KR100543692B1 - 담자균류로부터 분리된 불용성 베타-글루칸의 수용화방법 - Google Patents

Abstract

한국산 담자균류를 이용하여 기존의 β-글루칸계 다당류보다 생리활성이 우수하고, 수용성 특성이 있는 물질을 제공하고, 우수한 균주를 대량 배양하기 위한 최적 발효조건 및 기능성 다량류의 수율향상을 위한 제조공법을 제공한다. 수용화 방법은 황을 이용하여 불용성 β-글루칸 골격의 원소와 치환시켜 수용성 β-글루칸을 제조하며, 최종적으로는 천연 생합성 불용성 β-글루칸보다 용해성이 우수하여 제제화가 쉽고, 물리화학적으로 안정되고, 부작용이 적으며, 생리활성이 우수한 수용성 β-글루칸을 개발하여, 기능성 식품, 면역 증강용 의약품 소재, 화장품 보습제등의 원료로 사용한다.

고분자 다당류, 담자균류, β-글루칸, 수용성 β-글루칸, 균사체

Description

담자균류로부터 분리된 불용성 베타-글루칸의 수용화방법{DISSOLUTION METHOD OF INSOLUBLE β-GLUCAN SEPARATED FROM BASIDIOMYCETES}

도 1은 본 발명의 수용성 β-글루칸의 가스크로마토그라프 패턴과 단당류 조성을 나타낸 그라프이다.

도 2는 불용성 β-글루칸의 가스크로마토그라프 패턴과 단당류 조성을 나타낸 그라프이다.

도 3은 본 발명의 수용성 β-글루칸의 IR 스펙트럼을 나타낸 그라프이다.

도 4는 불용성 β-글루칸의 IR 스펙트럼을 나타낸 그라프이다.

도 5는 본 발명의 수용성 β-글루칸의 ¹³C-NMR 스펙트럼 분석그라프이다.

도 6은 본 발명의 수용성 β-글루칸의 분자량 분포 크로마토그라프이다.

본 발명은 생리활성 다당류 β-글루칸(Glucan)의 수용화 방법에 관한 것으 로, 특히 담자균류의 대표적 다당류인 비수용성 β-글루칸의 대량생산과 이의 수용화 방법 및 수용화에 따른 물리화학적으로 우수하고, 약리적 활성이 우수한 수용성 다당류에 관한 것이다.

일반적으로 담자균류의 β-글루칸은 기능성 식품소재, 면역증강 효과가 있는 반응조절물질(BRM: Biological Response Modifiers)로 현재 임상에서 면역 항암요법제로 활용되고 있는 천연 다당류이다.

한국산 담자균류의 다당류에 관한 연구는 구름버섯, 표고버섯, 느타리버섯 등의 자실체의 열수추출물이 사르코마(Sarcoma) 180에 강한 저지력이 있음을 밝힘으로써 시작되었다.

버섯속의 탄수화물은 트레할로스(trehalose), 만니톨(mannitol), 아라비니트롤(arabinitrol) 등 사람의 장으로 흡수되기 어려운 저분자 당과 β-글루칸, 헤테로글루칸, 키틴질 등 불소화성의 식물섬유소가 주체를 이룬다. 그 중에서 β-글루칸은 영지버섯과 같은 모든 버섯에서 생산되며, 특히 균사체에서 세포외 다당류로 합성되는 생리활성 다당류이다.

항암작용이 있는 다당류는 고등식물, 곰팡이, 이스트, 박테리아 등 천연자원에서 분리하여 연구되어 왔으며, 린저(Ringer 등, 1975)가 담자균류의 항암작용을 보고한 이래로 담자균류의 다당체에 대한 항암 연구가 광범위하게 행하여져 왔다.

이들 담자균류의 항암성분들이 면역능에 미치는 연구도 진행되었으며, 메다 (Maeda 등, 1971)는 렌티난(Lentinan)이 세포성 면역의 면역촉진제로 작용함을 밝혔고, 데너트(Dennert 등, 1973)은 렌티난이 티-세포(T-cell) 보강제(adjuvant)로 작용함을 입증하였다.

특히 β-글루칸은 세균, 바이러스, 진균류, 기생체 등에서 비롯된 숙주의 질병에 유효할 뿐만 아니라 암의 진행을 차단하거나, 변경시켜주는 역할을 한다. 그 결과 반응조절물질에 해당되는 β-글루칸을 이용한 항암제가 개발되었다.

반응조절물질은 항바이러스 작용, 세포증식 억제 작용, 대식세포 (macrophage)의 활성, 자연살해세포(natural killer cell)의 활성화, 항체생성의 촉진 및 암세포 유전자 발현에 조절적 역할을 한다. 이와 같은 반응조절물질의 장점은 화학요법제와는 다른 기전에 의하여 항암활성을 나타내므로 화학요법제와 병용시 항암작용의 상승을 기대할 수 있고, 화학요법제와 같이 중독성이 없다는 점이 특징이다. 그러므로 반응조절물질을 이용한 면역항암요법제의 개발은 암을 치료하는데 우수한 방법으로 주목되고 있다.

그러나 β-D-글루칸의 임상적 이용에 있어 중요한 장애는 액상에서 수용화되지 않는다는 점이다. 윌리암스의 연구에 의하면, 효모에서 분리된 정제되지 않은 (1→3)-β-D-글루칸은 불용성의 미소입자성 다당류(∼1-2 ㎛)이며(Williams 등, 1985), 만일 이들을 정맥 주사하면 간에 손상이 일어나거나, 내독소 중독 (endotoxin shock)이 나타난다고 보고하였다. 한편 정맥투여가 아닌 국소나 병소에 적용하면 독성이 전혀 나타나지 않는 것으로 보고하였다.

따라서, 이상과 같은 종래의 연구개발에서 가장 문제점으로 나타나는 것은 β-글루칸의 불용성 문제이다. 즉 이러한 다당류의 생리활성 구조는 모두 β-글루칸이나, 공통적으로 비수용성인 특성을 갖고 있고, 담자균류 다당류의 물성 개선에 관한 연구는 국내외적으로 아직 없는 실정이다.

그러므로 β-글루칸이 우수한 약물학적 활성을 나타내기 위하여는 원래의 골격을 유지하면서 용해성이 우수한 물질이 개발되어야 하고, 산업적으로 다양한 생리활성제품을 개발하기 위해서는 우선 대량생산이 가능해야 하며, β-글루칸 물질의 수용화 문제가 해결되어야 한다. 이 같은 연구의 성공은 산업 및 의학, 약학분야에 적용되어 국내의 기술로 다양한 제품을 개발할 수 있는 기초가 될 것이다.

본 발명은 영지버섯을 발효배양하여 균사체성 다당류를 생산하고, 생리활성이 우수한 불용성 다당류인 β-글루칸을 수용화하여 산업적으로 다양하게 활용되는 생물 신소재로서의 기능성 생리활성 다당류인 수용성 β-글루칸을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

또한 본 발명은 한국산 담자균류를 이용하여 기존의 β-글루칸계 다당류보다 생리활성이 우수하고, 수용성 특성이 있는 물질을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 수용성 β-글루칸은, 황(S) 원소를 이용하여 불용성 β-글루칸 골격의 원소와 치환시켜 수용성 β-글루칸을 수용화하여 제조한다.

상기 수용화방법은 우레아를 메틸설폭시드에 녹인 후, 여기에 불용성 글루칸을 가하고, 그 β-글루칸-Me₂SO-우레아 용액에 산성화된 메틸설폭시드 용액을 천천 히 가하고 가열하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서는 수용성 β-글루칸을 얻기 위하여 담자균류를 사용한다. 담자균류는 여러 생물 가운데 생리활성 다당류를 다량으로 얻는데 매우 유리하다. 즉, 발효조를 이용한 대량배양이 가능하며, 균체 내·외성 다당류는 일련의 공정과정을 거치면 고순도의 다당류를 쉽게 얻을 수 있다.

