JPH04502153A - マイコプラズマ ニューモニエ及びマイコプラズマホミヌスのスルファチドへの接着 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 マイコプラズマ　ニューモニエ及びマイコプラズマ　ホミヌスのスルファチドへ の接着 発明の分野 本発明は概して炭水化物レセプター及びそれらの用途に関する。特には、マイコ プラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｎｅｕｍａｎｉａｅ　：肺 炎マイコプラズマ）及びマイコプラズマ・ホミヌス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｈ ｏｍｉｎｕｓ）の検知のため、体液からのマイコプラズマ・ニューモニエ及びマ イコプラズマ・ホミヌスの除去方法、及びマイコプラズマ・ニューモニエ及びマ イコプラズマ・ホミヌスの成長阻害のため。

発明の背景 マイコプラズマは、バクテリアとウィルスの中間サイズの微生物群である。ヒト のマイコプラズマ種のうちで現在まで特性付けられているものに、マイコプラズ マ・ホミニス１及び２型（ｔｙｐｅｓ　１　ａｎｄ　２）　、ｖイコプラズマ費 すリバリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）　、マイコプラ ズマ・ファーメンタンス（ＭｙｃｏｐＩａｓｍａ　ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）　、 マイコプラズマ・オラーレｌ及び２型（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｏｒａｌｅｔｙ ｐｅｓ　１　ａｎｄ　２）、及びマイコプラズマ・ニューモニエが含まれる。マ イコプラズマ・ホミニス１型（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｏｍｊｎｉｓ　ｔｙｐｅ 　１）種は尿生殖路から回収され、そして性病、非バクテリア性尿道炎、子宮頚 炎、及び他の生殖器路の炎症性病気に関連するその度々の発生は、その滲出性咽 頭炎との関連と同様に報告されてきた。マイコプラズマ・バルモニス（Ｍ、　ｐ ｕｌｍｏｎｉｓ）は、ヒトには本来見られないけれども、白血病患者由来の標本 を接種した組織培養体から単離された。場合によりヒトの標本から単離されるマ イコプラズマ・ホミニス２型は、１歯類のマイコプラズマであるマイコプラズマ ・チースリティディス（Ｍ、　ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）と同一であることが示 された。

マイコプラズマの早い同定は、それらが菌感染のために使用される多くの抗生物 質及び化学療法剤に耐性となるので、特にマイコプラズマが原因作用因子である 病気に適当な処置を開始するのに非常に重要となる。

近年、細胞の代謝研究又はウィルスの増殖に使用されるような組織培養体中にマ イコプラズマが汚染物として存在することは報告されている。主な汚染物はマイ コプラズマ・ホミニスｌ型であると同定された。組織培養体中のマイコプラズマ の発生は、判定ではいつも培養体に微生物の汚染物が無いことを仮定しているの で、結果を誤って判定する潜在的原因となる。

従って、マイコプラズマ特にヒトの菌株の単離、同定及び成長阻害のための技術 及び方法は組織培養体の製造及び使用に重要となる。

マイコプラズマ・ニューモニエは、ヒトの気道の小さな原核性寄生体であり、ま た主な非定型肺炎の原因論的作用因子（ｅＨｏｌｏｇｉｃ　ａｇｅｎｔ）である 。この病原体は細胞壁を有さず、細胞膜及びグルコースの合成のため、炭素及び エネルギー源として外因性コレステロールを必要とする。気管型培養体において 、生存できるマイコプラズマの呼吸上皮への接着は、感染の開始のために必須で ある〔コリア−ら（ＣｏｌＨｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）　ｒインフエクト、イムノ、 （Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、）Ｊ　３　：　６９４−７０１，１９７１；ヒユ ーら（Ｈｕ　ｅｔ　ａｌ、）、前掲書　１１　：　７０４−７１０．１９７５　 ；ヒユーら（Ｈｇ　ｅｔ　ａｌ、）、前掲書１４二２１７−２２４．１９７６参 照〕。ひとたび結合したマイコプラズマ・ニューモニエは上皮表面に浸透しない けれども、気管上皮に広く害を与え、毛様体の静止、毛様体の消失及び最終的に 細胞死を導く原因となる〔コリア−ら（Ｃｏｌｌｉｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）“病原 体のミクロブラズ７　（Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｍｉｃｒｏｐｌａｓｍａ）”に おいて、　「チバ・ファンデーション・シンポジウム（Ｃ１ｂａ　Ｆｏｕｎｄａ ｔｉｏｎＳＹｍｐＯ８ｊｕｍ）Ｊ　１９７２年１月２５〜２７日、エルセヴイア ー（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）／北オランダ（Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ）アムステ ルダム。

ｐ　３０７−３２７及びカルマンら（Ｃａｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、）、　ｒイン フェクトイムン、　（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、）ノ２９　：　１１１７− １１２４．１９８０〕。

マイコプラズマ・ニューモニエはまた試験管内で、ヒト結腸癌細胞（ＷｉＤｒ） 、ヒト肺繊維芽細胞（ＭＣＲ５）、ヒーラ細胞、ハムスター気管上皮細胞、精子 及び赤血球を含めた多くの他の真核性細胞に結合する。これらの研究の幾つかは 、ノイラミジナーゼでの細胞の処置が結合を減少させるので、シアリル糖蛋白質 がマイコプラズマ・ニューモニエのためのレセプターであることを示唆している 〔マンチーら（Ｍａｎｃｈｅｅ　ｅｔ　ａｌ、）、ｒブリティッシュ　ジャーナ ル　オン　エクスペリメンタル　パソロジ−（Ｂｒ。

Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｐａｔｈｏｌ、’）　５０　：　６６−７５．１９６９　、ソ ベスラフスキーら（Ｓｏｂｅｓｌａｖｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ、）、ｒジャーナル　 オン　バクテリオロジ−（Ｊ、　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）　Ｊ　９６　 ：　６９５−７０５．１９６８　；及びバライル、エム、　ｘ７．（Ｂａｒｉｌ ｅ　Ｍ、Ｆ、）　ｒザ・マイコプラズマ（Ｔｈｅ　Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ）　 Ｊ第２巻中、チュリーら（ＴｕｌｌＹｅｔａｌ、）編、第４２５−４６４頁、ア カデミツクブレス（Ａｃａｄｅ−ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）　、ニューヨーク〕。

最近の研究は、生物が赤血球上のＮｅｕ−Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４　Ｇｌｃ ＮＡｃ配列を認識することを、この構造を含む糖脂質及び糖蛋白質の両方がバク テリアの接着を阻害するので、示唆している〔ルーメスら（Ｌｏｏｍｅｓ　ｅｔ 　ａｌ、）。

［ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドンＸＬｏｎｄ）　Ｊ　３０７　：　５ ６０−５６３．１９８４　、及びルーメスら（Ｌｏｏｍｅｓ　ｅＬ　ａＬ、）、 　ｒインフェクト、イムノ、　（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、）Ｊ　４７：　 １５−２０．１９８５参照）。しかしながら、他の研究は、糖脂質がマイコプラ ズマ・ニューモニエのためのレセプターでないことを示唆している〔ギヤブリッ ジら（Ｇａｂｒｊｄｇｅ　ｅｔ　ａｌ、）　ｒインフェクト、イムノ、　（Ｉｎ ｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、）　Ｊ　２５：　４５５−４５９、１９７９　、及び ギアリーら（Ｇｅａｒｙ　ｅｔ　ａｌ、）、ｒイスラエル　ジャーナル　オン　 メディカル　サイエンス（ｌｓｒ。

Ｊ、Ｍｅｄ、Ｓｃｉ、）　Ｊ　２３：　４６２−４６８．１９８７参照）。

多くの先行研究者は、マイコプラズマの検知及び同定のための方法を提供してき た。例えばセコリックら（Ｃｅｋｏｒｉｃ　ｅｔ　ａｌ、）は米国特許第３．６ ６８．０７５号に、成るヘバリノイド化合物が育成培地中のマイコプラズマの成 長を選択的に阻害する事実に基づいたマイコプラズマ群の同定方法を開示してい る。

マケラら（Ｍａｋｅｌａｅｔ　ａｌ、）は、米国特許第４．６５２．５１８号に 、グラム陰性菌の再−リボ多糖類突然変異株のためのリボ多糖類を用いるクラミ ジア感染の検知のための調剤を開示している。該多糖類は免疫応答を高めるため に担体分子に錯体化される。

ウォータースら（Ｗａｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、）は、米国特許第４，６３２、９ ０２号に、微生物の培養中に抗生物質及び他の微生物成長阻害物質を単離する栄 養育成培地を用いる生物活性の検知方法を開示している。育成培地は、微生物の 培養中に抗菌性物質を単離する単離用物質を含む。単離用物質はイオン交換樹脂 又は非官能性吸収性樹脂であってよい。

ケラ−ら（Ｋｅｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）は、米国特許第４．５４３．３２８号 に、血液の体外循環中に血液から生体適合性吸収剤でバクテリア、真菌及びウィ ルスを分離する方法を開示している。これらのポリマーは生体適合性であり、ポ リアクリレート、ポリメタクリレート、架橋ボリスチＩノン、酢酸セルロース、 コロジオン及びナイロンであってよい。

特公昭５５−３１９５９号公報には、ラテックス粒Ｐの懸濁液と合わせたマイコ プラズマ・ニューモニエ脂質抗原からなるマイコプラズマ・ニューモニエ感染病 の診断用ラテックスが開示されている。脂質抗原はマイコプラズマ菌体を有機溶 媒で抽出することにより製造することができる。マイコプラズマ・ニューモニエ 菌株は培養され、菌体が収集され、有機溶媒で抽出される。感作ラテツクスは、 脂質抗原を含む溶液を、ラテックス粒子が懸濁している懸濁液中に添加し、得ら れた混合物を２〜４時間処理することにより製造される。脂質抗原で感作性にさ れたラテックスは、グリシン又はデキストランのような保護剤を加え及び凍結乾 燥することにより、４℃で１時間以上保存することができる。

ンエファーら（Ｓｃｈｉｅｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）は、「スベンヤリア（Ｓｐｅ ｃｊａｌｉａ）　Ｊ　１９７Ｂ年８月１５日、第１０１１頁に、細胞化学染色法 操作を用い、コンカナバリンＡ　（ｃｏｎｃａｎｖａｌｉｎ　Ａ）及び鉄−デキ ストラン錯体でマイコプラズマ膜上に炭水化物構造を見えるようにできることを 開示した。しかしながら、この染色法が診断の目的に使用され得ることは開示さ れていない。

