CN115057949A - 从火龙果茎中提取的活性多糖类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于多糖制备技术领域，具体涉及从火龙果茎中提取的活性多糖类化合物，所述活性多糖类化合物的组分化学结构式为：
Figure DDA0003760195960000011
所述活性多糖类化合物的分子量为134.282kDa；所述活性多糖类化合物为摩尔比为1.00:11.94:3.05的鼠李糖、半乳糖和半乳糖醛酸组成的化合物。本发明还提供上述活性多糖类化合物的制备方法及其在抗肝癌药物中的应用。本发明制备活性多糖类化合物的步骤简单，且制备得到的活性多糖类化合物具有较佳的抗肝癌活性。

Description

从火龙果茎中提取的活性多糖类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于多糖制备技术领域，具体涉及从火龙果茎中提取的活性多糖类化合物及其制备方法。
背景技术
火龙果茎为火龙果多年生肉质植株，绿色，茎蔓呈三角柱形，攀附在墙壁、水泥柱上，每段茎节凹陷处各生有短刺1～3枝。火龙果茎具有生长迅速、分枝能力较强等特点，一年可长7～10cm。在火龙果种植过程中为加快其生长并保证果实品质，一般仅保留一根主茎，需要不断修剪分枝，产生了许多的火龙果茎资源。火龙果茎中含有植物多糖以及多种矿物质元素、维生素E和甾醇等物质，其中植物多糖含量最高，占干品的7-8％左右。火龙果茎含有丰富的营养成分，具有特殊的生理功能，其开发利用前景广阔，潜在价值高。将火龙果茎直接丢弃不仅造成宝贵资源的浪费，还会污染环境。
植物多糖是由单糖通过糖苷键结合的糖链。植物多糖能够调节机体免疫功能，还具抗肿瘤等作用，相比临床常用的抗癌药物，植物多糖具有对细胞毒性作用较小的优势。但是由于多糖本身结构的复杂性，难以阐明有效成分的化学结构与这些功能活性之间的关系，以及其作用机制难以明确等原因，阻碍了多糖类药物或保健品的开发。
目前，火龙果茎的研究主要集中于火龙果茎多糖的提取和结构鉴定，国内外鲜见对火龙果茎多糖功能活性的研究报道。鉴于此，研究火龙果茎的功能性多糖，并将其开发成具有抗肝癌功效健康食品，解决了火龙果副产物综合利用度不高、火龙果产业链条短等问题，还为消费者提供更多选择。
发明内容
本发明旨在解决上述技术问题，提供从火龙果茎中提取的活性多糖类化合物，该活性多糖类化合物具有较强的抗肝癌活性。
本发明的技术方案为：
本发明的从火龙果茎中提取的活性多糖类化合物，所述活性多糖类化合物的组分化学结构式为：
Figure BDA0003760195940000021
本发明的所述活性多糖类化合物的分子量为134.282kDa。
本发明的所述活性多糖类化合物为摩尔比为1.00:11.94:3.05的鼠李糖、半乳糖和半乳糖醛酸组成的化合物。
本发明还提供所述从火龙果茎中提取的活性多糖类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料预处理：取新鲜的火龙果茎，洗净，去除有疤痕的果茎后切块，打浆，得火龙果茎浆料，按照固液比1g:30-50mL向火龙果茎浆料中加入体积分数为90％乙醇溶液(除去色素、脂类等杂质)，过滤，收集固体物，冷冻干燥，得到预处理火龙果茎粉末；
(2)低共熔溶剂溶液制备：将甜菜碱、香叶醇按摩尔比为1.0-1.5:3.0-3.5的比例混合，得到低共熔溶剂，向低共熔溶剂加入蒸馏水，得到低共熔溶剂溶液，备用；
(3)多糖提取：将步骤(1)得到的预处理火龙果茎粉末与步骤(2)得到的低共熔溶剂溶液充分混合均匀，得到混合物；将混合物超声提取后，在6000-8000rpm/min条件下离心15-20min，收集和浓缩上清液，得到浓缩液；
(4)多糖醇沉：向浓缩液中按照体积比1:3-4，加入无水乙醇并在4℃环境中静置20-24h进行第一次醇沉，过滤，得到火龙果茎粗多糖；
(5)多糖分离：采用离子交换柱对火龙果茎粗多糖进行初步分离，按顺序依次以超纯水及浓度为0.2M、0.5M和1.0M的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为1-2mL/min；根据洗脱曲线选取质量最多的多糖组分洗脱峰段，按峰对洗脱液进行合并收集，旋蒸浓缩后经3-3.5kD超滤膜透析3-4天，冷冻干燥备用；