버섯류에 존재하는 다당류는 주로 β-글루칸이다. 이들은 결합방법에 따라 α, β-글루칸 형태로 분류되며, 진균류 글루칸은 대부분 포도당이 β-1, 3 결합을 하는 비수용성 선상의 중합체이다. 다당류의 용해성 차이는 폴리머 크기, 구조적 차이 및 체인 팩킹(chain packing) 등에 의하여 일어나는데, 알카리 불용성 글루칸은 키틴과 공유결합을 이루기 때문이라고 보고되었다.

버섯의 세포를 구성하는 다당류의 조성은 치마버섯(Schizophyllum commune)에서 잘 연구되었으며, 균사체의 세포벽은 알카리 가용성 분획(AS-글루칸)과 알카리 불용성 분획(AR-글루칸)으로 구분된다. AS-글루칸은 (1→6)-α-D-글루칸으로 분지된 (1→3)-α-D-글루칸이며, 크실로오스와 만노오스가 포함되어 있다. AR-글루칸은 키틴과 단백질을 갖는 (1→3)-β-, (1→6)-β-D-글루칸이다. 또한 구름버섯의 알카리 불용성 글루칸은 키틴과 공유결합되어 있는 β-1, 3 및 β-1, 6 결합의 다당류이다.

불용성 다당류가 친수성 원소로 치환될 경우, 수용성으로 전환시킬 수 있으 며, 본 발명에서는 설페이트(S)를 이용한 설페이션(sulfation) 방법을 통하여 수용성 기능성 다당류를 제조한다.

본 발명에서 얻어진 수용성 β-글루칸은 다양한 제품을 개발할 수 있는 신소재가 될 수 있다. 특히 다양한 산업분야에서 고부가가치를 창출할 수 있는 이상적인 물질로서 그 생산방식도 매우 효율적인 연속적인 발효방식으로 생산할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 생리활성 다당류 β-글루칸의 수용화 방법은, 담자균류로부터 발효 배양하여 기능성 다당류인 비수용성 β-글루칸을 대량생산하고, 여기에서 얻은 비수용성 β-글루칸을 수용화하여 기능성을 높이는 것으로서, 그 단계를 요약하면,

제1 단계: 담자균류로부터 기능성 다당류를 대량생산한다.

제2 단계: 담자균류의 대부분의 다당류가 갖는 비수용성 다당류를 산업적으로 이용하는데 해결되어야 할 용해도를 개선한다. 그 방법으로는 황(S)과 같은 원소를 이용하여 불용성 β-글루칸을 친수성 다당류로 전환시켰다.

제3 단계: 부분 치환된 β-글루칸의 물성변화와 구조를 분석한다.

제4 단계: 수용성 β-글루칸의 원치 않는 항원성 또는 독성의 발현을 확인하기 위하여 급성독성 시험을 실시한다.

제5 단계: 수용화된 β-글루칸의 면역활성이 원래의 다당류보다 우수하거나 동등한지를 인비보 및 인비트로에서 생리활성 시험을 수행하였다. 생리활성 시험으로는 항암시험, 항보체시험 및 β-글루칸의 표적이 될 수 있는 대식세포를 이용하였다. 세부 내용으로는 대식세포의 산화질소(nitric oxide) 생성 촉진능 및 종 양괴사인자(TNF-α)의 생성량을 확인하여 그 활성 정도를 확인하였다. 최종적인 목적은 물에 용해성이 우수한 면역 증강제, β-글루칸의 개발에 두었다.

이하 본 발명의 생리활성 다당류인 수용성 β-글루칸의 수용화 방법을 보다 구체적으로 기술한다.

1. 균주배양 및 물질 추출

1-1. 균주 및 배양

본 발명에서 사용한 주요한 담자균류는 영지(G. lucidum )이며, 균사체 보관용 배지는 감자 덱스트로스 한천(potato dextrose agar) 배지를 사용한다. 배양용 배지는 2% 수용성 전분, 0.2% 이스트 추출물, 0.5% K₂HPO₄, 0.001% KH₂ PO₄, 0.1% MgSO₄·7H₂O가 포함된 IYSM 배지를 이용하였다. IYSM 배지를 발효조(코바이오텍, 3L)에 넣고, pH 4.5로 조정한 후, 2기압에서 20분간 고압 멸균하였다. 여기에 감자 덱스트로스 배지에서 전 배양한 영지(G. lucidum) 균사체를 10%(v/v) 접종하였다. 이때 작업용량은 3L이며, 교반속도는 300 rpm, 통기량은 1 vvm으로 하여 27℃에서 6일간 배양하였다. 배양중 pH 조정액은 0.5N NaOH, 소포제로는 실리콘수지를 사용하였다.

1-2. 균사체 생장 측정

균사체의 생장은 7일간 배양시킨 배양액을 토요(Toyo) No.2 여과지로 여과한 후 105℃에서 8시간 건조하고 균사체의 건중량을 측정하여 표시하였다.

1-3. β-글루칸 추출

β-글루칸의 알카리 추출에 따른 에탄올 정제는 다음과 같은 방법으로 행하였다.

6일간 배양된 3L의 균사체액에 NaOH를 가하고(최종 2N), 실온에서 교반하여 알카리 가용성 다당류를 추출하였다. 추출액에 빙초산을 가하여 중화시킨 후, 원심분리(3000 x g)하여 알카리 가용성 및 불용성 분획으로 다시 분리하고, 여기에 에탄올을 가하여 다당류를 침전시킨다. 이상과 같이 에탄올에 침전된 모든 균사체 분획성 다당류들은 원심분리(6000 x g)를 통하여 수획하고, 소량의 증류수를 가한 다음 투석막 백(dialysis membrane bag; M.W cut off: 10,000)에 넣어 흐르는 탈이온수에서 5일 동안 투석시킨다. 투석된 분획들은 6000 x g에서 원심분리하여 수용성 분획과 비수용성 분획으로 구분한 다음 동결건조하여 비수용성인 β-글루칸을 얻는다.

1-4. β-글루칸의 생산조건

β-글루칸의 생산에 따른 당 및 단백질의 함량을 일정하게 유지해 줄 필요가 있으나 생산 롯트에 따라 당, 단백질의 함량 및 용해도에 차이를 보이고 있다. 따라서 여러 가지 추출조건을 비교 검토하여 원인을 분석하고 문제점을 개선하고자 실험을 진행하고 다음과 같은 결과를 얻었다.

가. 균사체 배양

배양용 액체배지를 넣고 멸균한 3ℓ 발효기 및 1ℓ 삼각플라스크에 종균 (seed)을 10%씩 접종하고 27.5℃에서 5일간 배양한 뒤 실험에 사용하였다.

나. 추출온도에 따른 영향

추출온도에 따라 당의 함량에 차이가 있다는 실험 근거에 의하여, 실온 (25), 40, 60 및 80℃에서 각각 24시간 동안 알카리 추출하여 온도에 따른 시료의 물성변화를 검토하였다.

실험 결과, 표 1에서 보는 바와 같이, 추출온도에 따른 수율의 변화는 없었으나, 추출온도가 높아짐에 따라 당 함량은 높아지고 단백질의 함량은 떨어짐을 알 수 있었다. 물에 대한 용해도는 실온에서 추출한 결과 가장 우수한 용해성을 나타내었다. 이와 같은 결과는 알카리에 의하여 단백질과 탄수화물의 결합이 절단되는 과정에서 온도가 상승함으로써 단백질의 가수분해가 촉진되고 저분자화되어 한외여과시 여과되어 이탈됨으로써 시료내의 단백질양은 감소되고 총 탄수화물의 양이 상대적으로 증가하는 것으로 여겨진다. 또한 시료내 탄수화물의 증가는 대부분 비 수용성인 β-글루칸의 증가로 인해 용해도는 감소하는 것으로 여겨진다.