発明の概要 本発明の目的は、マイコプラズマで誘導された病気の処置を進歩させること、及 び特にはマイコプラズマで誘導された病気の発見を改良させることである。

本発明の更なる目的は、マイコプラズマ・ニューモ二エミーンズ及びマイコプラ ズマ・ホミヌスの細胞への結合を仲介するレセプターを提供することである。

本発明の別の目的は、マイコプラズマ・ニューモニエ及びマイコプラズマ・ホミ ヌスのヒト細胞及び組織への接着を阻害することである。

本発明の更に別の目的は、生物体液中のマイコプラズマ・ニューモニエ及びマイ コプラズマ・ホミヌスの存在を検知するだめの方法を提供することである。

本発明のなお別の目的は、組織培養体中のマイコプラズマ・ニューモニエ及びマ イコプラズマ・ホミヌスの存在を検知するための方法を提供することである。

本発明によれば、デキストランスルフェートは、他の現に知られている硫酸化し た又はアニオン性の多糖類を除き、マイコプラズマ・ニューモニエ及びマイコプ ラズマ・ホミヌスの精製スルファチドへの結合を完全に阻害する。デキストラン スルフェートは、培養ヒト結腸線癌細胞へのマイコプラズマ・ニューモニエ及び ／又はマイコプラズマ・ホミヌスの接着を部分的に阻害する。

生物試料中のマイコプラズマ・ニューモニエ又はマイコプラズマ・ホミヌスの存 在又は不在は、本発明に従い試料とデキストランスルフェートを接触させ、そし て例えば染色法及び薄層クロマトグラフィーによりマイコプラズマ・ニューモニ エ又はマイコプラズマ・ホミヌスの存在をテストすることにより決定される。

デキストランスルフェートは、マイコプラズマ・ニューモニエ及びマイコプラズ マ・ホミヌスが、末端Ｇａ１（３Ｓｏ４）β１−残基を含有する細胞を含めたス ルファチドレセプターを含有する様々なヒト細胞に結合するのを阻害する。この 微生物の細胞への結合をデキストランスルフェートが阻害するので、この微生物 に感染した患者又は宿主への硫酸デキストランの投与は、この微生物の成長及び 増加を、そのヒト細胞への結合を阻害することにより防止することができる。

試料中のマイコプラズマ・ニューモニエは、様々な他の物質の分析に干渉し得る ので、試験を行う前に試験される液体からマイコプラズマ・ニューモニエを除去 することがしばしば望まれる。デキストランスルフェート単独、又はシアリルオ リゴ多糖類即ちα２，３−結合シャル酸含有化合物とデキストランスルフェート の組み合わせのどちらも不溶性担体上に吸着され、次いで試験流体がこの担体に 接触される。それでマイコプラズマ・ニューモニエが担体に接着し、試験液から 効果的に除去され得る。

図面の簡単な説明 図ＩＡおよびＩＢは薄層クロマトグラフィーにより分離された糖脂質へのマイコ プラズマ・ニューモニエ（７）結合を示す。

図２は精製糖脂質へのマイコプラズマ・ニューモニエの結合を示す。

ｒＩ！Ｊ３はスルファチドへのマイコプラズマ・ニューモニエのエネルギーおよ び温度依存結合を示す。

図４はスルファチドへのマイコプラズマ・ニューモニエ結合のデキストランスル フェートによる阻害を示す。

図５Ａおよび５ＢはＷ　ｉ　Ｄ　ｒ腺ガン細胞により合成されたスルファチドの 同定を示す。

図６は固定化糖タンパク質へのマイコプラズマ・ニューモニエ結合を示す。

図７は固定化糖タンパク質へのマイコプラズマ・ニューモニエ結合のノイラミダ ーゼ処理の作用を示す。

図８はマイコプラズマ・ニューモニエ接着を仲介するヒト絨毛膜ゴナドトロピン のα−サブユニット上でのシアリル化オリゴ糖の構造を示す。

図９はヒト腺ガン細胞系（ＷｉＤｒ）へのマイコプラズマ・ニューモニエ接着の 阻害を示す。

発明の詳細な説明 デキスランスルフェートは、全て末端にＧａ１（３Ｓ０４）β１残基を含むセミ ノリビドおよｉラクトシルスルファチドのような糖脂質等のスルファチドレセプ ターを含存する種々のヒト細胞へのマイコプラズマ・ニューモニエの結合を阻害 する。

本発明に従って、マイコプラズマ・ニューモニエの毒性株は〔３Ｈ〕パルミテー トで代謝的に標識され、そして糖脂質およびＷ　ｉ　Ｄ　ｒヒト結腸腺ガン細胞 への結合が研究された。当該生物は全て末端にＧａ　１　（３ＳＯ＝　）β１残 基を含むセミノリビドおよびラクトシルスルファチドのようなスルファチドおよ びその他のスルフェート化糖脂質に強く結合することが見出された。

マイコプラズマ・ニューモニエはシアリルネオラクト系および天然糖脂質等の多 （のガングリオシドに弱く結合するだけか、または全く結合しない。結合はＲＰ ＭＩ培地中３７℃で最大であり、そして栄養欠損培地中または４℃に細胞を保持 することにより結合はほとんど完全に消失するように、代謝的に活性なマイコプ ラズマ・ニューモニエ細胞だけがスルファチドに結合する。

このことは、スルファチドがヒト気管、肺およびＷｉＤｒ細胞中細胞量に生じる から、特に関連があり、そしてそれ故にデキストランスルフェートの投与はマイ コプラズマ・ニューモニエの上記ヒト細胞への結合を阻害し得る。

ラミニン、フェツインおよびヒト絨毛膜ゴナドトロピンを包含する種々の精製さ れた糖タンパク質は、プラスチックに吸収された場合、マイコプラズマ・ニュー モニエの投与依存性および飽和可能性接着を促進する。付着はグルコース不在の 培地では生じないので、タンパク質への接着エネルギー依存性である。全てのタ ンパク質への接着はシアル酸を必要とし、そしてα２−３−結合シアル酸を存す るこれらのタンパク質だけが活性である。

ヒト絨毛膜ゴナドトロピンのα−サブユニットはまた、付着を促進し、単純な２ アンテナ性のアスパラギン結合オリゴ糖が結合には十分であることが示唆される 。可溶性ラミニン、フェツインからのアスパラギン結合シアリルオリゴ糖、およ び３′　−シアリルラクトースはマイコプラズマ・ニューモニエのラミニンへの 付着を阻害するが、６′−シアリルラクトースは阻害しない。マイコプラズマ・ ニューモニエはまた、プラスチックに吸収されたスルファチドに結合する。スル ファチドへのマイコプラズマ・ニューモニエ結合を阻害するデキストランスルフ ェートはラミニンへの付着を阻害せず、そして３′　−シアリルラクトースはス ルファチドへの結合を阻害しない。このことは、２つの異なるレセプター特異性 がこれら２つの炭水化物レセプターへの結合を仲介することを示唆する。３゛　 −シアリルラクトースおよびデキストランスルフェートの両方はヒト結腸腺ガン 細胞系（ＷｉＤｒ）へのマイコプラズマ・ニューモニエ接着を、ラミニンまたは スルファチドへの結合をそれぞれ完全に阻害する濃度で部分的に阻害し、そして −緒になってそれらはこれらの細胞へのマイコプラズマ・ニューモニエの結合を 約９０％阻害する。従って、両方のレセプター特異性は培養されたヒト細胞への マイコプラズマ・ニューモニエ接着に寄与する。

ウシ脳スルファチド（ガラクトシルセラミド−１”−スルフェート）、セラミド モノヘキソシト、セラミドトリへキソシド、グロボシド、ならびにガングリオシ ドＧＭ１およびＧＤｌａはスベルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）から得られた。

ラクトシルセラミドおよびグルコシルセラミドはカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃ ｈｅｍ）から得られた。その他の関連ガングリオシドはパケム社（Ｂａｃｈｅｍ ）から得られた。セミノリビド（β−ガラクトシルアルキルアシルグリセロール −１”−スルフェート）は、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４θ：　３３６７−３３ ７３．１９８８にロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）等により記載されたようにウシ来 丸から単離された。ガラクトシルセラミド−ＩＢ−スルフェートはＪ、　Ｂｉｏ Ｌ、　Ｃｈｅｒｔｒ、　２６１：　６９７２−６９７７、１９８６にロバーツ等 により記載されたように、ガラクトシルセラミドのスルフェート化により製造さ れた。スルフェート化グルクロノシルパラグロボシド（ＩＶ’　−（３°　Ｓｏ 、ＧｌｃＡ）−ｎＬｃｏｓｅ４ｃｅｒ）はＪ、　ＢｉｏＬ、　Ｃｈｅｗ、　２６ １：　１１７１７−１１７２５．１９８６にチュー（Ｃｈｏｕ）等により報告さ れたようにヒト末梢神経から精製された。ラクトシルセラミド−■１−スルフェ ート、０Ｍ８およびシアリルラクトフコペンタオシルー（Ｉ［［）−セラミドは Ｊ、　ＢｉｏＬ、　Ｃｈｅｍ、　２５１：　７５１７−７５２０．１９７６にラ ウバラ（Ｒａｕｖａｌａ）等により、およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｒｙ　２０：　 ５３１０−５３１９．１９８１にハンフランド（Ｈａｎｆ　１ａｎｄ）等により 記載されたようにヒト腎臓から精製された。α−ガラクトシルバラグロボシド（ ＩＶ”　Ｇａ１ｎＬｃＯｓｅ４Ｃｅｒ）およびＩ−活性α−Ｇａ、１２ラクトイ ソオクタオシルセラミドはＪ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｗ、　２５４：　３２２１−３２２８．１９７９にワタナベ（Ｗａｔａｎ ａｂｅ）等により記載されたようにウサギ赤血球から精製された。

