CN1733808A - 从金银花中提取金银花多糖的方法 - Google Patents

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陈华庭
陈东生
张玉
陈文�
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Abstract

从金银花中提取金银花多糖的方法，它采用水提乙醇析出沉淀法，用水先将粗多糖从金银花中提取出来，用sevag试剂法除蛋白，再用氯仿，石油醚等除去脂溶性杂质，最后用乙醇将其从水提物中沉淀析出，从而分离出金银花多糖，经干燥即得到固体的多糖。本发明填补了金银花多糖提取方法的空白，具有快速、简便、成本低、收率高的优点，有利于更进一步研究金银花多糖在医疗上的应用。

Description

从金银花中提取金银花多糖的方法
技术领域
本发明属于一种中药活性成份的提取方法，更具体地说它涉及一种从金银花中提取金银花多糖的方法。
背景技术
多糖在抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝血、免疫促进等方面发挥着生物活性作用，因此对多糖的研究与开发已越来越引起人们的广泛关注。金银花为常见中药，具有清热解毒、抗菌消炎、保肝利胆的功能。临床应用于治疗疮疡、泻痢、外感、热病等疾病，也可用于治疗呼吸道感染、头痛咽痛等疾病。至今还未见有金银花多糖提取方法的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提出一种从金银花中提取金银花多糖的方法，本发明是在通过反复实验的基础上，以正交实验法优化金银花中多糖的醇析水提法，以金银花多糖提取产率和含量为指标，对提取过程中水浸提时间，浸提温度，氯仿萃取次数和沉析用的乙醇浓度等四个因素三个水平的提取效果进行分析，从而确定提取金银花多糖的最佳提取条件，为金银花多糖的开发利用提供依据。
本发明的目的是通过如下措施来达到的：金银花多糖的提取采用水提乙醇析出沉淀法，其原理是根据多糖易溶于水，难溶于乙醇，石油醚，氯仿等溶剂的性质，可用水先将粗多糖从金银花中提取出来，用sevag试剂法除蛋白，再用氯仿，石油醚等除去脂溶性杂质，最后用乙醇将其从水提物中沉淀析出，从而分离出金银花多糖，经干燥即得到固体的多糖。需要说明的是在实际应用中也可先用氯仿，石油醚等除去脂溶性杂质后，再用sevag试剂法除蛋白，这样并不影响金银花多糖的提取。
从金银花中提取金银花多糖的方法，它依次包括如下步骤：
①.取一定量的金银花加30倍水恒温浸泡，浸提时间为2-4小时，浸提恒温在70-90℃范围内，过滤，得提取液；
②.将浸泡过的金银花残渣再加15-20倍水继续恒温浸泡30分钟，恒温在70-90℃范围内，过滤得提取液；第三次将浸泡的金银花加15-20倍水继续恒温浸泡30分钟，恒温在70-90℃范围内，过滤得提取液；合并三次提取液；
③.将提取液置于旋转蒸发器浓缩至定量金银花的2倍量，用sevag试剂法除蛋白2次，用等量氯仿或石油醚萃取除去脂溶性杂质1-3次，取水层；
④.水层加乙醇，收集乙醇浓度为50-80％范围析出的沉淀，沉淀用丙酮和乙醚分别洗涤2次，干燥，即得固体金银花多糖。
在上述技术方案中，所述浸泡时间为4小时、浸提温度为90℃、等量氯仿萃取次数为1次，沉淀用乙醚浓度为80％。
在上述技术方案中，所述浸泡时间为2小时、浸提温度为90℃、等量氯仿萃取次数为3次，沉淀用乙醚浓度为80％。
在上述技术方案中，所述浸泡时间为2小时、浸提温度为90℃、等量氯仿萃取次数为1次，沉淀用乙醚浓度为80％。
本发明具有如下优点：本发明公开了一种从金银花中提取多糖的方法，填补了金银花多糖提取方法的空白，本方法提取金银花多糖具有快速、简便、成本低、收率高的优点，有利于更进一步研究金银花多糖在治疗有关疾病中的应用。
具体实施方式
下面通过实施例详细说明本发明的实施情况：
1金银花多糖的提取及含量测定方法：从金银花中提取金银花多糖的方法，它依次包括如下步骤：
①.取50g的金银花加30倍水1500ml恒温浸泡，浸提时间为2-4小时，浸提恒温在70-90℃范围内，过滤，得提取液；