표 1 추출온도에 따른 β-글루칸의 조성 변화

추출온도 (℃)	추출시간 (hr)	배양액 기준 β-글루칸 수율(%)	총 탄수화물 (%)	물에 대한 용해도 (%)
25	24	0.151±0.011	62.2±2.6	70.4±2.3
40	24	0.152±0.014	68.0±5.2	52.2±2.3
60	24	0.156±0.020	79.4±3.7	40.2±1.1
80	24	0.172±0.022	78.8±3.5	32.0±1.5

다. 일정 온도에서 추출시간에 따른 영향

온도를 60℃로 일정하게 유지하고 추출시간을 6, 12, 24 및 48시간으로 하여 각각 알카리 추출한 뒤, 시간에 따른 시료의 물성 변화를 검토하였다.

실험 결과, 표 2에서 보는 바와 같이 추출시간에 따른 수율의 변화는 없었으나, 추출시간이 길어짐에 따라 당 함량은 높아지는 것을 알 수 있었다. 또한 물에 대한 용해도는 표준공정인 실온, 24시간에서의 추출시보다, 60℃에서 추출시간이 길어질수록 용해도는 떨어졌다.

이와 같은 결과 역시, 알카리에 의하여 단백질과 탄수화물의 결합이 절단되는 과정에서 추출시간의 연장은 상대적으로 알카리용액 상태에서 가수분해가 잘 일어나는 단백질의 분해를 지속시킬 수 있어 탄수화물보다 저분자화될 수 있는 기회가 많아 한외여과시 이탈됨으로써 시료내의 단백질 양은 감소되고 총 탄수화물의 양이 상대적으로 증가하는 것으로 여겨진다. 결국 β-글루칸의 탄수화물 증가는 대부분 비수용성인 β-글루칸의 증가로 인해 용해도는 감소하는 것으로 여겨진다.

이상과 같은 결과로 볼 때, β-글루칸의 제조공정시 알카리용액 하에서 추출온도, 추출시간은 β-글루칸의 물성특성에 크게 영향을 미칠 수 있는 기술적 지표가 될 수 있다. β-글루칸을 제조공정시 추출온도를 변화(실온, 40, 60 및 80℃)시킬 경우, 당 함량 증가, 단백질 함량 감소, 용해도 감소가 있었지만 및 수율 변화에는 큰 영향을 주지 않는다. 또한 β-글루칸의 제조 공정중 일정 온도(추출온도: 60℃)에서 추출시간을 연장시킬 경우, 추출시간이 길어짐에 따라 당의 함량은 점점 증가하였고, 단백질의 함량은 점차 감소하였으나 수율에는 큰 변화가 없었다.

표 2 일정 온도에서 추출시간에 따른 β-글루칸의 영향

추출온도 (℃)	추출시간 (hr)	배양액 기준 β-글루칸 수율(%)	총 탄수화물 (%)	물에 대한 용해도 (%)
25	24	0.150±0.01	62.4±2.6	70.4±2.3
60	6	0.148±0.01	65.1±1.3	50.4±2.8
60	12	0.157±0.007	67.0±2.2	44.5±1.6
60	24	0.156±0.02	79.4±3.7	40.2±1.1
60	48	0.153±0.012	87.1±2.1	32.4±1.3

2. 불용성 β-글루칸의 수용화

2-1. 불용성 글루칸의 수용성화(β-글루칸의 설페이트화 과정)

영지의 불용성 글루칸을 가용성화하여 수용성 β-글루칸 설페이트를 조제하는 방법은 다음과 같다.

우선 우레아를 메틸설폭시드(Me₂SO)에 녹인 후, 여기에 불용성 글루칸을 가하였다. 완전히 녹을 때까지 혼합한 후, 다시 메틸설폭시드에 진한 황산이 첨가된 용액(산성화된 Me₂SO)을 첨가하였다. β-글루칸-Me₂SO-우레아 용액에 산성화된 용액을 천천히 가한 후, 100℃에서 가열하여 반응을 유도하였다. 반응 후 냉각시킨 물로 희석시키고 반응되지 않은 물질은 필터로 여과시켰다. 여과된 엷은 오렌지색의 용액에 초순도 탈이온수를 가한 후, 한외여과 장치를 이용하여 농축시키고, 농축액을 동결건조하여 수용성 글루칸을 얻었다.

영지의 불용성 β-글루칸을 가용성화하여 수용성 β-글루칸 설페이트를 조제하기 위하여, 표 3과 같은 다양한 시료를 이용하여 시험하였다.

직접적인 열수 추출과정를 통해 얻은 직접 추출물을 설페이션시킨 결과 0.578%로 가장 높은 수율을 얻었고, 알카리 추출물을 한외여과시켜 얻은 시료에서 는(Alkali Ex-UF) 0.084%의 수율, 그리고 보다 높은 순도를 위해 알카리 추출후 에탄올로 침전시킨 후 투석시킨 시료(Alkali-EtOH-DI)는 0.094%의 수율을 얻었다. 특히 100% 불용성인 β-글루칸의 수용화 과정을 통해 얻어진 수용성 β-글루칸은 85%의 수율로 얻었다.

표 3 불용성 β-글루칸의 추출 방법에 따른 수용성 β-글루칸의 수율

방법	샘플번호	β-글루칸 수율(%)	수용성 β-글루칸 수율(%)
직접 추출물	A	1.445	0.578
	B	1.466
Alkali Ex-UF	A	0.211	0.084
	B	0.21
Alkali-EtOH-DI	A	0.22	0.094
	B	0.25
불용성 β-글루칸	A	100	85

3. 수용성 β-글루칸의 물리화학적 특성

3-1. 용해도

설페이트로 부분 치환된 β-글루칸 100㎎을 10㎖(1%)의 증류수에 넣고 강하게 혼합하여 녹였다. 용액을 6000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후, 건조시켜 무게를 측정하며 최초 무게 대비 용해도를 측정한 결과, 표 4와 같이 95% 이상 용해되었다. 색은 다크 브라운이었으나 수용화과정을 거친 후 엘로우 브라운으로 변하였다.

표 4 수용성 β-글루칸의 용해도

특성	불용성 β-글루칸	수용성 β-글루칸
색	다크 브라운	엘로우 브라운
수율(%)	-	85
용해도(%)	5% 〈	〉95

3-2. 수용성 글루칸의 황(S) 함량

10㎎의 수용성 β-글루칸을 증류수에 잘 녹인 후, 90%의 포름산을 가하여 최종 60%에서 시료의 농도가 1㎎/㎖이 되도록 하였다. 이것을 밀폐된 시험관에 넣어 잘 용해시킨 후, 100℃에서 8시간 동안 가수분해하였다. 가수분해된 시료는 진공 조건하에서 건조시킨 후 0.5㎖의 증류수로 용해시킨다(500㎍/㎖). 0.2ml의 가수분해물과 표준용액(1.813g의 K₂SO₄를 100ml의 증류수에 녹인 용액)에 3.8㎖의 시약 A(100㎖의 증류수에 4g의 TCA를 녹인 용액)와 1㎖의 시약 B(젤라틴/BaCl₂ 용액; 400㎖의 증류수를 60-70℃로 항온시키면서 2.0g의 젤라틴을 용해시켰다. 젤라틴성 용액을 냉각시키고 4℃에서 최소한 6시간동안 방치한 후, 20g의 BaCl₂를 가하여 15분 동안 방치한 후, 500 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료내의 설페이트 함량은 K₂SO₄ 용액의 농도에 따른 흡광도로부터 얻은 직선으로부터 산출하였다.

설페이션을 통한 불용성 다당류의 수용화를 통해 얻어진 수용성 β-글루칸 내의 함유된 치환된 황의 양을 정량한 결과를 표 5에 나타내었다. 즉 설페이션 과정을 거치지 않은 불용성 β-글루칸의 경우 황의 함량은 0.2%이었으나 설페이션과정을 거친 수용성 β-글루칸은 14.9%을 갖는 다당류이었다. 불용성 다당류에 SO₃ ^- /단당(%) 비율은 80:48,600으로 607 단당 잔기마다 1개였으나, 수용성 β-글루칸은 9개 잔기마다 1개로 치환되었다. 또한 SO₄/단당(%)의 비율은 불용성 β-글루칸에서는 506 잔기마다 1분자이었으며, 수용성 β-글루칸은 7.5개의 단당 잔기마다 1개의 SO₄가 나타났다.

