JPH08325304A - 新規分岐シクロデキストリンおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 分岐シクロデキストリンの分岐側鎖の水酸基
にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基もしくはグル
コサミニル基が結合している新規分岐シクロデキストリ
ン並びに分岐シクロデキストリンとＮ−アセチルキトオ
リゴ糖を含有する溶液に、Ｎ−アセチルグルコサミニル
基転移酵素を作用させ、必要に応じて脱アセチル化する
ことを特徴とする請求項１記載の新規分岐シクロデキス
トリンの製造方法。 【効果】 本発明によれば、分岐ＣＤ分子中の分岐側鎖
の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が結
合している新規分岐ＣＤを効率よく得ることができ、こ
れらをアルカリ溶液で処理することによって脱アセチル
化を行い、分岐ＣＤ分子中の分岐側鎖の水酸基にβ結合
でグルコサミニル基が結合している新規分岐ＣＤを得る
ことができる。本発明の新規分岐ＣＤは、医薬品分野の
他、食品分野，化粧品分野等における幅広い利用が期待
される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規分岐シクロデキス
トリンおよびその製造方法に関し、詳しくは分岐シクロ
デキストリンの分岐側鎖にβ結合でＮ−アセチルグルコ
サミニル基もしくはグルコサミニル基を結合させた新規
分岐シクロデキストリンおよび酵素の糖転移作用を利用
した該新規分岐シクロデキストリンの製造方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】シク
ロデキストリン（以下、ＣＤと略記する。）は、グルコ
ースがα−１，４結合で連なった環状デキストリンで、
グルコース６，７，８個より成るそれぞれα−，β−お
よびγ−ＣＤが良く知られている。最近ではＣＤの溶解
度を改善するため、これらＣＤにα−１，６結合でグル
コシル基やマルトシル基等を結合させた分岐ＣＤが合成
されている。これらＣＤおよび分岐ＣＤには分子内部に
空洞があり、しかもこの空洞内部が疎水性になっている
ため、包接作用があり、各種油性物質を取り込む性質を
有している。

【０００３】ＣＤおよび分岐ＣＤは、このような性質を
もっているため、食品工業，化粧品工業，医薬品工業な
どの分野で広く使用されている。特に、医薬品工業の分
野では、難水溶性薬剤を分岐ＣＤに包接させることによ
り溶解度を上昇させ、結果として薬剤のバイオアベイラ
ビリティーが増加することが注目されている。また、薬
剤の副作用を少なくするため、糖質の細胞認識性に着目
して、これをドラッグ・デリバリー・システムの薬剤運
搬体の標識細胞へのセンサーとして利用する研究が活発
に行われている。特に、ガラクトースは肝臓組織に、マ
ンノースは肝臓実質細胞，肝臓非実質細胞，マクロファ
ージに強い親和性を示すことが良く知られている。

【０００４】既に、われわれは酵素の糖転移反応または
縮合反応を利用してＣＤの水酸基にガラクトシル基また
はマンノシル基が結合しているガラクトシル−ＣＤ，マ
ンノシル−ＣＤの開発に成功している。また、分岐ＣＤ
の側鎖の水酸基にガラクトシル基またはマンノシル基が
結合しているガラクトシル−分岐ＣＤ，マンノシル−分
岐ＣＤの開発に成功している。一方、Ｎ−アセチルグル
コサミンおよびその脱アセチル化物であるグルコサミン
は、カニ，エビの主要な外殻成分であるキチンの構成糖
であるが、細胞認識に重要な役割を示す糖鎖の基本的な
構成糖でもある。

【０００５】本発明者らはＣＤの有する包接作用とＮ−
アセチルグルコサミンおよびグルコサミンの上記の特質
を利用して、ドラッグ・デリバリー・システムに応用す
ること、難溶性薬剤の可溶化に応用することを目的とし
てＮ−アセチルグルコサミニル基をＣＤに結合させたＮ
−アセチルグルコサミニル−ＣＤの合成を試みた。そこ
で、本発明者らは鋭意努力を重ねた結果、リゾチームを
はじめとしたＮ−アセチルグルコサミニル基転移酵素
が、Ｎ−アセチルキトオリゴ糖化合物から分岐ＣＤの分
岐側鎖の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル
基を転移結合させたＮ−アセチルグルコサミニル−分岐
ＣＤを効率よく合成することを見出し、この知見に基づ
いて本発明を完成したのである。

