JP3816554B2

JP3816554B2 - 新規分岐シクロデキストリンおよびその製造方法

Info

Publication number: JP3816554B2
Application number: JP15410295A
Authority: JP
Inventors: 健一濱保; 哲也伊藤; 孝輝藤田; 耕三原; 京子小泉; 敏子谷本; 博文中野; 寿美雄北畑
Original assignee: Ensuiko Sugar Refining Co Ltd
Current assignee: Ensuiko Sugar Refining Co Ltd
Priority date: 1995-05-30
Filing date: 1995-05-30
Publication date: 2006-08-30
Anticipated expiration: 2021-08-30
Also published as: JPH08325304A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、新規分岐シクロデキストリンおよびその製造方法に関し、詳しくは分岐シクロデキストリンの分岐側鎖にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基もしくはグルコサミニル基を結合させた新規分岐シクロデキストリンおよび酵素の糖転移作用を利用した該新規分岐シクロデキストリンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
シクロデキストリン（以下、ＣＤと略記する。）は、グルコースがα−１，４結合で連なった環状デキストリンで、グルコース６，７，８個より成るそれぞれα−，β−およびγ−ＣＤが良く知られている。最近ではＣＤの溶解度を改善するため、これらＣＤにα−１，６結合でグルコシル基やマルトシル基等を結合させた分岐ＣＤが合成されている。
これらＣＤおよび分岐ＣＤには分子内部に空洞があり、しかもこの空洞内部が疎水性になっているため、包接作用があり、各種油性物質を取り込む性質を有している。
【０００３】
ＣＤおよび分岐ＣＤは、このような性質をもっているため、食品工業，化粧品工業，医薬品工業などの分野で広く使用されている。特に、医薬品工業の分野では、難水溶性薬剤を分岐ＣＤに包接させることにより溶解度を上昇させ、結果として薬剤のバイオアベイラビリティーが増加することが注目されている。
また、薬剤の副作用を少なくするため、糖質の細胞認識性に着目して、これをドラッグ・デリバリー・システムの薬剤運搬体の標識細胞へのセンサーとして利用する研究が活発に行われている。特に、ガラクトースは肝臓組織に、マンノースは肝臓実質細胞，肝臓非実質細胞，マクロファージに強い親和性を示すことが良く知られている。
【０００４】
既に、われわれは酵素の糖転移反応または縮合反応を利用してＣＤの水酸基にガラクトシル基またはマンノシル基が結合しているガラクトシル−ＣＤ，マンノシル−ＣＤの開発に成功している。また、分岐ＣＤの側鎖の水酸基にガラクトシル基またはマンノシル基が結合しているガラクトシル−分岐ＣＤ，マンノシル−分岐ＣＤの開発に成功している。
一方、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびその脱アセチル化物であるグルコサミンは、カニ，エビの主要な外殻成分であるキチンの構成糖であるが、細胞認識に重要な役割を示す糖鎖の基本的な構成糖でもある。
【０００５】
本発明者らはＣＤの有する包接作用とＮ−アセチルグルコサミンおよびグルコサミンの上記の特質を利用して、ドラッグ・デリバリー・システムに応用すること、難溶性薬剤の可溶化に応用することを目的としてＮ−アセチルグルコサミニル基をＣＤに結合させたＮ−アセチルグルコサミニル−ＣＤの合成を試みた。
そこで、本発明者らは鋭意努力を重ねた結果、リゾチームをはじめとしたＮ−アセチルグルコサミニル基転移酵素が、Ｎ−アセチルグルコサミニル基を含む配糖体および／またはオリゴ糖から分岐ＣＤの分岐側鎖の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基を転移結合させたＮ−アセチルグルコサミニル−分岐ＣＤを効率よく合成することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成したのである。
【０００６】
すなわち、本発明はα−，β−またはγ−シクロデキストリンの側鎖にグルコシル基，マルトシル基，ガラクトシル基およびマンノシル基のうちから選ばれた置換基が結合してなる分岐シクロデキストリンの分岐側鎖の水酸基に、β結合でＮ−アセチルグルコサミニル基もしくはグルコサミニル基が結合している新規分岐シクロデキストリン並びに分岐シクロデキストリンと、Ｎ−アセチルグルコサミニル基を含む配糖体および／またはオリゴ糖とを含有する溶液に、Ｎ−アセチルグルコサミニル基転移酵素を作用させ、必要に応じて脱アセチル化することを特徴とする上記の新規分岐シクロデキストリンの製造方法を提供するものである。
【０００７】
本発明に係る新規分岐ＣＤとしては、例えばＮ−アセチルグルコサミニル−グルコシル−α−ＣＤ，Ｎ−アセチルグルコサミニル−グルコシル−β−ＣＤ，Ｎ−アセチルグルコサミニル−グルコシル−γ−ＣＤ，グルコサミニル−グルコシル−α−ＣＤ，グルコサミニル−グルコシル−β−ＣＤ，グルコサミニル−グルコシル−γ−ＣＤ，Ｎ−アセチルグルコサミニル−マルトシル−α−ＣＤ，Ｎ−アセチルグルコサミニル−マルトシル−β−ＣＤ，Ｎ−アセチルグルコサミニル−マルトシル−γ−ＣＤ，グルコサミニル−マルトシル−α−ＣＤ，グルコサミニル−マルトシル−β−ＣＤ，グルコサミニル−マルトシル−γ−ＣＤなどを挙げることができる。
これらのうちの代表的な化合物の構造式を以下に示す。なお、式中のｎは５〜７を示す。
【０００８】
【化１】