(6)多糖纯化：按照固液比1g:40-50mL向步骤(5)得到的质量最多的多糖组分加入超纯水溶解，通过全自动凝胶纯化系统进行纯化，收集对称峰对应的收集液，将收集液透析，通过旋转蒸发仪进行浓缩，得到火龙果茎多糖组分浓缩液；
(7)多糖二次醇沉：向步骤(6)的火龙果茎多糖组分浓缩液中按照体积比1:3加入无水乙醇并在4℃环境中放置16-20h进行第二次醇沉，过滤，收集沉淀物；
(8)多糖干燥：将步骤(7)收集的沉淀物冷冻干燥，即得活性多糖类化合物。
本发明低共熔溶剂自身的粘度较大，对于本发明的活性多糖类化合物提取不利，优选地，本发明所述步骤(2)中，向低共熔溶剂加入蒸馏水，得到含水量(质量)为30％-40％的低共熔溶剂溶液。本发明通过加入蒸馏水能够有效降低低共熔溶剂粘度，并且改变低共熔溶剂中的液体结构，有效提高提取率，但是含水量超过40％，由于含水量过高，溶剂更多地呈现水的性质，会导致本发明的活性多糖类化合物提取率降低。
优选地，本发明所述步骤(3)中，将步骤(1)得到的预处理火龙果茎粉末与步骤(2)得到的低共熔溶剂溶液按固液比为100-120g:1L的比例充分混合均匀。如果固液比超过120g:1L，可能会造成提取的产物浓度过高而抑制产物的提取，造成提取率降低，如果固液比低于100g:1L时，溶液粘度大，产物不易扩散，会降低提取率。
为使得本发明的活性多糖类化合物具有更好的抗肝癌活性，本发明的低共熔溶剂采用甜菜碱和香叶醇混合，优选地，本发明所述甜菜碱、香叶醇按摩尔比为1.2:3.2。当改变甜菜碱和香叶醇的比例时，会影响活性多糖类化合物的的提取率。
为了提高活性多糖类化合物的提取率，所述步骤(3)中，浓缩上清液至原溶液体积的1/3-1/4倍。
超声提取时，适宜的提取温度和提取时间，能够提高活性多糖类化合物的提取率，优选地，本发明所述步骤(3)中，将混合物于55-65℃下超声提取60-80min。在超声提取时，如果提取温度低于55℃，提取率较差，如果提取高于65℃，由于加热温度过高，可能造成本发明的活性多糖类化合物结构遭到破坏，导致提取率降低。同时，在超声提取时，如果提取的时间低于60min，由于提取时间不够，导致提取不充分，会降低本发明的活性多糖类化合物提取率，如果提取时间超过80min，由于提取时间过长，造成提取产物长时间暴露在空气下而被氧化，降低本发明的活性多糖类化合物提取率。
本发明从火龙果茎中提取的活性多糖类化合物在抗肝癌药物中的应用。当活性多糖类化合物的浓度越高，对肝癌细胞的抑制能力越强。本发明的活性多糖类化合物在抗肝癌药物中的应用时，所述活性多糖类化合物的浓度优选为100-1000μg/mL。
由于采用上述技术方案，本发明的有益效果为：
1、本发明利用特定的低共熔溶剂溶液对预处理火龙果茎粉末进行靶向提取，获得本发明的活性多糖类化合物，且具有较高的提取率，同时也降低了能耗，制备工艺简单，操作方便。
2、本发明的火龙果茎是火龙果种植过程中产生的，基本作为废料处理，不仅浪费资源而且增加处理肥料的成本，在作为肥料处理过程中，如果处理不当，还会污染环境，而本发明以火龙果茎为原料提取，能够变废为宝，充分利用资源，提高火龙果种植产业的附加价值。
3、通过本发明方法制备得到的活性多糖类化合物具有较佳的抗肝癌活性，为制备具有抗肝癌功效药物、健康食品提供更多选择。
附图说明
图1为本发明实施例1中步骤(4)的火龙果茎粗多糖DEAESepharoseFastFlow洗脱图。
图2为本发明实施例1中活性多糖类化合物的相对分子质量分析图。
图3为本发明实施例1中活性多糖类化合物的单糖组成分析图。
图4为本发明实施例1中活性多糖类化合物的红外光谱图。
图5为本发明实施例1中活性多糖类化合物的GC-MS色谱图。
图6为本发明实施例1中活性多糖类化合物的1H NMR谱图。
图7为本发明实施例1中活性多糖类化合物的13C NMR谱图。
图8为本发明实施例1中活性多糖类化合物的DEPT135图谱
图9为本发明实施例1中活性多糖类化合物的1H-1H COSY图谱。
图10为本发明实施例1中活性多糖类化合物的HSQC图谱。