표 5 불용성 β-글루칸과 설페이션된 수용성 β-글루칸의 황화합물의 구성

특성	불용성 β-글루칸	수용성 β-글루칸
설페이트(%)	0.2	14.9
SO3 -/단당(%)분자비(80:180=2.35)	0.2/54 = 1:270(80:48,600) 607 잔기마다 1개의 SO3 -	15/60 = 1:4(80:720) 9개 잔기마다 1개의 SO3 -
SO4 /단당(%) 분자비(96:180=1.88)	0.2/54 = 1:270(96:48,600) 506 잔기마다 1개의 SO4	15/60 = 1:4(96:720) 7.5 잔기마다 1개의 SO4

3-3. 당 함량 및 단백질 함량 분석

β-글루칸의 당 함량은 페놀-황산법, 단백질의 함량은 BCA 단백질 에세이 키트(protein assay kit; Piece 사)를 사용하여 측정하였고, 그 결과는 표 6과 같다.

표 6 불용성 β-글루칸과 설페이션된 수용성 β-글루칸의 총 탄수화물

특성	불용성 β-글루칸	수용성 β-글루칸
총 탄수화물	62.4±2.9	74.2±0.05
총 단백질	12.5±0.03	9.5±0.26

3-4. 구성당 분석

구성당을 분석하기 위하여 시료 10㎎을 0.1N HCl에 용해시켜 질소를 충진시킨 후, 100℃에서 5시간 동안 가수분해시켰다. 여기에 3배량의 에탄올을 가하여 4 ℃에서 하루밤 동안 방치한 후, 원심분리하여 얻은 상등액을 50℃에서 감압농축하여 수분을 완전히 제거하였다. 수분이 제거된 가수분해된 단당에 100㎕의 포화 피리딘을 넣어 완전히 용해시켰다. 대조 단당의 경우, α-글루코스, β-글루코스, 아라비노스, 프럭토스, 갈락토스, 만노스, 리보스, 크실로스를 5㎖용 바이알에 10㎎씩 넣고 1㎖ 피리딘을 가하여 용해시킨다. 각각의 바이알에 20㎕의 헥사메틸 디실라존과 10㎕의 트리메틸 클로로실란을 가하여 완전 용해시켰다. 80℃에서 30분간 반응시킨 후, 반응액내의 당 분석은 가스크로마토그라프(GLC)를 이용하여 분석하였다. 분석조건은 다음과 같다. 칼럼; 3% OV-17(80-100 mesh Shimalite) 3mm(D) x 3m(L) 보론실리케이트 글라스 칼럼, 칼럼온도; 150-180℃ 그라디엔트, 검출온도 (Detector temperature); 240℃, 인젝션온도(Injection temperature); 240℃, 캐리어 가스(Carrior gas); He, 유동도(Flow rate); N₂-40 ㎖/min, air-60 min, Detector; FID, Attenuation ; 10² x 2¹ a.f.s.

분석 결과, 수용성 β-글루칸의 주요 구성 성분은 표 7에서 보는 바와 같이, 80.8%가 포도당으로 구성되었으며, α-결합 글루코스는 34.9%, β-결합 글루코스는 35.9%를 차지하였다. 대조 다당류로 사용한 시그마사의 초특급 시약 β-글루칸, 만난, 라미나린 및 지모산 A를 분석한 결과, 만난은 89%가 만노오스로 구성되어 있었으며, 고순도 β-글루칸인 라미나린은 42.7%의 α-글루코스, 47%의 β-글루코스로 구성되었다.

표 7 수용성 β-글루칸의 단당류 함량(%)

다당류	구성 단당류
	리보스	크실로스	프럭토스	만노스	갈락토스	α-글루코스	β-글루코스
수용성 β-글루칸	-	-	6.4	17.9	4.8	34.9	35.9
불용성 β-글루칸	-	1.3	4.26	4.24	9.4	44.8	23.8
만난	-	-	9.7	88.7	-	1.6	-
라미나린	-	-	2.2	-	8.1	42.7	47.0
지모산	0.6	-	-	37.0	1.4	25.7	35.6

3-5. 헥소사민(Hexosamine)의 함량

각각의 탄소원을 이용하여 추출, 분리된 다당류내의 헥소사민 함량을 측정하였다. 각 시료 5mg에 3N HCl 1㎖을 넣고 질소로 충진하여 100℃에서 15시간 가수분해시킨 후, 여과 감압농축하여 건조시켰다. 건조된 시료에 1㎖의 증류수를 가하여 완전히 녹인 후 0.5㎖를 취하여 시험관에 넣고, 시료에 대한 시약 A-1(1.5㎖의 아세틸아세톤과 50㎖의 1.25N Na₂CO₃ 혼합액)과 표준 글루코사민에 대한 시약 A-2(1.5㎖의 아세틸아세톤과 50㎖의 0.5N Na₂CO₃ 혼합액)을 다당류와 표준 글루코사민이 들어있는 시험관에 각각 1㎖씩 넣어 96℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액을 상온에서 식힌 다음, 10㎖의 96% 에탄올과 1㎖의 시약 B(진한 염산 30㎖에 p-디메틸아미노벤즈알데히드 1.6g를 녹이고 95% 에탄올 30㎖를 첨가한 용액)를 가하여 1시간 동안 방치한 후 535 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료내의 총 헥소사민의 함량은 표준 글루코사민을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 구하였다.

3-6. 적외선 스펙트럼

소량의 β-글루칸에 400배의 포타시움 브로마이드를 첨가하여 잘 분쇄시킨 후, 디스크(disc)를 만들고 FT-IR(Bruker, IFS-48)을 이용하여 측정하였다. 각 시료당 8번 스캐닝하여 IR 스펙트럼을 측정하였다. 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.

적외선 스펙트럼 측정 결과, 탄수화물 가운데 카르보닐 그룹(C=O)은 1725-49㎝^-1, 아세트아미도 그룹은 1648㎝^-1 부근에서 흡수파장을 보이는데, 글루칸의 경우 이러한 파장에서 모두 피이크를 나타내었다. 고리 형태의 단당은 제1번 탄소와 제5번 탄소는 에테르 결합(C-O-C)을 이룬다. 이러한 구조는 1150∼1080㎝^-1(링 형태), 1150∼1060㎝^-1(알킬에테르)에서 흡수파장을 나타내는데, 대부분의 시료는 이와 같은 범위의 파장에서 피크를 보였다.

3-7. NMR분석

수용성 β-글루칸의 결합 형태 및 구조적 특성은 200 MHz 스펙트로포토메타 (Bruker, AM-200, 독일)를 이용하여 ¹³C-NMR 스펙트럼 분석하였다. 용매로는 Me₂SO-d₆ 또는 D₂O 1㎖에 30㎎의 수용성 글루칸 및 표준물질을 넣어 용해시켜 측정하였다. β-1,3 링크된 트리플-헬리칼 글루코피라노스의 대조물질로 라미나리아 디키타라 (Laminaria digitata, 시그마사) 유래의 라미나린(laminarin)을 이용하였다.

그 결과는 표 8과 같다. β-글루칸은 시그마사의 95% 이상의 순도를 보인 라미나린보다 순도는 높지 않았으나 각각의 탄소에서 동일한 피크를 보여 β-글루 칸임을 알 수 있었다.