【０００６】すなわち、本発明は分岐シクロデキストリ
ンの分岐側鎖の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサ
ミニル基もしくはグルコサミニル基が結合している新規
分岐シクロデキストリン並びに分岐シクロデキストリン
とＮ−アセチルキトオリゴ糖を含有する溶液に、Ｎ−ア
セチルグルコサミニル基転移酵素を作用させ、必要に応
じて脱アセチル化することを特徴とする上記の新規分岐
シクロデキストリンの製造方法を提供するものである。

【０００７】本発明に係る新規分岐ＣＤとしては、例え
ばＮ−アセチルグルコサミニル−グルコシル−α−Ｃ
Ｄ，Ｎ−アセチルグルコサミニル−グルコシル−β−Ｃ
Ｄ，Ｎ−アセチルグルコサミニル−グルコシル−γ−Ｃ
Ｄ，グルコサミニル−グルコシル−α−ＣＤ，グルコサ
ミニル−グルコシル−β−ＣＤ，グルコサミニル−グル
コシル−γ−ＣＤ，Ｎ−アセチルグルコサミニル−マル
トシル−α−ＣＤ，Ｎ−アセチルグルコサミニル−マル
トシル−β−ＣＤ，Ｎ−アセチルグルコサミニル−マル
トシル−γ−ＣＤ，グルコサミニル−マルトシル−α−
ＣＤ，グルコサミニル−マルトシル−β−ＣＤ，グルコ
サミニル−マルトシル−γ−ＣＤなどを挙げることがで
きる。これらのうちの代表的な化合物の構造式を以下に
示す。なお、式中のｎは５〜７を示す。

【０００８】

【化１】

【０００９】

【化２】

【００１０】

【化３】

【００１１】

【化４】

【００１２】本発明の新規Ｎ−アセチルグルコサミニル
−分岐ＣＤは、分岐ＣＤとＮ−アセチルキトオリゴ糖を
含有する溶液に、Ｎ−アセチルグルコサミニル基転移酵
素を作用させることによって得られる。また、新規グル
コサミニル−分岐ＣＤは、上記の物質に既知の方法であ
るアルカリ溶液を作用させる脱アセチル化反応によって
得ることができる。

【００１３】本発明において、分岐ＣＤとしてはα−Ｃ
Ｄ，β−ＣＤまたはγ−ＣＤの側鎖にグルコシル基，マ
ルトシル基，ガラクトシル基およびマンノシル基のうち
から選ばれた置換基が結合したものなどがあり、重合度
や結合様式は限定されるものではない。またこれらの混
合物であってもよい。

【００１４】次に、本発明に用いるＮ−アセチルキトオ
リゴ糖類（以下、糖供与体と略記する。）としては、例
えばＮ−アセチルキトビオース，Ｎ−アセチルキトトリ
オース，Ｎ−アセチルキトテトラオース，フェニル−β
−Ｎ−アセチルグルコサミン，パラニトロフェニル−β
−Ｎ−アセチルグルコサミンなどのＮ−アセチルグルコ
サミニル基を含む配糖体やオリゴ糖などがある。その
他、キチンやその部分分解物およびそれらの混合物など
も用いることができる。

【００１５】本発明に用いる酵素としては、リゾチー
ム，Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼをはじめとして糖
供与体と分岐ＣＤを含有する溶液に作用させたとき、糖
供与体を分解し、そのＮ−アセチルグルコサミニル基を
分岐ＣＤにβ結合で転移させ、Ｎ−アセチルグルコサミ
ニル−分岐ＣＤを合成するものであれば、いずれも使用
可能である。本発明に用いる酵素は、自然界に広く分布
しているものが用いられる。例えば、卵白に含まれる動
物由来のリゾチームなどがある。また、Ｎ−アセチルグ
ルコサミニダーゼとしては牛腎臓に含まれる動物由来の
もの、タチナタマメに含まれる植物由来のもの、アスペ
ルギルス・ニガー等の生産する微生物由来のものなどが
ある。

