CN102091088A - 米邦塔仙人掌多糖在防治慢性神经退行性疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明揭示了米邦塔仙人掌多糖可改善大鼠神经行为障碍，减少脑梗死体积和皮层及海马神经元丢失，可减少细胞内ROS的产生，具有很好的神经保护作用，可作为预防和治疗中枢神经系统慢性神经退行性疾病的药物，用于预防和治疗中枢神经系统慢性神经退行性疾病。本发明还提供了优化的米帮塔仙人掌多糖提取工艺，该提取工艺具有方便简捷、经济适用，得糖率较高和适合大批量提取等特点。

Description

米邦塔仙人掌多糖在防治慢性神经退行性疾病中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及防治中枢神经系统慢性神经退行性疾病的药物。。

背景技术

人类多种中枢神经系统慢性疾病如脑缺血、癫痫、帕金森氏症、老年性痴呆等，其主要的病理改变即神经细胞的损伤、丢失、坏死和凋亡。近来越来越多的研究证明，导致神经细胞的损伤最终原因是氧化应激(oxidative stress，OS)，所谓氧化应激是机体在遭受各种有害刺激时，体内产生的大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)超出体内抗氧化防御系统对氧自由基的清除能力，最终氧化系统和抗氧化系统失衡导致组织损伤。自由基导致的细胞DNA氧化性损伤引发细胞凋亡。由于神经系统具有代谢率高以及抗氧化防御机制相对缺乏的特点，产生活性氧簇(ROS)多且更容易遭受氧化损伤导致疾病。抗氧化治疗主要是应用抗氧化剂，目前抗氧化剂包括天然抗氧化剂(维生素E、维生素C、β胡萝卜素、谷胱甘肽等)和合成抗氧化药物，如普罗布考等。大量的实验证实，抗氧化剂能通过清除自由基、抑制脂质过氧化而发挥神经保护作用，临床研究已取得一些可喜结果。但是，一些研究结果仍然令人困惑，如同一抗氧化剂动物实验有效，而临床试验往往无效。目前有关此类药物治疗的研究主要集中在两个方面：一是开发具有多重作用机制的自由基清除剂；二是鉴于自由基清除剂与抗炎药联合使用时效果更好，因此寻找具有自由基清除作用同时具有抗炎成为一个热点。在这一领域的认识还有待进一步提高，研发新的抗氧化剂及其在临床上的应用将为神经细胞氧化应激损伤的治疗提供更广阔的前景。具有极其重要的社会意义和经济效益。

多糖是生物体内普遍存在的一类大分子物质，作为生命物质的组成成分之一，广泛参与细胞的各种生理活动的调节，特别在细胞识别、细胞间物质运输、免疫调节等生物学功能方面新的认识广泛引起人们的重视。近年来大量研究证实，许多多糖具有抗肿瘤、降血糖、抗凝血、抗炎、抗衰老及抗氧化等重要药理活性，已引起药理学家的极大关注，所以多糖也逐渐成为当今新药开发的重要方向之一。因为多糖来源广泛，而生物活性显著，毒副作用小，所以在医药方面具有广阔的开发和利用前景。有人预言：“21世纪将是多糖的世纪”。

仙人掌(Opuntia dillenii Haw)作为地球上生命力最强盛的植物之一，已生存了两万多年。其药用价值在几千年前就被人类认识和利用，在我国作为药用首载于清代赵学敏所著的《本草纲目拾遗》。据该书记载，仙人掌味淡性寒，行气活血、清热解毒、消肿止痛、健脾止泻、安神利尿，可内服外用治疗多种疾病。清代刘善术著的《草木便方》中记载，仙人掌苦涩性寒，五痔泻血治不难，小儿白秃麻油擦，虫疮疥癞洗安然。另有《本草求原》、《陆川本草》、《岭南采药录》、《闽南民间草药》、《闽东本草》、《湖南药物志》、《中@国药植图鉴》、《分类草药性》、《贵州民间方药集》、《广西中草药》等也有论述。从资料记载可以看出，仙人掌除用于痢疾、哮喘、胃痛、肠痔泻血外，还用于肾炎、糖尿病、心悸失眠、动脉硬化、高血压、肥胖症及肝病的辅助治疗。进入21世纪后，医学界和食品科学研究部门又发现了它具有降血糖、降血脂和抗氧化等功效。随着近年深入研究，发现仙人掌可促进新陈代谢，提高人体免疫力，除对糖尿病、高血脂、高血压等有疗效外，特别是抗氧化作用，已作为一种天然抗氧化剂用于食品科学。

米邦塔仙人掌(Opuntia ficus-indica Milpa Alta)，是20世纪40年代墨西哥专家从植物仙桃(Opuntia ficus-indica)中选育出来、可作为果蔬食用的少刺的仙人掌品种，1998年我国农业部从墨西哥引进，现已大面积栽培成功，该仙人掌具有耐旱、耐瘠薄、适应性广、抗逆性强、病虫害较少、栽培管理容易等特点。米邦塔仙人掌含有18种人体必需氨基酸、多种维生素、微量元素和玉芙蓉、果仙纤维素、角蒂仙、多糖、甾醇、黄酮、亚油酸、SOD等降血脂、降血糖、免疫增强、抗衰老及防癌等药理活性成分。其中仙人掌多糖(cactuspolysaccharides，CP)为仙人掌所含主要有效成分之一，其含量高，药理活性强，对生物体毒副作用小，因此受到医药研究者的高度关注。

发明内容

本发明的任务是提供米邦塔仙人掌多糖在防治慢性神经退行性疾病中的应用。

本发明对我国栽培的米帮塔仙人掌茎进行提取，将米邦塔仙人掌茎用水浸醇沉法进行多糖的粗提，用乙醇，丙酮，乙醚除杂及除蛋白质后，用苯酚--硫酸法检测多糖的含量，进一步纯化得到米帮塔仙人掌多糖，新鲜植物得糖率约7.3％。所得米帮塔仙人掌多糖，主要含半乳糖、D-木糖、L-鼠李糖以及阿拉伯糖，与国外文献报道一致。药效研究发现：在整体大鼠局灶性脑缺血及缺血复灌实验，米邦塔仙人掌多糖可改善大鼠神经行为障碍，减少脑梗死体积和皮层及海马神经元丢失。在离体培养脑片及培养PC12细胞以及原代培养大鼠皮层、海马神经细胞，经多种方式氧糖剥夺损伤，米邦塔仙人掌多糖均可减少细胞内ROS的产生，具有很好的神经保护作用。本发明整体实验结果显示：米邦塔仙人掌多糖经消化道给予可以缓解大鼠局灶性脑缺血，及缺血复灌后神经症状，减少脑梗死体积；病理组织切片显示可显著减少脑缺血-再灌注皮层及海马神经元组织形态学损伤。离体脑片实验结果显示：米邦塔仙人掌多糖对物理性氧糖剥夺损伤、过氧化物H₂O₂诱导的大鼠海马及皮层神经元损伤，具有明显的保护作用。离体细胞培养实验结果显示：(1)离体培养PC12细胞以过氧化氢诱导的氧化应激损伤，米帮塔仙人掌多糖可明显减少细胞死亡，并对细胞凋亡具有明显抑制作用。(2)原代培养大鼠皮层、海马神经元，用化学物质对细胞进行氧糖剥夺损伤；米帮塔仙人掌多糖可保护细胞免遭其损伤，明显减少细胞死亡。本发明揭示：米帮塔仙人掌多糖无论对整体动物，还是离体培养脑片或神经细胞，对物理和化学性所致神经细胞氧化应激损伤均具有良好的保护作用，其作用机制可能与抑制细胞内活性氧及自由基的生成，增强体内抗氧化酶活性，加速活性氧与自由基的清除等作用有关，米帮塔仙人掌多糖可以作为预防和治疗慢性神经退行性疾病如脑缺血-再灌注损伤，老年性痴呆、帕金森氏症等神经退行性变的药物。