표 8 수용성 β-글루칸 및 라미나린 ¹³C-NMR 화학적 시프트

샘플	C-1	C-2	C-3	C-4	C-5	C-6
라미나린	106.2	76.5	88.5	71.5	78.8	63.3
수용성 β-글루칸	105.2	76.0	86.0	73.5	78.0	63.5

3-8. 분자량 측정

시료 10㎎를 1㎖의 0.3N NaOH에 용해시켜 세파로스(sepharose) CL-4B 칼럼에서 용출시켰다. 이때 칼럼 크기는 16mm(D) x 530mm(L)이고, 유동도는 6 ㎖/hr, 분획량을 2㎖로 설정하였다. 각각의 칼럼 크로마토그라피에서 얻은 용출물은 페놀-설폰산 방법을 이용하여 반응시킨 후 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 덱스트란(dextran)은 시그마사의 분자량 2,000, 124, 70 그리고 9.3 kD의 덱스트란을 각각 사용하였다.

각각의 시료를 용출시킨 결과 도 6과 같은 크로마토그람을 얻었다. 주 피크는 분획 번호 45∼46에서 최대 피크를 보임으로써, 이들의 평균분자량은 9.3 kD의 다당류인 것으로 나타났다.

4. β-글루칸의 대량생산

4-1. 배지

균주를 보관하기 위한 사면배지는 감자 덱스트로스 한천(PDA)를 사용하였으 며, 그외 모든 배지는 IYSM 배지를 사용하였다.

4-2. 종균 배양

사면배지로부터 균사체를 분리하여 소량의 액체 배양용 기본배지에 가한 후 호모나이저로 균질화시켜 100㎖의 액체배양용 기본배지가 함유된 500㎖ 배양용 플라스크에 분주하여 25℃에서 120 rpm으로 6일간 진탕 배양하였다.

4-3. 본 배양

액체배양용 배지가 100㎖씩 들어 있는 500㎖ 배양 플라스크에 균질화된 종균배양액 10㎖씩 접종하여 25℃에서 6일간 진탕 배양하였다.

4-4. 발효조 배양

균체를 포함한 배양액 전체를 균질화시킨 종균을 발효조(코바이오텍, 3L)에 10%(v/v)되게 접종하였으며, 이때 작업 크기는 3로 하고, 교반속도는 300 rpm, 통기량은 1.0 vvm으로 하여 25℃에서 6일간 배양하였다. pH 조정액으로는 0.5N NaOH, 소포제로는 실리콘수지를 사용하였다.

4-5. β-글루칸의 조제

β-글루칸의 대량생산은 다음과 같은 방법으로 행하였다.

균사체 배양후 알카리처리한 추출액을 한외여과장치(Satorius. Co. SM 17521)를 통해 여과 농축하여 고분자의 다당류를 분리하였다. 막의 구멍(pore) 크기는 분자량 M.W 10,000의 막을 사용하였다. 한외여과는 실온에서 2 bar의 공기압을 가하면서 글루칸 추출액을 농축한 다음, 농축액에 1,000배의 탈이온수를 연속적으로 가하면서 희석 농축을 실시하였다. 농축된 다당류액은 동결건조를 통하여 수 획하였다.

4-6. 제조공정에 따른 수율

균체 및 배양여액으로부터 글루칸을 추출시 사용되는 NaOH는 그 첨가량에 따라 중요한 요인이 될 수 있다. 그러므로 NaOH을 0.1M으로부터 3.0M 농도로 각각 처리했을 때 표 9와 같은 결과를 얻었다. 표 9에서 보는 바와 같이, 각각의 농도로 처리된 배양액으로부터 얻은 Wet 균사체의 비율은 농도가 높을수록 적어졌다. 이는 수산화나트륨의 농도가 높을수록 균체에 작용할 수 있는 가수분해과정이 활발하여 균사체의 세포구조를 와해시키는 것으로 여겨진다. 그러나 수산화나트륨의 농도가 1.5M 부터는 Wet 균사체의 수율에 큰 영향을 주지 못하는 것을 알 수 있다.

따라서 파이러트 규모에서 공정시, 1.5M∼2.0M의 NaOH를 첨가하는 것이 가장 경제적이라 여겨지며, 최종농도가 2.0M이 되도록 수산화나트륨을 직접 넣은 경우와 비교할 때 큰 차이가 없음을 알 수 있었다.

배양된 균사체를 믹서로 혼합한 후, 각각의 비이커에 넣고 2M NaOH를 첨가후 1일 동안 실온에서 방치한후 아세트산으로 중화시킨다. 중화된 배양액에 2 v/v, 2.5 v/v 및 3 v/v의 에탄올을 첨가한 후 회수되는 글루칸의 비율을 조사한 결과, 에탄올의 첨가량에 따라 다당류의 수율은 점차 증가하였으나 큰 차이는 없었다. 또한 중화된 배양액을 에탄올 침전방법을 사용하였을 때(샘플 2), 다당류의 회수율은 0.25%이었다. 대조실험 여과액을 한외여과기(MW size;10,000)로 분리할 경우, 분자량이 10,000 이상인 농축액에서는 약 0.1%의 다당류가 회수되었다.

표 9 추출방법에 따른 수율

샘플번호	정제방법	배지량(L)	글루칸(g)		수율(%)
			AI	AS
1	한외여과(UF)	2.9	4.10		0.144
2	한외여과(UF)	2.5	0.85	2.08	0.117
3	EtOH 침전법	1.0	4.10	3.17	0.250
4	UF:0.1N NaOH 사용 추출시	1.0	3.90		0.390
5	UF:0.5N NaOH 사용 추출시	1.0	4.40		0.440
6	UF: 1N NaOH 사용 추출시	1.0	2.34		0.234
7	UF:1.5N NaOH 사용 추출시	1.0	2.05		0.205
8	UF: 2N NaOH 사용 추출시	1.0	2.11		0.211
9	UF: 3N NaOH 사용 추출시	1.0	1.61		0.161
10	UF: 10N NaOH 사용 추출시	1.0	2.34		0.340
11	2V EtOH	1.0	1.18		0.118
12	2.5V EtOH	1.0	2.17		0.217
13	3V EtOH	1.0	2.07		0.207
14	열 추출물(동결건조)	1.4 sup/1.9	23.94		1.260
15	열 추출물(EtOH 침전)	2.4 sup/2.7	4.44		0.164

약어- AI; 알카리 가용성, 알카리 불용성, AS; 원심분리시 수용성이 있는

부분, sup; 상청액

5. 수용성 β-글루칸의 안전성

5-1. 급성복강독성시험

가. 시험동물 및 투여방법

5주령의 ICR(♂,♀) 쥐를 1주간 사육실에서 예비 사육후 체중증가가 순조로운 동물을 무작위법으로 군 분리하였다. 투여 용량에 따라 암수 양군으로 분리하며, 1개 군은 5마리의 쥐로 구성되게 하였다. 투여 용량의 설정은 국립안전연구원의 급성복강독성시험을 기준하여 군당 대조군, 제1군(1140 ㎎/㎏), 제2군(1520 ㎎/㎏), 제3군(2020 ㎎/㎏) 및 제4군(2700 ㎎/㎏)으로 하였다. 분말상의 시험물질(표 10)를 생리식염수에 현탁시켜 1㎖ 주사기를 사용하여 강제 복강투여하며, 시험기간 은 7일간 하였다(표 11). 시험물질을 투여한 후, 체중변화, 임상증상 및 사망 동물을 체크하고, 실험이 끝나는 7일차에 최종 부검을 하여 내부의 장기 변화를 관찰하였다.