图11为本发明实施例1中活性多糖类化合物的HMBC图谱。
图12为本发明实施例1中活性多糖类化合物的NOESY图谱。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)原料预处理：取新鲜的火龙果茎，洗净，去除有疤痕的果茎后切块，打浆，得火龙果茎浆料，按照固液比1g:40mL向火龙果茎浆料中加入体积分数为90％乙醇溶液，过滤，收集固体物，放入超声辅助真空冷冻干燥机冷冻干燥，得到预处理火龙果茎粉末；
(2)低共熔溶剂溶液制备：将甜菜碱、香叶醇按摩尔比为1.2:3.2的比例混合，得到低共熔溶剂，向低共熔溶剂加入蒸馏水，得到含水量为35％的低共熔溶剂溶液，备用；
(3)多糖提取：将步骤(1)得到的预处理火龙果茎粉末与步骤(2)得到的低共熔溶剂溶液按固液比为110:1(g/L)的比例充分混合均匀，得到混合物；将混合物超声提取后，在7000rpm/min条件下离心18min，收集和浓缩上清液至原溶液体积的1/3倍，得到浓缩液；
(4)多糖醇沉：向浓缩液中按照体积比1:3加入无水乙醇并在4℃环境中静置22h进行第一次醇沉，过滤，得到火龙果茎粗多糖；
(5)多糖分离：采用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱对火龙果茎粗多糖进行初步分离，按顺序依次以超纯水及浓度为0.2M、0.5M和1.0M的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为1mL/min；根据洗脱曲线选取质量最多的糖组分洗脱峰段，按峰对洗脱液进行合并收集，旋蒸浓缩后经3kD超滤膜透析3天，冷冻干燥备用；上述分离共获得PSP-W、PSP-0.2M、PSP-0.5M和PSP-1.0M四个多糖组分，其中PSP-0.2M多糖组分得率最高，为5.6％；
(6)多糖纯化：按照固液比1g:45mL向步骤(5)得到的PSP-0.2M多糖组分加入超纯水溶解，通过全自动凝胶纯化系统进行纯化，收集对称峰对应的收集液，将收集液透析，通过旋转蒸发仪进行浓缩，得到火龙果茎多糖组分浓缩液；
(7)多糖二次醇沉：向步骤(6)的火龙果茎多糖组分浓缩液中按照体积比1:3加入无水乙醇并在4℃环境中放置18h进行第二次醇沉，过滤，收集沉淀物；
(8)多糖干燥：将步骤(7)收集的沉淀物放入真空冷冻干燥机冷冻干燥，即得活性多糖类化合物，提取率87.2％。
实施例2
(1)原料预处理：取新鲜的火龙果茎，洗净，去除有疤痕的果茎后切块，打浆，得火龙果茎浆料，按照固液比1g:30mL向火龙果茎浆料中加入体积分数为90％乙醇溶液，过滤，收集固体物，放入超声辅助真空冷冻干燥机冷冻干燥，得到预处理火龙果茎粉末；
(2)低共熔溶剂溶液制备：将甜菜碱、香叶醇按摩尔比为1.0:3.0的比例混合，得到低共熔溶剂，向低共熔溶剂加入蒸馏水，得到含水量为30％的低共熔溶剂溶液，备用；
(3)多糖提取：将步骤(1)得到的预处理火龙果茎粉末与步骤(2)得到的低共熔溶剂溶液按固液比为100:1(g/L)的比例充分混合均匀，得到混合物；将混合物超声提取后，在8000rpm/min条件下离心15min，收集和浓缩上清液至原溶液体积的1/4倍，得到浓缩液；
(4)多糖醇沉：向浓缩液中按照体积比1:3加入无水乙醇并在4℃环境中静置20h进行第一次醇沉，过滤，得到火龙果茎粗多糖；
(5)多糖分离：采用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱对火龙果茎粗多糖进行初步分离，按顺序依次以超纯水及浓度为0.2M、0.5M和1.0M的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为2mL/min；根据洗脱曲线选取质量最多的糖组分洗脱峰段，按峰对洗脱液进行合并收集，旋蒸浓缩后经3.5kD超滤膜透析4天，冷冻干燥备用；上述分离共获得PSP-W、PSP-0.2M、PSP-0.5M和PSP-1.0M四个多糖组分，其中PSP-0.2M多糖组分得率最高，为6.1％；
(6)多糖纯化：按照固液比1g:40mL向步骤(5)得到的PSP-0.2M多糖组分加入超纯水溶解，通过全自动凝胶纯化系统进行纯化，收集对称峰对应的收集液，将收集液透析，通过旋转蒸发仪进行浓缩，得到火龙果茎多糖组分浓缩液；
