RU2678435C2 - Способ получения гетерогенного препарата на основе коллагеназы и хитозана - Google Patents
Способ получения гетерогенного препарата на основе коллагеназы и хитозана Download PDFInfo
- Publication number
- RU2678435C2 RU2678435C2 RU2017123460A RU2017123460A RU2678435C2 RU 2678435 C2 RU2678435 C2 RU 2678435C2 RU 2017123460 A RU2017123460 A RU 2017123460A RU 2017123460 A RU2017123460 A RU 2017123460A RU 2678435 C2 RU2678435 C2 RU 2678435C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- collagenase
- chitosan
- molecular weight
- buffer
- buffer solution
- Prior art date
Links
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 title claims abstract description 54
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 title claims abstract description 47
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 title claims abstract description 47
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 title abstract description 23
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title description 16
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 20
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 7
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 239000003357 wound healing promoting agent Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 36
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 36
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 33
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 15
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 14
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 241000193159 Hathewaya histolytica Species 0.000 description 5
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 108010041102 azocasein Proteins 0.000 description 5
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 4
- 102220240796 rs553605556 Human genes 0.000 description 4
- DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 4,4-diethylpiperidine Chemical compound CCC1(CC)CCNCC1 DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 3
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 2
- 102220547770 Inducible T-cell costimulator_A23L_mutation Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010063560 Excessive granulation tissue Diseases 0.000 description 1
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 1
- 208000001034 Frostbite Diseases 0.000 description 1
- 206010017711 Gangrene Diseases 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010013295 Microbial collagenase Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 208000004210 Pressure Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 208000000558 Varicose Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001139 anti-pruritic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003908 antipruritic agent Substances 0.000 description 1
- 229940064004 antiseptic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000001764 biostimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 108010041649 chymopsin Proteins 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000008278 cosmetic cream Substances 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 description 1
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940001501 fibrinolysin Drugs 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000001126 granulation tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000000622 irritating effect Effects 0.000 description 1
- 108010012151 iruxol Proteins 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 108010013286 lysoamidase Proteins 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000010399 physical interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000003356 suture material Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- -1 terrilithin Proteins 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/716—Glucans
- A61K31/722—Chitin, chitosan
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, а именно к способу получения средства на основе коллагеназы и хитозана, обладающего регенерирующим и ранозаживляющим действием, согласно которому осуществляют иммобилизацию коллагеназы в буферном растворе на матрицу кислоторастворимого среднемолекулярного или высокомолекулярного хитозана в соотношении 20 мл буферного раствора коллагеназы в концентрации 1 мг/мл на 1 г указанной матрицы, при этом в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М глициновый буфер с рН 8,6 для среднемолекулярного хитозана и с рН 10,5 для высокомолекулярного хитозана; далее проводят инкубирование в течение 5 часов при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; затем промывают образовавшийся осадок 50 мМ трис-HCl буфером с рН 7,5 до отсутствия в промывных водах коллагеназы. Изобретение обеспечивает сокращение расхода ранозаживляющего средства за счет его высокой стабильности и пролонгированного действия. 6 ил., 2 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к способу получения иммобилизованных ферментов, и может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности, медицинской и лабораторной практике при изготовлении лекарственных средств, обладающих регенерирующим и ранозаживляющим действием. Препараты можно получить в виде порошков различной дисперсности, пленок, гелей. Они стабильны при хранении, обладают пролонгированным антимикробным и адсорбирующим действием.
Ферментные лекарственные средства, применяемые при лечении гнойных ран, на российском рынке представлены незначительной группой фармацевтических препаратов. Использование многих энзимов в свободном состоянии (в растворе) не дает высокого эффекта, т.к. белок нестабилен в таких условиях и может подвергаться протеолизу. Все большее применение в медицине и промышленности находят иммобилизованные биопрепараты. В широком смысле иммобилизация означает любое ограничение числа степеней свободы молекулы фермента или ее фрагментов. Иммобилизованными называют энзимы, искусственно связанные с нерастворимым носителем посредством физических или химических взаимодействий и сохраняющие частично или полностью каталитические свойства.
Известно, что иммобилизация фермента на нерастворимом носителе позволяет решить несколько важных задач для медицины: 1) получение препаратов пролонгированного действия, благодаря стабилизации и увеличению времени полужизни фермента, 2) решение проблемы диффузии вещества в организме, 3) направленное регулирование оптимумов функционирования препарата (температурный оптимум, оптимум рН). Наиболее эффективными композициями являются гели, мази и повязки, позволяющие при локальном воздействии на рану одновременно влиять на патогенную микрофлору и стимулировать процессы заживления.