ラクトイソオクタンルセラミドは後者の脂質をコーヒー豆α−ガラクトシダーゼ と処理することにより調製された。Ｃ２−３−シアリルバラグロボシド（Ｎｅｕ Ｇｃ）、α２〜３−シアリルラクトネオヘキサオシルセラミド、０Ｍ３（Ｎｅｕ Ｇｃ）およびＩ−活性ガングリオシドはＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ１１＋、　２ ５４：　８２２３−８２２８．１９７９のワタナベ等の方法に従ってウシ赤血球 から調製された。Ｃ２−３−シアリル−バラグロボシド（ＮｅｕＡｃ）はＪ、　 Ｂｉｏｃｈｅｍ。

７９：　６２５−６３２．１９７６にアルド（Ａｒｄｏ）等により記載されたよ うにＯ型ヒト赤血球から単離された。

バラグロボシドおよびラクトネオヘキサオシルセラミドはそれぞれのガングリオ シドの１Ｍギ酸での１００’Ｃで６０１分間の脱シアリル化により調製された。

ラクト−Ｎ−）リアオシルセラミドはバラグロボシドのウシ翠丸β−ガラクトシ ダーゼでの消化によりｗ４１Ｒされた。

ネオラクト系糖脂質の同定は、ノイラミニダーゼ消化の前および後のモノクロー ナル抗体Ｍｙ−２８での免疫染色により行われた。脂質は正常なヒト肺、気管お よびＷ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞から抽出され、そして炭酸水素塩の形態にあるＤＥＡＥ セファロース上での陰イオン交換クロマトグラフィーにより中性および酸性画分 に分離された。いくつかの実験のために、Ｗ　ｉＤ　ｒ細胞が〔ｓｓＳ〕−スル フェートで代謝的に標識された。培地を除去し、そして１０ｍＭリン酸緩衝波緩 衝液　７．３中のＺ５ｍＭ　ＥＤＴＡを添加することにより、細胞を組織培養フ ラスコから除去した。３７℃で６０分後、遠心分離により細胞を集め、上記のよ うに抽出した。組織抽出物中のスルフェート化糖脂質は１１８１−フォノ・ウィ レブランド・ファクター（ｖａｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　ｆａｃｔｏｒ）との 高性能薄層クロマトグラフィーにより分離された脂質の染色により検出された。

微生物の増殖および標識 毒性マイコプラズマ・ニューモニエＭ１２９株、継代５−１５を、Ｉｎｆｅｃｔ 、　ＩｗＩｒａｕｎ、　３７　：　９４２，１９８２にチャンドラ−（Ｃｈａｎ ｄｌｅｒ）等により記載されたように、増殖させ、そして〔″Ｈ〕パルミチン酸 、１２−１７Ｃｉ１モルで代謝的に標識した。微生物を２６ゲージの針に４回通 し、そして１％ウシ血清アルブミンおよび２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、Ｉ）Ｈ７，３ 含有の脱気ＲＰ？・４１１６４０培地におよそ１０’ｃｐｍ／ｍｌに懸濁した。

マイコプラズマオーバーレイアッセイ マイコプラズマ・二；−モニエをｐｒｏｃ、　Ｈａｔｅ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　８５　：６１５７−６１６１．　＋９８８にクリパン（Ｋｒｉｖａｎ ）等によりおよびＡｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｔｍ、　ＢｉｏｐｈｙＳ、　２６０　 ：　４９３−４９６．１９８８にクリパン等により他の細菌に対して詳細に記載 されたように薄層クロマトグラム上に分離された糖脂質に結合させた。要するに 、糖脂質は、水中のクロロホルム：メタノール：　０．２５％ＣａＣ１＊　（６ ０：　３５　：　８）で展開されたアルミニウム裏打シリカゲル高性能プレート 上での薄層クロマトグラフィーにより分離された。クロマトグラフィーの後、プ レートを０．１％ポリイソブチルメタクリレートで被覆し、１１０ｎＭ塩化ナト リウム、５ｍＭ　ＣａＣ１ｔ１．０．２ｍＭ’フェニルメタンースルホニルフル オリド、および１％ウシ血清アルブミンを含有する０、　０５　Ｍ　）リスＨＣ Ｉ、ｐ）ｌ’７．６　（ＴＢｉＢＳＡ）中に浸漬し、そして（ｊＨ）標識マイコ プラズマ・ニューモニエ６０μｉ　／ａｌ、　ＲＰＭ　Ｉ−Ｂ　Ｓ　Ａの約１１ ０７ＣＰ／′ｆｆ１ｌと２５℃で３時間保温した。プレートをＯ，Ｘ５Ｍ塩化ナ トリウム含有の０．０１　Ｍリン酸ナトリウム。

ｐＨ７，２（ＰＢＳ）中で５回級やかに洗浄して、非結合微生物を除去し、乾燥 し、そＬ２てウルトラフィルム＃Ｈ（２２０８−１９０）高速フィルムｊこ２４ 時間ｊ！露した。

同相結合アッセイ 微量滴定プレート中に固定した精製糖脂質へのマイコプラズマ・ニューモニエの 結合はｐｒｏｃ、　Ｈａｔｌ、　Ａｃａｄ、　、Ｓｃ１、（上掲）にクリパン等 により記載されたように測定された。精製された糖脂質は、補助脂質コレステロ ールおよびホスファチジルコリンを各０．１μｇ含むメタノール２５μｆ中に連 続的に希釈された。蒸発により溶液を乾燥させた後、ウェルをＴＢＳ−ＢＳＡで 満たし、１時間後に空にし、ＲＰＭＩ−ＢＳＡですすぎ、そして〔８Ｈ〕マイコ プラズマ・ニューモニエ２５μｌ、約１０”ｃｐｍ／ｍｌＲＰＭＩ−ＢＳＡと保 温した。３７℃で２時間の保温後、特記しない限り、ウェルを食塩水で５回洗浄 し、結合されたマイコプラズマ・ニューモニエはアクアゾル中でシンチレーショ ンカウントすることにより定量された。阻害の研究のために、種々の多糖がＣ” Ｈ）　−マイコプラズマ・ニューモニエ２５ｍ１中に連続的に希釈された。

培養細胞へのマイコプラズマ接着 ガラス被覆スリップ上の細胞への（”Ｈ）−マイコプラズマ・ニューモニエの接 着は、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、（上掲）にチャンドラ−等により以前記載 された方法の変法により測定された。Ｗ　ｉ　Ｄ　ｒヒト結腸腺ガン、ＡＴＣＣ ＣＣＬ　２１８は、１０％ウシ胎児血清を含むイーグル最小必須培地中、５％Ｃ Ｏ１雰囲気下３７°Ｃで増殖させた。細胞をトリプシンで除去し、そして２４ウ 工ル組織培養プレート中の１２ｍｍ円形ガラスカバースリップ上で平板培養し２ 、そして３日間増殖さゼた。対照カバースリップを無細胞培地中で予め培養した 。カバースリップを無血清培地中で洗浄し、次いでＲＰＭＩ−ＢＳＡ中１中介５ 分間保温。培地を除去し、そしてＲＰＭＩ−ＢＳＡ　Ｏ，５ｍ　ｌに懸濁した標 識マイコプラズマ・ニューモニエを各ウェルに添加した。プレートをロッキング テーブル上３７℃で６０分間保温した。カバースリップを食塩水に６回浸漬する ことにより洗浄し、そして結合した放耐性バクテリアはシンチレーションカウン トにより決定された。阻害研究のために、阻害剤は、カバースリップにバクテリ アを添加する前にマイコプラズマ・ニューモニエに添加された。

薄層クロマトグラム上の糖脂質へのマイコプラズマ・ニューモニエの結合 薄層クロマトグラ、ム上で分けられた種々の糖脂質と〔”Ｈ）標識マイコプラズ マ・ニューモニエの保温は微生物の炭水化物結合特異性を決定するために使用さ れた。

オルシノール試薬で可視化された同様の薄層プレート（図ＩＢ）と比較されて、 オートラジオグラム（図ＩＡ）により示されるように、マイコプラズマ・ニュー モニエは真のスルファチドに強（結合し、この糖脂質１１００ｎを検出しく列Ｃ ３）、そしてヒト気管の酸性脂質画分中のスルファチドと同様の移動度を有する 糖脂質に強く結合した（列ｆ）。この気管の糖脂質は、１′■標議フオン・ウィ レブランド・ファクターでの特異的染色によりスルファチドであると確認された 。スルファチドはまた、ヒトの肺脂質中にも気管より低いレベルであるが検出さ れた。

マイコプラズマ・ニューモニエはまた、スルファチドと同様に末端にＧａ　Ｉ　 Ｃ３ＳＯｓ　）β１残基を含むラクトシルスルファチドおよびセミノリビドのよ うなその他のスルフェート化糖脂質、および末端のスルフェートがガラクトース の６位に結合されているスルファチドの異性体に結合した。表１は興味深い構造 を示す。

表１に示されるように、マイコプラズマ・ニューモニエはまた、大量のラクトシ ルセラミドに結合し、そしてより少ない範囲のグルコシルセラミド、バラグロボ シドおよびα−ガラクトシルバラグロボシドに結合するが、しかしその他の天然 の糖脂質には結合しない。Ｇ２−３−シアリルバラグロボシド、Ｉ−活性モノシ アリルガングリオシド等のその他の酸性糖脂質、またはガングリオシドＧＭ３． ０Ｍ２、ＧＭＩ、ＧＤｌａ、Ｇ５１ｂおよびＧＴＩＢには結合性が検出されなか った。さらに、マイコプラズマ・ニューモニエは、グルクロン酸の８位に結合し た末端のスルフェートを有する、大量のコレステロールスルフェートまたはスル フェート化グルクロノシルバラグロボシドには結合しないので、スルフェートそ れ自体は結合には十分ではない。

図１に示された結果を得るために、糖脂質は水中のクロロホルム：メタノール： ３５：８）で展開されたアルミニウム裏打シリカゲルＨＰＴＬＣプレート上での クロマトグラフが行われた。上記したように、プレートをプラスチックで被覆し 、トリス−ＢＳＡ中に浸漬し、そして１％ＢＳＡおよび２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　 （ｐＨ７．３）を含有するＲＰＭ１１６４０中に懸濁された（　”Ｈ）−パルミ テート−標識マイコプラズマ・ニューモニエと２５℃で３時間保温するか（図Ｉ Ａ）、またはオルシノール試薬を噴霧して糖脂質を同定した（図ＩＢ）。列ａ， 酸性糖脂質標準スルファチド（０．５μｇ）、０Ｍ８　（２μｇ）、０Ｍ２　（ ２μｇ）。