②.将浸泡过的金银花残渣再加900ml水继续恒温浸泡30分钟，恒温在70-90℃范围内，过滤得提取液；第三次将浸泡过的金银花加900ml水继续恒温浸泡30分钟，恒温在70-90℃范围内，过滤得提取液；合并三次提取液；
③.将提取液置于旋转蒸发器浓缩至定量金银花的2倍量，用sevag试剂法除蛋白2次，用等量氯仿或石油醚萃取除去脂溶性杂质1-3次，取水层；
④.水层加乙醇，收集乙醇浓度为50-80％范围析出的沉淀，沉淀用丙酮和乙醚分别洗涤2次，干燥，即得固体金银花多糖。
需要说明的是：浸泡金银花的用水量一般以淹没充分散开的金银花为佳，有机溶剂也可采用除氯仿、石油醚、乙醇之外的其它有机溶剂。
2金银花多糖含量的测定方法：用苯酚-硫酸法测定不同浓度葡萄糖的吸光度来制定浓度-吸光度标准曲线，再将样品配成一定浓度的溶液测其吸光度，代入浓度-吸光度标准曲线方程经计算得到所得多糖含量。
2.1标准曲线的制备：精密称取干燥至恒重的葡萄糖对照品10.2mg，置l00mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得葡萄糖对照品溶液。准确量取上述对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分别置10mL量瓶中，再分别各取0.5ml加浓硫酸7.5ml和5％苯酚1.5ml，于40℃保温30分钟，在490nm波长处测定吸收度，得回归方程C＝132.57A-20.67，r＝0.9971。结果表明：在10.2～51.0μg·mL-1的浓度范围内具有良好的线性关系。
3.正交试验设计：按照上述试验的提取工艺，下面经过多次(9个具体的实施例)单因子对比试验，正交试验设计为：水浸提时间(h)、浸提温度(℃)、100ml氯仿萃取次数和沉淀的乙醇浓度等四个因素，每因素3水平(见表1)，以金银花多糖的产率和含量为考察指标，用L9(34)正交表安排试验。
表1  正交试验因素水平表(试验条件)
  水平   A浸提时间(h)  B浸提温度(℃)   C100ml氯仿萃取次数  D乙醇浓度(％)
  1   2  70   1  50
  2   3  80   2  70
  3   4  90   3  80
(注：试验时其它条件完全相同)
3.1结果：按正交实验设计方法提取金银花多糖，收率和含量结果见表2。
表2  正交试验设计及结果
A B C D   产率(％) 含量(％)
 实施例1   1   1   1   1   1.44   35.89
 实施例2   1   2   2   2   2.97   27.90
 实施例3   1   3   3   3   4.39   77.24
 实施例4   2   1   2   3   2.91   26.04
 实施例5   2   2   3   1   2.90   42.42
 实施例6   2   3   1   2   5.24   32.87
 实施例7   3   1   3   2   2.88   20.84
 实施例8   3   2   1   3   5.39   32.37
 实施例9   3   3   2   1   4.77   44.80
  产率  k1   8.80   7.23   12.07   9.11
 k2   11.05   11.26   10.65   11.09
 k3   13.04   14.40   10.17   12.69
 R   1.41   2.39   0.63   1.19
  含量  k1   141.03   82.77   101.13   123.11
 k2   101.33   102.69   98.74   81.61
 k3   98.01   154.91   140.50   135.65
 R   14.34   24.05   13.92   18.01
(注：试验时其它条件完全相同)
3.2最佳产率工艺提取条件的确定：由表2中产率的R值可以看出，影响提取产率的因素排序为B＞A＞D＞C，B的影响最大，C则最小。经过运算可得出每个因素各水平之和K1、K2、K3。综合各因素K值和直观比较，得出理论上最佳提取产率的工艺条件为A3B3C1D3。故确定其最佳提取产率工艺条件为：浸提时间为4h，浸提温度为90℃，等量氯仿萃取次数为1次，沉析用的乙醇浓度为80％。