표 10 급성독성시험된 시료의 특성

샘플번호	특성	비고
샘플 1	알카리 추출물→한외여과 농축→불용성부분→ 고온고압멸균→불용성 β-글루칸	투여경로: 복강투여
샘플 2	샘플 1→설페이션 수용화→한외여과 농축→ 수용성 글루칸→고온고압멸균→수용성 β-글루칸	투여경로: 복강투여
샘플 3	수용성 β-글루칸 - 40 ㎎/㎏(i.v)	40 ㎎/㎏ 으로 정맥

표 11 수용성 β-글루칸의 급성독성시험방법

시험군	성별	동물수	총투여량 (㎎/㎏)	투여회수	투여액량 (㎎/㎏)	시험기간 (day)
대조	♂	5	-	1	20	7
	♀	5	-	1	20	7
G1	♂	5	1140	1	20	7
	♀	5	1140	1	20	7
G2	♂	5	1520	1	20	7
	♀	5	1520	1	20	7
G3	♂	5	2020	1	20	7
	♀	5	2020	1	20	7
G4	♂	5	2700	1	20	7
	♀	5	2700	1	20	7

나. 검사 항목

(1) 임상증상 및 사망 동물

투여 직후 및 시험기간 동안 시험물질로 인한 임상증상 및 사망동물을 기록하였다. 시험기간 동안 시험물질로 인한 동물의 특이한 임상증상은 투여후 1일째 이후 활동성 감소, 비정상 보행, 입모, 안검하수가 나타났으며 점차적으로 정상을 회복하였으며 사망례는 불용성 β-글루칸은 표 12, 수용성 β-글루칸은 표 13과 같다. 또한 시험물질 수용성 β-글루칸을 정맥 투여하였을 때의 동물의 임상 증세와 사망례는 나타나지 않았다.

표 12 불용성 β-글루칸의 사망례와 LD50

성별	용량 (㎎/㎏)	투여후 날자별 사망동물 숫자								사망율	LD50 (㎎/㎏)
		0	1	2	3	4	5	6	7
♂	0									0/5	2216.9
	1140	0								0/5
	1520	0								0/5
	2020	0		1	1					2/5
	2700	2		2						4/5
♀	0									0/5	1662.6
	1140	0								0/5
	1520	0		2						2/5
	2020	0		3	1					4/5
	2700	1		4						5/5

표 13. 수용성 β-글루칸의 사망례와 LD50

성별	용량 (㎎/㎏)	투여후 날자별 사망동물 숫자								사망율	LD50 (㎎/㎏)
		0	1	2	3	4	5	6	7
♂	0									0/5	2700.0 〉
	1140	0								0/5
	1520	0		1						1/5
	2020	0		1						1/5
	2700	1								1/5
♀	0									0/5	2700.0 〉
	1140	0								0/5
	1520	0								0/5
	2020	1								1/5
	2700	1								1/5

(2) 체중변화

투여 당일, 투여후 1일, 3일, 7일째에 체중변화를 기록했다. 대조군과 시험물질 투여군 간의 체중변화는 투여일, 투여후 1일, 3일 및 부검일에 관찰한 결과 유의성 있는 변화가 관찰되지 않았다.

(3) 부검소견

시험종료시 전 동물을 에틸에테르로 치사시켜 시험물질로 인한 내, 외부 장기의 변화를 기록했다. 시험물질 샘플 1(불용성 글루칸)을 투여한 후 폐사한 개체 및 생존한 개체의 전반적인 예에서 간장과 위장 및 비장과의 유착소견이 관찰되었다. 또한 시험물질 샘플 2(수용성 β-글루칸)의 정맥투여한 후 폐사한 개체 및 생존한 개체에서는 비 정상 소견이 관찰되지 않았다(표 12∼표 13 참조).

(4) 급성독성 소견

면역증강제로 개발 추진중에 있는 수용성 β-글루칸의 안정성을 평가하기 위하여 대량 배양된 영지 균사체 β-글루칸 중에서 비수용성 다당류를 분리하고, 여기에 설페이트로 부분 치환시킨, 용해성이 우수한 수용성 β-글루칸을 마우스 (ICR, ♂♀)에서 복강투여 급성독성시험을 수행한 결과 다음 결과를 얻었다.

우선 불용성 및 가용성 부분이 혼용된 β-글루칸은 대량 배양된 β-글루칸의 비용해성 부분으로서 임상증상과 부검 소견, 반수치 사용량(LD₅₀)으로 볼 때 암컷에서 1822.0 mg/kg으로 나타났으며, 수컷은 1691.0 mg/kg으로 나타났다. 장유착 소견이 나타났는데 이는 β-글루칸의 비용해성 부분의 염증작용으로 기인한 것으로 생각된다.

β-글루칸의 불용성 부분을 설페이트로 부분 치환을 시킨 수용성 β-글루칸은 임상 증상과 부검 소견, 반수 치사 용량(LD₅₀)으로 볼 때 매우 우수한 안정성을 보였다. 수용성 β-글루칸을 정맥투여 경로로 주사하였을 때 임상 증상과 부검 소견으로 볼 때 이 농도에서도 안정성을 보였다.

결론적으로 표 14에 기술한 바와 같이 수용성 β-글루칸의 마우스 복강투여시 급성독성 시험의 LD50치는 매우 안정한 것으로 나타났다.

표 14 마우스 복강투여시의 수용성 β-글루칸 및 WI-β-글루칸의 급성독성시험

성별	불용성 β-글루칸 (㎎/㎏)	수용성 β-글루칸 (㎎/㎏)
♂	2216.9	2700 〉
♀	1661.6	2700 〉

6. β-글루칸의 생리적 활성

6-1. β-글루칸과 관련 다당류의 고형암 S-180에 대한 항암 활성

가. 실험동물 및 종양세포

마우스는 20∼25g의 ICR계 웅성으로 삼육축산에서 구입하여 사용하였다. 암세포인 사르코마 180은 한국세포주 은행으로부터 분양받아 사용하였다.

나. 종양세포의 이식

ICR계 마우스의 복강 내에 일주일간 간격으로 이식하여 보존하고 있는 사르코마 180 세포를 실험용 종양세포로 사용하였다. 실험동물의 복강내에서 7일간 배양된 사르코마 180 세포를 복수와 함께 취하여 빙냉, 멸균한 생리식염수를 가하여 400 x g로 3분간 원심분리하여 세포침전물을 분리하였다. 분리된 세포를 빙냉, 멸균된 생리식염수로 3회 세척한 후 1 x 107 cells/㎖가 되도록 희석하였다. 이 부유액 0.1㎖씩(1 x 106 cells/mouse)을 실험동물의 왼쪽 서혜부에 피하 이식하였다.

다. 약물투여

종양세포를 10마리씩 군 분리된 마우스에 각각 이식하고 72시간후 약물투여를 시작하되, 매일 1회씩 10일간 연속하여 복강내 주사하였다. 대조군에는 생리식염수를 양성대조군에는 크레스틴을 20 ㎎/㎏의 농도로, 처치군에는 생리식염수에 용해시킨 시료를 20 ㎎/㎏씩 주사하였으며 주사용량은 0.1 ㎖로 하였다.

라. 항암실험 결과의 판정

종양세포를 이식한지 30일째 되는 날 실험동물을 치사시켜 유발된 고형암을 적출한 후, 그 중량을 측정하여 평균 종양중량을 얻고, 증식저지율은 생리식염수를 투여한 대조군과 비교하여 종양저지 백분율(Percent inhibition ratio = I.R.(%))을 계산하였다.

I.R.(%) = (Cw - Tw) / Cw × 100

Cw : 대조군의 평균 종양무게

Tw : 처치군의 평균 종양무게

마. 항암실험 결과

β-글루칸을 산업적으로 다양하게 이용하기 위해서는 해결되어야 할 문제점 가운데 하나가 용해성이다. 이와 같은 용해성을 해결하기 위해 개발된 것이 수용성 β-글루칸이다. 수용성 β-글루칸과 비수용성 β-글루칸간의 항암활성을 비교한 결과는 표 15와 같다. 즉 불용성 β-글루칸의 항암활성이 52.5%인 반면, 수용성 β-글루칸의 항암활성은 80.5%이었다. 이는 대조물질인 크레스틴(PS-K)보다 20% 이상의 암 저지효과가 있었다.

6-2. 면역활성 시험

가. 시약, 실험동물 및 대조물질

RPMI 1640, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지 및 소 태아 혈청은 GIBCO(Grand Island, N. Y)사로부터 구입하고, 스트렙토마이신, 페니실린, LPS(E. coli 0127: B8), IFN-γ, NaNO₂ 그리고 대조 다당류로 사용한 라미나린, β-글루칸 등은 시그마사(St. Louis, MO)에서 구입하였다. 실험에 사용한 ICR계 웅성 마우스는 생후 8∼10주령으로 무게 20-24g의 것을 삼육축산에서 구입하였다. 마우스의 사육조건으로 실험동물실 온도는 22±2℃, 습도는 55∼60%로 유지하였으며, 마우스용 고형사료와 물을 제한없이 공급하였다.

