CN101280026A - 一种具有α-1,4-葡聚糖链的海胆黄多糖的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种海胆黄多糖结构鉴定以及用途。利用化学分析和波谱技术对其结构进行鉴定，发现本发明中的海胆黄多糖的重复单元的结构中含1→4和1→6两种糖苷键，主链由1→4糖苷键组成，侧链由1→6糖苷键组成，糖残基为α构型，即其为首次从海胆中分离到的一种结构新颖的葡聚糖。同时，本发明中的海胆黄多糖可协同ConA或LPS刺激脾淋巴细胞的增殖，也可通过不同的方式激活巨噬细胞，因此表明本发明中的海胆黄多糖具有免疫增强剂的作用。

Description

一种具有α-1，4-葡聚糖链的海胆黄多糖的用途

技术领域

本发明涉及一种具有α-1，4-葡聚糖链的海胆黄多糖的用途，属于天然高分子领域，也属于分子生物学领域。

背景技术

海胆黄多糖是从产于黄渤海的光棘球海胆(Strongylocentrotus nudus)中提取出来的一种多糖。国内外研究结果表明，海胆不但是一种珍贵的水产品，而且含有具有抗肿瘤、抗菌和抗病毒等多种活性的天然产物，是一种有开发前途的海洋资源。国外对海胆活性成分的研究取得了一些可喜的成果，从海胆中分离出了一些活性成分。

同时，近二十年来，由于分子生物学的发展，人们逐渐认识到糖及其复合物分子具有极其重要的生物功能，糖类化合物特别是糖缀合物上的糖链参与了多种生命现象的调解，如细胞识别、粘连与融合；信号传导；免疫与应答；细胞转化、分化与反分化、细胞的生长和衰老都离不开糖链的参与，有时糖链的作用更为直接和重要。在糖蛋白新生肽链折叠、聚合时，糖链往往是不可缺少的。多糖是由糖甙键连接起来的醛糖或酮糖组成的一类天然大分子化合物，而药用多糖的研究始于20世纪50年代末对真菌多糖抗癌效果的发现，科学家们从大量的药理和临床研究发现，从天然产物中分离出来的多糖往往是一种免疫调节剂，它能激活免疫细胞而对正常细胞没有毒副作用。多糖作为免疫治疗药物正越来越受到重视，已成为新药研究的热点之一。多糖不但能治疗机体的免疫系统受到严重损伤的癌症，又能治疗多种免疫缺损疾病，如慢性病毒性肝炎和某些耐药细菌或病毒引起的慢性疾病，而且多糖作为药物对细胞毒性小：在治疗肿瘤时，它不像化疗药物直接杀死生长着的癌细胞，而是作为一种生物免疫反应或加强抗体生成及激活剂补体等，以达到抑制和消灭肿瘤细胞的效果，对正常细胞的影响极小。自1986年日本批准香菇多糖(Lentinan)上市以来，国内外已批准临床应用的多糖有：香菇多糖、云芝多糖、裂褶多糖、牛膝多糖和猪苓多糖。研究范围涉及多糖的分离纯化、结构分析、生物学活性、药理作用、构效关系、新药评价、临床应用等，其中一些多糖组分的理化性质、结构组成已经清楚，药理学作用研究已达到分子水平、受体水平和基因调控水平。随着对多糖结构的逐步深入了解，多糖化合物的生物活性研究得以迅速发展。

发明内容：

本发明的目的是鉴定光棘球海胆黄中所分离出的多糖的结构，并确定其具体活性用途。

本发明涉及海胆黄多糖的结构鉴定，即从光棘球海胆的海胆黄中分离纯化得到的海胆黄多糖，经酸水解和GC分析表明，海胆黄多糖为首次从海胆中分离到的一种结构新颖的葡聚糖，并通过化学分析和光谱分析推断出本发明中的海胆黄多糖的重复单元结构见图1，含1→4和1→6两种糖苷键，主链由1→4糖苷键组成，侧链由1→6糖苷键组成，糖残基为α构型。