На сегодняшний день для воздействия на многообразие микроорганизмов, которые вызывают гнойно-воспалительный процесс, используют средства с антибиотиками и антисептиками. Однако порой бесконтрольное их применение приводит сначала к появлению, а затем к преобладанию в ране резистентной к ним микрофлоры [Патент RU 2542373, МПК А61K 31/14, А61K 31/4164, А61K 47/34, А61K 47/48, А61K 9/06, А61Р 31/04, А61Р 17/02, опубл. 20.02.2015].
Применение протеолитических ферментов в лекарственных средствах способствует очищению пораженных тканей от детрита, экссудата, увеличению контакта между патогенным микробом и антибиотиком или другим противомикробным средством. С этой целью применяются различные протеазы, такие как химопсин, трипсин, фибринолизин, папаин, террилитин, стрептокиназа; нуклеазы - дезоксирибонуклеаза и рибонуклеаза; другие энзимы - гиалуронидаза, лизоамидаза. Однако с их помощью невозможно решить все вопросы, связанные с очищением ран, т.к. эти ферменты не способны воздействовать на коллаген [Вольф М., Рансбергер К. Лечение ферментами. - М.: Мир. - 1976; Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина. - 1988].
Коллагеназа (3.4.24.7) является уникальным ферментом, который способен избирательно гидролизовать коллаген, входящий в состав соединительной ткани живого организма. Расщепляя крайне устойчивые к действию других протеаз коллагеновые волокна, коллагеназа выполняет в организме человека и животных важнейшие функции, участвует в превращениях соединительной ткани при росте и морфогенезе, а также в устранении некоторых патологических процессов. Среди коллагеназ микробного происхождения наиболее изученными и хорошо известными являются коллагеназы, синтезируемые бактерией Clostridium histolyticum, которые характеризуются высокой специфичностью действия на коллагеновые волокна. Они широко используются в биотехнологии и для лабораторных целей. К настоящему времени уже разработан ряд фармацевтических композиций на основе коллагеназы [Патент RU 2166950, МПК А61K 35/74, C12Q 1/37, опубл. 20.05.2001; Патент RU 2129862, МПК А61K 9/06, А61K 47/36; Патент RU 2174389, МПК А61K 9/06, А61K 38/43, А61Р 17/02, опубл. 10.10.2001; Патент RU 2139044, МПК А61K 9/06, А61K 38/48; опубл. 10.10.1999; Патент RU 2127128, МПК A61L 15/32, опубл. 10.03.1999; Патент RU 2149644, МПК А61K 38/48, опубл. 27.05.2000]. Выявлено ее литическое действие на струп ожоговой раны. При гнойных ранах фермент способствует быстрому удалению нежизнеспособных тканей и эксудата, раннему появлению грануляционной ткани, эпителизации. Применение коллагеназы предупреждает развитие грубых рубцов, при этом сохраняется подвижность кожи и мягких тканей [Патент RU 2093166, МПК А61K 35/39, опубл. 20.10.1997].
Описан способ получения пористого ранозаживляющего материала, содержащего раствор коллагеназы, который выполняет функцию очистки раневой поверхности от некротической ткани, не обладает антисептическими свойствами и не освобождает раны от гноя и экссудата [Патент RU 2033805, МПК А61K 38/43, C12N 11/04, опубл. 30.04.1995].
Довольно близким к предлагаемой нами композиции является препарат «Ируксол» (Германия), который содержит коллагеназу в смеси с протеазами, выделенными из бактериальной культуры Clostridium histolyticum. «Ируксол» является комбинированным препаратом с протеолитическим и противомикробным действием для наружного применения, используется для энзиматического очищения ран, в том числе при варикозных язвах, пролежнях, при гангрене конечностей, в особенности у больных сахарным диабетом, а также при отморожениях, при длительно незаживающих послеоперационных ранах, после лучевой терапии, при подготовке к трансплантации кожи. Недостатком «Ируксола» является содержание в его составе антибиотика левомицетина, который может вызывать аллергическую реакцию и в настоящее время слабо действует на адаптировавшуюся к нему патогенную микрофлору. Кроме того, недостатком «Ируксола» является то, что липофильная основа препарата не обладает дегидратирующей способностью, что особенно важно при лечении гнойных ран в первой фазе раневого процесса [Susagawara R., Harper Е. Publication and characterization of three forms of collagenase from Clostridium histolyticum // Biochemistry. - 1984. - V. 23. - P. 5175-5182].