ＧＤｌａ　（２μｇ）、ＧＤＩＢ　（２μｇ）、ＧＴｌｂ（２μｇ）；列す，中 性標準ガラクトシルセラミド（４μｇ）、ラクトシルセラミド（４μｇ）、グロ ボトリアオシルセラミド（２μｇ）、Ｇ２（０．５μｇ）、およびＧ３（０．１ μｇ）；列ｄ，セミノリピド（２μｇ）：列ｅ，コレステロール８ースルフェー ト（２μｇ）；列ｆ。

ウシ赤血球湿重量１　０　０ｍｇからのヒト気管酸性糖脂質；列り，Ｇ２−８シ アリルパラグロボシド（２μｇ）；列ｉ，ウシ赤血球からの１−活性モノシアリ ルガングリオシド（２μｇ）。

微量滴定プレート中に固定された糖脂質へのマイコプラズマ・ニューモニエの定 量的結合 微量滴定プレートに吸収された精製糖脂質へのマイコプラズマ・ニューモニエの 結合は、結合特異性をさらに規定するために試験された。図２に示されるように 、スルファチドへの結合は感受性であり、そして投与依存性だった。マイコプラ ズマ・ニューモニエはラクトシルセラミドおよびバラグロボシドに弱（結合した が、一方、各ウェル１０μｇで試験されたコレステロールスルフェートまたはそ の他の糖脂質への結合は検出されず、オーバーレイアッセイから得られたデータ と一致した。

図３に示されるように、マイコプラズマ・ニューモニエのスルファチドへの結合 はエネルギーおよび温度の両方に依存性だった。８７℃でのスルファチド約０． ２５μｇが１／２最大結合に必要だった。結合活性は２５℃で約５倍低く、そし て４℃で最低だった。図３に示されるように、マイコプラズマ・ニューモニエは また、栄養欠損培地（ＲＰＭＩ非含有トリス−ＢＳＡ）中３７℃で、４℃で得ら れたものと比較し得る結合活性で弱く結合した。これらの結果は、マイコプラズ マ・ニューモニエが最大結合を生じるにはエネルギーおよび生理学的温度を必要 とすることを示唆する。

図２に示された結果を得るために、補助脂質コレステロールおよびホスファチジ ルコリン各２５μｇ中の脂質をポリ塩化ビニル微量滴定プレートの平底ウェル中 で蒸発させた。ウェルを１％アルブミンで１時間ブロックし、ＲＰＭＩ−ＢＳＡ で２回洗浄し、そして（　”Ｈ）マイコプラズマ・ニューモニエ２５μ／、約１ ０５ｃｐｍと２５℃で保温した。２時間後、ウェルを食塩水で５回洗浄し、プレ ートから切出し、そして結合した放射性をシンチレーションカウンターで定量し た。対照試験において、典型的には添加された全体の放射性の１％未満の非特異 的結合を補正するために、微生物は補助脂質だけと保温された。マイコプラズマ ・ニューモニエ結合性はＲＰＭＩ−ＢＳＡ中で、スルファチド（・）、ラクトシ ルセラミド（■）、バラグロボシド（◆）およびコレステロールスルフェート、 セラミドトリヘキソシト、グロボシド、ＧＭＩ、０Ｍ２、または０Ｍ３　（○） に対して決定され図３において、スルファチドへのマイコプラズマ・ニューモニ エのエネルギーおよび温度依存性結合を決定するために、図２に記載したように 微量滴定ウェルはスルファチドで被覆され、そしてアルブミンで黒化された。

〔″Ｈ〕マイコプラズマ・ニューモニエの結合性がＲＰＭｌ−ＢＳＡ中で２時間 、４℃（ＩＩ）、２５°Ｃ（１）、３７℃（ム）およびＲＰＭＩなしのＢＳＡ中 ３７℃（△）で決定された。

デキストランスルフェートによる固定化スルファチドおよびＷ　ｉ　Ｄ　ｒ単層 へのマイコプラズマ・ニューモニエ結合性の阻害 図４に示されるように、種々の陰イオン性多糖が微量滴定プレート中に吸収され たスルファチドへのマイコプラズマ・ニューモニエ結合性の阻害に対して試験さ れた。

０．４μｇ／ｍｌのデキストランスルフェートがスルファチド１μｇの約５０％ まで結合性を阻害したが、デキスト・ランは効果がなかった。１００μｇ　／　 ｍ、　ｌでは酵母ホスホマソナン、コロミン酸、ヒアルロネート、および種々の スルフェート化多糖例えばフコイジン、ヘパリン、およびコンドロイチンスルフ ェートは結合性を阻害しなかった。

図４に示した結果を得るために、精製スルファチド１μｇで予め被覆した微量滴 定ウェル中でＲＰＭＩ−ＢＳ八へ５μｌに連続的に多糖を希釈した。結合性は３ ７°Ｃで２時間、（”Ｈ）マイコプラズマ・ニューモニエ２５μｌとの保温を、 示された濃度のデキストラン（・）またはデキストランスルフェート（ム）とと もに行った後に決定された。

マイコプラズマ・ニューモニエ中の毒性株は哺乳類細胞に結合するから、Ｗ　ｉ 　Ｄ　ｒ細胞の単層が、デキストランスルフェートが有機体の接着を阻害するか 否かを決定するために使用された。表■に示されるように、〔１Ｈ〕標識マイコ プラズマ・ニューモニエは、デキストランスルフェートの存在下または不在下で 、カバースリップに付着したＷ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞の単層との保温を３種行われた 。

デキストランスルフェートは３種の試験全てにおいて接着を阻害したが、しかし 阻害の程度は試験により変化した。各試験において、１０μｇ／ｍｌデキストラ ンスルフェートは１μｇ／ｍｌより阻害したが、１００μｇ／ｍ１デキストラン スルフェートはさらに阻害を引き起こさなかった。従って、最大阻害は約１０μ ｇ／ｍｌデキストランスルフェートで得られた。同様の結果は、３回の実験にお いてマイコプラズマ・ニューモニエ接着の平均４７％がデキストランスルフェー トにより阻害されたＭＲＣ５肺腺維肺線維芽細胞れた。

７、ルアｙチド　ｃａｌ　（６ＳＯ，）β１−ＩＣｅｒ＊÷−ラクトンルスルフ ァチド　Ｇａ　１　（３３０イ）βｌ−４Ｇｌｃβ１−　Ｉ　Ｃｅ　ｒ　↓＋− グルコンルサー（ＣＭＨ）　Ｇｌｃβ１−ＩＣｅｒ”ラクトシルサー（ＣＤＨ） 　Ｇａ　ｌβ１−４Ｇ１ｃβ１−ＩＣｅｒ　＋＋パラグロポンド　Ｇａｌβ１− ４Ｇ］ｅＮＡｃβ１−３Ｇａ１β１−４Ｇｌｅβｌ−１ｃｅｒ　＝グロボシド（ ＧＬＡ）　Ｇａ　１ＮＡｃβｌ−３Ｇａｌａｌ−４Ｇａ１β１−４ＧＩｃβｌ− １ｃｅｒ　−表Ｉ　（ａき） ０Ｍ２　Ｇａ１ＮＡｃ　βｌ−４（ＮｅｕＡｃ　α２−３）Ｇａｌ　β１−ＧＩ ｃ！１ｌ−ＩＣｅｒ　−表■（続き） ！−アクティブ　ラクトイソオクタオシルサーＩ−アクティブ　Ｇａ１．−ラク トイソオクタオシルサ−［”Ｓ）−スルフェートを用いた代謝標識化により、図 ５に示すようにＷ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞は大量のスルファチドを作るということが確 認された。真正の脳スルファチドと共に弁移動するオルシノール−正でレゾルシ ノール負のグルコリポイドは、図５へのレインＣの如＜　Ｗ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞か らの酸性リポイド中に検出される。このリポイドは、図５へのレインｌの如＜　 （”Ｓ）を含み、そして図５Ｂのレイン１の如くスルファチド、セミノリボイド 及びコレステロール−３−スルフェートを溶解する酸性溶媒系中において真正の スルファチドとの弁移動によってスルファチドであることが確認された。定常状 態標識化の下での（”Ｓ　）の混合に基づくと、Ｗ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞は細胞のダ ラム湿潤重量当たり約９０ｎｍｏｌのスルファチドを含む。確認標識はコレステ ロール−３−スルフェート及び少量は図５Ｂのレインａの如くセミノリボイドと 共に弁移動するリポイドにも混合された。

図５に示す結果を得るために、上述の如＜　Ｗ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞は（”Ｓ）−ス ルフェートを用いて代謝的に標識化された。中性及び酸性リポイドは、クロロホ ルム／メタノール１０．２５％ＫＣＩ水溶液、５：４：１　（図５Ａ）又はクロ ロホルム／メタノール／アセトン／酢酸／水。

８：２：４：２：１　（図５Ｂ）中で展開されたシリカゲル高性能薄層プレート 上でクロマトグラフに付した。前記リポイドは、オートラジオグラフィーにより （レインａ）、又はオルシノール試薬により（レインｂ−ｆ）検出された。

図５Ａ中、１０６ＷｉＤｒ細胞からの（”Ｓ）標識化酸性リポイドはレインａに 、そして湿潤重量３０ｍｇのＷ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞からの中性リポイドはレインｂ に、酸性リポイドはレインＣに示される。オルンノール正スルファチドバンドは 、矢印（→）によって示される。参照グリコリポイドの移動は、左端に示される ・スルファチド、ＧＭ３．０Ｍ２、ＧＭＩ、ＧＤｌａ、ＧＤｌｂ及びＧＴｌｂ。

図５Ｂ中、＋０６ＷｉＤｒ細胞からの〔’Ｓ）標識化酸性リポイドはレインａ及 びレインＣに、ウシ脳スルファチドはレインｅに、そして頭部から底部までの中 性グリコリポイド標準：　ＣＭＨ，ＣＤＨ，ＣＴＨ及びＧＬ４はレインｆに示さ れる。