本发明实施例提供了一种优化的米帮塔仙人掌多糖的提取、分离与纯化方法。本发明提供的优化的米帮塔仙人掌多糖提取工艺，方便简捷、经济适用，得糖率较高，适合大批量提取。

本发明实验资料

一、整体动物实验：米邦塔仙人掌多糖对整体大鼠脑缺血损伤的保护作用研究

实验动物：雄性Sprague&Dawley大鼠，体重200-250g，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。实验仪器：高速冷冻离心机(HITACHI)Hitachi Koki Co，Ltd.Tokyo JapanDYY-8C型电泳仪(北京市六一仪器厂出产)。

大鼠脑缺血模型制备：采用Zea Longa方法并予改良的大脑中动脉线栓法(middle cerebralartery occlusion，MCAO)制备大鼠持续性局灶性脑缺血模型。大鼠水合氯醛麻醉(350mg/kg，IP)，依次分离右侧颈总、颈外、颈内动脉，结扎右侧颈外动脉，在靠近颈外、颈内动脉分叉处由颈总动脉沿颈内动脉缓慢插入预先被多聚酪氨酸包被的直径0.26-0.28mm的尼龙栓线，深度约为1.8-2.2cm。假手术组栓线插入深度为1.0cm，其余步骤同模型组。动物苏醒后出现对侧肢体运动障碍即为模型成功。持续观察8h。对于缺血-复灌所致的短暂性脑缺血(tMCAO)模型，在MCAO 2h后抽出大鼠颈内细线以进行复灌，并持续观察22h。大鼠随机分为假手术组、缺血组、生理盐水组、仙人掌多糖治疗组(200mg/kg/d)。生理盐水组给与等体积生理盐水。仙人掌多糖治疗组在手术前每天静脉注射仙人掌多糖200mg/kg，连续3天，术后15min再给予一次。

神经行为学评分：参考Zea Longa的6级评分法在术后3h、6h、8h进行评    分：0分，无神经损伤症状；1分，不能完全伸展对侧前爪；2分，向栓塞对侧转圈：3分，向对侧倾倒：4分，不能自发行走，昏迷：5分，死亡。

脑梗死体积测定：所有动物在栓塞后8h断头取脑。大鼠用10％水合氯醛1.5mL深度麻醉后处死，迅速取脑，-20℃冻10min，从视交叉处取冠状面均匀切成1-1.5mm厚脑片，放入2％TTC溶液(37℃)中染色30min，然后用4％多聚甲醛固定。24h后拍照并输入计算机，采用AUTOCAD图像处理软件计算梗死面积(粉红色区为正常脑组织，白色区为梗死区)，各脑片梗死面积之和乘以厚度(1.5mm)为总的梗死体积，以梗死体积/全脑体积比作为统计参数。

形态学检测：缺血2h再复灌注22h深度麻醉大鼠，透心灌注取脑(冰冷的生理盐水及4％多聚甲醛)，4％多聚甲醛4℃固定过夜，脱水后石蜡包埋，选择前囟后3和4.5mm处作等距离的冠状切片，片厚5μm，HE染色后于光镜下观察。

免疫组织化学分析：将如上所述切好的脑片用0.1M PBS清洗，脱蜡，酒精梯度洗脱，室温于10％H₂O₂中浸泡10min去除内源性过氧化物酶；PBS漂洗三遍后，10％正常山羊血清37℃孵育30min，加入一抗兔抗小鼠iNOS单克隆抗体(1∶100)37℃孵育2h；PBS清洗后加入生物素化羊抗兔IgG(1∶100)二抗37℃孵育1h；PBS清洗后加入SABC 37℃孵育1h；0.5g/LDAB显色5-10min。阴性对照实验用PBS代替一抗，其余步骤相同。

蛋白质印迹分析：暂时性脑缺血复灌注22h后，分别取每组大鼠各4只断头取脑，迅速于冰上分离右侧海马和皮层。将脑组织用0.4ml冰冷匀浆缓冲液(Tris-HCl 50mmol/L，PH7.4，NaCl 150mmol/L，0.5％Triton X-100，二胺四乙酸1mmol/L，phenylmethylsulfony fluoride 1mol/L，抑肽酶5mg/L)，在冰浴下制成匀浆，14,000×g 4℃离心30min。收集上清用作总蛋白测定。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶浓度为8％，pH 8.8，浓缩胶浓度为4％，pH 6.8。每泳道上样量皮层7μl，海马10μl。电泳结束后将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转膜到硝酸纤维素膜。将NC膜置于含5％牛奶的TBS缓冲液中4℃过夜，加入iNOS单克隆兔抗鼠抗体(1∶500)。TBS洗膜后，将膜用羊抗兔二抗室温下孵育1h.胶片上电泳蛋白条带扫描并用软件(Gel-ProAnalyzer 4.0)定量分析。

统计学分析：采用SPSS11.5统计软件，数值用

表示，神经行为学评分用非参数统计(Mann-Whitney)方法做秩禾检验，其他组间比较采用单因素方差分析(ONEWAY-ANOVA)和PLSD法进行显著性检验，p＜0.05有显著意义。

实验结果：(1).米邦塔仙人掌多糖对大鼠神经行为学评分及脑梗死体积的影响：神经行为学评分显示，局灶性脑缺血3h后，仙人掌多糖治疗组、生理盐水组及假手术组动物均有不同程度的神经功能缺损，但各组间损伤程度比较未见显著性差异。缺血6h及8h后给药组与生理盐水组行为学评分比较有显著差异(p＜0.05)。缺血组及生理盐水组的损伤程度相当，没有明显差异(p＞0.05)。脑梗死8h后大鼠脑片经TTC染色，梗死区域呈苍白色，非梗死区呈红色。缺血组及米邦塔仙人掌多糖治疗组大鼠缺血侧部分皮质及纹状体出现梗死，非缺血侧无梗死，与MCA支配的脑区一致，说明模型成功。假手术组未见梗死灶；缺血组及生理盐水组出现大面积的白色梗死区域，米邦塔仙人掌多糖治疗组脑梗死体积较缺血模型组及生理盐水组明显减少，经统计学差异有显著性(p＜0.05)。与神经行为学评分的结果一致，见图1。(2)米邦塔仙人掌多糖对大鼠缺血-再灌注损伤皮层和海马神经细胞形态学变化的影响：大鼠脑缺血-再灌注后，脑组织病理切片HE染色后于光镜下观察发现。脑缺血模型组大鼠皮层及海马神经细胞均可见明显的形态学变化：神经细胞丢失、核固缩、核深染等。米邦塔仙人掌多糖(200mg/kg)治疗组大鼠皮层及海马神经细胞的形态学变化得到显著改善，神经细胞丢失减少，核固缩、核深染减轻，表明其对脑缺血-再灌注损伤具有保护作用，见图2。(3).米邦塔仙人掌多糖对缺血-再灌注损伤大鼠脑组织中iNOS表达及活性的影响：免疫组织化学染色后光镜下iNOS在皮层及海马神经元表达的结果显示，缺血侧脑组织DAB染色后iNOS阳性反应产物呈深棕色，假手术组中，未见胞浆内iNOS明显表达，细胞形态完整。与假手术组相比，缺血模型组阳性反应细胞明显增加，米邦塔仙人掌多糖(200mg/kg)治疗组胞浆iNOS阳性细胞，与缺血组相比，表达明显减少，结果见图3。