【０００９】
【化２】

【００１０】
【化３】

【００１１】
【化４】

【００１２】
本発明の新規Ｎ−アセチルグルコサミニル−分岐ＣＤは、分岐ＣＤと、Ｎ−アセチルグルコサミニル基を含む配糖体および／またはオリゴ糖とを含有する溶液に、Ｎ−アセチルグルコサミニル基転移酵素を作用させることによって得られる。また、新規グルコサミニル−分岐ＣＤは、上記の物質に既知の方法であるアルカリ溶液を作用させる脱アセチル化反応によって得ることができる。
【００１３】
本発明において、分岐ＣＤとしてはα−ＣＤ，β−ＣＤまたはγ−ＣＤの側鎖にグルコシル基，マルトシル基，ガラクトシル基およびマンノシル基のうちから選ばれた置換基が結合したものなどがあり、重合度や結合様式は限定されるものではない。またこれらの混合物であってもよい。
【００１４】
次に、本発明に用いるＮ−アセチルグルコサミニル基を含む配糖体および／またはオリゴ糖（以下、糖供与体と略記する。）としては、例えばＮ−アセチルキトビオース，Ｎ−アセチルキトトリオース，Ｎ−アセチルキトテトラオースなどのＮ−アセチルキトオリゴ糖，フェニル−β−Ｎ−アセチルグルコサミン，パラニトロフェニル−β−Ｎ−アセチルグルコサミンなどのＮ−アセチルグルコサミニル基を含む配糖体などがある。その他、キチンやその部分分解物およびそれらの混合物なども用いることができる。
【００１５】
本発明に用いる酵素としては、リゾチーム，Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをはじめとして糖供与体と分岐ＣＤを含有する溶液に作用させたとき、糖供与体を分解し、そのＮ−アセチルグルコサミニル基を分岐ＣＤにβ結合で転移させ、Ｎ−アセチルグルコサミニル−分岐ＣＤを合成するものであれば、いずれも使用可能である。
本発明に用いる酵素は、自然界に広く分布しているものが用いられる。例えば、卵白に含まれる動物由来のリゾチームなどがある。また、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼとしては牛腎臓に含まれる動物由来のもの、タチナタマメに含まれる植物由来のもの、アスペルギルス・ニガー等の生産する微生物由来のものなどがある。
【００１６】
次に、本発明の新規分岐ＣＤの製造方法について説明する。反応系において、ＣＤと糖供与体を含む溶液（水溶液または懸濁液）は、ＣＤの濃度が約１〜８０％（ｗ／ｗ）、好ましくは２０〜６０％（ｗ／ｗ）、糖供与体の濃度が約１〜７０％（ｗ／ｗ）、好ましくは２０〜５０％（ｗ／ｗ）であることが望ましい。また、ＣＤに対する糖供与体の比率（重量）は、使用する糖供与体の種類によって異なるが、０．１〜５０倍の範囲、好ましくは０．３〜３倍の範囲とするのが適当である。
【００１７】
反応液のｐＨは３〜１０、好ましくは４〜８であり、温度は２０〜７０℃、好ましくは４０〜６０℃に調整して反応させることが適当である。使用酵素量は反応時間と密接な関係があるので、通常は反応が５〜２００時間、好ましくは１０〜５０時間で終了するような酵素量とすればよいが、これらに限定されるものではない。
本発明において、脱アセチル化反応は常法により行えばよく、例えば、上記方法にて調製したＮ−アセチルグルコサミニル−分岐ＣＤをアルカリ溶液で処理すればよい。処理条件は既知の方法に従えばよい。例えば、脱アセチル化の反応系は、Ｎ−アセチルグルコサミニル−分岐ＣＤの濃度は０．１〜５０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲とするのが適当である。
【００１８】
脱アセチル化反応の際に用いるアルカリ溶液は、好ましくは水酸化ナトリウム溶液であるが、脱アセチル化反応が進行するものであればこれに限定されるものではない。また、反応温度，濃度，アルカリ溶液の種類等は、相互に密接に影響を受けるので、通常は水酸化ナトリウム溶液の濃度０．１〜５０％、温度室温〜１００℃、反応時間０．１〜１２０時間の範囲が適当であるが、これらに限定されるものではない。
脱アセチル化反応終了後は、酸を滴下する等によって中和、脱塩した後、必要に応じて、精製して目的物とすればよい。
【００１９】
以上のような方法で反応させて得られた液を、カラムクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーにかけて、生成物を分画・分取した後、ＦＡＢ−ＭＳによる分子量測定、および核磁気共鳴法（ＮＭＲ）により構造解析を行った結果、前記した構造式Ｉ〜IVに代表される分岐ＣＤであることを確認した。