(7)多糖二次醇沉：向步骤(6)的火龙果茎多糖组分浓缩液中按照体积比1:3加入无水乙醇并在4℃环境中放置16h进行第二次醇沉，过滤，收集沉淀物；
(8)多糖干燥：将步骤(7)收集的沉淀物放入真空冷冻干燥机冷冻干燥，即得活性多糖类化合物，提取率89.2％。
实施例3
(1)原料预处理：取新鲜的火龙果茎，洗净，去除有疤痕的果茎后切块，打浆，得火龙果茎浆料，按照固液比1g:50mL向火龙果茎浆料中加入体积分数为90％乙醇溶液，过滤，收集固体物，放入超声辅助真空冷冻干燥机冷冻干燥，得到预处理火龙果茎粉末；
(2)低共熔溶剂溶液制备：将甜菜碱、香叶醇按摩尔比为1.5:3.5的比例混合，得到低共熔溶剂，向低共熔溶剂加入蒸馏水，得到含水量为40％的低共熔溶剂溶液，备用；
(3)多糖提取：将步骤(1)得到的预处理火龙果茎粉末与步骤(2)得到的低共熔溶剂溶液按固液比为120:1(g/L)的比例充分混合均匀，得到混合物；将混合物超声提取后，于6000rpm/min条件下离心20min，收集和浓缩上清液至原溶液体积的1/3倍，得到浓缩液；
(4)多糖醇沉：向浓缩液中按照体积比1:3加入无水乙醇并在4℃环境中静置24h进行第一次醇沉，过滤，得到火龙果茎粗多糖；
(5)多糖分离：采用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱对火龙果茎粗多糖进行初步分离，按顺序依次以超纯水及浓度为0.2M、0.5M和1.0M的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为1mL/min；根据洗脱曲线选取质量最多的糖组分洗脱峰段，按峰对洗脱液进行合并收集，旋蒸浓缩后经3kD超滤膜透析3天，冷冻干燥备用；上述分离共获得PSP-W、PSP-0.2M、PSP-0.5M和PSP-1.0M四个多糖组分，其中PSP-0.2M多糖组分得率最高，为5.9％；
(6)多糖纯化：按照固液比1g:50mL向步骤(5)得到PSP-0.2M多糖组分加入超纯水溶解，通过全自动凝胶纯化系统进行纯化，收集对称峰对应的收集液，将收集液透析，通过旋转蒸发仪进行浓缩，得到火龙果茎多糖组分浓缩液；
(7)多糖二次醇沉：向步骤(6)的火龙果茎多糖组分浓缩液中按照体积比1:3加入无水乙醇并在4℃环境中放置20h进行第二次醇沉，过滤，收集沉淀物；
(8)多糖干燥：将步骤(7)收集的沉淀物放入真空冷冻干燥机冷冻干燥，即得活性多糖类化合物，提取率86.9％。
对比例1
与实施例1不同的是：向低共熔溶剂加入蒸馏水，得到含水量为50％的低共熔溶剂溶液；
(5)多糖分离：采用DEAESepharose Fast Flow离子交换柱对火龙果茎粗多糖进行初步分离，按顺序依次以超纯水及浓度为0.2M、0.5M和1.0M的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为1mL/min；根据洗脱曲线选取质量最多的糖组分洗脱峰段，按峰对洗脱液进行合并收集，旋蒸浓缩后经3kD超滤膜透析3天，冷冻干燥备用；上述分离共获得PSP-W、PSP-0.2M、PSP-0.5M和PSP-1.0M四个多糖组分，其中PSP-0.2M多糖组分得率为1.9％；
(6)多糖纯化：按照固液比1g:45mL向步骤(5)得到的PSP-0.2M多糖组分加入超纯水溶解，通过全自动凝胶纯化系统进行纯化，收集对称峰对应的收集液，将收集液透析，通过旋转蒸发仪进行浓缩，得到火龙果茎多糖组分浓缩液；其余步骤参数同实施例1。最终得到的活性多糖类化合物，提取率54.1％。
对比例2
与实施例1不同的是：向低共熔溶剂加入蒸馏水，得到含水量为20％的低共熔溶剂溶液；(5)多糖分离：采用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱对火龙果茎粗多糖进行初步分离，按顺序依次以超纯水及浓度为0.2M、0.5M和1.0M的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为1mL/min；根据洗脱曲线选取质量最多的糖组分洗脱峰段，按峰对洗脱液进行合并收集，旋蒸浓缩后经3kD超滤膜透析3天，冷冻干燥备用；上述分离共获得PSP-W、PSP-0.2M、PSP-0.5M和PSP-1.0M四个多糖组分，其中PSP-0.2M多糖组分得率为1.6％；