二、离体脑片实验：米邦塔仙人掌多糖对离体脑片氧化应激损伤的保护作用

实验一：对离体脑片氧糖剥夺损伤的保护作用

实验动物：雄性SD大鼠，体重为200～300g，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。试剂：2，3，5-三苯基氯化四氮唑，同第一部分，人工脑脊液组成(mmol·L^-1：NaCl 126，KCl3.5，NaH₂PO₄1.2，MgCl₂1.3，CaCl₂2.0，葡萄糖11，NaHCO₃25，pH 7.4)，避光保存；碘化丙啶(propidium iodide，PI)，Sigma公司产品；乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，乳酸脱氢酶)、一氧化氮合酶(NOS，分型)、一氧化氮(NO)、考马氏亮蓝检测试剂盒(南京建成生物制品有限公司)，其余试剂均为分析纯。实验仪器：脑片切片机(美国生产)，酶标仪TECANA-5082(奥地利生产)。激光共聚焦显微镜：Leica，TCS-SP(德国生产)。

皮层和海马脑片的制备：成年SD大鼠快速断头，迅速将全脑取出，立即浸入冰冷的预先饱和混合氧气(95％O2+5％CO2)的人工脑脊液中，将小脑和脑干弃去，分离海马与皮质，分别用切片机沿纵轴切成400μm厚脑片.用人工脑脊液漂洗两次后放置培养瓶内(瓶内盛3ml人工脑脊液，(35±0.5)℃，持续通入95％O₂和5％CO₂混合气，进行孵育。

脑片损伤模型的建立：脑片在35℃ACSF中孵育30min后，实施氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation，OGD)损伤，用预先饱和混合氮气(95％N₂和5％CO₂)的无糖脑脊液(以10mmol·L^-1的蔗糖代替ACSF中的葡萄糖)置换瓶内培养液，分别持续通95％N₂+5％O₂各5、10、15、20、25、30min，再恢复含氧、含糖孵育条件正常孵育2h(reoxygenation，REO)，孵育结束后，所有脑片进行TTC染色，用酶标仪测定490nm处光密度(OD)值。计算不同时间氧糖剥夺损伤后的脑组织与对照组的损伤百分率(％)，以确定损伤模型所需的最佳时间。

实验分组：随机分为①正常空白对照组：脑片在孵育过程中不作任何处理②损伤模型组：脑片在ACSF中孵育30min后，氧糖剥夺15min，随后恢复正常ACSF孵育2h。③米帮塔仙人掌多糖处理组：分为3个浓度组，在损伤前30min分别加入0.2mg·L^-1、1mg·L^-1、2mg·L^-1米帮塔仙人掌多糖。

TTC染色脑片与2％TTC(用ACSF稀释)35℃条件下避光孵育30min，随后取出，生理盐水漂洗，吸去表面水分，称湿重，以1g脑片：20ml比例加入抽提液(乙醇∶二甲亚砜＝1∶1)，避光24h，按皮层脑片：200μl/孔，海马脑片：100μl/孔的量加至96孔板，酶标仪测定各孔在490nm处吸光度值(A490)。组织损伤百分率＝(1-A490损伤/A490对照)×100％。

激光共聚焦检测大鼠脑片细胞内PI荧光强度：以二甲基亚砜为溶剂，将PI配制成1mmol/L浓度，以2μl/ml加入脑片孵育杯中，混匀，将各组孵育后的脑片移至含有2μl/ml PI的人工脑脊液中，35℃下避光负载30min，持续通氧，人工脑脊液漂洗3次，随后进行激光共聚焦检测，观察并记录脑片组织的损伤情况即平均荧光强度。激光共聚焦工作条件为：Power 200mM；Zoom2，光切厚度10μm，中速扫描，激发波长490nm，发射波长650nm，10倍光学显微镜头进行观察。因PI可以透过损伤的细胞膜进入细胞内，和DNA结合后发出荧光，荧光愈强，表明损伤愈严重。

脑片孵育液生化指标检测：分别收集氧糖剥夺15min及复氧复糖2h后的脑片孵育上清液，按照试剂盒检测说明书检测孵育液中乳酸脱氢酶含量；实验结束后将各组脑片组织进行匀浆，检测组织中NO含量和iNOS活性变化。并进行组织蛋白含量测定。

统计学分析采用SPSS11.5统计软件，数值用

表示，组间比较采用单因素方差分析(ONEWAY-ANOVA)和PLSD法进行显著性检验，p＜0.05有显著意义。

实验结果：(1)米邦塔仙人掌多糖对氧糖剥夺损伤脑片活性的影响：米邦塔仙人掌多糖对脑片TTC染色的影响将0.2mg·L^-1、1mg·L^-1及2mg·L^-1的仙人掌多糖与大鼠皮层和海马脑片在正常条件共同孵育3h，对脑片TTC染色无影响。各组A490值之间差异无显著意义。氧糖剥夺损伤后大鼠皮层和海马脑片TTC染色A490值较正常对照组显降低，P＜0.01(组织损伤百分率：皮层36.36％；海马52.38％)。损伤前给与不同剂量仙人掌多糖均能明显逆转脑片TTC染色A490值的降低，与损伤组相比，P＜0.05。且其保护作用与剂量呈正相关，具有明显剂量依耐性。结果见图4。(2)米邦塔仙人掌多糖对脑片PI染色的影响：大鼠皮层、海马脑片负载PI后均能在激光共聚焦下显示出清晰的荧光图像，损伤区坏死细胞呈现红色。结果表明，氧糖剥夺损伤后，其PI平均荧光强度明显增加，分别为：323.89±35.69和189.76±20.06与对照组相比，P＜0.01。米邦塔仙人掌多糖1mg/L及2mg/L处理后能显著减弱氧糖剥夺损伤后脑片PI荧光强度，表明坏死细胞减少，进一步证明对脑组织氧化应激损伤具有保护作用。结果见图5。(3)米邦塔仙人掌多糖对乳酸脱氢酶释放的影响：氧糖剥夺损伤15min，乳酸脱氢酶的释放轻度增加，与正常对照组比较，无统计学意义，(P＞0.05)。如脑片氧糖剥夺损伤15min再复氧复糖孵育2h后，皮层、海马脑片孵育液中乳酸脱氢酶量显著增加，与正常对照组比较(P＜0.01)，米帮塔仙人掌多糖0.2mg/L、1mg/L和2mg/L处理后能显著减弱复氧复糖孵育2h后海马、皮层乳酸脱氢酶的释放，与损伤模型组比较差异有显著意义(P＜0.01)。结果见图6。(4)米邦塔仙人掌多糖对脑片NO/iNOS释放的影响：氧糖剥夺伤孵育15min后，皮层、海马脑片组织中NO含量明显增加，iNOS活性均显著增加，与对照组比较，P＜0.01；米帮塔仙人掌多糖0.2mg/L、1mg/L、2mg/L处理后均能不同程度降低海马、皮层脑片的NO的含量和减弱iNOS活性，与模型损伤组比较，P＜0.05，结果见图7。

实验二：米邦塔仙人掌多糖对H₂O₂所致大鼠离体脑片损伤保护作用

实验动物：雄性SD大鼠，体重为200～300g，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。试剂：2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC)，仙人掌多糖，同第二部分；乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，乳酸脱氢酶)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、谷胱甘肽(glutathion，谷胱甘肽还原酶)、总抗氧化能力(total antioxidationcapability)检测试剂盒购自南京建成生物制品有限公司。其余试剂均为分析纯。3.实验仪器：切片机和酶标仪同前；4.皮层和海马脑片的制备：同前。

H₂O₂致脑片氧化应激损伤模型的建立：脑片在35℃人工脑脊液中孵育30min后，分别用1，2和4mmol/L H₂O₂继续孵育30min，随后恢复正常人工脑脊液孵育2h。对照组实验步骤同损伤组，但孵育液中不含H₂O₂。TTC染色，计算不同浓度H₂O₂的脑组织损伤百分率，以确定损伤模型所需H₂O₂的最佳浓度。