上述海胆黄多糖在浓度25μg/mL时可协同ConA显著地刺激脾淋巴细胞的增殖；不同浓度下(25-200μg/mL)可协同亚适量的LPS刺激脾淋巴细胞的增殖。另外，在25-200μg/mL的浓度范围内，海胆黄多糖对小鼠脾T、B淋巴细胞的增殖均具显著的刺激作用，且其作用呈一定的剂量依赖性。而RT-PCR法测定上述海胆黄多糖对脾细胞中各细胞因子基因表达的影响，结果初步表明小鼠脾细胞经不同浓度的海胆黄多糖处理6h后，IL-1β、TNF-α基因表达上调。同时，它可显著地促进小鼠腹腔巨噬细胞增殖，在25～200μg/mL的浓度范围内，与对照组相比有显著差异(P＜0.05)，并且可以显著地促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力。

附图说明：

图1是海胆黄多糖的重复单元

图2是海胆黄多糖水解产物薄层层析图

图3是海胆黄多糖的糖醇乙酸酯的气相色谱图

图4是NaIO₄溶液的浓度-吸光值标准曲线

图5是海胆黄多糖消耗NaIO₄的量曲线

图6是海胆黄多糖的Smith降解产物的气相色谱图

图7是海胆黄多糖的糖醇乙酸酯GC-MS联机分析中的GC图谱

图8是海胆黄多糖的紫外分光图谱

图9是海胆黄多糖的红外分光图谱

图10是海胆黄多糖的¹H NMR图谱

图11是海胆黄多糖的¹³C NMR图谱

图12是海胆黄多糖的H-H COSY图谱

图13是海胆黄多糖的HSQC图谱

图14是海胆黄多糖的NOESY图谱

图15是海胆黄多糖协同ConA对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响图

图16是海胆黄多糖协同LPS对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响图

图17是海胆黄多糖对T、B淋巴细胞增殖的影响图

图18是脾细胞总RNA电泳图

图19是海胆黄多糖对iNOS、IL-1β、IFN-γ、TNF-α基因表达的影响

图20是海胆黄多糖对巨噬细胞增殖的影响

具体实施方式：

实施例1：

1、取本发明中的海胆黄多糖10mg置于安培管中，加入2mL 2.0mol/L三氟乙酸，充N₂封管后置于110℃水解2h，减压浓缩除去三氟乙酸(＜40℃)，然后加入甲醇蒸干，重复操作三次以完全除去TFA，再向样品中加入0.5mL左右的水使样品溶解。用微晶纤维素板作薄层分析，水解后的样品在下列不同的展开剂中层析：①乙酸乙酯∶吡啶∶水∶乙酸＝5∶5∶3∶1，②正丁醇∶吡啶∶水＝6∶4∶3，③正丁醇∶水∶乙酸＝4∶5∶1。显色剂为苯胺-邻苯二酸，显色温度为110℃，10min。，显色后与葡萄糖，鼠李糖，甘露糖、半乳糖、木糖和糖醛酸标准品对照以确定糖组成。结果从图2可以看出本发明中的海胆黄多糖仅有一个棕色斑点，且其Rf值与葡萄糖标准品一致，表明其可能为一种由葡萄糖组成的多糖。

2、本发明中的海胆黄多糖经水解成单糖后，在硼氢化钠的作用下还原成相应的糖醇，经乙酰反应，得到相应的糖醇乙酸酯衍生物，使不挥发多糖变成易挥发、对热稳定的衍生物。通过气相色谱分析，色谱条件为进样口：split-splitless，温度260℃；柱：HP-5，5％phenyl methylsiloxane规格30m×0.25mm×0.25μm，流量1.3mL/min；升温程序：150℃至220℃每分钟升温2℃，220℃至280℃每分钟升温30℃，共39分钟。见图3，表明本发明中的海胆黄多糖水解产物仅产生一个峰，其保留时间为33.834min，表明此海胆黄多糖由一种单糖组成；

3、NaIO₄溶液标准曲线的绘制：用重蒸水精确配制30mM、15mM、10mM、8mM、6mM、4mM、2mM的NaIO₄溶液，均稀释250倍后以重蒸水作对照调零测定其在223nm处的吸光值，绘制吸光值A₂₂₃-浓度C标准曲线，见图4。