【００２０】
【実施例】
次に、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１
（１）転移反応
Ｎ−アセチルキトオリゴ糖（重合度２から６の混合物）１ｇ，マルトシル−β−ＣＤ２ｇを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）４．５ｍｌに溶解させた後、卵白由来リゾチーム（生化学工業社製）を３００ｍｇ加え、６０℃にて９日間反応させた。反応液の一部を逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果を図１に示す。
反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけて転移生成物Ａを１４０ｍｇ分取した。
【００２１】
（２）構造解析
上記（１）で単離された転移生成物Ａは、図２に示すように、ＦＡＢ−ＭＳ分析により、分子量は１６６１であることがわかった。また、¹³Ｃ−ＮＭＲ解析により、図３に示すように、マルトシル−β−ＣＤのマルトシル基の３位の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が結合した化合物（前記の構造式Ｉ；ｎ＝６）であることが確認された。
【００２２】
実施例２
（１）転移反応
Ｎ−アセチルキトオリゴ糖（重合度２から６の混合物）１ｇ，マルトシル−α−ＣＤ２ｇを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）４．５ｍｌに溶解させた後、卵白由来リゾチーム（生化学工業社製）を３００ｍｇ加え、６０℃にて９日間反応させた。反応液の一部を逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果を図４に示す。
反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけて転移生成物Ｂを１４０ｍｇ分取した。
【００２３】
（２）構造解析
上記（１）で単離された転移生成物Ｂは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により、分子量は１４９９であることがわかった。以上のことより、実施例１の結果も踏まえて、この転移生成物Ｂはマルトシル−α−ＣＤのグルコシル基の３位の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が１分子結合した化合物（前記の構造式Ｉ；ｎ＝５）であることが確認された。
【００２４】
実施例３
（１）転移反応
Ｎ−アセチルキトオリゴ糖（重合度２から６の混合物）１ｇ，マルトシル−γ−ＣＤ２ｇを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）４．５ｍｌに溶解させた後、卵白由来リゾチーム（生化学工業社製）を３００ｍｇ加え、６０℃にて９日間反応させた。反応液の一部を逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果を図５に示す。
反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけて転移生成物Ｃを１５０ｍｇ分取した。
【００２５】
（２）構造解析
上記（１）で単離された転移生成物Ｃは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により、分子量は１８２３であることがわかった。以上のことより、実施例１の結果も踏まえて、この転移生成物はマルトシル−γ−ＣＤのグルコシル基の３位の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が１分子結合した化合物（前記の構造式Ｉ；ｎ＝７）であることが確認された。
【００２６】
実施例４
（１）転移反応
Ｎ−アセチルキトオリゴ糖（重合度２から６の混合物）１ｇ，グルコシル−β−ＣＤ２ｇを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）４．５ｍｌに溶解させた後、卵白由来リゾチーム（生化学工業社製）を３００ｍｇ加え、６０℃にて９日間反応させた。反応液の一部を逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果を図６に示す。