实验分组：脑片在35℃人工脑脊液中孵育30min，随机分为对照组：继续正常孵育；模型组：用含2mmol/L H₂O₂人工脑脊液孵育30min，随后恢复正常人工脑脊液孵育2h；米帮塔仙人掌多糖处理组：在损伤前30min，分别用0.333和1.67mg/L米帮塔仙人掌多糖预孵育，用含2mmol/L H₂O₂人工脑脊液孵育30min，恢复正常孵育2h后，将脑片进行TTC染色。7.TTC染色：同前。8.脑片孵育液生化指标检测孵育结束，取出培养脑片，滤纸吸干表面水分后称取湿重。将收集的人工脑脊液分别按照试剂盒说明书进行乳酸脱氢酶、SOD活性，谷胱甘肽还原酶含量和总抗氧化能力检测，将检测结果除以相应培养脑片组织湿重，以每克组织的检测量为单位。亚硝酸法测定SOD活性，SOD活性表示为试剂盒对照管与样品管间亚硝酸盐量的差值(Δ)。亚硝酸盐量根据亚硝酸盐标准品的标准曲线(Y＝a+bX)计算得出，Y代表吸光度值，X代表亚硝酸盐浓度。9.统计采用SPSS11.5统计软件，数值用

表示，组间比较采用单因素方差分析(ONEWAY-ANOVA)和PLSD法进行差异显著性检验，p＜0.05有显著意义。

实验结果：1.米邦塔仙人掌多糖对H₂O₂损伤脑片活性的影响：用含1，2和4mmol·L^-1H₂O₂的人工脑脊液孵育脑片30min均可降低大脑皮层和海马脑片TTC染色A_490nm值，表明H₂O₂对大鼠脑片可造成不同程度损伤(见图1)。其中2mmol/L H₂O₂损伤强度适中，组织损伤百分率：皮层(42±3)％，海马(53±3)％，可以确定为本实验比较理想的造模浓度。损伤前或损伤同时给予米帮塔仙人掌多糖能逆转脑片4_490nm值降低，表明其对H₂O₂所致脑片损伤具有一定的保护作用。实验发现不同时间给药所表现的效应不同，损伤前给药的脑组织保护作用优于损伤同时给药，如在损伤30min后给予则无明显保护作用(P＞0.05)。另外，其保护作用还与浓度相关，1.67mg·L^-1的保护作用强于0.333mg·L^-1(P＜0.01)。结果见表1.

表1米帮塔仙人掌多糖对H₂O₂诱导的大鼠皮层及海马脑片损伤的保护作用

表1说明：正常对照组脑片：用人工脑脊液孵育3h；损伤组脑片：正常孵育30min后用2mmol/L的H2O2孵育30min，再用正常ACSF孵育2h；米帮塔仙人掌多糖组脑片：则用分别用含多糖0.333和1.67mg/L的ACSF在各个时期孵育脑片，预防给予：H2O2损伤前30min给予，共同孵育：用H2O2损伤的同时给予；治疗给予：用H2O2损伤后给予。以上各组脑片在实验结束后，脑片用TTC染色检测脑片活性，检测脑组织TTC染色的A490nm值，脑片组织损伤率计算公式：组织损伤率＝(1-A490nm损伤/A490nm正常)×100％；与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与损伤组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。结果显示米帮塔仙人掌多糖对H2O2诱导的大鼠皮层及海马脑片损伤有明显的保护作用，并显示剂量依耐性。

2.米邦塔仙人掌多糖对H₂O₂所致脑片孵育液中乳酸脱氢酶(LDH)，谷胱甘肽(GHS)和超氧化物歧化酶(SOD)含量的影响：鉴于米帮塔仙人掌多糖预给药保护效果最好，故选择损伤前给药30min进行相关生化物质的检测。用2mmol/L H₂O₂孵育30min后，皮层和海马脑片孵育液中乳酸脱氢酶含量显著增加，而总抗氧化能力显著降低，谷胱甘肽释放量显著减少，与TTC法观察的脑片损伤程度相一致。预先给予米帮塔仙人掌多糖0.333和1.67mg/L能浓度依赖地减少损伤皮层和海马乳酸脱氢酶的含量，提高总抗氧化能力，增加谷胱甘肽含量。与H₂O₂2mmol/L共孵育30min后，皮层和海马脑片超氧化物歧化酶含量有所增加，仙人掌多糖1.67mg/L能进一步提高皮层、海马脑片的超氧化物歧化酶(SOD)释放量，与损伤组比较有显著差异。结果见表2。

表2米帮塔仙人掌多糖对H₂O₂诱导的大鼠皮层及海马脑片损伤所致的LDH，T-AOC，SOD和GSH含量的影响

表2说明：正常对照组脑片：用人工脑脊液孵育3h；损伤组脑片：正常孵育30min后用2mmol/L的H2O2孵育30min，再用正常ACSF复灌2h；米帮塔仙人掌多糖组脑片：则用分别用含多糖0.333和1.67mg/L的ACSF在各个时期孵育脑片：H2O2损伤前孵育30min，与H2O2共孵育30min并H2O2损伤后孵育2h。LDH：乳酸脱氢酶；T-AOC：总抗氧化能力；GSH：谷胱甘肽；SOD：超氧化物岐化酶。，与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与损伤组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，结果显示米帮塔仙人掌多糖对H2O2诱导的大鼠皮层及海马脑片孵育液中总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物岐化酶(SOD)的活力具有明显的增强作用。

三、离体细胞实验

实验一：米邦塔仙人掌多糖对PC12细胞过氧化氢损伤的保护作用

PC12细胞：华中科技大学同济医学院协和医院神经内科实验室提供。药品与试剂：仙人掌多糖，过氧化氢，来源同前所述，用D-Hanks液配制，过滤除菌后备用；DMEM/F12购自GIBCO(Invitrogen，USA)；加强型胎牛血清购自Hyclone(USA)；3-(4，5)-2-噻唑-(2，5)-二苯基溴化四氮唑兰(Thiazoyl blue tetrazolium bromide，MTT)购自Biotech；乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase，乳酸脱氢酶)试剂盒，购自南京建成生物有限公司；丫啶橙(Acridineorange，AO)，购自Amerisco；溴化乙啶(Ethidium bromide，EB)，2，7-二氯氢化荧光素(2’，7’-dichlorodihydrofluorescin diacetate，DHCF-DA)，购自Sigma公司；硝基四氮唑蓝(nitroblue tetrazolium，NBT)，购自Amerisco。实验仪器：CO₂培养箱(美国SHELLAB)，超净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司出产)，Sunrise全自动酶标仪(Sunrise，Australia)，光学显微照相系统，倒置荧光显微镜(苏州松下通信工业有限公司)，高速冷冻离心机(HITACHI)，Hitachi Koki Co，Ltd.Tokyo Japan。

PC12细胞的传代培养及过氧化氢损伤模型制备：将PC12细胞株悬浮于DMEM培养基(含10％胎牛血清，10％小牛血清，100u/mL青霉素，100ug/mL链霉素)中，置于37℃、含5％CO2、饱和湿度的培养箱中孵育，24h换液，用于以下实验。将PC12细胞按照不同实验要求接种于预先包被多聚赖氨酸的各种细胞培养板中，12h后，待细胞生长达到70％以上融合度，开始制备过氧化氢损伤模型。轻轻吸出培养细胞上清液，换含有0.3mM的DMEM培养基继续培养12h。正常对照组细胞则用DMEM培养基同样条件下孵育。阳性药物依达拉奉(60uM)组及给药组(0.1，0.25，0.5mg/L CP)在过氧化氢损伤前30min加入，损伤同时再次加入，直到损伤结束。然后分别进行以下的实验。

