CN104177510B - 一种α-1,4-葡聚糖及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从金银花中提取的多糖、其制备方法和在制备治疗阿尔兹海默症的药物中的用途。具体而言，本申请涉及一种从金银花中提取的α‑1,4‑葡聚糖，所述制备方法包括：首先从金银花中提取粗多糖，再醇沉、脱蛋白、多种柱层析纯化得所述α‑1,4‑葡聚糖。经体外实验证明，所述α‑1,4‑葡聚糖可显著抑制阿尔兹海默症的关键发病因子Aβ42的聚集并能抑制Aβ42的聚集诱导的神经细胞毒性，有望成为治疗阿尔兹海默症的潜在多糖药物。
Description
技术领域
本发明涉及中草药提取多糖，更具体地说，涉及一种从金银花(FlosLonicerae)中提取得到的α-1,4-葡聚糖、其制备方法以及其在制备治疗阿尔兹海默症的药物中的应用。
背景技术
随着糖化学与糖生物学的深入发展，植物多糖作为一类重要的生物活性物质，通过大量研究已被证实具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化及抗感染等多种生物活性，且对机体的毒副作用小。因此，具有生物活性的多糖已日益受到重视。
目前，以糖类为基础的药物研究和开发已逐渐成为国内外医药界的前沿课题。而糖类物质，尤其是中草药来源的多糖物质基于生物功能广泛，毒副作用小、资源丰富等诸多优势，也受到各国研发人员的极大重视，具有潜在广泛的应用前景。
金银花作为一种重要的传统中药，为藤蔓植物忍冬的干燥花蕾，据《神农本草经》记载，其性寒，味甘，有清热解毒、疏风散热之功效，临床上主要用于治疗风热感冒、痈肿疖毒、热毒血痢、痔漏便血等。金银花富含多种活性成分且组成复杂，药理研究表明这些化合物具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫及解热抗炎、保肝利胆、抗溃疡等多种生物活性。
多糖物质作为金银花药效的重要组成部分，目前研究较少。现有的几项对于金银花多糖的研究仅限于对其粗多糖的提取[1-3]及抑菌抗氧化生物活性等的初步筛选[4-6]。金银花多糖在治疗神经系统疾病中的作用，尚无报道。阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）亦称为早老性痴呆，是一种慢性进行性的神经退行性疾病，主要表现为渐进性的记忆能力下降，认知功能障碍以及失去生活独立自理能力。随着人口老龄化的不断加剧，AD的发病率也逐年升高，已成为最重要的公众关注的健康问题之一[7]。
β淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)在脑内的异常表达和沉积是目前认为引发AD的核心环节[8]。在AD患者中，由于AD相关基因突变、金属离子浓度增加及pH改变等因素，导致脑内微环境改变，从而引发淀粉样蛋白的构象发生变化，即由α-螺旋转变为易于聚集成纤维状的β-折叠，从而可干扰Ca2+稳态、引发氧化应激、线粒体功能障碍、炎症反应、诱导Tau蛋白过度磷酸化和导致神经元丢失等级联神经毒性，而最终导致痴呆[9]。因此，基于Aβ的神经毒性，以Aβ为作用靶点，寻找减少Aβ形成、抑制Aβ聚集和加速Aβ降解的药物是目前治疗AD药物的研究热点[10]。
我们实验发现，中药金银花来源的多糖可在体外显著抑制Aβ42聚集，并在人神经瘤母细胞水平上抑制Aβ42聚集诱导的细胞毒性，具有潜在的治疗阿尔兹海默症的作用。
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发明内容
本发明利用一种简单有效的多糖提取工艺和方法，以金银花为原料获得了一种α-1,4-葡聚糖，药理实验表明，所述α-1,4-葡聚糖在100μg/ml的浓度下，在体外可完全抑制Aβ42的聚集，并在细胞水平上抑制Aβ42聚集引发的细胞毒性，因此，所述α-1,4-葡聚糖有望开发成为一种治疗阿尔兹海默症的糖类药物。
本发明的一个目的在于提供一种α-1,4-葡聚糖，其结构式如下：
其中，x和y为整数且x+y=14；
n为正整数；
重均分子量范围为：约10-100kDa。
所述α-1,4-葡聚糖的重均分子量优选为约15-80kDa，更优选为20-50kDa。
本发明的另一目的是提供一种以金银花为原料制备所述α-1,4-葡聚糖的方法。
