CN113943381B - 一种新型海胆生殖腺多糖的纯化方法、分子结构及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型海胆生殖腺多糖的纯化方法、分子结构及其用途。该多糖的结构为：

Description

一种新型海胆生殖腺多糖的纯化方法、分子结构及其用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及来源于马粪海胆生殖腺中的一种结构新颖的具有葡萄糖侧链和葡萄糖醛酸侧链的葡聚糖，以及该多糖的纯化方法、分子结构、该多糖在制备肿瘤细胞毒制剂和/或抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

葡聚糖是由葡萄糖聚合而成，在自然界中分布极为广泛。其中β-葡萄糖通过1,3-或1,4- 糖苷键聚合形成的葡聚糖多存在于细菌、真菌、植物的细胞壁或纤维中，具有降血脂、调节血糖、提高免疫力等活性。另一种葡萄糖异构体α-葡萄糖通过1,4-或1,6-糖苷键聚合形成的多糖，在植物体内以直链淀粉或支链淀粉形式存在，是极为重要的食物来源，又是重要的药物制剂辅料；在动物体内则形成糖原贮存能量。更多的α-葡聚糖在动、植物和微生物体内以不同的链接方式、支链度、侧链、侧链取代位置等存在，具有多种显著的生理活性而备受关注。例如从香菇、草菇、丝孢酵母(Trichosporon sp.)、冬虫夏草、五味子、天麻、灰树花、非洲大蜗牛中发现的仅以α-葡萄糖，或以α-葡萄糖为主结合少量其它如甘露糖、阿拉伯糖形成的中性葡聚糖，具有显著的抗肿瘤、免疫调节、免疫器官保护活性。

已报道的α-葡聚糖结构中鲜有糖醛酸单元，有报道从假单胞菌(Pseudomonasveronii 2E)中得到一个由果糖和葡萄糖组成主链的多糖，有乙酰氨基葡萄糖侧链、β-糖醛酸 -(1→4)-α-果糖侧链，具有显著金属吸附作用。糖醛酸在多糖结构中大多占比小，但对多糖的理化性质和生理活性有显著影响。糖醛酸含量与多糖活性强度一般呈正相关，结构中有糖醛酸以及其占比增加，生物活性增强。另外，糖醛酸在水溶液中游离出的羧基负离子带负电荷，使得多糖溶于水后成为一种高分子电解质，不仅增加水溶性，活性也随之增强。由于糖醛酸与中性糖的主要区别是6-羧基，研究报道通过化学修饰，在多糖结构中引入羧基，可增强生物活性，进一步证明糖醛酸对活性的贡献。

海胆是棘皮动物门海胆纲生物，在我国沿海海域分布广泛。其生殖腺不仅含有丰富的不饱和脂肪酸等营养成分，也含有大量的多糖，具有降血脂、抗凝与抗血栓、抗肿瘤、免疫调节等生物活性。目前已从海胆中发现硫酸岩藻聚糖、硫酸半乳聚糖、杂多糖、糖胺聚糖等，国内学者从光棘球海胆生殖腺得到带有一个单糖侧链的中性葡聚糖，从虾夷马粪海胆中得到一个分支度较高、分子量达2.65×10⁷Da的葡聚糖，对其它几种经济型海胆中多糖确切的分子结构和生物活性研究较少。

发明人对山东威海沿海的马粪海胆Hemicentrotus pulcherrimus所含多糖进行了系统研究，从中得到一个结构新颖、有糖醛酸侧链的葡聚糖。经反复实验，研制出最佳纯化方法。已报道的多糖大多通过调节机体免疫系统，起到抗肿瘤作用，能够直接作用于肿瘤的多糖较少。对本发明所涉及的多糖进行的肿瘤细胞毒实验和BALB/c裸鼠体内Hela移植瘤生长抑制实验结果表明，该多糖能够直接作用于肿瘤细胞，抑制其增殖，在高剂量时仍无明显副作用，可用于研发肿瘤细胞毒制剂和/或安全性高、副作用小的抗肿瘤药物。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种新结构海胆多糖，综合运用化学和波谱学方法确证其基本结构单元如下所示：