细胞活性检测：(1)MTT还原实验：活细胞线粒体中的琥珀酰脱氢酶具有将3-(4，5)-2-噻唑-(2，5)-二苯基溴化四氮唑兰(Thiazoyl blue tetrazolium bromide，MTT)中的四氮唑环还原成一种蓝紫色的化合物——甲臜的能力，甲臜的量与活细胞数成正比。损伤结束后，向接种细胞的96孔板中加入MTT(5g/L，200μl/每孔)，37℃常氧条件下孵育4h。孵育结束后将上清去除，每孔加入150μl二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，振荡30min使深蓝色甲臜充分溶解，然后在全自动酶标仪上读出492nm的光密度值。细胞存活率(cell survival rate)＝(样品组A₄₉₂/正常组A₄₉₂)×100％。(2)乳酸脱氢酶释放的测定：细胞受损后，坏死细胞的胞膜破裂后，乳酸脱氢酶从胞内大量释放，分布于培养液中。故培养液中测得的乳酸脱氢酶活力可反应培养细胞中细胞的坏死程度。乳酸脱氢酶可以还原NAD⁺为NADH，从而引起在340nm处吸光度值上升，上升速率与乳酸脱氢酶活力成正比。过氧化氢损伤结束后，每组细胞离心后取上清，按试剂盒说明操作检测其中乳酸脱氢酶活力。在酶标仪上读取340nm处吸光度值，然后按公式转换为乳酸脱氢酶活力。(3)细胞凋亡检测：丫啶橙(acridineorange，AO)/(Ethidium bromide，EB)双染法可用来检测PC12细胞的凋亡坏死情况。AO可以同时被活细胞和早期凋亡细胞摄取，透过完整细胞膜嵌入细胞核DNA中，使之发出绿色荧光。EB只能透过膜受损细胞嵌入核DNA，发出橘红色荧光。取AO、EB各1mg，分别加入10ml D-hanks液中，配成100mg/L的母液。再取1ul母液加入到1ml细胞培养液中，37℃孵育20min后，在荧光显微镜下观察，可见4种细胞形态：(1)活细胞(VN)，核染色质为绿色并呈正常结构；(2)早期凋亡细胞(VA)，核染色质为绿色呈固缩状或圆珠状；(3)非凋亡的死亡细胞(NVN)，核染色质为橘红色并呈正常结构；(4)晚期凋亡细胞(NVA)，核染色质为橘红色并呈固缩状或圆珠状。细胞凋亡率由以下公式计算：(早期凋亡细胞+晚期凋亡细胞)/全部细胞。

细胞内过氧化物质的荧光检测：荧光探剂2，7-二氯氢化荧光素(2，7-dichlorofluorescindiaceta，DCFH-DA)可用于检测胞内过氧化物。2，7-二氯氢化荧光素可以被过氧化物转变为2，7-二氯荧光素(2，7-Dichlorofluorescein，DCF)，该反应非常灵敏，而且与过氧化物的浓度呈线性关系。DCFH-DA可以自由通过细胞膜而负载入细胞，细胞内的脂酶与之作用去掉乙酸盐基团，离子型的DCFH-DA不能通过细胞膜，限制在细胞内，可以被细胞内的过氧化物，主要为脂质过氧化物氧化成DCF而发出绿色荧光。在显微镜下可以被观察到。将DCFH-DA(20μM)与细胞在37℃共孵育1h，用D-hanks液洗三遍，然后在荧光显微镜下观察。

硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验：用来检测细胞内过氧化物质水平。在O₂·存在的情况下，可将NBT还原为兰色产物，该产物在630nm处有最大光吸收。细胞内过氧化物水平越高，A₆₃₀值就越大。培养细胞用H₂O₂损伤12h后，吸取上清，向接种细胞的96孔板中加入1mg/mlNBT试剂100ul，放入37℃培养箱继续培养2h。取出96孔板，弃去上清后，每孔加入甲醇120ul，固定10min后弃上清，用70％甲醇清洗1次。吸干孔内液体后，每孔加入2M的KOH 120ul和DMSO 140ul室温震荡10min。酶标仪检测630nm处吸光度值。

统计学分析：采用SPSS11.5统计软件，数值用

表示，组间比较采用单因素方差分析(ONEWAY-ANOVA)和PLSD法进行显著性检验，p＜0.05有显著意义。

实验结果：(1)米邦塔仙人掌多糖对过氧化氢所致的PC12细胞损伤的保护作用：倒置相差显微镜下观察，正常生长的PC12细胞呈圆形，胞体较饱满，边缘光滑，胞浆有较强的折光性。过氧化氢损伤后，正常细胞数目减少，凋亡或坏死的细胞增多，镜下可见细胞碎片增多，细胞核暗淡，边缘不光滑。米帮塔仙人掌多糖与依达拉奉(一种自由基清除剂)干预后细胞损伤情况明显减轻(图1)。MTT检测结果证实，过氧化氢损伤组MTT的A₄₉₂值较正常组明显降低，细胞存活百分率为45.89+8.97％，米帮塔仙人掌多糖(0.1，0.25，0.5mg/L)及依达拉奉(60uM)均可部分逆转过氧化氢损伤后MTT的A₄₉₂值的降低(见图2)。乳酸脱氢酶是糖酵解过程中一种重要的酶，普遍存在于机体各种细胞内，包括神经元。细胞损伤时乳酸脱氢酶由细胞内释放，其释放的量与细胞损伤程度成正比，因此可以用乳酸脱氢酶的活力来表示细胞受损程度。本研究结果发现，过氧化氢损伤后，细胞孵育液中乳酸脱氢酶量显著增加，说明细胞严重受伤。米帮塔仙人掌多糖(0.1，0.25，0.5mg/L)及依达拉奉(60uM)均可降低PC12细胞孵育液中乳酸脱氢酶的含量。结合MTT实验结果表明，米帮塔仙人掌多糖对培养PC12细胞过氧化氢损伤具有保护作用。结果见图8，9。(2)米邦塔仙人掌多糖对过氧化氢所致PC12细胞凋亡的保护作用：正常培养的PC12细胞，经AO/EB荧光双染结果显示，即可出现少量细胞凋亡，以早期凋亡细胞为主，用过氧化氢损伤后凋亡细胞及坏死细胞明显增多，以晚期凋亡细胞占多数。米帮塔仙人掌多糖(0.5mg/L)及依达拉奉(60uM)处理后可减少H₂O₂损伤后细胞的凋亡，晚期凋亡细胞比例明显减少，表明其对PC12细胞经H₂O₂损伤诱导的细胞凋亡具有保护作用。结果见图10。(3)米邦塔仙人掌多糖对过氧化氢所致PC12细胞内过氧化物质生成的影响：DCFH-DA荧光负载结果证实，过氧化氢损伤组PC12细胞内过氧化物质水平明显增高，绿色荧光强度增强，米帮塔仙人掌多糖(0.5mg/L)及依达拉奉(60uM)可明显减弱细胞内绿色荧光强度，表明米帮塔仙人掌多可以减轻胞内过氧化物质的释放。NBT还原实验结果证实，过氧化氢损伤后，PC12细胞NBT还原实验的A₆₃₀值较正常组明显增高，说明损伤引起了细胞内过氧化物水平的升高，米帮塔仙人掌多糖(0.5mg/L)及依达拉奉(60uM)可显著降低NBT还原实验的A₆₃₀值，与损伤组比较，P＜0.01。米帮塔仙人掌多糖与阳性药依达拉奉作用相似，其对细胞的保护作用可能与清除自由基有关。见图11。