マイコプラズマ　ニューモニエのグリコリポイド結合特性は、薄層オーバーレイ 　アッセイ（ｏｖｅｒｌａｐ’ａｓｓａｙ）により確立された。表工に示すよう なりロフトグラム上に存在する多数のグリコリポイドのうち、図ＩＡ及びＩＢに 示す如く、マイコプラズマ　ニューモニエはスルフェート化グリコリポイド及び 弱くラクトシルセラミド、グルコシルセラミド、ラクトトリヘキサオシルセラミ ド、パラグロボシド及びα−ガラクトシルバラグロボシドにのみ結合する。しか しながら、図２に示す如く、精製されたスルファチド及びラクトシルセラミドの 結合曲線は、スルファチドのみが良好な投与応答を表わし、反対にラクトシルセ ラミドはマイコプラズマニューモニエに弱く結合し、そして他のグルコリポイド は全く結合しないということを示した。興味深いことに、マイコプラズマ　ニュ ーモニエはガラクトシルセラミドＩ３−スルフェートとその非天然６−スルフェ ート異性体（表１参照）とを識別せず、それ故この生物はコレステロールスルフ ェート又はスルフェート化グルクロノシルパラグロポンド（これは、グルクロン 酸の３位に結合した末端スルフェートを有する）に結合しない。これらの結果は 、スルフェート単独ではマイコプラズマ　ニューモニエに対して充分ではなく且 つ少なくともグリコリポイド中のＧａｓ　（３ＳＯ４）β１−残基が必要である ということを示す。

マイコプラズマ　ニューモニエは、薄層クロマトダラム上の又はコレステロ−ル ーフすスファチジルーコリン若しくはミクロ滴定ブートに吸着されたα２−３− シアリルネオラクト系列に結合しなかった。この知見は、これらのグリコリポイ ド並びに脳ガングリコシド（これらは、ノエラクト系列コア構造を欠く）は、マ イコプラズマ　ニューモニエの接着を阻害するという報告と、前記生物は、前記 末端構造を有するアスパラギン−結合オリゴサツカライドに結合するという本発 明者らの知見とが相違することを示す。しかしながら、ラミニン−媒介血球凝集 反応及びスルファチドに結合しているラミニンにおいて示される如く、ガングリ コシドによる阻害は、それらがスルファチド１ノセブターを遮蔽することに関し て間接的かもしれない。マンノース（これはアスパラギン−結合糖蛋白質を生じ させるが、しかし糖脂質中には不存在である）は、強固な結合のために必要であ るかもしれないと仮定される。

マイコプラズマ　ニューモニエの接着に関するスルファチドについての生物学的 関連は、３種の知見により示唆される。第一に、図３に示される如く、代謝的に 活性なマイコプラズマ　ニューモニエのみがスルファチドに結合する。生理温度 において、結合性はＲＰＭＩ媒体中で最大となり、そして栄養素不足の媒体中又 は４°Ｃの温度でほとんと完全に無くなった。これらの結果は、マイコプラズマ 　ニューモニエの接着は代謝前、低温により、及び非生育性生物を使用すること により減少し、且つその接着は活性化膜により影響され得るという他の知見と＝ 一致する。第二に、スルファチドは人間の気管内に大量に生じ、且つ人間の肺に 存在し、且つ図１及び５に示す如＜、ＷｉＤｒ人間結腸アデノカルシツマ細胞を 培養する。後者は、細胞当たり約５千万個のスルファチド分子を有する。マイコ プラズマ　ニューモニエによって認識される別のスルフェート化複合糖質は、前 記組織中の糖蛋白質又はプロテオグリカン上に存在し得る。第三に、デキストラ ンスルフェート（これは、とりわけスルファチド−依存性結合を阻害する）は、 特にＷ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞に対するマイコプラズマ　ニューモニエの接着を阻害す る。

シアリル糖蛋白質より他のレセプターの存在は、シアリル複合糖質による培養細 胞系統に対するマイコプラズマ　ニューモニエの結合性の阻害は、何故通常不完 全であるかということを説明するであろう。これは、図４に示す如（，１Ｇａｇ ／ｍｌのデキストランスルフェートはプラスチック上に固定された精製スルファ チドへの結合性を完全に失わせるが、しかしＷ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞に対するマイコ プラズマ　ニューモニエの接着を部分的にのみ阻害する（表■参照）という阻害 研究を用いた場合でもある。それ故、細胞へのマイコプラズマ　ニューモニエの 結合を媒介する少なくとも２種の異なるレセプター（末端にＮｅｕＡｃａ２−２ Ｇａ　１β１−４Ｇ１ｃＮＡｃ配列を含む糖脂質）が多分存在し、その両方が培 養細胞へのマイコプラズマ　ニューモニエの結合の完全な阻害のために閉塞され ていなければならない。スルファチド−媒介接着は、強い栄養摂取の要求を満足 させるための宿主膜に対する寄生動物の緊密な接触を保証するために、マイコプ ラズマ病原性においては重要であるかもしれない。イン　ビトロにおける多数の 細胞種へのマイコプラズマ　ニューモニエの接着は、宿主細胞表面上のシアリル すりゴサッカライドの認知により媒介され得る。ＣＭＯ−シアル酸及び精製シア リルトランスフェラーゼを使用する結合性又はノイラミニダーゼ処理赤血球の選 択的回復に基づいて、マイコプラズマ　ニューモニエの表面生長シート・培養物 上への赤血球の接着は、とりわけα２−３ないしＮ−アセチルラクトースアミン に結合したシアル酸を必要どする。糖脂質、糖蛋白質及びオリゴサツカライドを 使用する阻害研究は、糖蛋白質及び糖脂質の両方の一トのシアリル化直鎖状又は 分岐鎖状ポリラクトースアミ二ノ配列は、マイコプラズマ　ニューモニエのため のレセプター及び赤血球であるということを示唆した。

ガングリオシドを含む糖脂質はこの場合の接着及び幾つかの他の接着分析を阻害 するけれども〔チャンドラ−（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）他、上ｎ　ｆ　ｅ　ｃ　ｔ　 、　−Ｌ■Ｌ巴且、３８：５９８−６０３．！９８２参照）他の研究者は、結合 性は糖蛋白質によって媒介されるが、しかし糖脂質によって媒介されないと結論 した（ガブリソジ（Ｇａｂｒｉｄｇｅ）他、Ｉｎｆｅｃｔ、１ｍｍｕｎ、２５： ４５５−４５９．１９７９及びギアリー（Ｇｅａｒｙ）他。

Ｉｓｒ、Ｊ、Ｍｅｄ、Ｓｃｉ、２３＋４６２−４６８゜１９７９参照〕。後者の 研究においては、肺線維芽（ＭＲＣ３）細胞からの精製レセプター蛋白質中に全 く見出されなかった。

α２−３結合ンアル酸を含むが、しかしα２−６結合ンアル酸を含まない幾つか の糖蛋白質は、マイコプラズマ　ニューモニエの接着を支持することができ、そ して簡単な二触角状アスパラギンー結合オリゴサツカライドは、接着を効果的に 媒介するために充分であるということが今や判った。阻害研究に基づくと、この 結合特性はスルファチド結合性と異なり、且つ両機構は培養人間細胞への接着に 含まれる。

固定化糖蛋白質へのマ・イコプラズマ　ニューモニエの接着 １５０ｍＭＮａＣ＋、１ｍＭＣａＣＩｚ及び０，０１％Ｎ　ａ　Ｎ　ｓを含むｐ Ｈ７，４の０．０１Ｍ燐酸ナト・リウム緩衝液に溶解した糖蛋白質を、４°Ｃで １６時間インキュベーションすることによりプラスチックのポリ塩化ビニル製８ ６ウエルミクロ滴定プレートに吸着させた。非結合蛋白質を除去し、次いで各ウ ェルをトリス−ＢＳＡを用いて満たし、次いで室温で３０分間インキュベーショ ンした。各ウェルを、ｐＨ７，３のＨＥＰＥＳ２５ｍＭを含むＲＰＭ１１６４０ 、次いで１％ウシ血清アルプミンを用いて洗浄した。（”Ｈ）−パルミテートを 用いて標識したマイコプラズマ　ニューモニエ株Ｍ１２９を。

２６ゲージ針を通して４回回すことによりＲＰＭＩ−ＢＳＡ中に分散させ、次い でこの懸濁液５０μｍを各ウェルに注いだ。３７℃で６０分間インキュベーショ ンした後、各ウェルを生理的食塩水を用いて５回洗浄し、次いで蛋白質に結合し た標識化マイコプラズマ　ニューモニエをアクアソール（Ａｑｕａｓｏｌ）中で シンチレーション計数により定量した。

阻害研究のために、ＲＰＭＩ−ＢＳＡ２５μｍ中の糖質を、ラミニンｌＯμｇ／ ｍｌを用いて被覆した各ウェルに添加し、続いて〔１Ｈ〕−マイコプラズマ　ニ ューモニエ２５μｍを添加した。各阻害濃度及び阻害剤の不存在下において、ラ ミニン被覆及び非被覆ウェルの両方で結合性を三重に決定した。幾つかの実験に おいて、吸着蛋白質はノイラミニダーゼを用いて予備処理した。蛋白質の吸着及 びトリス−ＢＳＡ中のインキュベーションの後、各ウェルを、１５０ｍＭＮａＣ １，５ｍＭＣａＣ１！　、１　ｍ　ｇ／ｍ　１ウシ血清アルブミン及び１ｍＭフ ェニルメタンスルフォニルフルオリドを含むｐＨ５，５の酢酸ナトリウム５０ｍ Ｍを用いて３回濯いだ。各ウェルを、同一の緩衝剤中でノイラミニダーゼ０．０ ５単位／ｍ１を用いて又は酵素を含まない緩衝剤を用いて２０℃で一晩インキユ ベーションした。各ウェルを、トリス−ＢＳＡを用いて３回濯ぎ、次いでマイコ プラズマ　ニューモニエ結合性を上記の如く決定した。

ノイラミニダーゼを用いた消化の前後の固定化蛋白質へのモノクローナル抗体Ｍ ｙ−２８の結合性は、トリス−ＢＳＡ中の腹水の１：１０００希釈液を使用して 決定した。室温で２時間インキュベーションした後、各ウェルをトリス−ＢＳＡ を用いて３回洗浄した。結合抗体は、ヨードケン法（Ｉｏｄｏｇｅｎ　ｍｅｔｈ ｏｄ）により１″ｌｌを用いて標識化したヤギ抗−マウスＩｇＭを使用して検出 した。

