CN110200987B - 桔梗总多糖在制备治疗由cccp诱导的细胞凋亡的药物中的应用 - Google Patents

桔梗总多糖在制备治疗由cccp诱导的细胞凋亡的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了桔梗总多糖在制备治疗由CCCP诱导细胞凋亡的药物中的应用。本发明通过选用CCCP建立线粒体途径引起的细胞凋亡模型，研究CCCP诱导猪肺泡巨噬细胞发生氧化损伤后，桔梗总多糖对细胞活性和细胞凋亡的影响。本发明首次发现，一定浓度的桔梗总多糖(100‑200μg/mL)能够拮抗CCCP所引起的细胞凋亡，而且使细胞核形变的现象显著减少，并能抑制线粒体膜电位的改变。本发明拓展了桔梗总多糖的医药用途，有利于以桔梗总多糖为有效成分的具有新适应症药物的开发。

Description

桔梗总多糖在制备治疗由CCCP诱导的细胞凋亡的药物中的 应用
技术领域
本发明涉及桔梗总多糖的医药用途领域，具体涉及桔梗总多糖在制备治疗由CCCP诱导的细胞凋亡的药物中的应用。
背景技术
羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)是一种解偶联剂，具有抑制线粒体氧化磷酸化的功能，能够提高细胞内氧气的消耗量，使细胞处于低氧状态，破坏生物氧化与磷酸化相偶联的作用。在电子传递链过程正常的情况下，CCCP通过消除线粒体跨膜质子浓度梯度，抑制由ADP转化成ATP的磷酸化过程，致使线粒体中的蛋白质合成受到影响，从而导致细胞的一步步损害直至细胞凋亡。
桔梗(Platycodon grandiflorum(Jacq)A.DC)为桔梗科桔梗属，是一种多年生的草本植物。桔梗的主要化学成分有桔梗皂苷、挥发油、甾体、黄酮类、多糖等。桔梗用于咽痛、音哑、咳嗽痰多、胸闷不畅、疮疡脓成不溃等症，具有利咽、宣肺、祛痰、排脓等功效。桔梗还可以作为食品，其含有丰富的营养，含多种人体所必需的微量元素和氨基酸。现代药理学研究发现桔梗具有多种生物学活性，如改善胰岛素抵抗、抗氧化、消炎、增强机体免疫功能及抗肿瘤等。
多糖是桔梗的主要活性成分之一，研究表明桔梗多糖(PGPS)具有抑菌、抗肿瘤、降低血糖、抗炎、调节机体免疫、抗氧化等功能。但尚未见有桔梗总多糖在拮抗由CCCP所诱导的细胞凋亡方面的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供桔梗总多糖在制备治疗由CCCP诱导的细胞凋亡的药物中的新应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供桔梗总多糖在制备治疗由CCCP诱导的细胞凋亡的药物中的应用。
进一步的，上述应用中，所述药物具有如下1)-3)至少一项所述的性能：
1)提高CCCP诱导条件下的细胞存活率，降低细胞凋亡率；
2)缓解细胞核损伤；
3)抑制线粒体膜电位的改变。
优选的，所述桔梗总多糖由如下方法制备而成：
将桔梗根切片，加入8-10重量倍的水浸泡过夜，然后在75-85℃的条件下浸提3-5h，过滤，将滤液浓缩至相对密度为1.05-1.15(50℃测)，离心除去杂质，得到浸提液；
向浸提液中加入体积浓度为95％的乙醇，边加边搅拌，使乙醇的终浓度为80％，静置，离心，分离沉淀，干燥，即制备得到桔梗总多糖。
更优选的，静置的时间为24h。
优选的，所述桔梗总多糖的数均分子量为1.72×103～1.66×105Da，重均分子量为2.05×103～2.67×105Da，分布宽度1.19～1.60。
优选的，所述桔梗总多糖的单糖组成包括：葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖和鼠李糖。
优选的，所述桔梗总多糖的浓度为100-200μg/mL。
本发明的第二方面，提供一种拮抗由CCCP诱导的细胞凋亡的保护剂，所述保护剂以浓度为100-200μg/mL的桔梗总多糖作为活性成分。
本发明的有益效果：
本发明通过选用CCCP建立线粒体途径引起的细胞凋亡模型，研究CCCP诱导猪肺泡巨噬细胞发生氧化损伤后，桔梗总多糖对细胞活性和细胞凋亡的影响。本发明首次发现，一定浓度的桔梗总多糖(100-200μg/mL)能够拮抗CCCP所引起的细胞凋亡，而且能够缓解细胞核损伤现象，并能抑制线粒体膜电位的改变。本发明拓展了桔梗总多糖的医药用途，有利于以桔梗总多糖为有效成分的具有新适应症药物的开发。