实验二：米邦塔仙人掌对大鼠原代培养皮层和海马神经元氧糖剥夺损伤的保护作用

实验动物：出生1-2天的Sprague and Dawley乳鼠，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。主要仪器和试剂：同前。皮层和海马神经元的原代培养：取1-3天龄的SD大鼠，75％酒精消毒3-5min，置于高压灭菌培养皿中，断头并分离出全脑，取脑后仔细剥离皮层血管和软脑膜，分离大脑皮层和海马，用D-Hanks液清洗后剪成约1mm³大小组织块，加入等体积0.25％胰蛋白酶37℃消化15-20min。血清终止消化后将组织块吹打成细胞悬液，200目不锈钢筛选网过滤，1000r离心10min，共两次，清洗干净残留的胰蛋白酶。在细胞沉渣中加入含20％胎牛血清的DMEM12培养液重悬细胞，调整细胞密度为5.0×10⁵/ml，接种在预先用0.1％多聚赖氨酸处理的96孔板或30mm培养皿内，置CO₂培养箱内培养。48h后全量换液，第四天加入阿糖胞苷作用24h抑制神经胶质细胞生长。以后每隔一天全量更换培养基。

氧糖剥夺模型制备：取培养7-8天皮层及海马神经元进行氧糖剥夺损伤。每孔用无糖Earle’液洗2次，加入含连二亚硫酸钠(一种强氧化还原性物质)2mM的无糖Earle’s液300μl，置于CO₂培养箱内培养4h。

实验分组及给药：1)正常对照组，2)氧糖剥夺损伤组(OGD)，3)OGD+米邦塔仙人掌多糖0.5mg/l，4)OGD+米邦塔仙人掌多糖5mg/L，5)OGD+米邦塔仙人掌多糖50mg/L，6)OGD+米邦塔仙人掌多糖100mg/L，7)OGD+米邦塔仙人掌多糖500mg/L，8)OGD+米邦塔仙人掌多糖1000mg/L，9)正常+米邦塔仙人掌多糖100mg/L。每组6孔，实验重复3次。各药物处理组细胞均预先药物孵育12h后，依前述方法制备氧糖剥夺损伤模型。

神经元活性的检测：MTT还原检测：OGD结束后，96孔板中加入MTT，37℃条件下孵育4h。孵育结束后吸出孔内培养上清液，每孔加入150μL的DMSO，振荡10min，使深蓝色甲臜充分溶解，然后在全自动酶标仪上读出570nm及650nm的光密度值，然后进行统计学分析。

实验结果：(1)米邦塔仙人掌多糖对大鼠原代培养皮层神经元的保护作用：根据各组皮层神经元存活率统计结果表明，米邦塔仙人掌多糖对原代培养皮层神经元化学性氧糖剥夺损伤具有保护作用。与正常对照组比较，氧糖剥夺组细胞存活率明显低于正常对照组(P＜0.01)；细胞氧糖剥夺后经不同浓度的米邦塔仙人掌多糖处理后细胞存活率与损伤组比较均显著提高(P＜0.01)，见图12。(2)米邦塔仙人掌多糖对大鼠原代培养海马神经元的保护作用：与正常对照组比较，氧糖剥夺组海马神经细胞存活率明显低于正常对照组(P＜0.01)；米邦塔仙人掌多糖处理组细胞存活率与模型组比较均显著提高(P＜0.01)，见图13。以上结果进一步证明米邦塔仙人掌多糖对原代培养的大鼠皮层和海马神经细胞化学性氧糖剥夺损伤具有浓度依耐性的保护作用。结果见图13。

本发明首次采用大鼠大脑中动脉栓塞所致局灶性脑缺血及缺血再灌注模型，研究米邦塔仙人掌多糖对持续性及短暂性脑缺血所致神经细胞损伤的保护作用及可能的作用机制；首次在离体培养脑片，采用多种氧化应激损伤(包括物理性和化学性应激损伤)模型，研究米邦塔仙人掌多糖在组织器官水平对神经细胞损伤的保护作用及可能的作用机制；首次在细胞水平，如培养PC12细胞和原代培养大鼠皮层、海马细胞，研究米邦塔仙人掌多糖对物理性和化学性应激损伤具有保护作用及可能的作用机制；本发明揭示了米邦塔仙人掌多糖可作为预防和治疗中枢神经系统慢性神经退行性疾病(如脑缺血损伤，血管性和老年性痴呆，帕金森氏病等)的药物，用于预防和治疗中枢神经系统慢性神经退行性疾病。

附图说明

图1为米帮塔仙人掌多糖对大鼠局灶性脑缺血所致神经行为学评分及脑梗死体积的影响(

n＝8)。大鼠用线栓法制作局灶性脑缺血，缺血前米帮塔仙人掌多糖200mg/kg/天静脉注射给予，连续3天，术后15min再给予一次。分别于缺血后3h，6h，8h按照6级评分法对动物进行神经行为学评分。然后将动物处死取脑，切片，TTC染色，测量脑梗死体积占全脑体积的％，进行统计学分析，.实验分组：假手术组，缺血+溶剂组，米帮塔仙人掌多糖处理组，图a：缺血后3h，6h，8h大鼠神经行为学评分；b：假手术、缺血、缺血+溶剂、缺血+米帮塔仙人掌多糖大鼠脑片TTC染色；c：各组大鼠脑梗死体积％统计图。与缺血+溶剂组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

图2为米帮塔仙人掌多糖200mg/kg/天静脉注射，连续给予3天对大鼠脑缺血-复灌后皮层及海马组织病理切片的影响(H&E染色)的影响。(a)：皮层假手术大鼠；(b)：皮层缺血大鼠；(c)：皮层米帮塔仙人掌多糖处理大鼠；(d)：海马假手术大鼠；(e)：海马缺血大鼠；(f)：海马米帮塔仙人掌多糖处理大鼠。从图中可见，假手术大鼠(a)和(d)神经细胞密集，形态正常，缺血大鼠(b)和(e)细胞数显著减少，细胞核深染；米帮塔仙人掌多糖处理大鼠(c)和(f)正常细胞数较缺血大鼠显著增多。

图3为米帮塔仙人掌多糖200mg/kg/天静脉注射，连续给予3天对大鼠脑缺血-复灌22h后，皮层与海马iNOS免疫组化和蛋白表达的影响。(a)：皮层假手术组；(b)：皮层缺血组；(c)：皮层米帮塔仙人掌多糖处理组；(d)：海马假手术组；(e)：海马缺血组；(f)：海马米帮塔仙人掌多糖处理组。上图为脑片免疫组化图，箭头指示的是缺血复灌注22h后皮层及海马iNOS阳性表达，图中可见，缺血复灌大鼠iNOS阳性表达较正常大鼠明显增多，而多糖处理后其表达明显减少。中图为蛋白印迹实验原始图，可见缺血大鼠iNOS蛋白表达较假手术大鼠明显增加，而米帮塔仙人掌多糖处理后大鼠iNOS表达较缺血大鼠明显减少，下图为蛋白印迹实验数据统计图，与缺血组比较*P＜0.05，**P＜0.01。结果显示，米帮塔仙人掌多糖对脑缺血复灌诱导的iNOS阳性表达有明显的抑制作用。

图4为米帮塔仙人掌多糖0.2mg·L-1、1mg·L-1及2mg·L-1预孵育30min对氧糖剥夺损伤后大鼠皮层和海马脑片活力的影响。实验分组：Injury即氧糖剥夺损伤组，CP 0.2、CP 1、CP 2分别为米帮塔仙人掌多糖0.2mg·L-1、1mg·L-1及2mg·L-1处理组，白色柱为皮层，黑色柱为海马。根据脑片TTC染色A490值计算脑片活力较对照组用ACSF孵育165min。损伤组正常孵育30min后，OGD 15min，再用正常ACSF孵育2h。仙人掌多糖0.2mg·L-1、1mg·L-1及2mg·L-1在正常孵育开始即加入。(n＝10，