3.3最佳含量工艺提取条件的确定：此外，由表2中含量的R值来分析，影响其含量的因素排序为：B＞D＞A＞C。B和D的影响较显著，A和C则不显著。说明提取过程中，浸提温度对金银花多糖的含量影响是最大的，温度高有利于提高金银花多糖的含量；乙醇浓度对金银花多糖含量的影响也较大，由表中可看出浓度为80％时含量较高；浸提时间和氯仿的萃取次数则影响较小。从其含量的K1、K2、K3看到，所得金银花多糖含量最佳的工艺条件为A1B3C3D3。要得到金银花多糖含量高的最佳提取工艺条件应为：浸提时间为2h，浸提温度为90℃，100ml氯仿萃取次数为3次，沉析用的乙醇浓度为80％。
3.4验证实验：为验证最佳工艺，称取金银花50g，按照优化后所得最佳提取工艺即加入30倍量水提取3次，浸提时间为2h，浸提温度为90℃，100ml氯仿萃取次数为1次，沉析用的乙醇浓度为80％进行提取，每次2小时，对所得多糖称重并进行测定。结果表明，多糖得率为4.78％，金银花多糖相对百分含量为78.10％，可知与正交表中的最优水平一致，这说明本发明所确定的工艺合理。
3.5最佳工业化提取条件的确定：提取条件的影响从表2的结果，我们还看出：(1)水浸提的时间有三个，分别为2h、3h和4h，这三个时间条件对产率的影响结果表明：浸提时间越长，产率越高，但金银花多糖的含量在浸提3h和4h时有所下降，且在浸提2h中3号的含量比其他的高很多，因此选取浸提时间为2h，时间过长，浸出的杂质越多，另外从时间与效率、成本来看，浸提时间选2h是最好的。(2)浸提温度对产率和含量的影响都是最大的，温度升高，产率和含量也升高，因此适当提高浸提温度是必要的，在此我们选择90℃作为浸提的最佳温度。(3)氯仿萃取次数对产率和含量的影响都是最小的，随着萃取次数的增加，产率和含量的变化不明显，从时间与效率、成本来看，萃取1次就可以了。(4)乙醇沉析用的浓度考察了三个水平，分别为50％、70％和80％。其对产率的影响虽不是很大，但乙醇浓度越高，产率也越高，而且乙醇浓度对含量的影响较大，浓度越高，含量越高，故从产率与产品的质量来考虑，选用乙醇浓度为80％最好，不但可降低乙醇的使用量，还可减少乙醇回收所带来的成本。综上所述，考虑金银花多糖的提取产率、纯度与成本等因素，对醇析水提法提取金银花多糖的条件再次优化，本发明选取了另一种工艺条件：水浸提时间为2h，浸提温度为90℃，100ml氯仿萃取次数为1次，沉析用的乙醇浓度为80％。
需要说明的是：对于所属领域的技术人员来说，在不改变本发明原理的前提下还可以对本发明做出若干的改变或变形，这同样属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1、从金银花中提取金银花多糖的方法，其特征在于它依次包括如下步骤：
①.取一定量的金银花加30倍水恒温浸泡，浸提时间为2-4小时，浸提恒温在70-90℃范围内，过滤，得提取液；
②.将浸泡过的金银花残渣再加15-20倍水继续恒温浸泡30分钟，恒温在70-90℃范围内，过滤得提取液；第三次将浸泡的金银花加15-20倍水继续恒温浸泡30分钟，恒温在70-90℃范围内，过滤得提取液；合并三次提取液；
③.将提取液置于旋转蒸发器浓缩至定量金银花的2倍量，用sevag试剂法除蛋白2次，用等量氯仿或石油醚萃取除去脂溶性杂质1-3次，取水层；
④.水层加乙醇，收集乙醇浓度为50-80％范围析出的沉淀，沉淀用丙酮和乙醚分别洗涤2次，干燥，即得固体金银花多糖。
2、根据权利要求1所述的从金银花中提取金银花多糖的方法，其特征在于所述浸泡时间为4小时、浸提温度为90℃、等量氯仿萃取次数为1次，沉淀用乙醚浓度为80％。
3、根据权利要求1所述的从金银花中提取金银花多糖的方法，其特征在于所述浸泡时间为2小时、浸提温度为90℃、等量氯仿萃取次数为3次，沉淀用乙醚浓度为80％。
4、根据权利要求1所述的从金银花中提取金银花多糖的方法，其特征在于所述浸泡时间为2小时、浸提温度为90℃、等量氯仿萃取次数为1次，沉淀用乙醚浓度为80％。
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