Непосредственное введение нативных ферментов в рану приводит к их быстрой инактивации, что снижает лечебный эффект, поэтому известны многочисленные методы иммобилизации различных энзимов, включая коллагеназу. Использование физической иммобилизации для получения комплекса сополимера и протеазы способствует пролонгированию ее лизирующего действия за счет депо-эффекта путем медленного высвобождения фермента в рану [Патент RU 2014086, МПК A61L 15/12, опубл. 15.06.1994].
Поликатионный полисахарид хитозан, продукт деацетилирования хитина, широко применяется в различных отраслях промышленности, биотехнологии, медицине и косметологии. Обнаружение биостимулирующего и ранозаживляющего действия хитозана способствовало созданию на его основе новых способов получения защитных и противораневых покрытий, шовных материалов, а также препаратов для ухода за кожей [Патент RU 2197971, МПК А61K 31/722, А61K 33/38, А61Р 17/02, A23L 1/054, опубл. 10.02.2003; Патент RU 2193895, МПК A61L 15/28, A61L 15/30, A61L 15/32, опубл. 10.12.2002; Патент RU 2080126, МПК A61L 17/00, опубл. 09.08.1994]. В частности, разработано средство для наружного применения «Полимед», содержащее хитозан, которое обладает антибактериальным, противогрибковым, противозудным, противоожоговым действием [Патент RU 2140264, МПК А61K 31/00, А61K 31/18, А61K 38/02, опубл. 27.10.1999]. Кроме того, хитозан применяют в качестве консерванта для стабилизации фармацевтических и косметических средств [Патент RU 2028138, МПК А61K 7/00, опубл; 09.02.1995; Патент RU 2136265, МПК А61K 7/00, А61K 7/48, А61K 9/06, опубл. 10.09.1999].
Сочетание коллагеназы и хитозана в одном препарате уже применялось при создании косметического крема, однако, в этом случае фермент не был иммобилизован на матрице полисахарида, а использовалась смесь компонентов. Авторами было продемонстрировано стимулирующее влияние их крема на пролиферацию клеток эпидермиса и ускорение его регенерации, на обменные процессы кожи. Такие показатели, как цвет кожи, ее тургор, эластичность, толщина кожной складки не менялись по сравнению с интактными животными, т.е. раздражающее и аллергизирующее действия отсутствовали. Образцы крема обладали выраженным антиоксидантным эффектом [Патент RU 2110987, МПК А61K 7/48, опубл. 20.05.1998].
В качестве прототипа служил СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ КОЛЛАГЕНАЗЫ (RU 2389794, МПК C12N 11/12, C12N 9/48, опубл. 20.05.2010), включающий растворение пищевой карбоксиметилцеллюлозы в подщелоченной дистиллированной воде с рН 9,5-10, добавление к фильтрату полученного раствора коллагеназы, выделенной из панкреаса крабов, или микробной коллагеназы, выделенной из Clostridium histolyticum с коллагеназной активностью не ниже 750-1000 ед./мг в виде порошка в присутствии 1-1,5%-ного раствора поверностно-активного вещества, интенсивное перемешивание со скоростью 3000-5000 об/мин в течение 40 мин, охлаждение образовавшейся эмульсии до 5-10°С, уменьшение рН реакционной смеси до 3-3,5, суточную инкубацию в холодильнике, отделение выпавших частиц из раствора, неоднократное добавление к оставшимся частицам ацетатного буфера с рН 4-4,5 при перемешивании, отделение выпавших частиц, содержащих коллагеназу, и их высушивание.
Основным недостатком этого способа является использование поверхностно активных веществ для активации природного соединения (карбоксиметилцеллюлозы), которые невозможно применять в фармацевтической промышленности.
Технический результат заключается в разработке способа получения гетерогенного препарата на основе коллагеназы и хитозана, который позволит сократить расход ранозаживляющего средства благодаря высокой стабильности препарата и его пролонгированному действию.