(6)多糖纯化：按照固液比1g:45mL向步骤(5)得到的PSP-0.2M多糖组分加入超纯水溶解，通过全自动凝胶纯化系统进行纯化，收集对称峰对应的收集液，将收集液透析，通过旋转蒸发仪进行浓缩，得到火龙果茎多糖组分浓缩液；其余步骤参数同实施例1。最终得到的活性多糖类化合物，提取率42.5％。
对比例3
与实施例1不同的是：将步骤(1)得到的预处理火龙果茎粉末与步骤(2)得到的低共熔溶剂溶液按固液比为95g:1L的比例充分混合均匀；
(5)多糖分离：采用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱对火龙果茎粗多糖进行初步分离，按顺序依次以超纯水及浓度为0.2M、0.5M和1.0M的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为1mL/min；根据洗脱曲线选取质量最多的糖组分洗脱峰段，按峰对洗脱液进行合并收集，旋蒸浓缩后经3kD超滤膜透析3天，冷冻干燥备用；上述分离共获得PSP-W、PSP-0.2M、PSP-0.5M和PSP-1.0M四个多糖组分，其中PSP-0.2M多糖组分得率为2.3％；
(6)多糖纯化：按照固液比1g:45mL向步骤(5)得到的PSP-0.2M多糖组分加入超纯水溶解，通过全自动凝胶纯化系统进行纯化，收集对称峰对应的收集液，将收集液透析，通过旋转蒸发仪进行浓缩，得到火龙果茎多糖组分浓缩液；其余步骤参数同实施例1。最终得到的活性多糖类化合物，提取率49.4％。
对比例4
与实施例1不同的是：将步骤(1)得到的预处理火龙果茎粉末与步骤(2)得到的低共熔溶剂溶液按固液比为125g:1L的比例充分混合均匀；
(5)多糖分离：采用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱对火龙果茎粗多糖进行初步分离，按顺序依次以超纯水及浓度为0.2M、0.5M和1.0M的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为1mL/min；根据洗脱曲线选取质量最多的糖组分洗脱峰段，按峰对洗脱液进行合并收集，旋蒸浓缩后经3kD超滤膜透析3天，冷冻干燥备用；上述分离共获得PSP-W、PSP-0.2M、PSP-0.5M和PSP-1.0M四个多糖组分，其中PSP-0.2M多糖组分得率为2.1％；
(6)多糖纯化：按照固液比1g:45mL向步骤(5)得到的PSP-0.2M多糖组分加入超纯水溶解，通过全自动凝胶纯化系统进行纯化，收集对称峰对应的收集液，将收集液透析，通过旋转蒸发仪进行浓缩，得到火龙果茎多糖组分浓缩液；其余步骤参数同实施例1。最终得到的活性多糖类化合物，提取率52.6％。
对比例5
与实施例1不同的是：将香叶醇换成1，3-丁二醇；(5)多糖分离：采用DEAESepharose Fast Flow离子交换柱对火龙果茎粗多糖进行初步分离，按顺序依次以超纯水及浓度为0.2M、0.5M和1.0M的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为1mL/min；根据洗脱曲线选取质量最多的糖组分洗脱峰段，按峰对洗脱液进行合并收集，旋蒸浓缩后经3kD超滤膜透析3天，冷冻干燥备用；上述分离共获得PSP-W、PSP-0.2M、PSP-0.5M和PSP-1.0M四个多糖组分，其中PSP-0.2M多糖组分得率为1.2％；
(6)多糖纯化：按照固液比1g:45mL向步骤(5)得到的PSP-0.2M多糖组分加入超纯水溶解，通过全自动凝胶纯化系统进行纯化，收集对称峰对应的收集液，将收集液透析，通过旋转蒸发仪进行浓缩，得到火龙果茎多糖组分浓缩液；其余步骤参数同实施例1。最终得到的活性多糖类化合物，提取率21.3％。
上述实施例和对比例提及的得率和提取率计算公式如下：
得率＝PSP-0.2M多糖组分质量/火龙果茎粗多糖质量×100％；