称取10mg上述海胆黄多糖，置于棕色反应瓶中，加入30mL 15mM的NaIO₄，振荡令其溶解，加塞置于4℃冰箱黑暗处氧化，见图5，在96h后达到平衡，接着将反应液稀释250倍测定其在223nm处的吸光值，根据标准曲线计算NaIO₄的消耗量为0.058mmol，以溴甲酚紫作指示剂，0.01M NaOH滴定计算得甲酸的释放量为0.0892mmol，[己糖基]∶[IO₄ ^-]∶[HCOOH]＝1∶1.15∶0.18。根据原理可推知，此海胆黄多糖每摩尔己糖基含1→4或(和)1→2糖苷键约0.81摩尔；1→6糖苷键或(和)非还原末端约0.19摩尔；不含1→3糖苷键。1→4或(和)1→2糖苷键与1→6糖苷键或(和)非还原末端的比例为4.2∶1。

4、Smith降解是将高碘酸氧化产物还原后进行酸水解或部分酸水解，经酸水解后用TLC或GC鉴定水解产物，由降解的产物可以推断糖苷键的位置。取9.0mg本发明中的海胆黄多糖，经NaIO₄完全氧化后，加入2mL乙二醇并并搅拌30min使反应终止，反应液对流水透析3天，再对蒸馏水透析1天。袋内液体减压浓缩至10mL，加入30mg NaBH₄，室温下暗处搅拌反应24h，再用0.1M醋酸调PH＝4～5，以除去过量的NaBH₄，依次用流水、蒸馏水透析至彻底脱盐，冷冻干燥得多糖醇。取多糖醇置于安培管中，加入2mL 2.0mol/L三氟乙酸，充N₂封管后置于110℃水解2h，减压浓缩除去三氟乙酸(＜40℃)，然后加入甲醇蒸干，重复操作三次以完全除去三氟乙酸。水解后的样品溶于3mL左右的蒸馏水中，加入20mg硼氢化钠，于室温下还原2h(不时地摇振一下)，用冰醋酸破坏过量的NaBH₄，调节溶液的pH值至4-5之间，减压蒸干，加入1-3mL甲醇及一滴冰醋酸，再减压蒸干，如此重复三次(最后一次不加冰醋酸)，真空干燥(P₂O₅)5-6h。还原后的样品加入2mL醋酸酐，密塞，100℃反应1h，减压蒸干，加入2mL甲苯，再蒸干，重复三次以完全除去过剩的醋酸酐。乙酰化后的产物用氯仿和蒸馏水交替溶解转移到分液漏斗中，振摇后静止，分层，去除水层，再以等体积的蒸馏水洗涤一次，去除水层，氯仿层以无水硫酸钠干燥，振摇后放置10min，再过滤除去硫酸钠固体，将氯仿浓缩至0.1mL后进行气相色谱(GC)分析。

见图6，表明此海胆黄多糖的Smith降解产物中有甘油(保留时间为6.538min)和赤藓醇(保留时间为13.610min)，峰面积归一化后得出二者的比例为1∶4。因此，1→4糖苷键与1→2、1→6糖苷键及非还原末端1→的摩尔比为4∶1。

5、多糖的甲基化：称取本发明中的海胆黄多糖8mg于反应瓶中，真空干燥5-6h，干燥后的样品加入用干燥4A分子筛处理过的3mL DMSO，室温磁力搅拌直至多糖样品完全溶解后加入研磨过的干燥的NaOH粉末20mg，室温搅拌10min，然后改用冰浴5min，待反应瓶中的溶液完全冰冻后，逐滴加入0.6mL碘甲烷(此过程大约需要15-20min)，同时反应物会慢慢地解冻，并逐渐澄清，直至成为亮黄色溶液，恢复至室温，继续磁力搅拌反应30min，室温减压蒸馏，去尽过量的碘甲烷，然后用蒸馏水透析两天，减压蒸至2mL左右，进行冷冻干燥，然后真空干燥5h，再重复上述操作3次后，取少量样品进行红外检测。当IR谱上原样品的3300cm^-1处强而宽的羟基峰消失，而2900cm^-1处的甲基峰相对增强时，说明样品已完全被甲基化。