附图说明
图1：实施例1制备的桔梗总多糖的红外吸收光谱图。
图2：实施例1制备的桔梗总多糖的GC-MC图；其中，C：桔梗总多糖；D：标准多糖。
图3：实施例1制备的桔梗总多糖核磁共振分析图；其中，C:1H NMR spectra ofPGPSt.F:13C NMR spectra of PGPSt。
图4：CCCP对3D4/21细胞的毒性作用；*表示与对照相比，*P<0.05,表示差异显著，**P<0.01,表示差异极显著。
图5：桔梗总多糖对3D4/21细胞的增殖作用；*表示与对照相比，*P<0.05，表示差异显著，**P<0.01表示差异极显著。
图6：CCCP与PGPSt共处理3D4/21细胞12h的细胞活性；*表示与对照相比，**P<0.01表示差异极显著；#表示与CCCP处理组相比，#P<0.05,表示差异显著，##P<0.01表示差异极显著。
图7：a流式细胞仪检测不同浓度PGPSt抑制CCCP诱导的3D4/21细胞凋亡；b PGPSt抑制CCCP诱导的3D4/21细胞凋亡；*表示与对照相比，**P<0.01表示差异极显著；#表示与CCCP处理组相比，#P<0.05,表示差异显著。
图8：a线粒体膜电位结果图；b线粒体膜电位变化的定量分析；*表示与对照相比，**P<0.01表示差异极显著；#表示与CCCP处理组相比，##P<0.01,表示差异显著。
图9：a激光共聚焦检测细胞凋亡(630×)；b定量分析凋亡细胞；*表示与对照相比，**P<0.01表示差异极显著；#表示与CCCP处理组相比，#P<0.05,表示差异显著，##P<0.05，表示差异极显著。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景部分所介绍的，桔梗总多糖(PGPSt)作为桔梗的主要活性成分之一，具有抑菌、抗肿瘤、降低血糖、抗炎、调节机体免疫、抗氧化等功能，但在拮抗由CCCP所诱导的细胞凋亡方面还未见有报道。
为进一步深入研究桔梗总多糖的功效，本发明建立了由CCCP诱导的线粒体途径引起的细胞凋亡模型，探讨桔梗总多糖(PGPSt)对羰基氰化物间氯苯腙(CCCP)诱导的猪肺泡巨噬细胞(3D4/21细胞)线粒体凋亡途径的潜在保护作用。采用CCK-8法测定细胞活力，Annexin V和PI双染色法处理细胞，流式细胞术检测细胞凋亡率，Hoechst 33342法对细胞染色后激光共聚焦显微镜观察凋亡细胞核形态变化，JC-1法检测细胞线粒体膜电位的变化。结果显示，15μM的CCCP处理细胞的存活率为51.4％，PGPSt(100μg/mL、200μg/mL)与CCCP共处理后细胞存活率分别为62.2％、78.6％，表明PGPSt能够抑制CCCP引起的细胞损伤；采用Annexin V和PI双染色法处理细胞，流式细胞术检测细胞凋亡率，结果表明15μM CCCP单独处理细胞12h细胞凋亡率上升，PGPSt与CCCP共处理后，细胞凋亡被抑制，细胞凋亡率下降；采用Hoechst 33342法对细胞染色，共聚焦显微镜观察凋亡细胞核形态变化，结果表明15μM CCCP单独处理12h后出现显著的细胞核深染，核内陷，核形状不规则等形态变化，PGPSt与CCCP共处理后，这种核形变的现象显著减少，结果表明PGPSt能缓解CCCP引起的细胞核损伤。
多糖是由多个单糖分子链接而成的大分子化合物，多糖的分子量不同、多糖分子中单糖间的排列方式不同等，都会导致多糖的药理活性不同。本发明中所采用的桔梗总多糖是经水煎-醇沉法提取得到，桔梗总多糖的数均分子量为1.72×103～1.66×105Da，重均分子量为2.05×103～2.67×105Da，分布宽度1.19～1.60；由葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖、鼠李糖六种单糖组成，多糖主链由(1→3)-D-Glcp-(1→6)-D-Glcp组成。经试验发现，上述分子量和单糖结构组成的桔梗总多糖具有最优的拮抗由CCCP所诱导的细胞凋亡的功效。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：
