитозана | |
| RU2822736C1 (ru) | Способ получения гибридного препарата папаина и аскорбата хитозана в виде густого раствора | |
| RU2504396C1 (ru) | Фармацевтическая композиция, содержащая ферменты: коллагеназу и лизоцим и/или сангвиритрин | |
| RU2678435C2 (ru) | Способ получения гетерогенного препарата на основе коллагеназы и хитозана | |
| RU2677232C2 (ru) | Способ получения гетерогенного препарата различной дисперсности на основе бромелайна и хитозана | |
| RU2792785C1 (ru) | Способ получения композиционного препарата бромелайна и альгината натрия в виде густого раствора | |
| RU2792783C1 (ru) | Способ получения гибридного препарата фицина и ацетата хитозана в виде густого раствора | |
| Medusheva et al. | New medical materials with an integral lasting effect based on fibre-forming polymers | |
| RU2795425C1 (ru) | Способ получения гибридного препарата папаина и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200704 |