该多糖的结构特征是分子量约2.996×10⁷Da，基本结构单元由下列4种单糖残基组成：

A：→4)-α-葡萄糖(1→；

B：→4,6)-α-葡萄糖(1→；

C：α-葡萄糖(1→；

D：α-葡萄糖醛酸(1→；

基本结构单元中A:B:C:D的比例约为12：3：2：1。即葡萄糖通过1,4-链接形成主链，主链中每隔4个糖连有一个支链，支链上葡萄糖和葡萄糖醛酸与主链糖的6-位形成糖苷键。

本发明的目的之二是提供所述多糖的纯化方法，包括以下步骤：

(1)取新鲜采集马粪海胆，解剖取出海胆黄，将海胆黄匀浆后用丙酮或乙醇脱脂、干燥得到脱脂粉末。脱脂粉末经水提、水提液浓缩、木瓜蛋白酶和Sevag法脱除蛋白，透析、醇沉、干燥后得到海胆总多糖粉末；

(2)海胆总多糖水溶后用DEAE-52离子交换柱色谱纯化；

(3)步骤(2)得到的多糖水溶液减压浓缩后，用分子排阻色谱纯化得到本发明的多糖；

优选地，步骤(1)中，水提取温度小于50℃、水的用量是脱脂粉末的8-20倍、提取2-3 次；木瓜蛋白酶的量按脱脂粉末：蛋白酶＝100:(4-8)的质量比计算加入；浓缩和干燥所用温度均小于50℃；

优选地，步骤(2)中，将海胆总多糖配制成20-50mg/mL水溶液，加入色谱柱后，用3-5 个柱体积的蒸馏水洗脱得到海胆多糖。

优选地，步骤(3)中，分子排阻色谱的固定相是Sepharose CL-2B琼脂糖凝胶，用3-4个柱体积的蒸馏水洗脱，水洗脱液经减压浓缩、冷冻干燥得到本发明的海胆多糖。

更为优选地，步骤(2)中，上样体积为1/20～1/10柱体积，洗脱时每1/20柱体积接收一份，苯酚-硫酸法检测多糖所在洗脱部分，合并。

更为优选地，步骤(3)中，浓缩至多糖含量约20-50mg/mL。洗脱时每1/20柱体积接收一份，苯酚-硫酸法检测多糖所在洗脱部分，合并、浓缩至50-100mg/mL，冷冻干燥得到本发明的海胆多糖。

本发明的目的之三是提供该多糖在制备肿瘤细胞毒制剂和/或抗肿瘤药物中的应用。

前期已证实本发明所述多糖对多种人源肿瘤细胞包括人肝癌细胞BEL-7402、人胰腺癌细胞panc-28、人成骨肉瘤细胞U20S、人单核白血病细胞THP-1、人胃癌细胞SGC7901和人肝癌细胞HepG2具有细胞毒活性。进一步研究表明本发明的多糖对人宫颈癌Hela细胞也有显著的细胞毒活性，更进一步的动物实验结果表明，本发明的多糖能显著抑制免疫缺陷BALB/c裸鼠体内Hela移植瘤的生长，高剂量多糖(80mg/Kg)的抑瘤率达76.65％，且对裸鼠体重、血清中白细胞介素IL-6和肿瘤坏死因子TNF-α表达水平无显著影响，而阳性药5-氟尿嘧啶组 (20mg/Kg)在给药后期裸鼠体重明显下降。以上结果表明本发明所涉及的多糖能够直接作用于肿瘤，抑制其增殖，在高剂量时仍无明显副作用，具有高效、低毒的优势。

本发明的有益效果：

1.根据多糖的结构、理化性质和分子量，优选了两种纯化效果最佳的色谱材料，本发明的纯化方法能够将多糖纯度提高到99.5％以上，不含核酸和蛋白质，达到注射用原料药纯度要求；同时大大提高其水溶性和水溶液稳定性，20℃时的水溶性最高达207.5mg/mL，而且其水溶液非常稳定，在4℃下长期放置仍能保持稳定，不发生沉淀、结晶等变化。