细胞凋亡诱导剂CCCP，蛋白裂解液，二甲基亚砜(DMSO)，胰蛋白酶-EDTA消化液(北京Solarbio公司)；无支原体胎牛血清(杭州四季青有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)；RPMI1640培养基(美国GIBCO公司)；CCK-8试剂盒，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(日本Dojindo公司)；JC-1线粒体膜电位检测试剂盒，其他常规试剂等均为国产分析纯。
实施例1：桔梗总多糖的制备与结构分析
1.桔梗总多糖的制备：
将桔梗根切片，加入8重量倍的水浸泡过夜，然后在80℃的条件下浸提4h，过滤，将滤液加热浓缩至相对密度为1.05-1.15(50℃测)，冷却后3000rpm离心10min除去杂质，得到浸提液；
向浸提液中缓慢加入体积浓度为95％的乙醇，边加边搅拌，使乙醇的终浓度为80％，静置24h，离心，分离沉淀，将沉淀在60℃真空干燥，即制备得到桔梗总多糖(PGPSt)。
2.桔梗总多糖的结构分析：
对实施例制备的桔梗总多糖分别进行红外光谱分析、分子量分析、单糖组成分析和核磁共振分析，具体方法如下：
2.1红外光谱分析
分别称取2mg左右的桔梗总多糖与干燥的KBr粉末进行研磨，混合均匀后压片，在400～4000cm-1范围内测定红外扫描。结果记录在红外光谱仪上，主峰(强度和波数)的获得光谱利用OMNIC软件检测(Nicolet仪器公司)。结果见图1。
由图1可以看出，在3420，2920，1620，1400和1100cm-1处均有多糖的特征信号峰。在3334cm-1处有吸收，显示出广泛的强峰，这是由于糖分子内或分子间氧键的O-H伸缩振动引起的；在2933cm-1，处出现的峰为-CH2和H-C＝O键的伸缩振动；在1670cm-1和1455cm-1处，PGPSt有两个显著的多糖吸收峰，表明存在C＝O键、C＝C键的变性振动结构；在1409.78cm-1处有特征吸收峰是C-H相关的变形振动。由以上四组峰可初步判断该物质为糖类化合物。在950-1200cm-1之间的吸收峰是由两种伸缩振动形成的，一种是C-O-C，另一种是C-O。808cm-1和883cm-1吸收信号显示为甘露糖残基。IR图谱显示桔梗总多糖具有多糖的典型特征吸收峰。
2.2多糖分子量分析
多糖分子量分析采用凝胶渗透色谱(GPC)进行，通过观察峰值的保留时间和峰面积归一化得到分子量。
2.2.1测定方法
将已知分子量的标样葡聚糖分别用流动相溶解制成10mg/mL溶液，进样量25μL标准品溶液，记录示差色谱图，用SHIMADZU GPC软件以标准葡聚糖分子量的对数logMW对保留时间tR进行回归处理。将样品用流动相溶解制成10mg/mL的溶液进行分析，记录示差色谱图。计算分子量。
2.2.2标准曲线的制备
将葡聚糖标样(Dextran，分子量为1270，5220，11600，23800，48600)用流动相配制成10mg mL-1的溶液，待仪器的基线是一直线，即达到平衡后，进样量为25μL，每个样持续时间45min，以标准葡聚糖摩尔质量(Molar Mass)对洗脱体积ElutionVolume进行回归处理，得到葡聚糖相对分子质量分布标准曲线及标准方程。
结果表明：本发明实施例制备的桔梗总多糖的数均分子量为1.72×103～1.66×105Da，重均分子量为2.05×103～2.67×105Da，分布宽度1.19～1.60。
2.3多糖的单糖组成分析：
多糖的单糖组成分析采用GC-MS进行。
2.3.1色谱条件
160℃开始，保留3min，以2℃min-1线性升到210℃，载气：氦气；柱流量：1.0mL/min；进样口温度：250℃；质谱条件：EI源；电力电压:70eV；离子源：250℃；扫描范围：33-550aum；分流比：50:1。
2.3.2测定方法
多糖衍生物的制备：10mg多糖样品，加入4mL的CF3COOH充N2，120℃密闭水解4h，减压蒸干，加入10mg盐酸羟胺，0.5mL吡啶，于90℃油浴中反应30min，加入0.5mL乙酸酐，上述油浴条件反应30min，反应产物减压蒸干。用1mL的三氯甲烷充分溶解衍生物，0.22μm滤膜过膜处理，上机，进样量0.2μL。峰面积法定量。