所述方法包括以下步骤：
a.多糖提取：干燥的金银花经乙醇脱脂、水提、过滤，将所得滤液浓缩，再经15%三氯乙酸脱蛋白，中和、透析、浓缩、醇沉、离心、真空干燥，得水提金银花粗多糖；
b.多糖纯化：将所述水提金银花粗多糖先用DEAE纤维素阴离子柱进行初步分级，水洗脱得中性多糖组分，进而用凝胶色谱柱纯化，得α-1,4-葡聚糖。
优选地，所述方法包括以下步骤：
a.多糖提取：干燥的金银花经75%-95%乙醇脱脂，干燥，加入去离子水，加热条件下提取，过滤，残渣再次用去离子水提取，如此反复提取2-6次，滤液合并，加热浓缩，浓缩液经终浓度为15%的三氯乙酸在4℃下脱蛋白，离心，上清液经中和，透析，再浓缩，加入3倍于浓缩液体积的75%-95%乙醇，离心得沉淀，沉淀经真空干燥得水提金银花粗多糖；
b.多糖纯化：取所述金银花粗多糖，水溶解，离心，上清液通过DEAE纤维素阴离子柱进行分离，以蒸馏水洗脱，硫酸-苯酚检测，收取合并洗脱液，浓缩冷冻干燥得水洗脱组分，进而采用G150凝胶色谱柱分离，纯化得α-1,4-葡聚糖。
更优选地，所述方法包括以下步骤：
a.多糖提取：干燥的金银花经95%乙醇脱脂7-10天，室温自然干燥，干燥后的金银花加入20倍重量的去离子水，100℃下提取2-6次，每次5-7h，滤液合并，加热浓缩，浓缩液经终浓度为15%的三氯乙酸在0-4℃下脱蛋白，离心，上清液经中和，透析，再浓缩，加入3倍于浓缩液体积的95%乙醇，离心得沉淀，沉淀经真空干燥得水提金银花粗多糖；
b.多糖纯化：取所述金银花粗多糖，加入10倍重量的水中溶解，离心，上清液通过DEAE纤维素阴离子柱进行分离，以蒸馏水洗脱，硫酸-苯酚检测，收取合并洗脱液，浓缩冷冻干燥得水洗脱组分，将该水洗脱组分溶于0-0.2mol/L NaCl，离心后通过G150凝胶色谱柱分离，纯化得α-1,4-葡聚糖。
多糖结构鉴定：
经高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定，根据本发明的α-1,4-葡聚糖的重均分子量范围约为10-100kDa。将其进行糖组成分析，即将多糖完全水解、还原、乙酰化、萃取、浓缩后送入气相色谱仪分析。糖组成分析结果显示，根据本发明的α-1,4-葡聚糖只含葡萄糖单元。然后用碘甲烷进行反应至多糖完全甲基化，再完全酸水解、还原、乙酰化、萃取、浓缩后用气相色谱仪和质谱仪分析。结合红外和核磁共振分析(参见图2和3)和甲基化结果，确定根据本发明的α-1,4-葡聚糖是以α-1,4连接的葡萄糖为主链，并在C6位伴有少量α-1,4连接的葡聚糖分支结构，平均每16个葡萄糖残基含有1个支链。
本发明的又一目的是提供根据本发明的α-1,4-葡聚糖在制备治疗由β-淀粉样蛋白诱导的神经系统损伤的药物中的用途。优选地，本发明提供根据本发明的α-1,4-葡聚糖在制备治疗阿尔兹海默症的药物中的用途。
本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的内容。
附图说明：
图1为实施例1的α-1,4-葡聚糖LJW0F2的纯度鉴定图；
图2为实施例1的α-1,4-葡聚糖LJW0F2的红外光谱图(infraredspectrogram，IR)；
图3为实施例1的α-1,4-葡聚糖LJW0F2的13C NMR谱图；
图4为实施例1的α-1,4-葡聚糖LJW0F2抑制Aβ42聚集活性测定结果；（图4A为硫磺素荧光检测结果；图4B为Aβ42单独孵育7天后原子力显微镜检测结果；且图4C为LJW0F2与Aβ42共孵育7天后原子力显微镜检测结果)
图5为实施例1的α-1,4-葡聚糖LJW0F2抑制Aβ42聚集诱导的神经元细胞毒性结果。
具体实施方式
实施例1：α-1,4-葡聚糖LJW0F2的制备
a.多糖提取：
干燥的金银花（产地为山东省平邑县，购自上海养和堂药业连锁经营有限公司），用95%的乙醇脱脂一周，然后室温自然干燥。干燥后的金银花1000g用沸水20L提取5次，每次6h。硫酸-苯酚检测至无明显反应，过滤，将每次的提取液合并后加热浓缩至3L，冷却后加入约500g三氯乙酸使其最终浓度为15%，在4℃下脱蛋白，后经离心，上清液经1mol/L NaOH中和至pH值为7.0，然后对流动水透析72h，透析袋内液浓缩至2L体积，在搅拌下加入三倍体积的95%乙醇，静置过夜，倾去上清液，离心分离，所得沉淀用2倍体积的无水乙醇洗涤，离心分离，沉淀置40℃下真空干燥，得水提金银花粗多糖LJW75g。