2.提供了所涉及多糖明确的分子结构和分子量，为多糖药物开发、制剂设计、多糖产品分析与质量控制提供了重要的结构依据。

3.通过免疫缺陷裸鼠体内移植瘤生长抑制实验，明确了所涉及多糖的体内抗肿瘤有效性，且具有较高的抑制效果，无明显副作用。

本发明内容解决了海胆多糖纯度低、水溶性差、水溶液不稳定、多糖结构不明确、生物活性弱等技术难题，使本发明所涉及海胆多糖在开发高效、低毒的抗肿瘤多糖药物方面极具应用前景。

附图说明

图1：多糖的示差折光检测图谱(A)和多角度激光光散射图谱(B)

图2：多糖水解产物的高效离子色谱分析结果，A：标准中性单糖混合物；B：标准糖醛酸的混合物；C：全水解产物；D：部分酸水解产物。赤藓糖(a)，岩藻糖(b)，鼠李糖(c)，阿拉伯糖(d)，半乳糖(e)，葡萄糖(f)，甘露糖(g)，木糖(h)，山梨糖(i)，核糖(j)，半乳糖醛酸(k)，葡萄糖醛酸(l)，甘露糖醛酸(m)。

图3：多糖的红外光谱(A)；多糖甲基化后的红外光谱(B)。

图4：多糖甲基化产物GC-MS分析结果。

图5：多糖的核磁图谱。¹H NMR谱(A),¹³C NMR谱(B),HSQC(C),HMBC(D),¹H-¹H COSY(E), 和NOESY谱(F)

图6：多糖对荷Hela裸鼠移植瘤的瘤体

图7：多糖对荷Hela裸鼠移植瘤的药效结果，瘤重(A)和体重(B)

图8：多糖对荷Hela裸鼠血清中TNF-α和IL-6的表达水平影响

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明的海胆多糖、纯化方法和活性评价实验过程作进一步的说明，以下实例是用于阐释本发明的技术内容，并不是对本发明内容的限定，所有基于马粪海胆所含多糖以及本发明所做出的变化或等同替换，均应属于本发明的保护范围。

实施例1马粪海胆生殖腺多糖的制备

取山东威海采集的马粪海胆20Kg，剥除海胆壳，得黄色海胆生殖腺4.0Kg。用组织匀浆机粉碎，重复操作至海胆黄为匀浆。向海胆黄匀浆中加入两倍体积的无水乙醇常温搅拌6h，离心收集沉淀。沉淀再用无水乙醇重复脱脂3次，再用95％乙醇重复脱脂4次至乙醇溶液无色，干燥称重得脱脂粉末1.7kg。取200g加入400ml水，加热至90℃维持10min，再加入1.6L水维持50℃提取4h。离心，沉淀再用2000mL水提取2次。提取液合并后，减压浓缩至3000mL，加入1.0g木瓜蛋白酶于55℃酶解24h，然后加热至90℃灭活15min，离心收集上清液。向上清液中加入其体积分数1/5的sevage试剂(氯仿︰正丁醇＝4︰1)萃取，弃去下层液体和变性蛋白，再重复该操作10次。上层多糖水溶液减压浓缩至1.0L，装入孔径为6000Da的透析袋内，用流动蒸馏水透析24h。向透析后的多糖水溶液中加入4L无水乙醇，静置12h，离心，沉淀用无水乙醇洗涤3次，充分干燥得白色海胆总多糖粉末24g。取 200mg总多糖粉末溶于10ml水中，加入DEAE-52离子交换色谱柱，用600mL蒸馏水洗脱，每 20mL接收一管，苯酚-硫酸法检测多糖所在管，合并浓缩至10-20mL，加入Sepharose CL-2B 琼脂糖凝胶柱色谱，用800mL蒸馏水洗脱，每20mL接收一管，苯酚-硫酸法检测多糖所在管，合并浓缩至10ml，冷冻干燥所得本发明的海胆多糖91mg，苯酚-硫酸法测定纯度为99.8％。

实施例2多糖的分子结构表征

(1)测试多糖纯度和分子量

称取本发明的多糖5mg溶于1ml0.05mol/L的NaCl水溶液，用0.22微米微孔滤膜过滤，手动注射100μL进入配备示差折光检测器和多角度激光光散射器的高效凝胶渗透色谱，分析得出其重均分子量Mw为2.996×10⁷Da(图1)，重均分子量比数均分子量(Mw/Mn＝多分散系数)为1.2，说明该多糖的分子量分布较窄，均一性良好。