对照标准单糖：葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖。做同样衍生化处理上机。根据出峰时间确定每种单糖的出峰时间。
GC-MS的色谱图如图2所示，结果表明，本发明制备的桔梗总多糖是由葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖、鼠李糖六种单糖组成，但存在不同的摩尔比，见表1。
表1：桔梗总多糖中各单糖所占的摩尔比
Figure BDA0002093478620000061
注:Glu:glucose，Man:mannose，Ara:arabinose，Gal:galactose，Xyl:xylose，Rib:ribose，Rha:rhamnose。
2.4多糖的核磁共振分析
取桔梗总多糖样品20mg经D2O交换3次后，溶于0.5mL D2O中，用BRUKER400型核磁共振仪，测定1H-NMR(频率400MHz，温度296.9K)、13C-NMR(100MHz，温度296.9K，扫描25000次)。
本发明实施例制备的桔梗总多糖的核磁共振分析图谱见图3，由图3C可以看出，在δ4.0～5.5ppm之间有两类单糖的端基质子的响应信号，如δ5.18ppm是β-型糖的端基质子信号，可归属于β-葡萄糖、β-半乳糖和β-甘露糖；δ4.74和δ4.63ppm是α-吡喃型糖的端基质子信号，分别归属于鼠李糖和阿拉伯糖；
13C-NMR可通过异头碳的共振区(δ90～110ppm)峰的个数确定糖残基的数量和相对含量。在所测样品中，δ103.90ppm，103.18ppm，103.09ppm显示为β-型糖端基碳的共振信号，葡萄糖与半乳糖及甘露糖互为差向异构体，端基碳出峰较接近，另外从信号峰的强度说明桔梗总多糖中β型糖苷含量较高，这与水解单糖的结果相符合。在糖的其它碳信号可以看出，以(1→6)方式链接的葡萄糖残基相对较少，6号位碳发生苷化位移的信号峰不够强(PGPSt图3F)，而δ81.6ppm的较强信号峰可以说明葡萄糖残基多以(1→3)方式链接。通过PGPSt的谱图来看，说明多糖的单糖组成相对一致。
根据对桔梗总多糖核磁共振的1H NMR和13C NMR谱进行比较，实验得出结论，PGPSt主链由(1→3)-D-Glcp-(1→6)-D-Glcp组成。
实施例2：桔梗总多糖对CCCP诱导猪肺泡巨噬细胞凋亡的保护作用研究
1.试验方法：
1.1桔梗总多糖的配制
母液(5mg/mL)的配制：用精密天平准确称取50mg桔梗总多糖(实施例1制备)与8mLRPMI 1640培养基混合均匀，然后在超净台中用0.22μm滤器过滤，分装于1mL的离心管中，4℃避光保存。
工作液的配制：将桔梗总多糖母液配制成100μg/mL、200μg/mL的桔梗总多糖工作液。
1.2细胞培养
猪肺泡巨噬细胞3D4/21细胞系培养在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养1-2d，将细胞从培养箱移至倒置显微镜下观察，若细胞正处于对数生长期，且已经铺满至细胞瓶85％以上的细胞可以用来进行后续的处理和使用。在细胞超净工作台中将原细胞瓶中的细胞培养液废弃，向细胞培养瓶中加入1mL 37℃预热的PBS清洗细胞2-3次。加入2mL0.5％胰酶-EDTA转移至二氧化碳培养箱中消化6-8min，然后移至倒置显微镜观察细胞，若出现细胞成片的脱落，细胞游离在培养液中，细胞形态开始变圆且透亮，即可视为消化完成。在超净工作台中加入4mL的细胞培养液，终止胰酶的消化作用，用移液枪反复吹吸至细胞全部脱落，转移至10mL离心管中，1200rpm离心5min。待离心完毕后，移至超净工作台，弃去上清液，加入4mL细胞培养液，反复吹吸细胞悬液至细胞分散均匀，进行细胞计数，调整细胞的浓度，然后接种到25cm2细胞瓶中，在37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。
1.3 CCK-法检测细胞存活率