)，与损伤组比较，*P＜0.05，**P＜0.01.结果显示米帮塔仙人掌多糖对离体培养脑片缺氧缺糖损伤有明显保护作用，可剂量依耐性增加脑片活力。

图5米帮塔仙人掌多糖(1-2mg/L)对氧糖剥夺损伤所致脑片碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色的影响。实验分组：正常对照组；上图：氧糖剥夺损伤组；仙人掌多糖1mg/L处理组；仙人掌多糖2mg/L处理组；上图为海马脑片(左)和皮层脑片(右)各组脑片碘化丙啶染色后原始图片，显红色为死亡细胞，从图片中可损伤后脑片红色部位明显增多，用多糖处理脑片红色部位比单纯损伤脑片明显减少。下图为激光共聚焦显微镜检测PI染色的荧光强度统计图(n＝5，)，损伤组PI染色的荧光强度平均值显著高于正常对照组，米帮塔仙人掌多糖可依剂量降低PI染色的荧光强度平均值，与损伤组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。结果显示，通过脑片碘化丙啶染色和激光共聚焦显微镜检测，进一步证明米帮塔仙人掌多糖对培养脑片缺氧缺糖损伤的保护作用。

图6为米帮塔仙人掌多糖0.2mg/L、1mg/L和2mg/L预孵育30min后对培养大鼠皮层及海马脑片孵育液中乳酸脱氢酶含量的影响。氧糖剥夺图左：OGD(氧糖剥夺)，图右：REO(复氧)后LDH释放的影响。实验分组：实验分组：Control即正常对照组；Injury即损伤组，CP0.2、CP1和CP2分别为仙人掌多糖0.2mg/L、1mg/L、糖2mg/L处理组，对照组用人工脑脊液孵育165min。损伤组正常孵育30min后，OGD 15min，再用正常人工脑脊液孵育2h。米帮塔仙人掌多糖在正常孵育开始即加入。图中白色柱为皮层，黑色柱为海马，(n＝10，

)，与损伤组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

图6米帮塔仙人掌多糖0.2mg/L、1mg/L和2mg/L预孵育30min后对培养大鼠皮层及海马脑片孵育液中乳酸脱氢酶含量的影响。氧糖剥夺图左：OGD(氧糖剥夺)，图右：REO(复氧)后LDH释放的影响。实验分组：实验分组：Control即正常对照组；Injury即损伤组，CP0.2、CP1和CP2分别为仙人掌多糖0.2mg/L、1mg/L、糖2mg/L处理组，对照组用人工脑脊液孵育165min。损伤组正常孵育30min后，OGD 15min，再用正常人工脑脊液孵育2h。米帮塔仙人掌多糖在正常孵育开始即加入。图中白色柱为皮层，黑色柱为海马，(n＝10，

)，与损伤组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

图7为米帮塔仙人掌多糖0.2mg/L、1mg/L和2mg/L预孵育30min后对大鼠皮层及海马脑片NO/iNOS的影响。图左：对NO的影响，图右：对iNOS的影响；实验分组：实验分组：Control即正常对照组；Injury即损伤组，CP0.2、CP1和CP2分别为仙人掌多糖0.2mg/L、1mg/L、糖2mg/L处理组，对照组用人工脑脊液孵育165min。损伤组正常孵育30min后，OGD15min，再用正常人工脑脊液孵育2h。米帮塔仙人掌多糖在正常孵育开始即加入。图中白色柱为皮层，黑色柱为海马，(n＝10，

)，与损伤组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，结果显示，米帮塔仙人掌多糖可剂量依耐性减少氧糖剥夺损伤后脑片孵育液中NO、iNOS的水平。

图8米帮塔仙人掌多糖对过氧化氢损伤所致的培养PC12细胞活性的影响。实验分组：缺氧缺糖损伤组，缺氧缺糖损伤+多糖处理组(多糖处理组分别为0.1mg/L、0.25mg/L、0.5mg/L处理组)，依达拉奉(60uM)为阳性药对照组；损伤组细胞用含0.3mM过氧化氢的DMEM培养基继续培养12h。正常对照组细胞则用DMEM培养基同样条件下孵育。仙人掌多糖和依达拉奉均在过氧化氢损伤前30min加入，损伤换液的同时再次加入，直到损伤结束(

n＝6)。与损伤组比较，**P＜0.01；与依达拉奉组比较，#P＜0.01。结果显示米帮塔仙人掌多糖对过氧化氢损伤所致的培养PC12细胞活性可剂量依耐性增强，其作用强度与已知阳性药60uM依达拉奉相似。

图9米帮塔仙人掌多糖对过氧化氢损伤所致的PC12细胞LDH释放的影响。损伤组细胞用含0.3mM过氧化氢的DMEM培养基继续培养12h。正常对照组细胞则用DMEM培养基同样条件下孵育。阳性药物依达拉奉(60uM)或仙人掌多糖(0.1，0.25，0.5mg/L)在过氧化氢损伤前30min加入，损伤换液的同时再次加入，直到损伤结束(n＝6)。与正常组比较，*P＜0.01；与损伤组比较，#P＜0.01。结果显示米帮塔仙人掌多糖对过氧化氢损伤所致的培养PC12细胞孵育液中乳酸脱氢酶可剂量依耐性减少。

图10米帮塔仙人掌多糖对过氧化氢诱导的PC12细胞凋亡的影响。上图为培养细胞用AO/EB荧光双染原始照片(×400)，绿色为正常细胞，红色为凋亡细胞；下图为实验数据统计图；正常对照组细胞用DMEM培养基同样条件下孵育。损伤组细胞用含0.3mM过氧化氢的DMEM培养基继续培养12h。阳性药物依达拉奉(60uM)或仙人掌多糖(0.5mg/L)在过氧化氢损伤前30min加入，损伤换液的同时再次加入，直到损伤结束AO/EB荧光双染。与正常组比较，*P＜0.01；与损伤组比较，#P＜0.01。结果显示米帮塔仙人掌多糖对过氧化氢损伤诱导的PC12细胞凋亡有明显的抑制作用。

图11米帮塔仙人掌多糖对过氧化氢所致的PC12细胞内活性氧(ROS)水平的影响上图为培养细胞经DCFH-DA荧光染色后在荧光显微镜下显示(放大倍数×400)，下图为各组培养细胞DCFH-DA荧光染色光密度值统计图损伤组细胞用含0.3mM过氧化氢的DMEM培养基培养12h。正常对照组细胞则用DMEM培养基同样条件下孵育。阳性药物依达拉奉(60uM)或仙人掌多糖(0.1，0.25，0.5mg/L)在过氧化氢损伤前30min加入，损伤同时再次加入，直到损伤结束后细胞经DCFH-DA荧光染色，(

n＝6)。与正常组比较，*P＜0.05；与损伤组比较，#P＜0.05。结果显示米帮塔仙人掌多糖对过氧化氢损伤诱导的PC12细胞内活性氧(ROS)有明显的抑制作用，但未显示剂量依耐性。

图12为米邦塔仙人掌多糖对原代培养大鼠皮层神经元氧糖剥夺损伤细胞存活的保护作用。上图皮层神经细胞培养实例图：下图：各实验组数据统计图。实验分组：正常：正常条件培养细胞；OGD：用2μmol/L连二亚硫酸钠的无糖eale’s培养液对细胞进行氧糖剥夺损伤；分别用含米帮塔仙人掌多糖0.5-1000mg/L处理组；正常给药组：正常条件下培养细胞(未进行氧糖剥夺损伤)给予仙人掌多糖。与正常组比较#p＜0.01差异有极显著意义，与损伤组比较＊＊p＜0.01，差异有极显著意义。结果显示米帮塔仙人掌多糖对原代培养大鼠皮层神经元氧糖剥夺损伤细胞存活有明显的保护作用，并显示剂量依耐性。