【００１６】次に、本発明の新規分岐ＣＤの製造方法に
ついて説明する。反応系において、ＣＤと糖供与体を含
む溶液（水溶液または懸濁液）は、ＣＤの濃度が約１〜
８０％（ｗ／ｗ）、好ましくは２０〜６０％（ｗ／
ｗ）、糖供与体の濃度が約１〜７０％（ｗ／ｗ）、好ま
しくは２０〜５０％（ｗ／ｗ）であることが望ましい。
また、ＣＤに対する糖供与体の比率（重量）は、使用す
る糖供与体の種類によって異なるが、０．１〜５０倍の
範囲、好ましくは０．３〜３倍の範囲とするのが適当で
ある。

【００１７】反応液のｐＨは３〜１０、好ましくは４〜
８であり、温度は２０〜７０℃、好ましくは４０〜６０
℃に調整して反応させることが適当である。使用酵素量
は反応時間と密接な関係があるので、通常は反応が５〜
２００時間、好ましくは１０〜５０時間で終了するよう
な酵素量とすればよいが、これらに限定されるものでは
ない。本発明において、脱アセチル化反応は常法により
行えばよく、例えば、上記方法にて調製したＮ−アセチ
ルグルコサミニル−分岐ＣＤをアルカリ溶液で処理すれ
ばよい。処理条件は既知の方法に従えばよい。例えば、
脱アセチル化の反応系は、Ｎ−アセチルグルコサミニル
−分岐ＣＤの濃度は０．１〜５０％（ｗ／ｖ）、好まし
くは０．５〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲とするのが適当で
ある。

【００１８】脱アセチル化反応の際に用いるアルカリ溶
液は、好ましくは水酸化ナトリウム溶液であるが、脱ア
セチル化反応が進行するものであればこれに限定される
ものではない。また、反応温度，濃度，アルカリ溶液の
種類等は、相互に密接に影響を受けるので、通常は水酸
化ナトリウム溶液の濃度０．１〜５０％、温度室温〜１
００℃、反応時間０．１〜１２０時間の範囲が適当であ
るが、これらに限定されるものではない。脱アセチル化
反応終了後は、酸を滴下する等によって中和、脱塩した
後、必要に応じて、精製して目的物とすればよい。

【００１９】以上のような方法で反応させて得られた液
を、カラムクロマトグラフィーおよび高速液体クロマト
グラフィーにかけて、生成物を分画・分取した後、ＦＡ
Ｂ−ＭＳによる分子量測定、および核磁気共鳴法（ＮＭ
Ｒ）により構造解析を行った結果、前記した構造式Ｉ〜
IVに代表される分岐ＣＤであることを確認した。

【００２０】

【実施例】次に、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例１ （１）転移反応 Ｎ−アセチルキトオリゴ糖（重合度２から６の混合物）
１ｇ，マルトシル−β−ＣＤ２ｇを１０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ４．５）４．５ｍｌに溶解させた後、卵白由来リ
ゾチーム（生化学工業社製）を３００ｍｇ加え、６０℃
にて９日間反応させた。反応液の一部を逆相カラムを用
いた高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果を
図１に示す。反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を逆
相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけて
転移生成物Ａを１４０ｍｇ分取した。

【００２１】（２）構造解析 上記（１）で単離された転移生成物Ａは、図２に示すよ
うに、ＦＡＢ−ＭＳ分析により、分子量は１６６１であ
ることがわかった。また、¹³Ｃ−ＮＭＲ解析により、図
３に示すように、マルトシル−β−ＣＤのマルトシル基
の３位の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル
基が結合した化合物（前記の構造式Ｉ；ｎ＝６）である
ことが確認された。