(2)分析单糖组成

取20mg多糖溶于3mL蒸馏水，再加入3mL4 mol/L的三氟乙酸，120℃水解4h，减压蒸干，再用2mL水溶解。为了检测其中是否有糖醛酸，进行部分酸水解，取2mg多糖溶于2mL 蒸馏水，再加入2mL1 mol/L的三氟乙酸，60℃水解2h，减压蒸干，再用1mL水溶解。上述水溶液用高效离子色谱仪配备脉冲安培检测器分析，结果(图2)表明本发明的多糖主要有葡萄糖，有少量的葡萄糖醛酸。

(3)红外光谱

取1mg多糖或甲基化后的多糖加适量溴化钾研磨均匀，压片后用傅里叶红外光谱仪检测。多糖的红外光谱(图3)给出3277cm^-1的羟基吸收峰；1636cm^-1的羧基负离子(COO^-)吸收峰，且该吸收峰在多糖被甲基化后向高波数位移至1735cm^-1，是羧甲酯基团中羰基的特征吸收峰，进一步证实多糖结构中有COOH，结构中有糖醛酸。1148cm^-1、1077cm^-1和1013cm^-1处吸收峰说明是吡喃型糖，849cm^-1处吸收峰说明为α-型糖苷键。

(4)甲基化分析

称取纯化的多糖HPP-1 20mg，在真空干燥箱中干燥过夜，干燥箱中加入五氧化二磷干燥剂。将多糖溶于10mL DMSO(高温处理后的4A分子筛去水)，室温溶解。将250mg NaOH和6mL DMSO混合后，充分搅拌均匀，然后加到已经溶解的多糖样品中，氮气保护下加入5mLCH₃I，室温下反应7min，后加6mL的去离子水终止反应，去离子水透析24h。之后用旋转蒸发仪浓缩到10mL，加入相同体积的CHCl₃萃取3次，CHCl₃萃取液用去离子水洗3遍，再用Na₂SO₄干燥12h除水，过滤后蒸除CHCl₃。采用FT-IR法检测于3400cm^-1附近无明显吸收峰，证明多糖甲基化完全。甲基化多糖加入1mL88％HCOOH，100℃水解4h后蒸干，再加2mL2 mol/L 的三氟乙酸，120℃水解4h，减压除去TFA。再加2mL去离子水，向其中加NaBH₄室温还原12h。加入50％的乙酸中和至PH＝6-7，蒸干后放入真空干燥箱干燥过夜。加0.5mL乙酸酐， 0.5mL吡啶，100℃反应1h后蒸除乙酸酐。再向其中加2mL去离子水，加2mLCHCl₃萃取3 次，用去离子水洗涤萃取液3遍，用Na₂SO₄干燥萃取液12h，过滤去除Na₂SO₄后蒸除CHCl₃。用1mLCHCl₃溶解样品进行GC-MS分析。GC-MS分析图谱(图4，表1)给出4种结构片段的衍生物，分别是α-葡萄糖(1→(a)、α-葡萄糖醛酸(1→(b)、→4)-α-葡萄糖(1→(c)；→4,6)-α-葡萄糖(1→(d)，4个主要峰的峰面积比例约为11.9：3.1：2：0.8，其中糖醛酸的比例偏低，可能是由于在水解过程中有部分糖醛酸甲酯被水解，而引起少量损失，因此比例偏低。

