CN115710320B

CN115710320B - 一种预防和/或治疗自身免疫疾病的黄精多糖

Info

Publication number: CN115710320B
Application number: CN202211477378.1A
Authority: CN
Inventors: 汪珍; 孙桥旭; 付然泽; 王斌
Original assignee: Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Current assignee: Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Priority date: 2022-11-23
Filing date: 2022-11-23
Publication date: 2023-10-24
Anticipated expiration: 2042-11-23
Also published as: CN115710320A

Abstract

本发明公开了一种预防和/或治疗自身免疫疾病的黄精多糖。本发明自滇黄精的根茎中分离纯化得到一种黄精多糖，并对其分子量、单糖组成、化学结构等进行了分析鉴定，确定了其分子量和结构组成。该多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖醛酸组成，其摩尔比为5:3:2:1。经检测，该多糖为碱性多糖。经体外DPPH实验和MH7A细胞活性评价后，确定该多糖具有显著的抗炎免疫活性。该多糖可用于制备预防和/或治疗自身免疫疾病的药物、保健品和食品，具有较佳的应用前景和商业价值，还可提高黄精的利用价值。

Description

一种预防和/或治疗自身免疫疾病的黄精多糖

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及多糖及其应用，具体地说，涉及一种预防和/或治疗自身免疫疾病的黄精多糖。

背景技术

多糖是从各种生物材料中提取到的具有生理活性的一类大分子天然产物，通常为10个及以上的单糖单元所构成的天然高分子聚合物，是参与机体生长发育及各种生命活动的重要物质之一。目前，研究已发现多糖具有多种生理作用，如免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、降血糖等。

黄精为百合科植物滇黄精(Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.)、黄精(Polygonatum sibiricum Red.)或多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)的干燥根状茎。黄精属补阴虚中药，具有补气养阴的功效。黄精中含有多种化学成分，主要包括多糖、甾体皂苷、三萜、生物碱、黄酮等，其中多糖组分约占总成分的20％以上，被认为是黄精的主要药效物质，可视为黄精的质量标志物。目前，有关黄精多糖中发挥生物活性的具体药效物质尚不明确。

研究表明，黄精多糖主要具有增强免疫、抗肿瘤、抗炎症等作用。比如，专利文献CN110343185B公开了一种酒制黄精多糖能够调节脾虚免疫功能；专利文献CN108164615A公开了黄精多糖可提高由环磷酰胺诱导免疫低下的小鼠的脾脏与胸腺指数，增强刀豆蛋白A刺激下脾脏与胸腺细胞体外增殖能力，增强免疫低下小鼠巨噬细胞的吞噬功能和分泌IL-6(白细胞介素-6)和TNF-α(肿瘤坏死因子-α)的能力；专利文献CN104106763B公开了黄精多糖可以通过抑制肿瘤新生血管生成、免疫抑制、抗氧化及抑制结肠癌成纤维细胞生长等多途径调节肿瘤微环境，从而抑制结肠癌；专利文献CN112076205B公开了黄精多糖在制备抑制炎症因子的释放、调控菌群失调修复肠粘膜屏障损伤的药物中的应用，与本申请不同的是，该发明制备的黄精多糖是通过调节中性粒细胞髓过氧化物酶(MPO)活性以降低炎症因子IL-6、TNF-α的产生及升高抗炎因子IL-10(白细胞介素-10)的表达，抑制炎症表达，从而实现治疗溃疡性结肠炎的。专利文献CN111956738A公开了黄精提取物可抑制脂多糖诱导的小鼠中IL-1β(白细胞介素-1β)和TNF-α的产生，与本申请不同的是，该发明制备的黄精提取物是用于治疗腹膜炎及腹膜炎所致的肺损伤的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种预防和/或治疗自身免疫疾病的黄精多糖及其制备方法。

其具体技术方案为：

本发明提供了一种预防和/或治疗自身免疫疾病的黄精多糖，其由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖醛酸组成，其摩尔比为5:3:2:1。