培养3D4/21细胞，待细胞铺满细胞瓶，将细胞悬液按照2×104个/孔传至96孔板中，每孔中细胞悬液100μL，培养12-24h；实验分组：空白组(对照)；CCCP组；桔梗总多糖处理组；CCCP和桔梗总多糖共孵育组；待细胞铺满96孔板约85％时，细胞用0～50μM CCCP和0～800μg/mL PGPSt处理细胞12h。当处理完毕后，向96孔板中每孔加入10μL CCK-8试剂。37℃培养箱中孵育90min；OD值检测：使用酶标仪检测各处理组细胞在450nm处的吸光值；细胞存活率的计算：细胞存活率＝[(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]×100％。
1.4流式细胞术检测细胞凋亡率
将细胞悬液传代至六孔板培养；待细胞长至85％时，处理细胞12h，实验分四组：空白处理组(对照)，CCCP处理组，PGPSt(100μg/mL)+CCCP(15μM)共处理组、PGPSt(200μg/mL)+CCCP(15μM)共处理组；用PBS洗涤细胞2次，用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞5～8min；1200rpm离心5min，弃上清，收集细胞；重复洗涤2次；加入Annexin V Binding Solution，重悬细胞，加Annexin V，FITC结合液，再加入PI Solution，室温避光孵育15min，最后加入Annexin V Binding Solution调整细胞悬液浓度，上机检测。
1.5激光共聚焦显微镜观察凋亡细胞
将胞悬液传代至六孔板培养；待细胞长至85％时，处理细胞12h，实验分四组：空白处理组(对照)，15μM CCCP处理组，PGPSt(100μg/mL)+CCCP(15μM)共处理组、PGPSt(200μg/mL)+CCCP(15μM)共处理组；用预冷的PBS缓冲液清洗细胞2次，加入200μL Hoechst 33342染色液，室温避光孵育10min；孵育完毕用预冷的PBS洗涤2次；将细胞爬片取出，封片；在激光共聚焦显微镜下观察，在1h内检测完成，防止时间过长荧光发生淬灭影响实验结果。
1.6线粒体膜电位检测
将细胞悬液传代至六孔板培养；待细胞长至85％时，处理细胞12h，实验分四组：空白处理组(对照)，15μM CCCP处理组，PGPSt(100μg/mL)+CCCP(15μM)共处理组、PGPSt(200μg/mL)+CCCP(15μM)共处理组；用预冷的PBS缓冲液清洗细胞2次，胰蛋白酶消化细胞，收集于离心管中离心弃上清，0.5mL细胞培养液重悬细胞；加入0.5mL JC-1染色液，吹打混匀，37℃孵育20min；JC-1染色缓冲液洗涤细胞，600g离心3-4min，重复2次；上机检测。
1.7统计学分析
数据采用平均值±标准差(Mean±SE)表示，使用SPSS 24.0生物统计软件对数据进行One-Way ANOVA统计分析。同时，采用Graph Pad Prism 7.0软件作图，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
2.试验结果：
2.1 CCCP的细胞毒性作用
用CCCP处理3D4/21细胞会引起细胞凋亡，呈剂量和时间依赖性，如图4所示，15μMCCCP处理3D4/21细胞在12h其抑制率为51.5％。因此，选择15μM CCCP处理12h作为后续的试验条件。
2.2 PGPSt对细胞的增殖作用
为了研究PGPSt对3D4/21细胞的影响，根据之前CCCP毒性结果筛选的时间，用不同浓度的PGPSt处理3D4/21细胞12h，检测细胞活力的变化。结果表明，PGPSt处理细胞12小时，在浓度低于400μg/mL时，PGPSt对细胞没有毒性作用，细胞增殖率与PGPSt呈剂量依赖性增加。因此我们选用100μg/mL、200μg/mL的PGPSt作为后续的试验条件。见图5。
2.3 PGPSt对细胞的保护作用