b.多糖纯化：
取上述制备的金银花粗多糖LJW10g，100mL水溶解，离心除去不溶物，上清液通过Cl-型DEAE-纤维素柱（GE Lifescience公司）进行初步分离。以蒸馏水洗脱，硫酸-苯酚法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线收取合并洗脱液。洗脱液经浓缩以及冷冻干燥后得多糖LJW02.4g。取LJW0200mg加入2mL0.2M NaCl溶解并离心，上清液通过G150凝胶色谱柱（GE Lifescience公司）进行纯化，流速为0.3mL/min，硫酸-苯酚法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收取合并洗脱液，如此反复纯化得到多糖组分LJW0F2100mg。
实验实施例1：多糖结构解析：
经高效凝胶色谱法(HPGPC)分析表明LJW0F2的相对重均分子量约为37.1kDa，其纯度测定图见图1。糖组成分析表明LJW0F2为一葡聚糖。红外图谱显示，3403cm-1为O-H伸缩振动吸收峰，2927cm-1为C-H伸缩振动吸收峰,1000-1400cm-1附近为C-O和糖环振动信号，1720cm-1附近没有吸收峰，表明该多糖不含有糖醛酸（图2）。13C NMR谱中，位于δ100.98的碳信号，为α-葡聚糖的C-1信号。其他碳信号依次为C-2(δ72.97),C-3(δ74.60)，C-4(δ78.08),C-5(δ72.61)和C6(δ61.70)（图3）。
多糖LJW0F2中糖残基连接方式的种类及比例可用甲基化分析。结果表明，LJW0F2的葡萄糖残基有三种连接方式，分别为1,4-、1,4,6-以及末端连接葡萄糖基，其比例为14:1:1。从上述比例可以发现，LJW0F2的主链结构应为1,4-连接的葡聚糖结构，并且在主链的部分C6位带有1,4-连接的葡聚糖分支结构。
以上结果表明LJW0F2的结构为：
其中，x和y为整数且x+y=14；
实验实施例2
抑制Aβ42聚集试验
1）硫磺素荧光标记实验
将Aβ42粉末（Rpeptide公司）溶于110μL无水DMSO中（浓度为2mM）,配成母液。取1μL该溶液溶于19μL磷酸缓冲液(50mM磷酸盐,pH7.5,100mM NaCl，0.02%NaN3)中，或1μL该溶液加入10μL不同浓度的LJW0F2多糖溶液（0.5mg/mL,1.0mg/mL,2.0mg/mL）再加入9μL PBS缓冲液，37℃共孵育30min，加入硫磺素溶液（6.25μM硫磺素溶于50mM甘氨酸-NaOH,pH8.5）80μL,37℃共孵育，每隔2h用酶标仪检测(Novostar,BMG labtech公司)，检测波长为Ex=450/10nm,Em=483/10nm。
由图4A可见，α-1,4-葡聚糖LJW0F2在100μg/mL的终浓度下，能完全抑制Aβ42的聚集。
2）原子力显微镜检测实验
为进一步验证多糖LJW0F2抑制Aβ42聚集的结果，采用原子力显微镜观察多糖LJW0F2对Aβ42聚集形态的影响。将1μL浓度为2mM的Aβ42、10μL浓度为1.0mg/mL的LJW0F2多糖溶液溶于89μL双蒸水中，37℃共孵育7天。将1μL浓度为2mM的Aβ42溶于99μL Millipore水中，或将10μL浓度为1.0mg/mL的LJW0F2多糖溶液溶于90μL Millipore水中，37℃孵育7天，作为对照。取5μL将样品溶液滴在干净的云母片上并小心吹干，在原子力显微镜下（NanoscopeⅢa,Veeco Instrucments公司）的轻敲模式下进行测试。
由图4B可观察到，Aβ42在单独孵育7天后，出现大量寡聚体，而与多糖LJW0F2共孵育7天后（图4C），未发现明显的聚集。该结果与硫磺素荧光检测结果相吻合，证明多糖具有抑制Aβ42聚集的活性。
实验实施例3：
α-1,4-葡聚糖LJW0F2抑制Aβ42聚集导致的神经元细胞毒性实验
1）细胞培养
人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y（购自中国科学院细胞库）用体积比1:1的MEM和Ham’s F12培养基（含10%胎牛血清）于5%CO2培养箱37℃培养，2-3天换液1次。细胞贴壁长满后，用0.25%胰蛋白酶（Invitrogen公司）消化后，以35000个细胞/孔接种到96孔细胞培养板，每孔体积100μL。37℃培养16h，使细胞贴壁。