Действующим веществом предлагаемого нами средства является коллагеназа, которая обладает противовоспалительным и ранозаживляющим действием. Кроме того, в качестве носителя для иммобилизации коллагеназы (основы повязки) нами был выбран хитозан различной молекулярной массы и степени дисперсности, который как носитель для иммобилизации ферментов способен не только повысить их стабильность по отношению к действию различных денатурирующих факторов (что необходимо для достижения возможности пролонгированного действия лекарственных средств), но и сам обладает ранозаживляющими свойствами, что может повысить клиническую эффективность действия препаратов. Введение хитозана в основу лекарственного или косметического средства придает ему бактерицидные свойства и позволяет снизить в готовых формах препарата концентрацию химических консервантов, обеспечивая тем самым снижение токсичности и увеличение биосовместимости.
Поставленная задача решается синтезированием препаратов иммобилизованной на матрице хитозана коллагеназы в виде порошков [Гамзазаде А.И. Производные хитина/хитозана контролируемой структуры в качестве потенциально новых биоматериалов // Дис д. хим. н. - Москва. 2005. - 363 с.], гелей [Патент RU 2172325, МПК С08В 37/08, А61K 31/722, A23L 1/056, опубл. 20.08.2001; Патент RU 2099352, МПК С08В 37/08, опубл. 20.12.1997], пленок [Патент RU 2458077, МПК C08J 5/18, C08L 5/06, C08L 5/08, C08L 101/16; Патент RU 2461575, МПК С08В 37/08, C08J 5/18, опубл. 20.09.2012], что позволяет получать на ее основе биокатализаторы для самых различных целей, включая пищевую, химико-фармацевтическую, медицинскую и сельскохозяйственную отрасли промышленности.
Технический результат достигается тем, что в способе получения гетерогенного препарата различной дисперсности на основе коллагеназы и хитозана, включающем иммобилизацию ферментного препарата в буферном растворе, инкубирование и промывку, согласно изобретению, иммобилизацию коллагеназы проводят на матрицу кислоторастворимого хитозана среднемолекулярного (200 кДа) или высокомолекулярного (350 кДа) в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 1 мг/мл на 1 г носителя; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М глициновый буфер с рН 8,6 для среднемолекулярного и с рН 10,5 для высокомолекулярного хитозана; инкубация проводится в течение 5 часов при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; образовавшийся осадок промывают 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7.5) до отсутствия в промывных водах белка.
Фиг. 1. Приведены диаграммы содержания белка (в мг на 1 г носителя) в препаратах коллагеназы, адсорбционно иммобилизованной на матрице среднемолекулярного (А) и высокомолекулярного (Б) хитозанов. Фиг. 2. Приведены диаграммы общей активности (в ед на 1 мл раствора) препаратов коллагеназы, адсорбционно иммобилизованной на матрице среднемолекулярного (А) и высокомолекулярного (Б) хитозанов. Фиг. 3. Приведены диаграммы удельной активности (в ед на 1 мг белка в пробе) препаратов коллагеназы, адсорбционно иммобилизованной на матрице среднемолекулярного (А) и высокомолекулярного (Б) хитозанов. Фиг. 4. Приведена диаграмма содержания белка (в мг на 1 г носителя) в препаратах коллагеназы, иммобилизованной различными способами: сополимеризация фермента (с применением 2% и 10% глутарового альдегида), ковалентная (на средне- и высокомолекулярном хитозанах с применением 25% глутарового альдегида) и сорбционная иммобилизация. Фиг. 5. Приведена диаграмма общей активности (в ед. на 1 мл раствора) препаратов коллагеназы, иммобилизованной различными способами: сополимеризация фермента (с применением 2% и 10% глутарового альдегида), ковалентная (на средне- и высокомолекулярном хитозанах с применением 25% глутарового альдегида) и сорбционная иммобилизация. Фиг. 6. Приведена диаграмма удельной активности (в ед. на 1 мг белка в пробе) препаратов коллагеназы, иммобилизованной различными способами: сополимеризация фермента (с применением 2% и 10% глутарового альдегида), ковалентная (на средне- и высокомолекулярном хитозанах с применением 25% глутарового альдегида) и сорбционная иммобилизация.
В качестве объекта исследования была выбрана коллагеназа из Clostridium histolyticum фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich». В качестве носителей для иммобилизации тестировали четыре вида хитозана (ЗАО «Биопрогресс»): хитозан пищевой кислоторастворимый среднемолекулярный (Mr=200 кДа), хитозан кислоторастворимый высокомолекулярный (Mr=350 кДа), хитозан пищевой и сукцинат хитозана водорастворимый.
