JPS5840301A - 抗腫瘍活性を有するβ−１，３−グルカン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３−グルカンに関し、その目的とするところは医薬とし
て有用な新規β−１，３−グルカンを提供することにあ
る。

本発明のβ−１．３−グルカンは下記繰返し単位 （式中一ほ１ｔたは４であり、ｎはＯまたは１である、
ただし■が１のと舎ｎは０であり、■が４のときｎは！
である、Ｇｌｕはグルコビラノース残基を表わす）から
なる高分子多糖体であり、盤菌綱（　ｔｌｉｓｏｏ■ｙ
ｅ＠ｓφ１）のくるちゃわんたけ属（　Ｐ＊＊ｕｓｌｏ
ｐｌｓｏｔａｎｉａ　）に属する微生物の子取すること
がで舎る。

本発明の上記／−　１　、　３−グルカンは、同種移植
腫瘍系に対して強力な抗腫瘍活性を示すだけでなく、公
知の７−　１　、　３−グルカンては有効性が報告され
ていない同種移植腫瘍系に対しても著しく強い抗腫瘍活
性を示し、更に比較的免疫感受性の低いザルコーマ−１
　８　０　−Ｃ３Ｈ／Ｉｌ・系朧瘍１ζ対しても極めて
強い抗腫瘍活性を示す。

従来より、抗腫瘍活性を有する／−１．３−グルカンに
ついてはｍ−（の研究がなされておリ、その中でグルカ
ンの構−造が報告されているものは以下のとおりである
。

（１）シゾフィラン：スエヒロタケの生産するβ−１，
３−グルカン（日本農芸化学会誌第４４巻、第３３７頁
〜第３４２頁１９７ｏ年：同第４５巻、第１６２頁〜第
１６８頁１９７１年） （２）キクラゲ属の生産するβ−１，３−グルカン（特
開昭５４−６３０１２号） （３）レンチナン：イイタケの生産するβ−１，３−グ
ルカン（「癌と免疫増強」千原呉部着＃Ｒ談社発行、１
８５１頁、１９８０年：ネイチ１−第２２２１！１１１
６８７１〜％６８８１１９６９年：カーボハイドレｔ＜
・リサーチ１４４７巻、第９９頁〜第１０４頁、１９７
６年） 上記公知のβ−１，３−グルカンも本発明のβ−１，３
−グルカンも何れもβ−１，３−結合を主鎖とし、グル
コビラノース１個の長さのβ−１，６−結合分枝を有す
る高分子グルカンであるが、上記各構造式から明らかな
ように本発明のβ−１，３−グルカンは公知のβ−１゜
３−グルカンと較べ主鎖のβ−１，３−結合数に対する
β−１，６−結合分校数の比率がそれぞれ異なっており
、本発明番こより初めて明らかｋされた新規β−１，３
−グルカンである。

ｔた本発明のβ−１，３−グルカンは動物実験による抗
ＩＩＩｇｓ活性において、開脚移植腫瘍系に対しては勿
論、上記公知のβ−１，３−グルカンでは有効性の報告
さ植でいない同系移＃ａ粋瘍系に対しても著しく強い活
性を示し、更に比較的免疫感受性の低いザルコー？　−
１８０−Ｃ３Ｈ／Ｈ・系腫瘍番こ対しても極めて強い抗
腫瘍活性を示すものであり、癌の免疫療法剤としての有
効性は公知のβ−１，３−グルカンと較べ極めて高いこ
とが期待される。

次ｉこ本発明のβ−１，３−グルカンの構造および性質
に関し、て説明する。

（１）構造 式（Ｉ）に示したとおりであり、本構造は以下番こ示す
実験により確認されたものである。

（、）本多糖体をバシデイオマイセテＱＭ８０６（ｌａ
ｓ１ｄｉｏｍｙａ＊ｔ＠Ｑ　Ｍ　１３　Ｑ　（３、）の
産生ずるエキソ−β−１，３−グルカネースと作用させ
、その分解産物をペーパークロマトグラフィーで同定し
たところグルコースとゲンチオビオースが得られた。こ
の分解産物をパイ？ゲル−ｐ−２，４００メツシユでゲ
ル濾過し、グルコースとゲンチオビオースに分画し、そ
の七Ｎ比を測定したところほぼ１：１または１：０．８
であった。