表1多糖甲基化衍生物离子峰及碎片离子

(5)核磁共振波谱分析

将50mg多糖溶于0.5mL重水后冷冻干燥，重复该操作3次，最后用0.5mL重水溶进核磁管，测试¹H NMR,¹³C NMR,¹H-¹H COSY,HSQC,HMBC和NOESY谱。如图5所示，氢谱给出4 种端基质子信号，分别位于5.40、5.37、5.34和4.98ppm，说明有4种糖残基，均为α-构型。糖上其它连氧碳上的质子信号位于3.4-4.2ppm，没有位于1.0ppm附近的质子信号，说明没有甲基糖。碳谱给出与氢谱相对应的4个端基碳信号，化学位移位于101.41-102.81间，进一步说明是α-构型糖。根据HSQC谱将直接相连的碳和氢信号归属后，根据COSY谱找出同一偶合系统的质子，包括A1/A2/A3/A4/A5/A6,B1/B2/B3/B4/B5,C1/C2/C3/C4, D1/D2/D3/D4/D5，再结合HMBC谱中的远程相关信息将每个糖的碳和氢信号进行归属。进一步的，HMBC谱中H_A1与C_B4、H_B1与C_A4的远程相关，以及NOESY谱中H_A1与H_B4、H_A4与H_B1的相关信号，进一步表明二者是通过1→4糖苷键相连。NOESY谱中的H_C1与H_B6相关信号说明侧链葡萄糖的 1-位与主链糖的6-位相连。其它NOESY信号如H_A1与H_A6、H_A1与H_A3、H_C1与H_C2、H_C4与H_C2、H_C4与 H_C3、H_C4与H_C6，进一步确证了已归属的核磁信号，也为糖的α-构型提供证据。

表2多糖的核磁数据

通过解析以上化学和波谱学数据，对核磁数据进行归属，最终确证本发明的多糖是结构新颖的有糖醛酸侧链的葡聚糖，分子量达千万Da，该级别分子量的多糖也较为少见。

实施例3肿瘤细胞毒活性评价

(1)人源宫颈癌Hela细胞株的复苏、培养及冻存

细胞复苏：将冷冻管从液氮罐内或-80℃冰箱中取出后，迅速放入37℃水浴中，当细胞呈现冰水混合物的状态时，从水浴中取出冻存管，用75％酒精灭菌消毒后，移入无菌超净台内。将冻存管内的细胞吸出后加入预先加有培养液的离心管中，混匀，1000rpm离心5min。弃去上清液，收集下层细胞，用培养液洗2次，加入装有适量培养液的培养瓶中，放入37℃、 5％CO2的恒温培养箱中培养。每日观察细胞的生长状态，待细胞长至80％-90％后进行传代培养。(培养液的配制：适合类型的培养基加10％胎牛血清，1％的青霉素链霉素混合液)

细胞的传代：将培养瓶从CO₂培养箱中取出放入超净台中，贴壁细胞直接弃去培养液，加入PBS缓冲液冲洗两次后，用胰酶消化，用培养液终止消化，进行分瓶培养。37℃、5％CO₂的恒温培养箱中培养。

(2)MTT法检测多糖对Hela细胞的细胞毒活性

细胞传代后，以5×10³个/孔加入96孔板内，每孔200μL，再加入无菌的待检样品(0， 32，64，128，256，512，1024μg/mL)于37℃、5％CO₂培养箱培养24h，然后吸去上清。最后使用MTT法进行检测：每孔加入20μL的MTT染色液(5mg/ml)，反应4h后弃上清，加入 DMSO150μL，避光震荡溶解10min后用酶标仪检测570nm处的吸光值，计算细胞存活率。

(3)统计学处理

结果中的数据以平均值±SD的形式显示，应用软件SPSS 17.0进行数据处理，保证3次实验重复。采用单因素方差分析法比较多组数据，对照组与各实验组之间的差异通过t检验进行对比分析，当P<0.01时，对照组与实验组差异极其显著，当P<0.05时对照组与实验组有显著性差异。结果如表3所示，多糖于64μg/mL浓度时开始显示抑制效果，最高浓度时抑制率达49.7％。实施例3的结果表明，本发明的海胆多糖具有显著的肿瘤细胞毒活性。

表3海胆多糖对Hela细胞的细胞毒活性

与空白对照组相比，*P＜0.05,**P＜0.01；阳性对照药顺铂的IC₅₀＝2.41±1.1μM

实施例4海胆多糖对人宫颈癌细胞Hela裸鼠移植瘤的药效研究

受试动物：品系：BALB/c裸鼠；日龄：4-5周；性别：雌性；动物数：每组6只，共30 只。

阳性药：5-氟尿嘧啶(5-FU)，规格：10mL：0.25g

分组及给药方案：

模型组：腹腔注射等量生理盐水，一天一次，持续观察21天；

5-FU 20mg/kg：腹腔注射，两天一次，持续观察21天；

海胆多糖20mg/kg：腹腔注射，一天一次，持续观察21天；

海胆多糖40mg/kg：腹腔注射，一天一次，持续观察21天；

海胆多糖80mg/kg：腹腔注射，一天一次，持续观察21天；

模型的制备：收集培养的人宫颈癌细胞Hela细胞悬液，浓度为1×10⁷个/ml，以每只0.1ml 接种于裸鼠右侧腋窝皮下。

分组与给药：裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，接种15天后，肿瘤生长至100-150mm³时将动物随机分组，每组6只。同时，各组裸鼠开始给药，给药方案见组别与给药方案。实验结束后，眼球采血，随即处死裸鼠，手术剥取瘤块称重。