Для иммобилизации коллагеназы на матрице хитозана использовали различные методики.
Вариант 1. Сорбционная иммобилизация. К 50 мг хитозана добавляли 1 мл буферного раствора фермента в концентрации 1 мг/мл (применяли различные буферные системы, изменяя их рН и ионную силу), инкубировали с периодическим перемешиванием в течение 4 часов для среднемолекулярного хитозана и 5 часов для высокомолекулярного хитозана.
Вариант 2. Ковалентная иммобилизация. К 900 мг хитозана добавляли 18 мл раствора фермента в глициновом буфере с рН 10,0 в концентрации 1 мг/мл и 10 мл 25% глутарового альдегида, инкубировали с периодическим перемешиванием в течение 1 часа.
Вариант 3. Сополимеризация фермента. 5 мг фермента растворяли в 5 мл глицинового буфера с рН 10,0, затем добавляли 5 мл глутарового альдегида различной концентрации и оставляли в чашке Петри до образования пленки.
Во всех трех вариантах после окончания инкубации образовавшийся осадок (или пленку) промывали 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка (контроль осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 при λ=280 нм).
Содержание белка в иммобилизованных препаратах коллагеназы определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V. 193. - P. 265-275]. Метод определения протеолитической активности фермента проводили на субстрате азоказеине (Fluka). К 50 мг образца добавляли 200 мкл трис-HCl, рН 7,5, 800 мкл азоказеина (0,5% в 50 мМ трис-HCl буфере, рН 7,5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее добавляли 800 мкл ТХУ (5%), инкубировали 10 минут при -4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 13000 об/мин для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 3% NaOH для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 1 см кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 50 мг образца и 200 мкл буфера. За единицу каталитической активности принимали количество фермента, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ субстрата за 1 мин. Удельную протеолитическую активность коллагеназы рассчитывали по формуле:
ПА=D*1000/120/200/Ср,
где ПА - протеолитическая активность, мкМ/мин на 1 мг белка, D - оптическая плотность при 410 нм, Ср - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури, 120 - время инкубации в минутах, 200 - объем пробы, 1000 - пересчет в мкМ.
Статистическую обработку полученных результатов проводили при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
На первом этапе экспериментов для получения гетерогенных биокатализаторов на основе коллагеназы, иммобилизованной методом адсорбции на матрице хитозанов различной молекулярной массы, в качестве иммобилизационной среды мы использовали различные буферные растворы с рН 8,6-10,5. Результаты для наиболее подходящих буферных систем отражены на фиг. 1-3.
В ходе выполнения эксперимента по определению содержания белка (в мг на 1 г носителя) было выявлено, что сорбция коллагеназы на матрице средне- и высокомолекулярного хитозанов максимальна при использовании глицинового буфера с рН 10,0 и трис-глицинового буфера с рН 8,6 соответственно (фиг. 1). Для пищевого хитозана и сукцината хитозана подобрать удовлетворительные условия сорбции на удалось (степень сорбции в наших экспериментах не превышала 20%).
Высокую общую активность (в ед на мл раствора) показали препараты коллагеназы, иммобилизованные на матрице среднемолекулярного хитозана, приготовленные в среде глицинового буфера с рН 10,0 и трис-глицинового буфера с рН 8,6. При сорбции на высокомолекулярном хитозане оптимальными оказались глициновый буфер с рН 9,5 и трис-глициновый буфер с рН 9,0 (фиг. 2).
Максимальная удельная активность (в ед на мг белка) гетерогенного биокатализатора на основе коллагеназы, сорбированной на матрице среднемолекулярного хитозана, наблюдалась при использовании глицинового буфера с рН 8,6. Для высокомолекулярного хитозана оптимальным оказался глициновый буфер с рН 10,5 (фиг. 3).