（ｂ）本多糖体をメチル化し、メチル誘導体を加水分解
したのち、ペーパークルマドグラフィー詔よびガスクロ
マトグラフィーで分析した結果、２，３，４．６−チト
ラーＯ−メチルー°Ｄ−グルコース、２，４．６−）ジ
−０−メチル−ｐ−グルコースおよび２゜４−ジー０−
メチル−Ｄ−グルコースが検出され、それぞれのモル比
がほぼ１：１：１または０．８　：　１　：　０．８の
割合で生成し九（ａ）本多糖体を０．０５Ｍの過沃素酸
！完全に酸化すると構成糖当り０．３４４モルのギ酸が
生成し、０．６６７モルの過沃素酸が消費された。

０）本多糖体の過沃素酸酸化物をスミス分解法に従い水
素化硼素す２ウムで還元後、酸で加水分解すると、グリ
セリンとグルコースがほぼ１：２．１のモル比で生成し
た。

←）上記還元物を０．０３モルの硫酸で緩和加水、分解
すると、グリセリψの他に水不溶性の石油エーテル、エ
ーテル、アセトン、ベンゼン、エタノール、メタノール
等の有機溶媒に不溶。

（１ａ）呈色反応 モーリッシュ反応、アンスロン反応に陽性、ヨードデン
プン反応、バイアル反応、ニンヒドリン反応、エルソン
ーモ、ルガン反応、カルバゾール−硫酸反応番こ陰性。

（１１）水溶液のｐＨ 中性付近。

（１の外観 白色の粉末。

（１３）構成糖 Ｄ−グルコースのみ（Ｐ、Ｐ、Ｃ、Ｔ、Ｌ、Ｃ。

Ｇ、Ｌ、Ｃおよびグルコースオキシブニスにより確認）
。

以上に述べた如く、本発明のβ−１，３−グルカンは式
〔！〕の構造を有し、■）〜（１３）項の理化学的性質
を有する新規なβ−１，３−グルカンである。

次に本゛発明の／−１、３−グルカンの抗腫瘍性につき
、マウスを用いた動物実験の実験例により説明する。一
連の動物実験は特記した以外は常法番こより行なった。

実験例　１ 本発明の７−１　、３−グルカンを用い、ザルコーマ−
１８０−ＩＣＲ系に対する抗腫瘍活性を検定した。その
結果を第１表に示した。

第　　　１　　　表 移植細胞数：　４Ｘ１０・個／マウス マウス：　ＩＣＲ系♀ 投与：Ｍ腔内、腫瘍移植後１日目から隔日に１回×５回 判定：腫瘍阻止率−一（τ−亨）／Ｔｘ１ｏ。

Ｃ：対照群の平均腫瘍重量 〒：治療群の平均腫瘍重量 実験例　２ 実験例１と同様−こして本発明によるβ−１゜３−グル
カンノザルコ−７−１８０−Ｃ３Ｈ／Ｉｓ系、エールリ
ッヒ固形癌−ＩＣＲ系および誠・ｔｈＡ　−ＢＡＬＢ１
０系番ど対する抗腫瘍活性を検定した。

その結果をそれぞれ第２表、第３表および第４表番ζ示
した。

第　　　２　　　　表 移植細胞数：４Ｘ１０儂個／マウス マウス：Ｃ＄−Ｈ／Ｈ・♀ 投与：腹腔内、腫瘍移植後１日目から隔日に１回×１０
回 判定：腫瘍移植後５週日 第　　　３　　　表 移植細胞数：４Ｘ１０・個／マウス マウス：　ｒｃ＊系９ 投与：腹腔内、障瘍移植後１日目から隔日に１回×８回 判定：膣瘍移Ｍ５Ｊ目 第　　　４　　　表 移植細胞数：ｌＸ１０−個／マウス マウス：　Ｂ　ＡＬ　Ｂ　／　ａ系９ 投与：腫瘍内、腫瘍移植後１ロ目から隔日に１回×１０
回 判定：腫瘍移植後５週日 実験例　３ 実験例１と同様にして本発明によるβ−１゜３−グルカ
ンのエールリッヒ腹水癌−ＩＣＲ系に対する抗腫瘍活性
を検定した。その結果を第５表に示した。