反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけて転移生成物Ｄを５０ｍｇ分取した。
【００２７】
（２）構造解析
上記（１）で単離された転移生成物Ｄは、ＦＡＢ−ＭＳ分析により、分子量は１４９９であることがわかった。以上のことより、実施例１の結果も踏まえて、この転移生成物はグルコシル−βＣＤのグルコシル基の３位の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が１分子結合した化合物（前記の構造式III;ｎ＝６）であることが確認された。
【００２８】
実施例５
（１）脱アセチル化反応
実施例１で得られたＮ−アセチルグルコサミニル−マルトシル−β−ＣＤ（前記の構造式Ｉ；ｎ＝６）１０ｍｇを濃度１％、２０％水酸化ナトリウム溶液を調製し、８０℃で３時間反応した。反応終了後、濃塩酸を滴下してｐＨを中性まで下げた。反応液はＯＤＳカラムを用いて塩を除き、脱アセチル化物を８ｍｇ分取した。
【００２９】
（２）構造解析
上記（１）で調製された脱アセチル化物は、ＦＡＢ−ＭＳ分析により、分子量は１６１９であることがわかった。以上のことより、脱アセチル化物はマルトシル−β−ＣＤのマルトシル基の３位の水酸基にβ結合でグルコサミニル基が結合した化合物（前記の構造式II；ｎ＝６）であることが確認された。
【００３０】
実施例６
Ｎ−アセチルグルコサミニル基を含む配糖体およびオリゴ糖（重合度１から６の混合物）５０ｍｇ，マルトシル−β−ＣＤ１００ｍｇを１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）２００μｌに溶解させた後、タチナタマメ由来のＮ−アセチルヘキソサミニダーゼ（生化学工業社製）を５Ｕ加え、４０℃にて２日間反応させた。
反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけて転移生成物を１ｍｇ分取した。この転移物は酸分解でＮ−アセチルグルコサミンとグルコースに分解されることから、また、酵素分解の結果から、マルトシル−β−ＣＤのマルトシル基の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が結合した化合物であることが推定された。
【００３１】
【発明の効果】
本発明によれば、酵素の糖転移作用を利用して、分岐ＣＤ分子中の分岐側鎖の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が結合している新規分岐ＣＤを効率よく得ることができる。また、これらをアルカリ溶液で処理することによって脱アセチル化を行い、分岐ＣＤ分子中の分岐側鎖の水酸基にβ結合でグルコサミニル基が結合している新規分岐ＣＤを効率よく得ることができる。
本発明の新規分岐ＣＤは、医薬品分野の他、食品分野，化粧品分野等における幅広い利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の反応液の高速液体クロマトグラフである。
【図２】実施例１の反応生成物ＡのＦＡＢ−ＭＳスペクトルである。
【図３】実施例１の反応生成物Ａの¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４】実施例２の反応液の高速液体クロマトグラフである。
【図５】実施例３の反応液の高速液体クロマトグラフである。
【図６】実施例４の反応液の高速液体クロマトグラフである。

Claims

α−，β−またはγ−シクロデキストリンの側鎖にグルコシル基，マルトシル基，ガラクトシル基およびマンノシル基のうちから選ばれた置換基が結合してなる分岐シクロデキストリンの分岐側鎖の水酸基に、β結合でＮ−アセチルグルコサミニル基もしくはグルコサミニル基が結合している新規分岐シクロデキストリン。
分岐シクロデキストリンと、Ｎ−アセチルグルコサミニル基を含む配糖体および／またはオリゴ糖とを含有する溶液に、Ｎ−アセチルグルコサミニル基転移酵素を作用させ、必要に応じて脱アセチル化することを特徴とする請求項１記載の新規分岐シクロデキストリンの製造方法。
Ｎ−アセチルグルコサミニル基を含む配糖体および／またはオリゴ糖が、Ｎ−アセチルキトビオース，Ｎ−アセチルキトトリオース，Ｎ−アセチルキトテトラオース，フェニル−β−Ｎ−アセチルグルコサミンおよびパラニトロフェニル−β−Ｎ−アセチルグルコサミンのうちから選ばれたものである請求項２記載の新規分岐シクロデキストリンの製造方法。