图13为米邦塔仙人掌多糖对原代培养大鼠海马神经元氧糖剥夺损伤后细胞存活的保护作用。上图神经细胞培养实例图：下图：各实验组数据统计图。实验分组：正常：正常条件培养细胞；OGD：用2μmol/L连二亚硫酸钠的无糖eale’s培养液对细胞进行氧糖剥夺损伤；分别用含米帮塔仙人掌多糖0.5-1000mg/L处理组；正常给药组：正常条件下培养细胞(未进行氧糖剥夺损伤)给予仙人掌多糖。与正常组比较#p＜0.01差异有极显著意义，与损伤组比较＊＊p＜0.01，差异有极显著意义。结果显示米帮塔仙人掌多糖对原代培养大鼠海马神经元氧糖剥夺损伤细胞存活有明显的保护作用，并显示剂量依耐性。

图14、米邦塔仙人掌多糖粗提物通过DEAE-纤维素柱进行分离，硫酸-苯酚法测定糖的含量，用紫外分光光度法在485nm处检测吸光度，根据其吸光度的不同绘制出的分析图。

图15为本发明优化的米帮塔仙人掌多糖提取工艺线路图。

具体实施方式

实施例1米帮塔仙人掌多糖的提取、分离与纯化

药材来源：米邦塔食用仙人掌购自河南省种植基地，新鲜采购。主要试剂：纤维素DEAE-52(Whatman公司)；无水乙醇、95％乙醇、丙酮、乙醚、浓硫酸、苯酚均为国产市售分析纯。主要仪器：恒温水浴槽、真空干燥箱、电子天平、旋转蒸发仪、紫外分光光度计。

米帮塔仙人掌粗多糖的制备：将新鲜购置的米邦塔仙人掌茎清水洗净去皮后切成碎片，干燥。取干燥米邦塔仙人掌茎碎片用双蒸水按0.1∶1(重量与体积之比，即1千克物质∶1升溶剂水)95℃搅拌3h过滤，去滤液，在残渣中再次加入2倍的双蒸水95℃搅拌2h，再次去滤液。将2次提取的滤液充分搅拌后抽滤，然后将抽滤后的滤液放入旋转蒸发仪中，旋转蒸发至原体积的10％，再加入适量的氯仿萃取4-5次，然后将上层液体移至另一容器中，按体积比1∶4加入无水乙醇至终浓度为80％，4℃过夜，常温抽滤，留沉淀物。依次用无水乙醇，丙酮，乙醚分别将沉淀清洗3次，去杂质后进行真空干燥得米邦塔仙人掌粗糖粉末。提取工艺线路图见图15。

米邦塔仙人掌粗糖分离纯化：用纤维素DEAE-52分离柱进行分离纯化。首先用如下方法将上柱预处理：(1).将干粉的纤维素浸泡在蒸馏水中，约3小时左右，去除杂质，抽干；(2).用0.5mol/L的HCl溶液浸泡2小时，用去离子水洗净至PH中性，并抽干；(3).将抽干的纤维素再浸泡在0.5mol/L的NaOH溶液中2小时，用去离子水洗至中性，抽干。将粗糖粉末与45℃双蒸水按1∶4(重量与体积之比)溶解，将此溶解液分别用双蒸水及0.5M的NaOH溶液缓冲液，用上述处理后的分离柱进行洗脱，流速3ml/5min，然后将洗脱液用苯酚-硫酸法检测糖的出现，最后收集含糖洗脱液放入旋转蒸发仪中蒸发，转速为50-80/3min，温度60℃，蒸发至稠状液体，进行真空干燥得纯化米邦塔仙人掌多糖粉末。提取工艺线路图见图15。

米邦塔仙人掌多糖中可溶性糖的含量鉴定：苯酚-硫酸法测定测定原理：利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛或羟甲基糠醛等衍生物，然后与苯酚缩合生成橙黄色化合物，其颜色深浅与糖的含量成正比，故可用比色法测定。所测的可溶性糖主要有葡萄糖、木糖、果糖、半乳糖、乳糖、甲基化的糖、戊糖等。测定方法：试剂：6％苯酚溶液现配现用；浓硫酸(比重1.84)；分别从试管中精密量取冲洗液25ul，加ddH₂O至2ml，在继续加入苯酚试液1.0ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0ml，摇匀，置沸水浴中加热15min，取出，冷水冷却至室温，见颜色变化。根据所测吸光度值绘制工作曲线，见图14。

结果：新鲜米邦塔仙人掌茎，用热水浸提法提取多糖，经对米邦塔仙人掌多糖的提取工艺进行优化，最佳提取条件是：料液比为9∶1，提取温度95℃，提取时间4h，最佳醇沉条件为：乙醇体积分数为80％，乙醇用量为提取物体积的4倍，沉淀时间为15h。提取液用Savage法脱蛋白后，真空干燥。粗多糖的平均提取率为6.91％。粗多糖采用纤维素DEAE-52柱层析纯化，并经过硫酸-苯酚法检测糖的含量，真空干燥后得到米邦塔仙人掌多糖。多糖的得率为35％。

本发明提供的上述优化的米帮塔仙人掌多糖提取工艺，方便简捷、经济适用，得糖率较高，适合大批量提取。

Claims (4)

1.米帮塔仙人掌多糖在制备用于预防或/和治疗慢性神经退行性疾病中的应用。

2.根据权利要求1所述的米帮塔仙人掌多糖在制备用于预防或/和治疗慢性神经退行性疾病中的应用，其特征在于，所述的慢性神经退行性疾病是中枢神经系统慢性神经退行性疾病。

3.根据权利要求１所述的米帮塔仙人掌多糖在制备用于预防或／和治疗慢性神经退行性疾病中的应用，其特征在于，所述的慢性神经退行性疾病是慢性神经退行性疾病如脑缺血-再灌注损伤、老年性痴呆、帕金森氏症等。

4.一种制备米帮塔仙人掌多糖的方法，包括以下步骤：

a.米帮塔仙人掌粗多糖的制备：将新鲜购置的米邦塔仙人掌茎清水洗净去皮后切成碎片，干燥，取干燥米邦塔仙人掌茎碎片投入双蒸水中，米邦塔仙人掌茎碎片与双蒸水的重量/体积比为0.1∶1，于95℃搅拌3h过滤，去滤液，在残渣中再次加入2倍的双蒸水95℃搅拌2h，再次去滤液。将2次提取的滤液充分搅拌后抽滤，然后将抽滤后的滤液放入旋转蒸发仪中，旋转蒸发至原体积的10％，再加入适量的氯仿萃取4-5次，然后将上层液体移至另一容器中，按体积比1∶4加入无水乙醇至终浓度为80％，4℃过夜，常温抽滤，留沉淀物。依次用无水乙醇，丙酮，乙醚分别将沉淀清洗3次，去杂质后进行真空干燥得米邦塔仙人掌粗糖粉末；

b.米邦塔仙人掌粗糖分离纯化：用纤维素DEAE-52分离柱进行分离纯化：首先用如下方法将上柱预处理：(1).将干粉的纤维素浸泡在蒸馏水中，约3小时左右，去除杂质，抽干；(2).用0.5mol/L的HCl溶液浸泡2小时，用去离子水洗净至PH中性，并抽干；(3).将抽干的纤维素再浸泡在0.5mol/L的NaOH溶液中2小时，用去离子水洗至中性，抽干，将粗糖粉末与45℃双蒸水按重量与体积之比为1∶4的比例溶解，将此溶解液分别用双蒸水及0.5M的NaOH溶液缓冲液，用上述处理后的分离柱进行洗脱，流速3ml/5min，然后将洗脱液用苯酚-硫酸法检测糖的出现，最后收集含糖洗脱液放入旋转蒸发仪中蒸发，转速为50-80/3min，温度60℃，蒸发至稠状液体，进行真空干燥得纯化米邦塔仙人掌多糖粉末。 

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