Ｗ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞に対するマイコプラズマ　ニューモニエの接着 グラスカバースリップ上のＷ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞に対する標識化マイコプラズマ　 ニューモニエの接着は、前記の如く決定した。阻害研究のために、デキストラン スルフェート及び３′−シアリルラクトースをＲＰＭｌ−ＢＳＡに溶解し、次い でＮａＯＨを用いてｐＨを７．４に調節した。阻害剤を、Ｗ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞を 接着させた洗浄カバースリップ、又は溶媒若しくはトリス−ＢＳＡ中で予備イン キュベージタンしたブランクカバースリップを含む各ウェルに添加した。標識化 マイコプラズマ　ニューモニエを即座に添加し、次いでゆっくり振震しなから３ ７゛Ｃで６分間インキュベーションした。カバースリップを生理的食塩水中に６ 回浸漬することにより洗浄した後、結合したマイコプラズマ　ニューモニエをア クアソール中でシンチレーション計数により決定した。図６において、（”Ｈ） −ｍｉｌ化マイコプラズマ　ニューモニエ（６３００００ｃｐｍ１５ｘｌＯ’　 ＣＣＵ）を、所定濃度でラミニン（・）、フェツイン（○）、ｈＣＧ（■）又は トランスフェリン（ロ）を用いて重複して被覆したミクロ滴定ウェル中でインキ ュベーションした。非結合生物を除去するために洗浄した後、結合したマイコプ ラズマをシンチレーション計数により決定した。非被覆ウェルへの結合は、用い た放射能の３％であった。

ラミニン、フェチュイン、およびｈＣＧを含む数種の糖タンパク質は、第６図に 示すように、プラスチック上に吸着させたときマイコプラズマ・ニューモニエの 線量依存と飽和接着を維持する。典型的には、加えたマイコプラズマ・ニューモ ニエの２０ないし６０％は、飽和タンパク質濃度にてウェルに結合する。非被覆 ウェルへの非特異的結合は適用した放射能総量の０．３ないし３％てあった。結 合はエネルギー依存てあり、そして結合はグルコースを用いないトリスアルブミ ン緩衝液において検出されなかった。しかしながら、大部分のタンパク質は、第 ６図および第３図に示すように、この分析法において不活性である。マイコプラ ズマ・ニューモニエ接着を促進する数種のタンパク質の相対的活性は、線量応答 曲線を比較することにより評価し、そして表ＩＩＩに要約して示す、タンパク質 ラミニン、フェチュイン、トロンポスポンシン、ｈＣＧ、およびｈＣＧのα−サ ブユニットは同様の活性を有しそして１０ｎｇ未満の糖タンパク質て被覆された ウェルへの接着を促進する。グリコホリンおよびα、−酸糖タンパク質は弱い活 性である一方、他のタンパク質は本質的に不活性であり、試験した最も高い水準 にて、１−５ｇｇ／ウェルにて加えたマイコプラズマ・ニューモニエの１０％未 満の結合を促進する。

また吸着タンパク質へのマイコプラズマ・ニューモニエ接着のための基質として 、免疫２微小力価プレートおよび細菌学ポリスチレンを試した。結合が使用プラ スチツクにより変化するけれども、活性糖タンパク質および不活性糖タンパク質 間の差異はすべて三種のプラスチックを用いて一貫して観察した。シ・たかワて 、活性の相違はたぶん活性糖タンパク質の選択的吸着の細工物てはない。

１４７図は固定化糖タンパク質Ｃ結合するマイコプラズマ・ニューモニエについ てのノイラミニダーゼ処理の効果を図示する。微小力価ウェルは、フェチュイン （円形）、ｈＣＧ（四角形）、またはｈＣＧのα−サブユニット（三角形）によ り被覆し、そして１６時間の間酢酸ナトリウム緩衝液中の０．０５Ｕ／ｍ１ノイ ラミニダーゼ（閉し記号）でまたは緩衝液単独（開き記号）て処理した。［３Ｈ ］−ｍ識マイコプラズマ・ニュ・−モニエ結合は上記の通り測定した。

第７図に示すような吸着タンパク質のノイラミニダーゼ処理または吸着（結果は 図示せず、）がすべての結合活性を止める前の溶液中のノイラミニダーゼを用い た前処理のように、活性糖タンパク質との結合はシアル酸を必要とする。また数 種の不活性糖タンパク質はシアル酸を含むか、ヒトトランスフェリン、フィブリ ノゲン、およびプラズマフィブロネクチンにおいて報告された連鎖はα２−６か らガラクトースまてを除外している。ｈｃＧおよび大多数のＮ−結合フェチュイ ンオリゴ糖における連鎖はα２−３である。従って、マイコプラズマ・ニューモ ニエの表面成長したシート培地への赤血球接着についての従来の研究と一致して 、固定化タンパク質上の標識フィコプラズマ・ニューそニュの結合はα２−３結 合シアル酸につき特異的であると思われる。

ｈＣＧを除いて、すべての活性糖タンパクｇＲ１その糖質構造において広範に不 均質性を有するかまたは４分的に特徴付けられた構造のみを有する。ｈＣＧは両 方のサブユニット上に千ノーおよびビーアンテナ（ａｎｔｅｎｎａｒｙ）アスパ ラギン結合オリゴ糖とβ−ユニッ１〜上に４債の〇−結合オリゴ糖のみを含む０ 表ＩＩ＋および第７図に示すように、ｈＣＧのα−サブユニットはマイコプラズ マ・ニューモニエ並びに完全タンパク質と結合するので。

β−サブユニット上の〇−結合糖質は結合を必要としない、従って、α２−３− 結合シアル酸とどアンテナ（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）アスパラギン結合された 糖質はマイコプラズマ・ニューモニエの結合に十分である。

表　Ｉｌ！ プラスチック上に吸着された糖タンパク質に結合するマイコプラズマ・ニューモ ニエタンパク質　相対的結合活性１ ｈＣＧα−サブユニット　０．８ ヒト血小板トロンポスボンシン　０．７ヒト型ＭＭグリコホリン　０．０６ ヒトαビ＃糖タンパク質　０．０３ ニワト・リオボムコイｌ〜　＜０．０１ヒトトランスフエリン　＜ｏ、ｏｉ ヒトプラズマフイブリノゲン　＜ｏ、ｏｉヒトプラズマフィブロネクチン　＜０ ．０１ウシ血清アルブミン　＜０．０１ １・＋３）（）−マイコプラズマ・ニューモニエの結合は０゜００６ないし２μ ｇの各タンパク質てポリ塩化ビニル微小力価つＪルについて測定した。タンパク 質の相対的活性はマイクロプラズマの最大結合の半分を与えるのに必要とされる タンパク質の量により決定し、そして１．０の値を割り当てたフェチュインに対 して表わすこととした。結果は２または３の実験の平均値である。

すべての吸着タンパク質かノイラミニダーゼ処理の後車クローン性抗体Ｍｙ−２ ８と結合しないので、ノイラミニダーゼ処理後の結合の阻害は汚染プロテアーゼ によるものてない、この抗体は、糖脂質および糖タンパク質中に見出されたＮ− アセチルラクトサミン配列を認識する。多くの場合において、抗体結合はノイラ ミニダーゼ消化の後にのみ検出される。約十倍より小さい抗体を結合するところ のグリコホリンを除いて、すべてのアシアログリコプロティンは抗体Ｍｙ−２８ と同様の結合曲線を持つ、すべてのノイラミニダーゼ処理糖タンパク質への抗体 の均一な結合は、すべてのタンパク質が使用条件の下回程度にプラスチック上に 吸着されること、そして固定化タンパク質上のシアリル化Ｎ−アセチルラクトサ ミン配列か抗体とマイコプラズマ・ニューモニエの結合のために近づきやすいこ とを確認するものである。

吸着ラミニンへのマイコプラズマ・ニューモニエの結合は溶解性ラミニンにより 阻害され１表ＩＶに示すように、８０ｇｇ／ｍｌて５０％阻害となる。また結合 は３゛−シアリルラクトースにより相当濃度にて阻害される。６′−シアリルラ クトースは少なくとも１０倍より小さい活性である。ラミニンまたは３−シアリ ルラクトースのいずれも、スルファチドへの付着においてはマイコプラズマ・ニ ューモニエを阻害しない、逆に、デキストランスルフェートはスルファチドへの 結合の潜在的な阻害剤であるか、ラミニン上ての付着について効果を奏しない、 従って、二種の結合特異性はおそらくマイコプラズマ・ニューモニエ病原上に二 個の独立した糖質結合サイトを必要とする。

またフェチュインから遊離したアスパラギン結合オリゴ糖は、表ＴＶに示すよう に、ラミニンへのマイコプラズマ・ニューモニエ結合を阻害する。非分画オリゴ 糖およびコンカナバリンＡ−セファロースについてクロマトグラフィーからの非 結合画分は３°−シアリルラクトースに対して同様の阻害性活性を有する。後者 の両分はフェチュインのトリアンテナ（ｔｒｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）オリゴ糖を 含む、コンカナバリン−Ａカラムからの結合画分は、フェチュインのビアンテナ オリゴ糖を含むべきであるか、約２０倍より活性てあり、１２．Ｍにてマイコプ ラズマ・ニューモニエ結合を５０％阻害する。

表　ＩＶ プラスチック上に吸着されたラミニン またはスルファチドへのマイコプラズ マ・ニューモニエ結合の阻害 支　持　体 阻　害　剤　□ ラミニン　スルファチド ３°−シアリルラクトース　０．３ｍ１ｉ　＞５■閣６°−シアリルラクトース 　＞５　ｍＭ　”　Ｎ、Ｄ。

フェチュインオリゴ＠　Ｏｊ　ｍＶ　Ｎ、Ｄ。

コンカナバリン非結合 フェチュインオリゴ糖　０．０１２■Ｍ　Ｎ、Ｄ。

コンカナバリン結合 ラミニン　８０　ｐｇ／■ｌ　＞２００　ｐｇ／■ｌデキストランスルフェート ＞　２００　ｐｇ／ｍｌ　ｅＯ，５ｐｇ／ｓ１ｍ＝対照結合の５０％阻害を与え る阻害剤の濃度、オリゴ糖濃度は過沃素酸塩−レツルシノール分析法により測定 されたシアリル酸濃度として表わす（１２）。