【００２２】実施例２ （１）転移反応 Ｎ−アセチルキトオリゴ糖（重合度２から６の混合物）
１ｇ，マルトシル−α−ＣＤ２ｇを１０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ４．５）４．５ｍｌに溶解させた後、卵白由来リ
ゾチーム（生化学工業社製）を３００ｍｇ加え、６０℃
にて９日間反応させた。反応液の一部を逆相カラムを用
いた高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果を
図４に示す。反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を逆
相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけて
転移生成物Ｂを１４０ｍｇ分取した。

【００２３】（２）構造解析 上記（１）で単離された転移生成物Ｂは、ＦＡＢ−ＭＳ
分析により、分子量は１４９９であることがわかった。
以上のことより、実施例１の結果も踏まえて、この転移
生成物Ｂはマルトシル−α−ＣＤのグルコシル基の３位
の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が１
分子結合した化合物（前記の構造式Ｉ；ｎ＝５）である
ことが確認された。

【００２４】実施例３ （１）転移反応 Ｎ−アセチルキトオリゴ糖（重合度２から６の混合物）
１ｇ，マルトシル−γ−ＣＤ２ｇを１０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ４．５）４．５ｍｌに溶解させた後、卵白由来リ
ゾチーム（生化学工業社製）を３００ｍｇ加え、６０℃
にて９日間反応させた。反応液の一部を逆相カラムを用
いた高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果を
図５に示す。反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を逆
相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけて
転移生成物Ｃを１５０ｍｇ分取した。

【００２５】（２）構造解析 上記（１）で単離された転移生成物Ｃは、ＦＡＢ−ＭＳ
分析により、分子量は１８２３であることがわかった。
以上のことより、実施例１の結果も踏まえて、この転移
生成物はマルトシル−γ−ＣＤのグルコシル基の３位の
水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が１分
子結合した化合物（前記の構造式Ｉ；ｎ＝７）であるこ
とが確認された。

【００２６】実施例４ （１）転移反応 Ｎ−アセチルキトオリゴ糖（重合度２から６の混合物）
１ｇ，グルコシル−β−ＣＤ２ｇを１０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ４．５）４．５ｍｌに溶解させた後、卵白由来リ
ゾチーム（生化学工業社製）を３００ｍｇ加え、６０℃
にて９日間反応させた。反応液の一部を逆相カラムを用
いた高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果を
図６に示す。反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を逆
相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけて
転移生成物Ｄを５０ｍｇ分取した。

【００２７】（２）構造解析 上記（１）で単離された転移生成物Ｄは、ＦＡＢ−ＭＳ
分析により、分子量は１４９９であることがわかった。
以上のことより、実施例１の結果も踏まえて、この転移
生成物はグルコシル−βＣＤのグルコシル基の３位の水
酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基が１分子
結合した化合物（前記の構造式III;ｎ＝６）であること
が確認された。

【００２８】実施例５ （１）脱アセチル化反応 実施例１で得られたＮ−アセチルグルコサミニル−マル
トシル−β−ＣＤ（前記の構造式Ｉ；ｎ＝６）１０ｍｇ
を濃度１％、２０％水酸化ナトリウム溶液を調製し、８
０℃で３時間反応した。反応終了後、濃塩酸を滴下して
ｐＨを中性まで下げた。反応液はＯＤＳカラムを用いて
塩を除き、脱アセチル化物を８ｍｇ分取した。

【００２９】（２）構造解析 上記（１）で調製された脱アセチル化物は、ＦＡＢ−Ｍ
Ｓ分析により、分子量は１６１９であることがわかっ
た。以上のことより、脱アセチル化物はマルトシル−β
−ＣＤのマルトシル基の３位の水酸基にβ結合でグルコ
サミニル基が結合した化合物（前記の構造式II；ｎ＝
６）であることが確認された。