提取率＝活性多糖类化合物质量/PSP-0.2M组分质量×100％。
试验例1：对实施例1制备得到的活性多糖类化合物进行结构鉴定与解析，结果如下：
(1)火龙果茎粗多糖极性分离
对实施例1步骤(5)梯度洗脱时，洗脱曲线如图1所示。洗脱曲线中，从左到右依次对应峰为收集：PSP-W、PSP-0.2M、PSP-0.5M和PSP-1.0M，各组分得率分别为：4.1％、5.6％、2％、2.7％，其中PSP-0.2M为最佳洗脱峰段，其组分得率最高，为5.6％。
(2)火龙果茎多糖组分分子量分析
采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)研究实施例1得到的活性多糖类化合物的分子量(Mw)。经HPGPC分析结果显示，该组分为较纯且均一的组分(见图2)，测得Mw为134.282kDa。
(3)火龙果茎多糖组分单糖组成
采用离子色谱法分析实施例1得到的活性多糖类化合物的单糖组成。取16种单糖标准品(岩藻糖Fuc、鼠李糖Rha、阿拉伯糖Ara、半乳糖Gal、葡萄糖Glc、木糖Xyl、甘露糖Man、果糖Fru、核糖Rib、半乳糖醛酸GalA、葡萄糖醛酸GlcA、氨基半乳糖盐酸盐GalN、盐酸氨基葡萄糖GlcN、N-乙酰-D氨基葡萄糖GlcNac、古罗糖醛酸GulA、甘露糖醛酸ManA)配成约10mg/ml标准溶液。取各单糖标准溶液精密配置0.1、0.5、1、5、10、20、50mg/L梯度浓度标准品。根据绝对定量方法，测定不同单糖质量，根据单糖摩尔质量计算出摩尔比，结果如图3所示。根据测定，实施例1得到的活性多糖类化合物属于杂多糖，其单糖摩尔比为Rha:Gal:GalA＝1.00:11.94:3.05。
(4)火龙果茎多糖组分红外图谱
实施例1得到的活性多糖类化合物的红外结果如图4所示。吸收带在3600-3200cm-1是-OH的伸缩振动吸收峰，这个区域的吸收峰是糖类的特征峰。具体如下：3399cm-1是O-H的伸缩振动吸收峰，是糖类的特征峰。在2929cm-1处有一个吸收峰，可能归属于C-H伸缩振动。在1635m-1处有一个吸收峰，可能归属于结晶水。在1417cm-1处有吸收峰，可能归属于C-O伸缩振动。在1249cm-1处、1043cm-1处有吸收峰，可能归属于O-H变角振动。在952cm-1处有吸收峰，可能归属于末端次甲基的横摇振动。在890cm-1处有吸收峰，可能归属于β-端基差向异构的C-H变角振动。
(5)火龙果茎多糖组分甲基化图谱
实施例1得到的活性多糖类化合物通过甲基化等衍生后，结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)法，分析其连接方式，结果如图5所示。火龙果茎多糖组分主要以1→2键、1→2,4键、1→4键、1→3键、1→3,4键、1→6键、1→4,6键等连接。
(6)火龙果茎多糖的1HNMR谱图
如图6的1H NMR谱图所示，氢谱信号主要集中在3.0-5.5ppm之间。δ3.2-4.0ppm为糖环质子信号，主要端基质子峰δ4.4、4.56、4.99、5.17的信号峰集中分布在4.3-5.5ppm区域内。
(7)火龙果茎多糖的13C NMR谱图
如图7的13C NMR谱图所示，碳谱分析在13C NMR(201MHz,D2O)：核磁碳谱信号主要集中在60-120ppm之间。通过观察碳谱，可以看到主要异头碳信号峰δ99.8、100.96、104.48、105.8异头碳区域主要在δ93-105之间。而δ83.6、69.3、82.5、71.55、18.4、69.43、69.77、79.62、72.19、174.8、74.66、76.62、83.4、77.36、62.28、73.21、74.84、79.03、76.01、62.1主要信号峰分布在10-85ppm区域。根据单糖组成结果，该多糖由鼠李糖，半乳糖和半乳糖醛酸组成。说明该多糖主要为鼠李半乳聚糖。
(8)火龙果茎多糖的DEPT135图谱
如图8所示，Dept135图谱分析，62.10和62.28ppm峰为倒峰，表明为C6的化学位移。
(9)火龙果茎多糖的1H-1H COSY图谱和HSQC图谱