第　　　５　　　　表 移植細胞数：５Ｘ１０暴個／マウス マウス：　ｔｃｙｔ系♀ 投与：腹腔内、重傷移植後１日日から毎日１回×１０回 判定：腫瘍移植後７週日におけるマウス生存区数ａよび
平均生存日数で示した。

以上の実験例により示した如く、本発明のβ−１，３−
グルカンはザルコーマ−１ｆ３　Ｑ　、　ＩＣＲ系等の
同種移植朧瘍系に対しては勿論のこと、公知のβ−１，
３−グルカンでは有効性５の報告されていないＭｏｔｈ
　　＾−３ムＬＢ１０系の同系移植重傷系に対しても極
めて強い抗腫瘍活性を示し、更に比較的免疫感受性の低
い腫瘍系のザルコーマ−１８０−０３１１／Ｉｔｓ系に
対しても着しく強い抗腫瘍活性を示すことが判明した。

なお本発明のβ−１，３−グルカンの急性毒性をマウス
化膿腔内投与して検べたところＬＤ５０はｔｏｏｏｇｖ
／Ｑ以上であった。

本発明のβ−１，３−グルカンは特１ｉ１８５Ｂ−３２
７９７号に記載された方法により作ることができる。即
ちくるちゃわんたけ属に属する微生物の子実体または培
養菌体を水性溶媒で抽出して得だ一抽出液もしくは上記
微生物を培養して得た培養ｐ液から塩析、溶媒沈澱、透
析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー等の手段
を単独あるいは適宜組み合わせて分離精製することによ
り容易に採取することができる。上記くろちゃわんたけ
属に属する微生物としては例えばくろちゃわんたけ（Ｐ
ｓｓｕｄｏｐｌ＊ａｔａｎｉａｎｉｇｒｓｌｌａ　（Ｐ
＠ｒｓ　）　Ｆｕｏｋ＊１　〕Ｋ　−１４２５株（微工
研菌寄第５８０３号）がある。

くるちゃわんたけに−１４２６株を培養する際の培地お
よび培養条件としては通常の微生物の培養に用いられる
手段を応用することができる。即ち培地としては上記菌
株の利用可能な炭素源、窒素源、無機塩等を適当量含有
するものであれば良く、培養の初発ｐＨは２〜９が、培
養温度は１５〜３５℃が適当である。通気攪拌培養を行
なう場合は、通気量は０１〜２，０１７１・分、攪拌速
度は３０〜５００　ｒｐ−の条件が好ましい。

培養時間は培地条件、培養条件により異なるが、目的と
するβ−１，３−グルカンの生産量が最高に達した時点
で培養を終了させる。のが有利である。

上記の如くして得た培養液から濾過等の手段によって培
養菌糸体と培養Ｆ液に分け、培養菌（糸体は水性溶媒で
抽出して抽出液となし、培養ｐ液はそのままで用い、前
述した分離精製手段を施すことにより本発明のβ−１，
３−グルカンが白色の粉末として採取される。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例　１ グルコース２．０％、コーンスチーフリカー０．５哄、
大豆粉ｏ、　ｉ嘴、酵母エキス０．１噂、ＫＨ，ＰＯ４
０，１％、Ｍｇ８０４・７ＪＯ０，０５％からなる液体
培地（ｐＨ５，６）　１００ｍを５００ｄ容のヒダ付三
角フラスコに分注し綿栓を付した後、１２０℃で２０分
間殺菌した。冷却後、これに別にグルコース２．０％、
エビオス０．５％、寒天１．５嘔からなる培地に斜面培
養して奢いたくるちゃわんたけ（Ｐｓ＠ｕｌｏｐｌ＠ａ
ｔａｎ口ｎ１ｇｒ＠ｌｌａ　（Ｐａｒｓ　）デｕａｋ・
１］に一１４２６株の菌糸を接種し、・２７℃で１０日
間振盪培養して種菌とした。別に３゜ｌ容ジャー・ファ
ーメンタ−に前記の組成の液体培地２０１を分注し、１
２０℃で２０分間殺菌し、上記種菌を接種して２７℃、
１２日間、通気量０−５１　／　ｔ　・ｍ　ｉ　ｎ　ｓ
攪拌２２０　ｒｐｍの条件下で通気攪拌培養を行なった
。培養終了後培養液を濾過し菌糸体１３０ｇ（乾物）と
培養ｐ液１７／を得た。