수용성 글루칸의 면역활성 시험을 하기 위하여 대조 검색물질은 INF-γ (시그마사), LPS(시그마사) 및 생물 유래 다당류 등을 실험 재료로 이용하였다.

나. 인비트로 시험

(1) 마우스 경구 및 정맥투여에 따른 혈중 종양괴사인자(TNF-α)의 측정

① TNF-α의 정량방법

혈청 및 배양물내 TNF-α의 정량은 멀티플 앤티바디 샌드위치(multiple antibody sandwich) 원리를 이용한 고상(solid-phase) ELISA 방법을 통하여 측정하였다. 마우스 혈청내의 TNF-α를 측정하기 위한 혈청의 준비는 다음과 같이 행하였다. 20∼25g의 ICR계 마우스에 수용성 β-글루칸(20 ㎎/㎏), LPS(500 ㎍/㎏) 및 β-글루칸 및 크레스틴^TM 등을(20 ㎎/㎏) 5일 동안 연속 투여하였다. 약물 투여 4일후, 마우스를 에테르로 마취하고 복부를 절개하여 복부 대동맥으로부터 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액은 2시간 동안 방치한 후, 원심분리하여 혈청을 분리하고 -70 ℃에서 동결시켜 보관하였다가 실험에 이용하였다.

대식세포 및 모노사이트 배양액내의 TNF-α 정량은 다음과 같이 실행하였다. 대식세포 배양액에 수용성 β-글루칸을 비롯한 활성인자들을 가하고 24시간 동안 배양한 후, 배양 상층액을 수획하여 초원심분리를 하였다. 원심분리를 통해 얻어진 상층액들은 -70 ℃에서 동결보관하여 실험에 이용하였다. 혈청과 배양상층액내 의 TNF-α 정량법을 간략하면, 모노크로날 앤티-mTNF-α가 전코팅되어 있는 96-well 마이크로티터 (microtiter) 플레이트에 50㎕의 희석버퍼를 넣고, β-글루칸으로 활성화된 마우스 혈청 및 대식세포의 배양상등액을 50㎕을 가하여 시험 샘플내에 존재하는 마우스 TNF-α와 결합시킨다. 시료를 첨가한 후, 37℃에서 3.5시간 동안 반응시킨 후, 세척버퍼로 4회 수세하여 결합되지 않은 물질을 제거시킨다. 다시 퍼옥시다제-콘쥬게이티드 폴리크로날 앤티-mTNF-α(HRP-conjugate)를 첨가하여 이미 결합된 mTNF-α와 결합시킨다. 37 ℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 결합하지 않은 물질을 제거하기 위하여 플레이트를 4회 수세하고, 기질액을 가하여 퍼옥시다제와 촉매반응을 유도시켜 발색시킨다. 효소의 반응을 정지시키기 위하여 100㎕의 반응 정지액을 가하였다. 반응 정지후 30분 이내에 ELISA 리더( Bio-Tek instrument, Inc. Ceres UV. HDi)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료 속의 mTNF-α 양은 표준 mTNF-α의 농도에 따라 얻어진 흡광도를 플로팅하여 얻은 표준직선으로 산출하였다.

② 경구투여시 혈중 종양괴사인자의 생성 결과

수용성 β-글루칸에 의한 마우스 혈중 종양괴사 인자의 생성 촉진은 표 16과 같이 대조군보다 수용성 β-글루칸의 경우, 혈중 TNF의 농도가 대조군보다 15.5배 증가하였으며, 불용성 β-글루칸보다 1.4배 많은 종양괴사인자의 촉진 효과를 볼 수 있었다.

(2) 랫트의 모노사이트(Monocyte)로부터 종양괴사인자 측정

① 모노사이트 세포 배양

모노사이트는 랫트의 골수에서 채취하였으며, 세포들은 4℃에서 200 x g로 10분간 원심분리하였다. 1L에 40mM 글루타민, 50㎖의 엔도톡신프리 열 불활성화된 (free heat inactivated)(58℃, 30분간) 소 태아 혈청, 100 IU 페니실린 및 100㎍ 스트렙토마이신이 함유된 DMEM배지로 세척한 다음, 100mm 티슈 배양접시(Cornning 25020)에 분주하여 37℃의 5% CO₂ 인큐베이타에 2시간 배양하였다. 2시간후 배양접시의 상층액을 제거하여 비부착성 세포를 버린 후, 다시 신선한 DMEM배지를 가하여 배양하여 부착성 세포를 얻었다. 이를 수획하여 실험에 이용하였다.

② 모노사이트 활성

골수의 모노사이트 세포는 코스타 페트리 접시에 2 x 10⁶ cells/㎖ 세포가 되도록 분주하고 37℃, 5%의 CO₂하에서 전 배양하였다. 배양된 대식세포 가운데 비부착성 세포를 제거하고, 실험전 37℃로 유지된 신선한 DMEM배지로 수세한 다음 수획하였다. 수획된 모노사이트 세포는 트리판 블루(tryphan blue)로 염색하여 95%의 세포생존율을 가질 때 실험에 활용하였다. 세포수는 혈구계(hemocytometer)를 이용하여 2 x 10⁶ cells/㎖로 조정한 후, 96 well에 200㎕씩 분주(4x10⁵ cells/well)하여 37℃, 5% CO₂ 하에서 90분간 배양하였다. 90분후 비부착성 세포를 제거하고, 다시 신선한 180㎕의 DMEM배지를 각각의 well에 분주하였다. 시험하고자 하는 수용성 β-글루칸을 포함한 배지 20㎕를 각각 첨가하여 37℃, 5%의 CO₂ 하에서 24시간 동안 배양한 후 대식세포의 활성 정도를 측정하였다.

③ 모노사이트 활성 결과

수용성 β-글루칸에 의한 랫트의 모노사이트를 활성한 결과 종양괴사 인자의 생성 촉진은 표 17과 같이 수용성 β-글루칸은 대조군보다 6.3배 증가하여 촉진 효과를 볼 수 있었다.

(3) 수용성 β-글루칸을 정맥투여후 혈청 TNF-α농도 측정

모노카인(Monokine)인 TNF는 항암활성을 중재하는 단백질로서 활성화된 대식세포에 의해서 분비된다. 또한 TNF는 호중구 세포의 기능조절, 미로이드 세포 (myloid cell) 분화촉진, B 세포의 증식 및 대식세포등의 활성 등을 유발시킬 수 있다. 특히 TNF-α는 정상세포와 무관하게 종양, 살모넬로시스(salmonellosis), 그리고 바이러스에 감염된 세포를 인식하고 살해시킬 수 있는 능력이 있다. 이런 의미에서 항암성 다당류에 의한 종양괴사 인자의 생성 촉진은 생체내 면역반응의 촉진유무에 지표로 삼을 수 있다. 수용성 β-글루칸을 투여후 마우스에서 혈액을 채취하여 혈청을 분리하고, 앞서 설명한 ELISA방법으로 TNF-α의 양을 측정하였다.

정맥투여(꼬리 미정맥)에 의한 TNF-γ생성(mouse) 정도는 다음과 같다. 수용성 β-글루칸을 증류수에 녹여 멸균한 후, 마우스 꼬리 미정맥에 투여하고 (5mg/0.2ml/kg), 시간 경과에 따라 마우스의 복부대정맥으로부터 채혈하여 TNF-γ의 양을 ELISA 방법으로 측정한 결과는 표 18과 같다.