通过HSQC图谱(如图10)，可以观察到异头碳信号为δ105.80，HSQC图谱(如图10)中对应的异头氢信号是δ4.56，通过1H-1H-COSY(如图9)，H1-2的信号为4.56/3.60；H2-3的信号为3.60/3.69；H3-4的信号为3.69/4.08；可以推断出H1，H2，H3，H4分别为δ4.56、3.60、3.69、4.08。对应的C1-4为δ105.80、73.21、74.84、79.03；C6的化学位移为δ62.10。C5为δ76.01因此，该信号应归→4)-β-D-Galp-(1→。
(10)火龙果茎多糖的HMBC图谱
HMBC图(如图11)谱中，我们对多糖的糖苷键信号进行归属；
支链分析：
β-D-Galp-(1→的异头碳与其→4)-β-D-Galp-(1→的H4有相关信号峰；表明存在β-D-Galp-(1→4)-β-D-Galp-(1→。
主链分析：
→2,4)-α-L-Rha-(1→的异头氢与其→4)-α-D-GalAp-(1→的C4有相关信号峰,表明存在→2,4)-α-L-Rha-(1→4)-α-D-GalAp-(1→。
NOESY图谱(如图12)中，→4)-α-D-GalAp-(1→的H1与其→2,4)-α-L-Rha-(1→的H2有相关峰，表明存在→4)-α-D-GalAp-(1→2,4)-α-L-Rha-(1→。
主链支链连接位点分析：
→4)-β-D-Galp-(1→的异头氢与其→2,4)-α-L-Rha-(1→的C4有相关信号峰,表明存在→4)-β-D-Galp-(1→2,4)-α-L-Rha-(1→。
综上，确定了实施例1得到的活性多糖类化合物的化学结构式如下：
Figure BDA0003760195940000111
试验例2：实施例1得到的活性多糖类化合物在抗肝癌药物中的应用
肝癌HepG-2细胞保留有许多肝细胞的特性与功能，故本发明以HepG-2为肝癌体外细胞模型，研究实施例1得到的活性多糖类化合物的抗肝癌活性。取对数生长期的HepG-2肝癌细胞接种于96孔培养板内，每孔100μL(约含5×10个细胞)。细胞贴壁后，加入100μL不同浓度的实施例1的活性多糖类化合物溶液(经0.22μm滤膜滤过)，阳性药组给予相同体积的阿霉素溶液，另设调零组(只加200μL完全培养基)、对照组(只加100μL细胞悬液+100μL完全培养基)，每组均设6个平行孔。在37℃、5％CO2培养箱中培养24-48h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，小心振荡后于CO2培养箱中继续培养1-2h后，利用酶标仪于450nm处测值，并计算HepG-2肝癌细胞存活率。按照以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率(％)＝[(OD实验组-OD调零组)/(OD对照组-OD调零组)]×100％
结果如表1所示，实施例1得到的活性多糖类化合物对HepG-2肝癌细胞具有显著的抑制能力，且呈时间—剂量依赖关系。
表1实施例1得到的活性多糖类化合物在不同浓度下HepG-2肝癌细胞存活率
细胞活性 24h 48h
多糖100μg/mL 83.67±1.22％<sup>a</sup> 71.22±2.98％<sup>a</sup>
多糖500μg/mL 68.14±2.17％<sup>c</sup> 53.79±1.56％<sup>c</sup>
多糖1000μg/mL 46.68±1.47％<sup>d</sup> 30.98±1.49％<sup>d</sup>
阿霉素50μg/mL 57.88±1.23％<sup>b</sup> 42.55±2.01％<sup>b</sup>
注：以上不同字母表示在不同浓度下P＜0.05的差异。
从表1可知，在相同时间下，不同浓度的活性多糖类化合物对HepG-2肝癌细胞的抑制能力具有显著性差异(P＜0.05)。当活性多糖类化合物浓度为1000μg/mL时，HepG-2肝癌细胞存活率最低，说明在这个浓度下，活性多糖类化合物对HepG-2肝癌细胞的抑制率最高；当活性多糖类化合物浓度为100μg/mL时，HepG-2肝癌细胞存活率最高，说明在这个浓度下，活性多糖类化合物对HepG-2肝癌细胞的抑制率最低。说明实施例1的活性多糖类化合物的浓度越高，HepG-2肝癌细胞的活性越低，即本发明的活性多糖类化合物抗肝癌活性越强。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (9)