将已完全甲基化后的样品溶于3mL 90％的甲酸溶液中，密塞，100℃下水浴解聚6h，减压蒸干，加入2-3mL甲醇，蒸干，重复三次以除尽过量的甲酸。然后向解聚后的样品中加入4mL2mol/L TFA，密封后110℃下水解3-4h，反应瓶中的溶液减压蒸干，再加入2-3mL甲醇，蒸干，重复三次以除尽过量的TFA。水解后的样品用2mL水溶解，加入20mg NaBH₄于室温下反应2h，然后用冰醋酸调pH值至5左右，加1-2mL甲醇及一滴冰醋酸再减压蒸干，重复三次，以除尽过量的醋酸。于110℃下干燥10-15min后，加入3mL的醋酸酐，100℃下反应1h，减压蒸去未反应的醋酸酐，加入2mL甲苯，减压蒸干，如此重复三次以除尽醋酸酐。最后将乙酰化后的样品溶于氯仿，再加入等体积的水洗涤氯仿层三次，除去水层，氯仿层加入无水硫酸钠干燥，放置10min，过滤，将氯仿溶液浓缩至0.1mL左右，作气质联用(GC-MS)分析，升温方式为T＝140(3)-250/5。

见图7，此海胆黄多糖出现了三个甲基化衍生物离子峰，其保留时间分别为10.77min、14.13min和18.17min。联机检索各质谱图，初步确定各质谱的归属；根据部分甲基化糖醇乙酸酯衍生物的裂解规律归属质谱图中的初级碎片和次级碎片，通过解析，GC谱图中三个组成依次应为1，5-二-氧-乙酰基-2，3，4，6-四-氧-甲基-葡萄糖(简写为2，3，4，6-Me4-Glc)、1，4，5-三-氧-乙酰基-2，3，6-三-氧-甲基-葡萄糖(简写为2，3，6-Me3-Glc)、1，4，5，6-四-氧-乙酰基-2，3-二-氧-甲基-葡萄糖(简写为2，3，-Me2-Glc)，三个组分摩尔比约为1∶7.80∶1.15。可以看出，上述海胆黄多糖为一种含有非还原末端1→，由1→4及1→6糖苷键组成的葡聚糖，三者的比例为1∶7.8∶1.15。

6、部分酸水解：称取一定量的上述海胆黄多糖，置于安培管中，加入0.3M的TFA，封管，100℃水解18-20h，用NaOH中和多余的TFA，透析，冷冻干燥得水解产物。水解产物经NalO₄氧化和NaBH₄还原后得相应的糖醇，糖醇经水解和衍生化生成糖乙醇酯的衍生物后进行气相色谱分析，仅检出赤藓醇，表明其仅含有1→4糖苷键，即上述海胆黄多糖的主链由1→4糖苷键组成。

7、紫外光谱分析：将本发明中的海胆黄多糖配成1.0mg/mL水溶液，用紫外分光光度计在600～200nm的范围内进行扫描。见图8，其在260nm和280nm处均无特征吸收峰，表明该海胆黄多糖均无蛋白质和核酸。

8、红外光谱分析：取干燥的上述海胆黄多糖1.0mg，以KBr压片，在4000～400cm^-1的范围内进行红外光谱扫描。见图9，其在3600～3200cm^-1处(3384.54cm^-1)出现一个较强的宽峰，为羟基(-OH)的伸缩振动，存在着分子间和分子内的氢键；在3000～2800cm^-1处(2929.43cm^-1)出现的吸收峰较弱，为C-H的伸缩振动，1400～1200cm^-1处(1364.06cm^-1)的峰是C-H的变角振动。这两组峰为多糖的特征吸收峰。1646.88cm^-1处出现的吸收峰是由于溶剂(水)引起的^[174]。1154～1022cm^-1范围为C-O的伸缩振动，1022.51cm^-1处的强吸收说明本发明中的海胆黄多糖的主要组成单糖为葡萄糖；852.41cm^-1有吸收峰且在898～884cm^-1处无吸峰表明海胆黄多糖仅含α糖苷键；在932.72cm^-1处的吸收峰以及1022.51、1080.17及1155.13cm^-1表明其由α-D-吡喃葡萄糖组成。