ｂ：結合は５■關阻害剤にて対照の５４％であった。

Ｃ：結合は２００　ｐｇ／■ｌデキストランスルフェート　Ｍｒｓｏｏ、ｏｏｏ にて対照の１１２％であった。

第９図はヒトアデノガン腫細胞１１ｆ　（Ｗ　ｉ　Ｄ　ｒ　）へのマイコプラズ マ・ニューモニエ接着の阻害を示す、　１３■霞ガラス力バー片上で成長するＷ 　ｉ　Ｄ　ｒ細胞への［３Ｈ］−マイコプラズマ・ニューモニエの接着は、上記 の通り測定した。示した濃度てのデキストランスルフェートまたは３°−シアリ ルラクトースによる阻害は阻害剤を用いずにＲＰＭＩ／ＢＳＡ中で測定した対照 結合に対して算出した。結果は百分率阻害として表わした（平均＝Ｓ、Ｄ。

ｎ＝４、阻害剤を用いない対照結合の測定についてはｎ＝８）。

３−シアリルラクトースは、Ｗ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞を用いた単層へのマイコプラズ マ・ニューモニエ接着を阻害する。

該阻害は、線量依存であるが、ラミニンへの結合を阻害するための１．Ｄ、ｓｏ より十倍より高い濃度にて、対照接着の４０％が残る。同し実験において、デキ ストランスルフェートはマイコプラズマ・ニューモニエ接着の部分的阻害をも与 える。しかし、二種の阻害剤を組み合わせたとき、接着は９０％まてに阻害され る。従って１両方の結合特異性はＷ　ｉ　Ｄ　ｒ細胞への接着に寄与しそしてこ れら細胞へのマイコプラズマ・ニューモニエ接着の完全な阻害は両方の結合機構 についての阻害剤の組合せを使用して達成することかてきる。

上記より解るように、接着性糖タンパク質ラミニンおよびトロンポスボンジンお よび数種の他の糖タンパク質は、プラスチック上に吸着したとき、マイコプラズ マ・ニューモニエの吸着を強く促進する。これら全てのタンパク質の接着活性は それらのオリゴ軸上のシアル酸に依存し、そしてノイラミニダーゼ処理の後先わ れる。これらタンパク質上の全てまたは大部分のシアル酸はガラクトースにα２ −３結合している。ヒトプラズマフィブロネクチンおよびフイブリノゲンにおい てそしてトランスフェリン中の少数のトリアンテナオリゴ糖を除いて、すべての シアル酸はα２−６結合しており、またマイコプラズマ・ニューモニエの結合は 検出されなかった。従って、精製糖タンパク質への結合のためのα２−３結合シ アル酸に対する特異的条件はマイコプラズマ・ニューモニエへの赤崩球の接着に ついての以前の結果と合致する。

いくつかの活性糖タンパク質上のオリゴ糖構造は不均質または部分的にのみ特徴 付けられている一方、ｈＣＧのα−サフユニットは、−個のモノアンテナ（５ｏ ｎｏａｎｔｅｎｎａｒｙ）および−個のビアンテナ　アスパラギン結合オリゴ糖 のみを含み、またより複雑化したオリゴ糖構造を持つ他の糖タンパク質と同様に 活性である。したがって、マイコプラズマ・ニューモニエの接着のための最小構 造は多分末端ガラクトースにα２−３結合したシアル酸を持つ単純なビアンテナ オリゴ糖である。シアリルビアンテナオリゴ糖による強い阻害は、これかマイコ プラズマ・ニューモニエ結合にとって好ましい構造であることを示唆する。これ は多分多くの細胞の表面糖タンパク質上に存在する普通の構造てありそしてシア ル酸−依存マイコプラズマ・ニューモニエ結合を示す多くの細胞種にとって説明 となるものである。

マイコプラズマ・ニューモニエを結合する糖タンパク質のアスパラギン−結合オ リゴ結上て見出され、糖脂質上て生じるのと同し末端配列、５ｉａｌα：ｌ’− ３ＧＡＬβ１−４Ｇ１ｃＮＡｃβ−は、Ｓ層プレート上てまたはプラスチック上 のホスファチジルコリン／コレスプロール単層において糖脂質を固定化したとき マイコプラズマ・ニューモニエの結合をもはや維持しない、該配列の配向は糖脂 質において異なり、このためマイコプラズマ・ニューモニエを結合することか認 められないかまたは無結果に阻害されているか、あるいは糖タンパク質上にのみ 見出される別の糖残基例えばマンノースは高い活性結合か必要とされつる。

ポリラクトサミン配列かマイコプラズマ・ニューモニエ結合にとって必要とされ ることは提案されているか、フェチュインも、トロンポスボンシンも、またはｈ ＣＧもポリラクトサミン配列を有しない、ラミニンは該配列を有するけれども。

さらに、ヒトα１＃糖タンパク質はポリラクトサミン配列を有するか、それらは グリコホリンにおいて積でありかついずれの該タンパク質もマイコプラズマ・ニ ューモニエを十分に結合しない、これは、後二者のタンパク質はフェチュインよ りも良好にマイコプラズマ・ニューモニエへの赤血球接着を阻害するという発見 （Ｌｏｏｓｅｓ等、Ｎａｔｕｒｅ（１，ａｎｄ）：３０７：５６０−５６：１． １９８４参照）と対照をなす、グリコホリンは疎水性領域を含む。

しかしながら、シアル酸−依存の赤血球結合の阻害および熱帯熱マラリア原虫の 部分接合体（ｍｅｒｏｚｏｉｔｅｓ）による優入はグリコホリンの疎水性ペプチ ドの毒性から生しる。グリコホリンに対する“レセプター”はマイコプラズマ・ ニューモニエ膜から遊離するかその結合は完全なりリコホリンによると同様に糖 質に不足するグリコホリンの疎水性ペプチドにより阻害されるので、同様の毒性 はマイコプラズマ・ニューモニエ＃着の阻害にとフて説明となりつる。

フェチュインはウシ胎児血清中の主タンパク質てあり、付着分析法に使用されて きた大部分の細胞種にとっての成長媒質の成分であるのて、プラスチック上に吸 着させたときにマイコプラズマ・ニューモニエを結合するフェチュインの能力は 興味のあるものである。従って、フェチュインはガラス支持体上にまたはＷ　ｉ 　Ｄ　ｒおよび他の細胞の表面上に吸着することかてきそして全てのまたは一部 のシアル酸−依存接着にとって説明となりうる。ウシ胎児血清を含む媒質中て予 備培養したカバーガラスへのマイコプラズマ・ニューモニエの“非特異的”接着 は３゛−シアリルラクトースによって特異的に阻害されるがデキストランスルフ ェートによっては阻害されない、しかし、３゛−シアリルラクトースは　ｔｒｉ ｓ−Ｂ　Ｓ　Ａ中て予備培養されたカバーガラスへの非特異的結合を阻害しｆＪ い。

表ＩＶで示された阻害研究は、マイコプラズマ　ニューモニエがそれぞれ糖タン パク上に硫酸化糖脂質およびα２−８９結合シアリルオリゴ糖類を認める二つの 別個の接着を持つことを示す。結合の際、赤血球シアリルオリゴ糖類に完全に依 存することを根拠にして、後者のレセプターのみが赤血球を結合することを必要 とする。

しかし、スルファチド結合の阻害剤によって培養された細胞系（ｃｅｌｌ　１ｊ ｎｅｓ’）に付着するマイコプラズマ　ニューモニエを阻害し、次いでノイラミ ニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｊｄａｓｅ）で処理することは通常、不十分である 。図９に示されるように３′　−シアリルラクトースとデキストランスルフェー トの効果は相加的であり、はぼ完全な阻害は両方の阻害剤から得られ、両方のタ イプの炭水化物は試験管内でこれらの細胞に接着するためマイコプラズマニュー モニエによって利用されるということが示唆されている。これらの結果に基づい て、どちらかの炭水化物レセプターへの結合阻害剤は宿主の上皮細胞への接着を 妨げることによって感染を防ぐことができそうもないが、二つのタイプの阻害剤 の組み合わせはマイコプラズマ　ニューモニエによる感染を防ぐことができる。

マイコプラズマ　ニューモニエは、特にスルファチドおよびラクトシルスルファ チドとしてガラクトースの硫酸化エステルを含む糖脂質に特異的に結合すること が見いだされた。そしてこの結合はデキストランスルフェートによって試験管で 特異的に阻害されつる。

か（して、不溶性の担体または支持体上に固定された硫酸デキストランまたはＧ ａ１（ＳＯｓ）β１−シーフェンスは、体液または他の溶液中のマイコプラズマ 　ニューモニエまたはマイコプラズマ　ホミヌスを特異的に検出するために、凝 集または酵素結合分析に於いて使用することができる。Ｇａ１（３ＳＯ＜）β１ −シーフェンスまたはデキストランスルフェートは、体液または他の溶液からマ イコプラズマ　ニューモニエまたはマイコプラズマ　ホミヌスを除去するため、 及び感染過程で宿主組織への結合を介在するバクテリア細胞上で成分を親和的に 精製するために使用されつる。

マイコプラズマ　ホミヌスまたはマイコプラズマ　ニューモニエで感染された患 者を処理するため、デキストランスルフェートまたは５Ｏｓ−Ｇａｌ−β−１ｆ セラミドシークエンスを有する化合物は製薬的に許容性の担体に結合され、そし て病原体と結合し、患者の系からそれを除去するために十分な量を患者に投与さ れる。感染に対する好結果の処理が明らかになるまで、その分野の当業者によっ てたやすく決定されるこれらの量は、１日に１患者あたり約０．１グラムから約 ５グラムの範囲である。

本発明の組成物は、有効成分がその目的を達成するための有効量を含有する組成 物を含む。有効量はもちろん、当業者の判断の範囲内で決定される。

活性マイコプラズマ結合化合物に加えて、本発明の製剤組成物は、マイコプラズ マ病原体の感染を処理するため製剤的に使用されつる製剤に、有効成分を加工す ることを促進する賦形剤および補助剤からなる適当な製剤的に許容可能な担体を 含んでよい。