実施例　２ 実施例１で得た培養菌糸体１３０’９に水１５１を加え
、１２０℃で３０分間加熱抽出し、濾過して抽出液と抽
出残渣とに分離し、抽出残渣からの再抽出を、上記と同
様の手段で２回繰返して行ない抽出液４３１を得た。こ
の抽出液を約１容ま去濃縮し、濃縮液に等量゛の一タノ
ール１０　　　　　　　・ を加えて多糖体を沈澱させて分離し、これに少量の水を
加えて溶解した後透析した。透析内液をＤＩＡＩ−セフ
ァデックスて処理して非吸着区分を得、この区分をさら
に５ｐ−ｂファデックスで処理して非吸着区分を得、こ
れを再び透析し凍結乾燥して白色の粉末８．６２を得た
。

このものは前記（ａ）〜（ｆ）の実験により、前記式ｒ
ｌＪの繰返し単位を有するβ−１，３−グルカンである
ことが同定された。平均分子量は約１００万であった（
ゲル濾過法による）。

実施例　３ 実施例１で得た培−戸液１７１を実施例２の菌糸体抽出
液と同様に処理して白色の粉末１３，２このものは前記
（ａ）〜「）の実験により、前記式（１）の繰返し単位
を有するβ−１，３−グルカンであることが同定された
。平均分子量は約１００万であった（ゲル濾過法による
）。

本物質の赤外吸収スペクトルはｇＪ１図に示したとお−
りである。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例３の本発明による物質東赤外吸収スペク
トルである。 特許出願人　　寅洒造株式会゛社 第１頁の続き ０発　明　者　大林晃 大津市瀬田３丁目４番１号責酒 造株式会社中央研究所内 ０発　明　者　田辺脩 大津市瀬田３丁目４番１号賓酒 造株式会社中央研究所内 ０発　明　者　佐々木琢磨 ゛　　東京都目黒区東が丘２丁目５番２８号国立癌セン
ター東が丘ＲＧ 宿舎４０１ （自発）手続補正書 昭和５６年１０月昏１日 特許庁長　官島　１）春樹殿 １、事件の表示　昭和５６年特許願第１３９０３９号２
、発明の名称 抗腫瘍活性を有するβ−１，３−グルカン３、補正をす
る者 事件との関係　　特許出願人 ＼ｋｋｋ ′１ｆ＆＼名称　　賓酒造株式会社 ４、代理人 明　　細　　書 ６、補正の内容 明細書の浄書（内容に変更なし） ７、添付書類目録 明細書（浄書したもの）　　　　ｌ禰 （自発）手続補正書 特許庁長官島　１）春樹殿 １、事件の表示　　昭和５６年特許願第１３９０３９号
２、発明の名称 抗Ｍ活性を有するβ−１，３−グルカン３、補正をする
者 事件との関係　　特許出願人 一＼！＆ｈ＾ ４、代理人 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 （１）昭和５６年１０月２日付手続補正書による訂正明
細書第１Ｏ頁末行、 ［判定：１ＩＩＩ蛎阻止率（憧＝（τ−７）７石Ｘ１０
０Ｊを［判定二緒瘍移植後４週日　−− 腫ｈａ！Ｉ４止咽−＝τ−？　）／ＣＸＩ　ＯＯＪとｉ
ｌｌ正する。 以

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. である、ただし−が１のときｎはＯであり、Ｉが４のと
   きｎは１である、０１ｕはグルコビラノース残基を表わ
   す）からなるβ−１，３−グルカン。