不同浓度的α-1,4-葡聚糖LJW0F2溶液（0，1000，100，10μg/mL）同Aβ42（200μM）或者等体积的DMSO，37℃水浴孵育4天后，吸去培养过夜细胞上清，加入用培养基稀释的上述孵育4天的溶液，每孔100μL，使Aβ42终浓度为2μM，α-1,4-葡聚糖LJW0F2终浓度为（0，10μg/mL，1μg/mL，0.1μg/mL）。37℃继续培养48h，CCK-8测定细胞存活率。
2）细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)测定
每孔加CCK-8溶液10μL。继续孵育4h，选择450nm波长，在酶联免疫监测仪上(Novostar,BMG labtech公司)测定各孔光吸收值，记录结果，计算细胞存活率。
如图5所示，1）Aβ42单独孵育4天，加入SH-SY5Y细胞后，该细胞存活率较正常组下降10%左右，说明Aβ42寡聚体对SH-SY5Y细胞产生了细胞毒性。2）当Aβ42与不同浓度α-1,4-葡聚糖LJW0F2共孵育4天，加入SH-SY5Y细胞后，该细胞的存活率恢复到正常水平，说明α-1,4-葡聚糖LJW0F2可抑制Aβ42聚集诱导的神经细胞毒性。而α-1,4-葡聚糖LJW0F2单独加入SH-SY5Y细胞，对该细胞的成活无明显影响。这些结果表明，α-1,4-葡聚糖LJW0F2能够通过抑制Aβ42的寡聚化进而保护其对神经元细胞SH-SY5Y的损伤。
Claims (7)
1.一种α-1,4-葡聚糖，其结构式如下：
其中，x和y为整数且x+y＝14；
n为正整数；
所述α-1,4-葡聚糖的重均分子量范围为：10-100kDa。
2.根据权利要求1所述的α-1,4-葡聚糖，其重均分子量范围为15至80kDa。
3.一种以金银花为原料制备根据权利要求1所述的α-1,4-葡聚糖的方法，所述方法包括以下步骤：
a.多糖提取：干燥的金银花经乙醇脱脂、水提、过滤，将所得滤液浓缩，再经15％三氯乙酸脱蛋白，中和、透析、浓缩、醇沉、离心、真空干燥，得水提金银花粗多糖；
b.多糖纯化：将所述水提金银花粗多糖先用DEAE纤维素阴离子柱进行初步分级，水洗脱得中性多糖组分，进而用凝胶色谱柱纯化，得α-1,4-葡聚糖。
4.根据权利要求3所述的方法，所述方法包括以下步骤：
a.多糖提取：干燥的金银花经75％-95％乙醇脱脂，干燥，加入去离子水，加热条件下提取，过滤，残渣再次用去离子水提取，如此反复提取2-6次，滤液合并，加热浓缩，浓缩液经终浓度为15％的三氯乙酸在4℃下脱蛋白，离心，上清液经中和，透析，再浓缩，加入3倍于浓缩液体积的75％-95％乙醇，离心得沉淀，沉淀经真空干燥得水提金银花粗多糖；
b.多糖纯化：取金银花粗多糖，水溶解，离心，上清液通过DEAE纤维素阴离子柱进行分离，以蒸馏水洗脱，硫酸-苯酚检测，收取合并洗脱液，浓缩冷冻干燥得水洗脱组分，进而采用G150凝胶色谱柱分离，纯化得α-1,4-葡聚糖。
5.根据权利要求3所述的方法，所述方法包括以下步骤：
a.多糖提取：干燥的金银花经95％乙醇脱脂7-10天，室温自然干燥，干燥后的金银花加入20倍重量的去离子水，100℃下提取2-6次，每次5-7h，滤液合并，加热浓缩，浓缩液经终浓度为15％的三氯乙酸在0-4℃下脱蛋白，离心，上清液经中和，透析，再浓缩，加入3倍于浓缩液体积的95％乙醇，离心得沉淀，沉淀经真空干燥得水提金银花粗多糖；
b.多糖纯化：取金银花粗多糖，加入10倍重量的水中溶解，离心，上清液通过DEAE纤维素阴离子柱进行分离，以蒸馏水洗脱，硫酸-苯酚检测，收取合并洗脱液，浓缩冷冻干燥得水洗脱组分，将水洗脱组分溶于0-0.2mol/LNaCl溶液，离心后通过G150凝胶色谱柱分离，纯化得α-1,4-葡聚糖。
6.根据权利要求1所述的α-1,4-葡聚糖在制备治疗由β-淀粉样蛋白诱导的神经系统损伤的药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述由β-淀粉样蛋白诱导的神经系统损伤为阿尔兹海默症。
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