为了确定PGPSt对细胞凋亡的保护作用，根据之前筛选出来的CCCP攻毒浓度和PGPSt的保护浓度，用PGPSt与CCCP共处理细胞，使用CCK-8法测定细胞活力。结果如图6，与对照相比，15μM CCCP处理细胞，细胞存活率显著下降(P<0.01)；PGPSt(100μg/mL)与CCCP共处理，细胞存活率较CCCP处理组明显上升(P<0.05)；PGPSt(200μg/mL)与CCCP共处理，细胞存活率较CCCP处理组显著上升(P<0.01)。结果表明PGPSt作为一种保护剂能显著的拮抗CCCP引起的细胞损伤且呈剂量依赖性。
2.4 Annexin V-FITC和PI双染法检测细胞凋亡
为探讨PGPSt对CCCP诱导的3D4/21细胞凋亡的保护作用，Annexin V-FITC和PI双染法检测细胞凋亡率。如图7所示，由流式分析可知，CCCP处理组的细胞凋亡率较对照组显著上升(P<0.01)；PGPSt(100μg/mL)与CCCP共处理，凋亡细胞的数量较CCCP组减少，细胞凋亡率下降；PGPSt(200μg/mL)与CCCP共处理，细胞凋亡率显著下降(P<0.05)。结果表明CCCP诱导3D4/21细胞发生凋亡，添加PGPSt后，能够抑制CCCP所引起的细胞凋亡，且呈剂量依赖效应。
2.5检测线粒体膜电位变化
为了确定线粒体膜电位(MMP)的变化是否与PGPSt的保护作用有关，使用JC-1探针测定MMP的变化。如图8所示，与对照组相比，CCCP处理组MMP下降的细胞数量显著增加(P<0.01)。PGPSt(100μg/mL、200μg/mL)与CCCP共处理，PGPSt能抑制MMP的下降，且在200μg/mL时效果显著(P<0.01)。结果表明PGPSt对CCCP诱导的MMP下降有拮抗作用，且呈剂量依赖效应。
2.6激光共聚焦显微镜观察凋亡细胞的形态变化
为进一步研究PGPSt对CCCP诱导的3D4/21细胞凋亡的影响，用Hoechst 33342染色对细胞染色，使用激光共聚焦显微镜观察凋亡细胞。图9-a结果显示，15μM CCCP单独处理12h后出现显著的细胞核深染、核内陷、核形状不规则等形态变化。PGPSt(100μg/mL、200μg/mL)与CCCP共处理后，这种核形变的现象显著减少；图9-b定量分析结果显示，与对照组相比，CCCP处理可使凋亡细胞显著增加(P<0.01)，PGPSt(100μg/mL)与CCCP共处理，出现核损伤的细胞数量较CCCP组减少(P<0.05)；PGPSt(200μg/mL)与CCCP共处理，出现核损伤的细胞数量较CCCP组显著减少(P<0.01)。结果表明PGPSt能缓解CCCP引起的细胞核损伤，对凋亡细胞有一定的保护作用。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (4)

1.桔梗总多糖在制备治疗由羰基氰化物间氯苯腙诱导的猪肺泡巨噬细胞凋亡的药物中的应用；
所述药物具有如下1）-3）至少一项性能：
1）提高羰基氰化物间氯苯腙诱导条件下的细胞存活率，降低细胞凋亡率；
2）缓解细胞核损伤；
3）抑制线粒体膜电位的改变；
所述桔梗总多糖由如下方法制备而成：
将桔梗根切片，加入8-10重量倍的水浸泡过夜，然后在75-85℃的条件下浸提3-5h，过滤，将滤液浓缩至在50℃测相对密度为1.05-1.15，离心除去杂质，得到浸提液；
向浸提液中加入体积浓度为95%的乙醇，边加边搅拌，使乙醇的终浓度为80%，静置，离心，分离沉淀，干燥，即制备得到桔梗总多糖；
所述桔梗总多糖的浓度为100-200 μg/mL。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，静置的时间为24h。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述桔梗总多糖的数均分子量为1.72×103~1.66×105 Da，重均分子量为2.05×103 ~2.67×105 Da，分布宽度1.19~1.60。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述桔梗总多糖的单糖组成包括：葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、木糖和鼠李糖。
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