检测指标：

(1)体重:第1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21天记录一次裸鼠体重。

(2)血清TNF-α,IL-6含量：用Elisa试剂盒检测血清中TNF-α,IL-6含量。

统计处理：均值用X±SD表示，组间分析用t检验进行统计学处理，应用SPSS 17.0对结果进行统计分析。

结果如图6、图7和表4所示，多糖20mg/kg即表现出显著的抑制效果，抑制率达51.13％，略低于同剂量阳性药5-FU的63.02％，多糖40mg/kg和80mg/kg的抑制率分别为70.66％和 76.65％，均高于阳性对照药的。模型组和多糖给药组裸鼠体重稳步增加，5-FU组后期体重增加不明显，可能是其副作用逐渐显现。多糖和5-FU组对裸鼠血清中TNF-α和IL-6两种因子表达水平影响均不显著(图8)。实施例4的结果表明，本发明的海胆多糖体内抗肿瘤的有效性，能够直接作用于肿瘤，发挥抑制活性，且具有较高的抑制效果，无明显副作用。

表4海胆多糖对人宫颈癌细胞HELA裸鼠移植瘤肿瘤生长的影响(X±SD，n＝6)

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

Claims (5)

1.一种新型海胆生殖腺多糖，其特征在于，该多糖来源于马粪海胆Hemicentrotuspulcherrimus，所述海胆生殖腺多糖的分子结构为：

上述结构中，主链由α-葡萄糖组成，侧链为α-葡萄糖和α-葡萄糖醛酸。

2.一种如权利要求1所述的海胆生殖腺多糖，其特征在于，其平均分子量为2.996×10⁷Da，重复单元由(1,4)-α-葡萄糖、(1,4,6)-α-葡萄糖、末端-α-葡萄糖、末端-α-葡萄糖醛酸这4种糖残基组成，比例为12：3：2：1。

3.一种如权利要求1所述的海胆生殖腺多糖的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取新鲜采集的马粪海胆，解剖取出海胆黄，将海胆黄匀浆后用乙醇脱脂、干燥得到脱脂粉末；脱脂粉末经水提、水提液浓缩、木瓜蛋白酶和Sevag法脱除蛋白、透析、醇沉、干燥后得到海胆总多糖粉末；

(2)海胆总多糖经水溶后用DEAE-52离子交换柱色谱纯化；

(3)步骤(2)得到的多糖水溶液减压浓缩后，用分子排阻色谱纯化得到本发明的多糖；

步骤(1)中，使用水提取法，提取温度小于50℃，水的用量是脱脂粉末的8-20倍；木瓜蛋白酶的量按脱脂粉末：蛋白酶＝100:(4-8)的质量比计算加入；

步骤(2)中，DEAE-52离子交换柱色谱纯化中，总多糖配制成20-50mg/mL水溶液，上样体积为1/20-1/10柱体积，加入色谱柱后，用3-5个柱体积的蒸馏水洗脱，每1/20柱体积接收一份，苯酚-硫酸法检测目标多糖所在部位，收集合并；

步骤(3)中，分子排阻色谱法的固定相是Sepharose CL-2B琼脂糖凝胶，上样多糖浓度为20-50mg/mL，用3-4个柱体积的蒸馏水洗脱，洗脱时每1/20柱体积接收一份，苯酚-硫酸法检测目标多糖所在部位，合并后经减压浓缩、冷冻干燥得到本发明的海胆多糖，其纯度高于99.5％，不含核酸和蛋白质。

4.如权利要求1～3任一项所述的多糖在制备肿瘤细胞毒制剂中的应用。

5.如权利要求1～3任一项所述的多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。

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