9、核磁共振(NMR)分析：取冷冻干燥后的本发明中的海胆黄多糖约25mg，室温下真空干燥1-2天后溶于0.5mL D₂O中，在AVANCE500核磁共振仪上测定其¹H NMR和¹³C NMR谱，以DSS为内标(δ_H 0.00ppm，δ_C 21.74ppm)，测定温度为30℃。另外，还测定了上述海胆黄多糖的¹H-¹H COSY、HSQC和NOESY等2D NMR谱，其中，NOESY谱的混合时间为200ms。见图10，其在δ＞4.5ppm的低场区有两个异头质子信号，其化学位移分别为δ5.3857ppm和δ4.9713ppm，提示该多糖含有两种α糖苷键，由于两类异头质子H信号比例不同，说明两种糖苷键在该多糖中不均衡。

见图11，该海胆黄多糖在δ＞100ppm的低场区出现两个信号峰，为异头碳的信号峰，其化学位移分别是δ102.495和100.363ppm，与¹H NMR谱中的两个异头氢信号峰相对应，说明组成其的基本重复单元中确实含有两种糖苷键的连接方式，且糖残基构型为α型，再根据甲基化分析等化学分析方法可确定该海胆黄多糖含1→4和1→6两种连接方式，因此，两个异头碳及异头质子的信号峰分别归属于1→4和1→6。

根据海胆黄多糖的H-H COSY(见图12)及HSQC谱(见图13)可得出相对应C-H信号的化学位移，根据前面的¹H NMR、¹³C NMR分析结果，将对应的C-H信号时行部分归属见表1。

表1，海胆黄多糖的H-H COSY及HSQC谱的具体各信号归属

见图14，此海胆黄多糖在异头氢产生NOE信号的非异头氢及其化学位移见表2。

表2，海胆黄多糖的NOESY图中部分数据

多糖中与异头氢具有NOE信号分别为C-2上氢信号(分子内)和与C-1相连的另一糖残基的碳上的氢信号(分子间)，由于δ3.915ppm归属C4，δ3.750、3.947ppm归属C6，因此，本发明中的海胆黄多糖为一主链为1→4糖苷键，侧链含1→6糖苷键的多糖。同时δ3.546、δ3.421ppm应分别归属于1→4、1→6位键合的糖残基上C-2的氢信号。

因此通过对1D NMR及2D NMR谱的全面分析，此海胆黄多糖糖残基的C、H信号亦可完成全归属见表3。

表3，海胆黄多糖在¹H and ¹³C NMR中的化学位移

10、综合上述分析可得出如下结论：

(1)糖组成分析结果表明，本发明中的海胆黄多糖为葡聚糖；

(2)高碘酸氧化、Smith降解及甲基化分析表明，上述海胆黄多糖含有1→4，1→6两种糖苷键和非还原末端1→，三者的比例约为8∶1∶1；

(3)部分酸水解结果表明此多糖糖链的主链由1→4糖苷键组成；

(4)UV分析本发明中的海胆黄多糖不含蛋白质和核苷酸，IR结果表明它由α-D-吡喃葡萄糖组成的葡聚糖。

(5)NMR分析表明该多糖的重复单元的结构中含1→4和1→6两种糖苷键，主链由1→4糖苷键组成，侧链由1→6糖苷键组成，糖残基为α构型。

因此，本发明中的海胆黄多糖的重复单元可能的结构如图1，是首次从海胆中分离到的一种结构新颖的葡聚糖。

实施例2：

试剂与药品  海胆黄多糖(自制  经HPLC、聚丙烯酰胺凝胶电泳及薄层层鉴定为均一多糖组分)，脂多糖(LPS，Sigma公司)，噻唑蓝(MTT，Sigma公司)，刀豆蛋白A(ConA，Sigma公司)，脂多糖(LPS，Sigma公司)，RPMI-1640培养基(Gibco公司)，新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。

动物  清洁级ICR小鼠(中国药科大学实验动物中心)。

仪器  超净工作台(苏州净化设备厂)，CO₂培养箱(美国ThermoForma公司)，DM-IRB荧光倒置显微镜(德国Leica公司)，Model 680型酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司)。