Адсорбционная иммобилизация часто является обратимой из-за участия в этом процессе только водородных связей и слабых физических взаимодействий (электростатических, гидрофобных, ван-дер-ваальсовых), поэтому мы использовали также другие методы получения гетерогенных препаратов коллагеназы (ковалентную иммобилизацию с применением глутарового альдегида в качестве сшивающего агента и сополимеризацию фермента (без носителя) в присутствии глутарового альдегида в различных концентрациях) и сравнили полученные результаты с экспериментом по сорбции энзима на средне- и высокомолекулярном хитозанах (фиг. 4-6). Согласно полученным данным, метод адсорбции позволяет сохранить удельную каталитическую активность коллагеназы в большей степени, чем ковалентная иммобилизация и сополимеризация фермента в присутствии глутарового альдегида. Наиболее высокие значения общей и удельной каталитической активности были характерны для образцов, иммобилизованных путем адсорбции на высоко- (350 кДа) и среднемолекулярном (200 кДа) хитозанах при использовании в качестве иммобилизационной среды 0,05 М глицинового буфера с рН 10,5 и 8,6 соответственно. В связи с этим при использовании препаратов в медицине или аналитической практике необходим компромисс между высокой активностью и стабильностью катализатора.
Из вышеизложенного материала следует, что среди апробированных нами вариантов иммобилизации (сорбционная, ковалентная иммобилизация и сополимеризация фермента) для создания гетерогенных препаратов на основе коллагеназы и хитозана наиболее перспективным является адсорбция фермента на высокомолекулярном и среднемолекулярном хитозанах:
Пример 1. К 50 мг высокомолекулярного (350 к Да) хитозана добавляли 1 мл раствора фермента (в концентрации 1 мг/мл) в 0,05 М глициновом буфере с рН 10,5, инкубировали с периодическим перемешиванием в течение 5 часов с суспензией высокомолекулярного хитозана (350 к Да). После окончания инкубации образовавшийся осадок промывали 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка (контроль этого факта осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 при λ=280 нм).
Пример 2. К 50 мг среднемолекулярного (200 кДа) хитозана добавляли 1 мл раствора фермента (в концентрации 1 мг/мл) в 0,05 М глициновом буфере с рН 8,6, инкубировали с периодическим перемешиванием в течение 5 часов с суспензией среднемолекулярного хитозана (350 кДа). После окончания инкубации образовавшийся осадок промывали 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка (контроль этого факта осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 при λ=280 нм).
Claims (1)
- Способ получения средства, обладающего регенерирующим и ранозаживляющим действием, на основе коллагеназы и хитозана, включающий иммобилизацию коллагеназы в буферном растворе на матрицу кислоторастворимого среднемолекулярного или высокомолекулярного хитозана в соотношении 20 мл буферного раствора коллагеназы в концентрации 1 мг/мл на 1 г указанной матрицы, при этом в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М глициновый буфер с рН 8,6 для среднемолекулярного хитозана и с рН 10,5 для высокомолекулярного хитозана; инкубирование в течение 5 часов при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; промывание образовавшегося осадка 50 мМ трис-HCl буфером с рН 7,5 до отсутствия в промывных водах коллагеназы.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017123460A RU2678435C2 (ru) | 2017-07-03 | 2017-07-03 | Способ получения гетерогенного препарата на основе коллагеназы и хитозана |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017123460A RU2678435C2 (ru) | 2017-07-03 | 2017-07-03 | Способ получения гетерогенного препарата на основе коллагеназы и хитозана |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2017123460A3 RU2017123460A3 (ru) | 2019-01-10 |
| RU2017123460A RU2017123460A (ru) | 2019-01-10 |
| RU2678435C2 true RU2678435C2 (ru) | 2019-01-29 |
Family
ID=64977313
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2017123460A RU2678435C2 (ru) | 2017-07-03 | 2017-07-03 | Способ получения гетерогенного препарата на основе коллагеназы и хитозана |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2678435C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2788454C1 (ru) * | 2022-08-01 | 2023-01-19 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Способ получения гибридного препарата бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2204600C2 (ru) * | 2001-04-16 | 2003-05-20 | Воронежский государственный университет | Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы |
| RU2389794C2 (ru) * | 2008-07-02 | 2010-05-20 | Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет леса" | Способ получения иммобилизованной коллагеназы |
-
2017
- 2017-07-03 RU RU2017123460A patent/RU2678435C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2204600C2 (ru) * | 2001-04-16 | 2003-05-20 | Воронежский государственный университет | Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы |
| RU2389794C2 (ru) * | 2008-07-02 | 2010-05-20 | Федеральное агентство по образованию Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет леса" | Способ получения иммобилизованной коллагеназы |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| SLOVAKOVA Marcela et al. Testing of collagenase covalently linked to chitosan nanofibers for biomedical applications / Conference: Nanocon 2015, At Brno Czech Republic. * |
| Белов А.А. и др. Текстильные материалы, содержащие хитозан и протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба, для медицинских целей / Биомедицинская химия, Т.55, N.1, с.61-67. * |
| Королева В.А. и др. Исследование сорбционной емкости кислоторастворимых хитозанов по отношению к бычьему сывороточному альбумину / Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация, 2015, N.4, с.85-89. * |
| Королева В.А. и др. Исследование сорбционной емкости кислоторастворимых хитозанов по отношению к бычьему сывороточному альбумину / Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация, 2015, N.4, с.85-89. Белов А.А. и др. Текстильные материалы, содержащие хитозан и протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба, для медицинских целей / Биомедицинская химия, Т.55, N.1, с.61-67. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2788454C1 (ru) * | 2022-08-01 | 2023-01-19 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Воронежский государственный университет" (ФГБОУ ВО "ВГУ") | Способ получения гибридного препарата бромелайна и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2017123460A3 (ru) | 2019-01-10 |
| RU2017123460A (ru) | 2019-01-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Baidamshina et al. | Anti-biofilm and wound-healing activity of chitosan-immobilized Ficin | |
| Zhang et al. | Functional biomaterials for treatment of chronic wound | |
| Pérez-Rafael et al. | Nanoparticle-driven self-assembling injectable hydrogels provide a multi-factorial approach for chronic wound treatment | |
| Saravanakumar et al. | Fungal enzyme-mediated synthesis of chitosan nanoparticles and its biocompatibility, antioxidant and bactericidal properties | |
| Martínez et al. | Immobilized keratinase and enrofloxacin loaded on pectin PVA cryogel patches for antimicrobial treatment | |
| Dosadina et al. | The effect of immobilization, drying and storage on the activity of proteinases immobilized on modified cellulose and chitosan | |
| US20070148215A1 (en) | Therapeutically active dressings, their manufacture and use | |
| Leonida et al. | Nanocomposite materials with antimicrobial activity based on chitosan | |
| Gordienko et al. | The alginate–chitosan composite sponges with biogenic Ag nanoparticles produced by combining of cryostructuration, ionotropic gelation and ion replacement methods | |
| Painter | Concerning the wound-healing properties of Sphagnum holocellulose: the Maillard reaction in pharmacology | |
| RU2677858C2 (ru) | Способ получения гетерогенного ферментного препарата на основе фицина, обладающего ранозаживляющими и регенерирующими свойствами | |
| RU2678435C2 (ru) | Способ получения гетерогенного препарата на основе коллагеназы и хитозана | |
| Brkich et al. | Miramistin as an antimicrobial component in the innovative substance of Chitosan-Miramistin Complex (CMC) for the treatment of infected wounds of various genesis | |
| Liu et al. | Chitosan-based GOx@ Co-MOF composite hydrogel: A promising strategy for enhanced antibacterial and wound healing effects | |
| Su et al. | Development of fungal mycelia as a skin substitute: characterization of keratinocyte proliferation and matrix metalloproteinase expression during improvement in the wound‐healing process | |
| Valrntinovna et al. | Collagenases in medical practice: modern collagenase-based preparations and pros pects for their improvement | |
| RU2712690C1 (ru) | Способ получения препарата папаина в геле на основе пищевого хитозана и сукцината хитозана | |
| RU2372922C1 (ru) | Способ лечения глубокого ожога кожи | |
| RU2769243C1 (ru) | Способ получения гетерогенного ферментного препарата на основе фицина и низкомолекулярного хитозана | |
| RU2822736C1 (ru) | Способ получения гибридного препарата папаина и аскорбата хитозана в виде густого раствора | |
| Brkich | Development of a scientific methodological approach to expansion of product range for treatment of infected wounds | |
| RU2795425C1 (ru) | Способ получения гибридного препарата папаина и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора | |
| Holyavka et al. | Novel biocatalysts based on bromelain immobilized on functionalized chitosans and research on their structural features. Polymers. 2022; 14 (23): 5110 | |
| RU2712528C1 (ru) | Способ получения препарата коллагеназы в геле на основе пищевого хитозана и сукцината хитозана | |
| RU2771183C1 (ru) | Способ получения препарата фицина в геле на основе карбоксиметилцеллюлозы |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20200704 |