【００３０】実施例６ Ｎ−アセチルキトオリゴ糖（重合度１から６の混合物）
５０ｍｇ，マルトシル−β−ＣＤ１００ｍｇを１０ｍＭ
酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）２００μｌに溶解させた後、
タチナタマメ由来のＮ−アセチルヘキソサミニダーゼ
（生化学工業社製）を５Ｕ加え、４０℃にて２日間反応
させた。反応終了後、酵素を熱失活させた溶液を逆相カ
ラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにかけて転移
生成物を１ｍｇ分取した。この転移物は酸分解でＮ−ア
セチルグルコサミンとグルコースに分解されることか
ら、また、酵素分解の結果から、マルトシル−β−ＣＤ
のマルトシル基の水酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコ
サミニル基が結合した化合物であることが推定された。

【００３１】

【発明の効果】本発明によれば、酵素の糖転移作用を利
用して、分岐ＣＤ分子中の分岐側鎖の水酸基にβ結合で
Ｎ−アセチルグルコサミニル基が結合している新規分岐
ＣＤを効率よく得ることができる。また、これらをアル
カリ溶液で処理することによって脱アセチル化を行い、
分岐ＣＤ分子中の分岐側鎖の水酸基にβ結合でグルコサ
ミニル基が結合している新規分岐ＣＤを効率よく得るこ
とができる。本発明の新規分岐ＣＤは、医薬品分野の
他、食品分野，化粧品分野等における幅広い利用が期待
される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１の反応液の高速液体クロマトグラフ
である。

【図２】 実施例１の反応生成物ＡのＦＡＢ−ＭＳスペ
クトルである。

【図３】 実施例１の反応生成物Ａの¹³Ｃ−ＮＭＲスペ
クトルである。

【図４】 実施例２の反応液の高速液体クロマトグラフ
である。

【図５】 実施例３の反応液の高速液体クロマトグラフ
である。

【図６】 実施例４の反応液の高速液体クロマトグラフ
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 藤田 孝輝 神奈川県横浜市鶴見区大黒町13番46号 塩 水港精糖株式会社内 (72)発明者 原 耕三 神奈川県横浜市鶴見区大黒町13番46号 塩 水港精糖株式会社内 (72)発明者 小泉 京子 大阪府藤井寺市春日丘３−14−３ (72)発明者 谷本 敏子 兵庫県西宮市高須町２−１−28−415 (72)発明者 中野 博文 大阪府豊中市服部西町３丁目14番３号 (72)発明者 北畑 寿美雄 大阪府泉南郡熊取町野田621−440

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 分岐シクロデキストリンの分岐側鎖の水
   酸基にβ結合でＮ−アセチルグルコサミニル基もしくは
   グルコサミニル基が結合している新規分岐シクロデキス
   トリン。
2. 【請求項２】 分岐シクロデキストリンが、α−，β−
   またはγ−シクロデキストリンの側鎖にグルコシル基，
   マルトシル基，ガラクトシル基およびマンノシル基のう
   ちから選ばれた置換基が結合したものである請求項１記
   載の新規分岐シクロデキストリン。
3. 【請求項３】 分岐シクロデキストリンとＮ−アセチル
   キトオリゴ糖を含有する溶液に、Ｎ−アセチルグルコサ
   ミニル基転移酵素を作用させ、必要に応じて脱アセチル
   化することを特徴とする請求項１記載の新規分岐シクロ
   デキストリンの製造方法。
4. 【請求項４】 分岐シクロデキストリンが、α−，β−
   またはγ−シクロデキストリンの側鎖にグルコシル基，
   マルトシル基，ガラクトシル基およびマンノシル基のう
   ちから選ばれた置換基が結合したものである請求項３記
   載の新規分岐シクロデキストリンの製造方法。
5. 【請求項５】 Ｎ−アセチルキトオリゴ糖が、Ｎ−アセ
   チルキトビオース，Ｎ−アセチルキトトリオース，Ｎ−
   アセチルキトテトラオース，フェニル−β−Ｎ−アセチ
   ルグルコサミンおよびパラニトロフェニル−β−Ｎ−ア
   セチルグルコサミンのうちから選ばれたものである請求
   項３記載の新規分岐シクロデキストリンの製造方法。