海胆黄多糖协同ConA/LPS对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

取6～8周龄ICR小鼠，颈椎脱臼处死，无菌制备脾淋巴细胞悬液，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度为6～8×10⁶/mL，将细胞分为两部分，一部分直接加入96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，再加100μL培养液(空白对照)以及含有不同浓度的海胆黄多糖溶液；另一部分细胞加入亚适量的ConA或LPS混匀，于96孔培养板中，每孔加入100μL细胞悬液，再加入100μL培养液(亚适量的ConA/LPS对照)、含有不同浓度的海胆黄多糖溶液，最后于酶标仪上测各孔的吸光值。根据不同浓度该海胆黄多糖单独作用及ConA/LPS-海胆黄多糖共同作用孔的吸光值(分别记为A_S、A_C-S/L-S)，计算A_S+A_ConA/LPS及A_C-S/L-S+A_Control，若后者大于前者表明该海胆黄多糖与ConA/LPS有协同增殖的作用，否则无。

见图15，高浓度(200μg/mL、100μg/mL)的海胆黄多糖与2μg/mL的ConA对小鼠脾淋巴细胞增殖未表现出协同作用；该多糖的低浓度(25μg/mL)与2μg/mL的ConA对小鼠脾淋巴细胞增殖则具有明显的协同作用。

见图16，可以看出不同浓度的海胆黄多糖与4μg/mL的LPS对小鼠脾淋巴细胞增殖均具有一定的协同作用，其中100μg/mL的该海胆黄多糖与LPS对小鼠脾淋巴细胞增殖的协同能力最强，50μg/mL的次之，200μg/mL的海胆黄多糖协同增殖能力最弱。

海胆黄多糖对T、B淋巴细胞增殖的影响  取脾细胞及T、B细胞悬液，调整细胞浓度为5～6×10⁶/mL。于96孔培养板中，每孔加入100μL细胞悬液，再加100μL培养液(空白对照)、10μg/mL ConA及10μg/mL LPS(阳性对照)及含有不同浓度的样品溶液，置5％CO2，37℃培养48h。培养结束前4h，于每孔加入5mg/mL的MTT 20μL，培养结束后，每孔加入酸化的20％的SDS溶液120μL裂解细胞过夜，在酶标仪上测各孔的吸光值(测定波长570nm，参比波长630nm)，计算增殖指数SI

见图17，表明不同浓度的海胆黄多糖对小鼠脾脏的T、B淋巴细胞具有显著的刺激增殖的作用，且均呈现一定剂量依赖性。

RT-PCR法测定海胆黄多糖对脾细胞中各细胞因子基因表达影响

1.海胆黄多糖处理脾细胞

取6～8周龄的ICR小鼠，颈椎脱臼处死，无菌取脾，制备脾细胞悬液并调整细胞浓度为6～8×10⁶/mL。于24孔培养板中，每孔加入500μL细胞悬液，再加500μL培养液(空白对照)、10μg/mL ConA(阳性对照)及含有不同浓度的样品溶液，置5％CO2，37℃培养6h。

2.总RNA的提取

采用经典的异硫氰酸胍方法提取脾细胞总RNA。

3.总RNA浓度测定及电泳鉴定

取4μL总RNA，用DEPC水稀释到1000μL，用分光光度计测定总RNA的OD₂₆₀及OD₂₈₀。另取0.5g琼脂糖，加入30mL 0.1％DEPC水，在微波炉中熔化，再加5mL 10×甲醛变性电泳缓冲液，冷却至约50℃，加入8.9mL甲醛溶液，再加6.1mL 0.1％DEPC水，混匀后将胶加到制胶槽内，取5μL总RNA上样，电泳，紫外灯观察并拍照以鉴定RNA的完整性，结果见图18，可以发现28S和18S两条明显的条带，并且28S的亮度是18S的两倍左右，且260/280紫外吸收值之比为1.86，表明RNA的抽提效果比较好，没有明显的降解。

4.RT-PCR

由Genebank获取小鼠细胞因子IL-1β、IFN-γ、TNF-α及内标GAPDH基因全序列。PCR系统如下：模板cDNA 5μL，4×dNTP 1μL，10×buffer 2.5μL，上下游引物各1.5μL，Taq DNA聚合酶0.3μL，MgCl₂ 2.2μL，最后用无菌双蒸水补足体积至25μL，每管加入一滴液体石蜡封口，离心分层，94℃变性5min后按下列程序循环30次，94℃30s，53℃45s，72℃45s。然后72℃延伸10min。PCR产物以2.0％琼脂糖凝胶电泳，用Bio-Rad凝胶成像系统测定各条带的扫描积分值。结果见图19，可以看出，用浓度为25～200μg/mL的范围内的海胆黄多糖处理脾细胞6h，可使脾细胞的细胞因子IL-1β、TNF-α的基因表达上调，而IFN-γ的基因表达与培养液对照组比没有明显的变化。