好ましくは、製剤、特に経口で投与され、そして錠剤、糖衣錠およびカプセルの ような投与形態で使用される製剤、及び坐剤のような直腸から吸収される製剤、 ならびに経口または注射による投与に適当な溶液は、賦形剤と一緒に有効成分を 約０．１ないし約９９％、好ましくは約２５−８５％含む。　゛ 本発明の製剤は、それ自身公知の方法、例えば、慣用な混合、粒化、糖衣錠の製 造、溶解または凍結乾燥で製造される。所望ならば、または必要ならば、錠剤ま たは糖衣錠の核を得るため、適当な補助剤を添加後、経口で使用される製剤は、 有効成分を固体賦形剤で結合し、該複合物を加工することにより得られる。

適当な賦形剤は、充填剤、例えば、乳糖、蔗糖、マンニトールまたはソルビトー ルのような糖、セルロース製剤および／またはリン酸三カルシウム並びにリン酸 水素カルシウムのようなリン酸カルシウム、並びにトウモロコシデンプン、小麦 デンプン、イネデンプン、ジャガイモデンプ゛ンのようなデンプンを使用したデ ンプンのり、ゼラチン、トラガントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピ ルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニ ルピロリドンのような結合剤を含む。

所望ならば、分解剤は上記のデンプンおよびカルボキシメチルデンプン、架橋さ れたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸または、アルギン酸ナトリウムの ようなそれらの塩に添加されうる。

補助剤は特に、シリカ、タルク、ステアリン酸またはその塩、および／またはポ リエチレングリコールのような流度調節剤および潤滑剤である。

糖衣錠の核は所望ならば胃液に耐性がある適当なコーティングを施される。この 目的のため、濃縮された砂糖溶液を使用することができ、該溶液は随意に、アラ ビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよび／ま たは二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適当な有機溶媒または溶媒混合物を含み うる。

胃液に耐性を持つコーティングを作るため、アセチルセルロースフタレートまた はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートのような適当なセルロール製 剤溶液が使用される。染料または顔料は、例えば、同定のため、または有効成分 の投与量の異なる組み合わせを特徴付けるため、錠剤または糖衣錠のコーティン グに添加されうる。

経口で使用されつる他の製剤は、ゼラチン製の押出しく　ｐｕｓｈ−ｆｉｔ）カ プセル、並びにゼラチン及びグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤で 作られたソフトでシールされたカプセルを含む。押出しカプセルは、乳糖のよう な充填剤、デンプンのような結合剤および／またはタルクまたはステアリン酸マ グネシウムのような潤滑剤、随意に安定剤で混合されつる粒子の形態で有効成分 を含みことができる。

ソフトカプセルにおいて、有効成分は好ましくは、脂肪油、液体パラフィンまた は液体ポリエチレングリコールのような適当な液体に溶解され、または懸濁化さ れる。

さらに、安定剤が加えられる。

直腸で使用されうる可能な製剤は例えば、支持体ベース中に有効成分の組み合わ せからなる坐剤を含む。適当な支持体ベースは例えば、天然または合成トリグリ セライド、パラフィン炭化水素、ポリエチレングリコールまたはより高級なアル カノールである。さらにベースと有効成分の組み合わせからなる、ゼラチン直腸 用カプセルを使用することもできる。適当なベース材料は例えば、液体トリグリ セライド、ポリエチレングリコールまたはパラフィン炭化水素を含む。

非経口の投与および病気の組織の洗浄に適当な製剤は、水可溶の形態で有効成分 水溶液を含む。さらに適当な油状注射用懸濁液として有効成分の懸濁液は、投与 されうる。適当な親油性溶媒または媒体は、ゴマ油のような脂肪油、またはオレ イン酸エチルまたはトリグリセライドのような合成脂肪酸エステルを含む。水性 注射用懸濁液は、カルボキンメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび ／またはデキストランのような懸濁液の粘度を増加させる物質を含みうる。随意 に、懸濁液は安定剤を含む。

本発明のレセプターを使用して行われる検出方法は、その分野の当業者にたやす く評価されるだろう。フェチュインのようなシアリルオリゴ糖レセプターを含む タンパク質は、ポリスチレンビーズのような固体担体上に固定される。試験液体 に存在するマイコプラズマ　ホミヌスマたはマイコプラズマ　ニューモニエのど れも担体上のシアリルオリゴ糖レセプターに結合するだろう。その後、マイコプ ラズマの存在は、高速ＥＬ　Ｉ　ＳＡ技術における酵素−デキストランスルフェ ート結合体によって、またはラテックス凝集体によって検出される。

本発明で製造される組成物は、マイコプラズマ　ニューモニエまたはマイコプラ ズマ　ホミヌスのようなマイコプラズマ病原体の一つで感染された患者を処理す るために使用される。本発明の組成物は、感染の兆しが現れている時間、患者に 投与される。この期間は当業者によって過度の実験をすることな（決定される。

感染の決定は、患者から得た体液サンプル中の病原体を検出すること、または熱 、震え等の感染の臨床的な発現を試験することからによって行われる。

病気の組織は、組織からマイコプラズマ病原体を除去するため、硫酸デキストラ ンまたはＳＯ，−β−１−ＩＧａｌ−シーフェンスを含有する化合物を含む液体 組成物で洗浄されうる。好ましくは、有効成分をリットルあたり約０゜１ないし ５グラム含む希釈溶液は、生理食塩水のような製剤的に許容可能な担体を含む。

組織中に存在する病原体がもはやないと示されるまで、組織の洗浄は続けられる 。

デキストランスルフェートまたは５Ｏ１−β−１−ＩＧａｌ−シーフェンスを含 む他の化合物は代わりに、ポリスチレンビーズ、ガラスカバープレート、または 類似物のような不溶性担体上に固定され、体液または他の液体中のマイコプラズ マ　ニューモニエまたはマイコプラズマ　ホミヌスを検出するために凝集体また は酵素が架橋された分析物中で使用されつる。

従って、デキストランスルフェートまたは５ＯＩ−β−１１Ｇａｌ−シーフェン スを含む他の化合物は、適当な担体上に固定され、他の分析物を干渉しないよう に、体液からこれらのバクテリアを除去するために使用されうる。この化合物は 担体上に吸着され、体液中に導入され、それによってマイコプラズマ　ニューモ ニエまたはマイコプラズマ　ホミヌスを担体に付着させ、バクテリアを含む担体 を溶液から除去する。

本発明はある特殊な実施例に関して上記に記載される一方、多くの変法が可能で あり、代替材料および試薬が本発明からはずれることなく使用できると理解され るだろう。

幾つかの場合、そのような変法および代用物は幾つかの実験を要求するが、慣例 の試験のみを必要とするだろう。上記の特殊な実施例での記載は、本発明の一般 的な特性を十分に表しているので、他の部分は、現在の知識を使って、一般の概 念からそれることな（、特殊な実施例のような種々の適用法にたやすく修正およ び／または適合させることができる。それゆえ、そのような適合及び修正は、開 示された実施例と同等の手段および範囲内に包含されるべきであると思われる。

ここで使用される表現または用語は、説明の目的のためであり、なんら制限する ものではないと理解されるべきである。

”Ｓ合：　’ｋＦ−＜　Ｚ　＜　：）−１ａう７°マー二＝−＝＝　（ｃｐｍ　 ｘ　’＋Ｏ−２）ｂ含コフちマイコ７１うｒｚ−二＝＝；＝　（ｃｐｍ　ｘ　ｉ ｏ”）細含：＝　２イつｒラス−マー二＝−；；＝　（ｃｐｍ　ｘ　１Ｏ−３） ａ　ｂｃ　ａ　ｂｃｄｅｆ 式を二へ−（Ｉ利−コ４コア８ラス゛°マ・二島−一：：（・／−Ｊ＊５＠：＊ ％ｒ’Ｈｈ？（コア°うｌ−７，二、−％　：　二　（：；ｒｒ＋　Ｘ　１０− ’）ｖＪＸＤｒ　Ｓ、ａＲ２へｒ　Ｃ’−ゴーコイ）７’５７”７＋　＝、−： −：二補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１項）平成３年５月２８ 町ハ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．デキストランスルフェート及びＳＯ■−Ｇａｌβ１−１セラミド構造含有化 合物よりなる群から選択される化合物を含む、マイコプラズマ・ホミヌス及びマ イコプラズマ・ニューモニエよりなる群から選択される病原体のためのレセプタ ー。
2. ２．上記ＳＯ■−Ｇａｌβ１−１セラミド構造含有化合物がスルファチド及びシ アリルオリゴ糖よりなる群から選択される請求項１記載のレセプター。
3. ３．製薬学的に許容できる担体に請求項１記載のレセプターを含む製薬組成物。
4. ４．上記の製薬学的に許容できる担体が水溶性である請求項３記載の組成物。
5. ５．上記の製薬学的に許容できる担体が非水溶性である請求項３記載の組成物。
6. ６．試料と請求項１記載のレセプターとを接触させ、上記試料を上記レセプター と共に上記試料が上記レセプターに結合するのに充分な時間培養し、そして上記 試料から上記レセプターを除去することからなる、上記試料からのマイコプラズ マ・ホミヌス及びマイコプラズマ・ニューモニエよりなる群から選択される病原 体の除去方法。
7. ７．上記レセプターが固体の非水溶性担体に担持されている請求項６記載の方法 。
8. ８．下記患者に請求項３記載の組成物の有効量を投与することからなるマイコプ ラズマ・ホミヌス及びマイコプラズマ・ニューモニエよりなる群から選択される 病原体で感染された患者を処置する方法。
9. ９．適当な担体上にフェチュインを固定し、分析すべき試料に固定化フェチュイ ンを接触させ、そして酵素−デキストランスルフェート結合体を用いて病原体の 存在を検知することからなるマイコプラズマ・ニューモニエ及びマイコプラズマ ・ホミヌスよりなる群から選択される病原体の検知方法。
10. １０．請求項３記載の組成物の有効量を宿主に投与することからなる、マイコプ ラズマ・ニューモニエ及びマイコプラズマ・ホミヌスよりなる群から選択される 病原体の宿主内への感染を予防する方法。
11. １１．下記病理組織に請求項３記載の組成物を接触させることからなる、マイコ プラズマ・ニューモニエ及びマイコプラズマ・ホミヌスよりなる群から選択され る病原体で感染された病理組織の処置方法。