(4) 대식세포로부터 산화질소 측정

대식세포가 생성하는 산화질소(NO)는 6∼8초간 존재하며, 그 후 자발적으로 산화되어 NO₂ ^－와 NO₃ ^－ 상태로 전환되어 축적된다. 따라서 생성되는 반응성 질소 중간체(RNI) 양은 NO₃ ^－ 을 환원 요소로 전환시켜야 정확하지만 보통 NO₂ ^－가 대부분이기 때문에 이를 발색시켜 딩(Ding) 등의 방법에 따라 간접적으로 정량하였다. 간략하면, 100㎕의 배양액과 동량의 그리스(Griess) 시약(1% 설포닐아마이드/0.1% 나프틸렌디아민 디하이드로클로라이드/2.5% H₃PO₄)를 섞고 실온에서 방치한 후, ELISA 리더를 이용해 540 nm에서 측정하였다. NO₂ ^－의 농도는 소디움 니트레이트를 희석하여 흡광도를 측정하여 표준곡선을 작성하여 얻었다.

랫트의 대퇴부로부터 골수를 채취하여 피콜-파크(ficoll-paque)에서 원심분리하여 골수내의 모노사이트를 수집하였다. 수집된 단구세포는 RPMI1640에서 배양한 후, 세포수가 ㎖당 2 x 10⁶ 되도록 한 후, 시료를 처리하여 48시간이 지난 후 산화질소를 측정한 결과는 표 19와 같다.

(5) 항보체 활성 시험

항보체활성(anticomplementary activity)은 야마다(Yamada) 등의 방법을 변형하여 측정하였다. 10㎖ 시험관에 150㎕의 GVB²⁺완충용액(gelatin veronal buffered saline: 0.15mM CaCl₂, 0.5mM MgCl₂, 1.8mM 소디움 바비탈, 3.1mM 바비투릭산, 141 mM NaCl 및 0.1% 젤라틴, pH 7.4)과 250 ㎍/㎖ 농도의 각 시료 50㎕를 가한 다음, 여기에 50㎕(100 U/㎖)의 모르모트(guinea pig) 혈청을 보체로서 가하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 4.75㎖의 GVB²⁺ 완충용액을 가하여 보체의 최종농도를 1 unit/㎖로 조정하였다. 조정된 보체 혼합물을 1.0 유니트, 1.2 유니트 및 1.6 유니트가 되게 각 시험관에 분주한 다음, 항 면양(anti-sheep) 헤모리신 (2MHU/㎖l)과 동량의 SRBC (5x10⁸ cells/ml)를 혼합하여 실온에서 30분간 감작한 후, 감작된 SRBC 2㎖를 시험관에 첨가하고 최종 5㎖가 되도록 GVB²⁺ 완충용액으로 조정하였다. 각각의 시험관을 37^oC에서 60분간 반응시킨다. 반응을 중지시키기 위하여 70㎕의 0.5M EDTA용액을 가하여 혼합한 후, 400 x g에서 5분간 원심분리하여 얻은 상등액의 흡광도를 541 nm에서 측정하였다. 항보체활성은 대조군 대비 총보체 용혈(50% of total complement hemolysis, TCH₅₀)의 저지율(inhibition of TCH₅₀ , ITCH₅₀ )로 나타낸다.

저지율(%) = (대조군 총보체 용혈 - 샘플 처리 총보체 용혈) /

대조군 총보체 용혈 × 100

면역계는 매우 복잡하게 연관되어 일어나는 일련의 반응계로서, 그중 보체계는 생체내에서 면역기능의 하나인 감염방어등과 같은 방어반응과 종양 면역에 중요한 역할을 한다고 알려졌다. 보체계는 항암효과가 있는 다당류에 의해 활성화되므로 항암활성 검색에 사용된 동일한 시료를 사용하여 항보체활성을 검색하였다.

표 20에서 보는 바와 같이, 보체계의 활성도는 불용성 β-글루칸의 경우, 농 도 의존적인 항보체활성을 나타내었으며 25 ㎍/ml에서는 22.4%이었으나, 200 ㎍/ml에서는 약 2배가 증가한 43.7%의 항보체활성을 나타내었다. 반면에 수용성 β-글루칸은 상대적으로 낮은 13.2%의 항보체활성을 보였는데, 이는 고분자의 다당류가 설페이트화되면서 저분자로 변하기 때문인 것으로 여겨진다. 대조군으로서 크레스틴은 20.9%의 항보체 활성을 나타내었다.

표 15 항암활성 비교

샘플	용량 ㎎/㎖	종양 무게(g)										통계		항암활성
		1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	평균	SD
수용성 β-글루칸	10	0.1	1.5	0.7	2.1	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.0	0.55	0.77	80.5
불용성 β-글루칸	10	0.0	0.4	1.8	3.0	2.3	0.5	2.0	2.0	0.1	0.0	1.34	1.04	52.5
크레스틴 (PS-K)	10	0.0	0.0	1.6	1.4	0.0	3.0	2.7	0.0	1.4	0.0	1.12	1.12	60.3
Saline	10	3.6	3.6	3.5	3.4	0.9	3.8	3.2	3.4	1.4	0.9	2.77	1.19	0
Saline	10	2.3	3.7	2.4	2.9	3.5	2.9	2.0	1.9	4.2	0.0	2.87	0.80	0

표 16 수용성 β-글루칸의 경구투여에 따른 마우스 혈청내 TNF-γ생성

시료	TNF-γ(pg/㎖)
음성 대조군	4.55
수용성 β-글루칸	70.60
불용성 β-글루칸	49.00

표 17 랫트의 골수성 모노사이트 배양액에 수용성 β-글루칸 처치 TNF-γ생성

시료	TNF-γ(pg/㎖)
수용성 β-글루칸	1320.9
불용성 β-글루칸	1462.0
LPS	2441.8
IFN-γ	1995.7
음성 대조군	209.7

표 18 정맥투여(꼬리 미정맥)에 의한 TNF-γ생성 (마우스)

시간	TNF-γ(pg/㎖)
1 시간	68.43
4 시간	83.63
6 시간	132.17
12 시간	115.27
24 시간	92.03
27 시간	29.67
48 시간	16.17

표 19 수용성 β-글루칸 농도에 따른 골수세포의 산화질소 생성능

수용성 β-글루칸 농도	산화질소(마이크로 M)
대조군	6.51±0.84
1 ㎍/㎖	15.94±1.10
5 ㎍/㎖	45.16±10.38
10 ㎍/㎖	53.02±2.66
20 ㎍/㎖	82.26±2.78

표 20 β-글루칸과 유사제품의 보체계 활성효과 비교

샘플	농도(㎍/㎖)	항보체활성(ITCH 50%)
불용성 β-글루칸 (영지균사체 추출물)	25 50 100 200	22.4 28.6 38.6 43.7
수용성 β-글루칸	50	13.2
크레스틴	50	20.9

본 발명은 생리활성이 우수한 불용성 다당류인 β-글루칸을 수용화하여 산업적으로 다양하게 활용되는 생물 신소재로서의 기능성 생리활성 다당류인 수용성 β-글루칸을 제공한다.

또한 본 발명은 한국산 담자균류를 이용하여 기존의 β-글루칸계 다당류보다 생리활성이 우수하고, 수용성 특성이 있는 물질을 제공한다.

Claims (4)

1. 한국산 담자균류로부터 알카리추출에 의하여 β-1,3-글루칸 및 β-1,6-글루칸을 포함하는 불용성 다당류 β-글루칸을 얻고, 상기 불용성 다당류 β-글루칸을황원소를 이용하여 불용성 β-글루칸 골격의 원소와 치환시켜 황의 함량이 14.9%인 수용성 β-글루칸을 얻는 것을 특징으로 하는 불용성 다당류 β-글루칸의 수용화방법.
2. 제1항에 있어서, 우레아를 메틸설폭시드에 녹인 후, 여기에 불용성 글루칸을 가하고, 그 β-글루칸-Me₂SO-우레아 용액에 산성화된 메틸설폭시드 용액을 천천히 가하고 가열하는 것을 특징으로 하는 불용성 다당류 β-글루칸의 수용화방법.
3. 삭제
4. 삭제

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