1.从火龙果茎中提取的活性多糖类化合物，其特征在于，所述活性多糖类化合物的组分化学结构式为：
Figure FDA0003760195930000011
所述活性多糖类化合物的分子量为134.282kDa；
所述活性多糖类化合物为摩尔比为1.00:11.94:3.05的鼠李糖、半乳糖和半乳糖醛酸组成的化合物。
2.如权利要求1所述从火龙果茎中提取的活性多糖类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)原料预处理：取新鲜的火龙果茎，洗净，去除有疤痕的果茎后切块，打浆，得火龙果茎浆料，按照固液比1g:30-50mL向火龙果茎浆料中加入体积分数为90％乙醇溶液，过滤，收集固体物，冷冻干燥，得到预处理火龙果茎粉末；
(2)低共熔溶剂溶液制备：将甜菜碱、香叶醇按摩尔比为1.0-1.5:3.0-3.5的比例混合，得到低共熔溶剂，向低共熔溶剂加入蒸馏水，得到低共熔溶剂溶液，备用；
(3)多糖提取：将步骤(1)得到的预处理火龙果茎粉末与步骤(2)得到的低共熔溶剂溶液充分混合均匀，得到混合物；将混合物超声提取后，在6000-8000rpm/min条件下离心15-20min，收集和浓缩上清液，得到浓缩液；
(4)多糖醇沉：向浓缩液中按照体积比1:3-4，加入无水乙醇并在4℃环境中静置20-24h进行第一次醇沉，过滤，得到火龙果茎粗多糖；
(5)多糖分离：采用离子交换柱对火龙果茎粗多糖进行初步分离，按顺序依次以超纯水及浓度为0.2M、0.5M和1.0M的NaCl溶液进行梯度洗脱，流速为1-2mL/min；根据洗脱曲线选取质量最多的多糖组分洗脱峰段，按峰对洗脱液进行合并收集，旋蒸浓缩后经3-3.5kD超滤膜透析3-4天，冷冻干燥备用；
(6)多糖纯化：按照固液比1g:40-50mL向步骤(5)得到的质量最多的多糖组分加入超纯水溶解，通过全自动凝胶纯化系统进行纯化，收集对称峰对应的收集液，将收集液透析，通过旋转蒸发仪进行浓缩，得到火龙果茎多糖组分浓缩液；
(7)多糖二次醇沉：向步骤(6)的火龙果茎多糖组分浓缩液中按照体积比1:3加入无水乙醇并在4℃环境中放置16-20h进行第二次醇沉，过滤，收集沉淀物；
(8)多糖干燥：将步骤(7)收集的沉淀物冷冻干燥，即得活性多糖类化合物。
3.如权利要求2所述从火龙果茎中提取的活性多糖类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，甜菜碱、香叶醇按摩尔比为1.2:3.2。
4.如权利要求2所述从火龙果茎中提取的活性多糖类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，向低共熔溶剂加入蒸馏水，得到含水量为30％-40％的低共熔溶剂溶液。
5.如权利要求2所述从火龙果茎中提取的活性多糖类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，将步骤(1)得到的预处理火龙果茎粉末与步骤(2)得到的低共熔溶剂溶液按固液比为100-120g:1L的比例充分混合均匀。
6.如权利要求2所述从火龙果茎中提取的活性多糖类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，浓缩上清液至原溶液体积的1/3-1/4倍。
7.如权利要求2所述从火龙果茎中提取的活性多糖类化合物的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中，将混合物于55-65℃下超声提取60-80min。
8.如权利要求1-7任意一项所述从火龙果茎中提取的活性多糖类化合物在抗肝癌药物中的应用。
9.如权利要求8所述从火龙果茎中提取的活性多糖类化合物在抗肝癌药物中的应用，其特征在于，所述活性多糖类化合物的浓度为100-1000μg/mL。
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