实施例3

1、取处于对数生长期的小鼠单核-巨噬细胞RAW264.7，胰酶消化收集细胞，用培养液调整细胞浓度为5×10⁵/mL，加入96孔板，100μL/孔，贴壁2h后，弃上层培养液，加入不同浓度的上述海胆黄多糖、培养液(阴性对照)和LPS(阳性对照)，于37℃、5％的CO₂培养24h。吸弃上层培养液，补充新鲜的培养液100μL/孔，同是加入5mg/mL的MTT 20μL/孔，同样条件下继续培养4h后，轻轻吸弃上清，加入150μL DMSO震荡10min，充分混匀，置室温10min后，用酶标仪在570nm处测定吸光值。结果如图20可见该海胆黄多糖可显著地促进小鼠腹腔巨噬细胞增殖，在25～200μg/mL的浓度范围内，与对照组相比有显著差异(P＜0.05)。

2、于96孔板中制备细胞浓度为1×10⁶/mL腹腔巨噬细胞单层，弃上层培养液，加入不同浓度的上述海胆黄多糖各100μL/孔，于37℃、5％的CO₂培养24h。取上清液，加入等量的Griess试剂，室温反应10min，于酶标仪上测定540nm处的吸光值。以培养液作空白对照，以20ug/mL的LPS作阳性对照。根据回归方程为A₅₄₀＝0.01052[NO]+0.01365(R＝0.9991)的NaNO₂标准曲线计算NO的含量。如表4，可以看出，在25～200μg/mL的浓度范围内，上述海胆黄多糖可明显地促进小鼠腹腔巨噬细胞产生NO，并呈一定的剂量依赖性，随着浓度的升高，诱生NO的能力增强；100μg/mL的海胆黄多糖诱生NO的能力略高于同浓度的香菇多糖。

表4，不同浓度海胆黄多糖对腹腔巨噬细胞产生NO的影响

^*P＜0.05；^**P＜0.01相对与对照组

3、制备细胞浓度为1×10⁶/mL腹腔巨噬细胞单层，加入96孔板，100μL/孔；加入不同浓度的上述海胆黄多糖100μL/孔，5％CO2培养箱中培养22h；然后向每孔中加入0.1％中性红生理盐水液，继续培养20min，倾去上清液，用温PBS缓冲液洗3遍，每孔加入细胞溶解液(为体积分数50％的乙酸和体积分数50％的无水乙醇)0.2mL，室温下放置2～3h，待细胞溶解后，即在酶联免疫检测仪上测540nm处的吸光度，不加药物，加培养基作为对照组，每个浓度3个复孔。结果如表5，在25～100μg/mL浓度范围，该海胆黄多糖处理组的吸光值明显高于培养液对照组，其中，浓度为50μg/mL时，对巨噬细胞吞噬功能的增强作用最强，与LPS对照组无显著差异(P＞0.05)。说明上述海胆黄多糖可以显著地促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力。

表5，海胆黄多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的影响

^*P＜0.05；^**P＜0.01相对于对照组

因此从实例2与实例3可以看出，海胆黄多糖是一种免疫增强剂，可显著增强免疫活性，而且它可通过多途径、多方式进行免疫调节从而达到抗肿瘤的目的。

Claims (6)

1. 一种具有α-1，4-葡聚糖链的海胆黄多糖，其重复单元的结构中含1→4和1→6两种糖苷键，主链由1→4糖苷键组成，侧链由1→6糖苷键组成，糖残基为α构型，其为首次从海胆中分离到的一种结构新颖的葡聚糖。

2. 权利要求1所述的海胆黄多糖具有主链由1→4糖苷键组成，侧链由1→6糖苷键组成，糖残基为α构型的重复单元结构。

3. 权利要求1所述的海胆黄多糖是一种具有α-1，4-葡聚糖链的葡聚糖。

4. 权利要求1所述的海胆黄多糖的用途。

5. 权利要求4所述的用途，包括免疫增强剂，抗肿瘤药物，抗氧化药物。

6. 权利要求5所述，优先保护免疫增强剂。

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