进一步地，所述的多糖的分子量为1.91kDa。

进一步地，所述的多糖为碱性多糖，其pH值为10.21。

进一步地，所述的多糖包含2,4-连接的β-D-吡喃葡萄糖残基Glcp、3-连接的α-D-吡喃葡萄糖残基Glcp、2,3-连接的α-D-吡喃甘露糖残基Manp、2,3,4-连接的α-D-吡喃半乳糖残基Galp、1,4-连接的β-D-吡喃半乳糖残基Galp和葡萄糖醛酸GlcA。

进一步地，所述的多糖的化学结构中，分子中糖苷键链接方式由Glcp(3→，→2)Glcp(4→，→2)Glcp(4→，→2)Manp(3→，→2,3)Galp(4→，→2)Glcp(4→，→1)Galp(4→，Glcp(3→构成，在→2,3)Galp(4→的4位上的支链由→2)Manp(3→，→2)Glcp(4→，GlcA构成。

进一步地，所述的多糖包含如下结构：

其中，n为1或2。

本发明还提供了一种黄精多糖的制备方法，其包括如下步骤：

(1)取黄精粉末，加水超声，将所得水提物依次经醇沉、离心、冷冻干燥得到黄精粗多糖；

(2)将步骤(1)所得的黄精粗多糖通过离子交换柱层析，洗脱，收集洗脱液，得到黄精多糖精提液；

(3)将步骤(2)所得的黄精多糖精提液通过凝胶色谱柱层析，洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥。

进一步地，所述的制备方法的步骤(1)中，所述的黄精粉末选自滇黄精的根茎粉末、黄精根的茎粉末、多花黄精的根茎粉末的一种，优选为滇黄精的根茎粉末。

进一步地，所述的制备方法的步骤(1)中，所述的水的温度为80～100℃；比如，所述的水的温度为80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100℃。

进一步地，所述的制备方法的步骤(1)中，所述的超声的时间为0.5～2h；比如，所述的超声的时间为0.5、1、1.5、2h；在本发明的一个实施例中，该超声时间为1h。

进一步地，所述的制备方法的步骤(1)中，所述的滇黄精根茎粉末与水的料液比(W/V，g/mL)为1:(2～6)；比如，所述的滇黄精根茎粉末与水的料液比为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6；在本发明的一个实施例中，该料液比为1:4。

进一步地，所述的制备方法的步骤(1)中，所述的水提物与醇的体积比为1:(2～6)；比如，所述的水提物与醇的体积比为1:2、1:3、1:4、1:5、1:6；在本发明的一个实施例中，该体积比为1:4。

进一步地，所述的制备方法的步骤(1)中，所述的醇为70～90％乙醇；比如，所述的醇为70、75、80、85、90％乙醇；在本发明的一个实施例中，该醇为80％乙醇。

进一步地，所述的制备方法的步骤(1)中，所述的醇沉温度为25～30℃；比如，所述的醇沉温度为25、26、27、28、29、30℃。

进一步地，所述的制备方法的步骤(1)中，所述的醇沉时间为6～24h；比如，所述的醇沉时间为6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24h；在本发明的一个实施例中，该醇沉时间为12h。

进一步地，所述的制备方法的步骤(1)中，所述的离心的转速为1000～5000rpm；比如，所述的离心的转速为1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000rpm；在本发明的一个实施例中，该离心的转速为2000rpm。

进一步地，所述的制备方法的步骤(1)中，所述的离心时间为5～20min；比如，所述的离心时间为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20min；在本发明的一个实施例中，该离心时间为10min。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)包括：取滇黄精根茎粉末，加水超声，过滤，浓缩，加入80％乙醇，收集沉淀，离心，冷冻干燥，得到黄精粗多糖。

进一步地，所述的制备方法的步骤(2)中，所述的离子交换柱为纤维素柱，其填料为DEAE-纤维素。

进一步地，所述的制备方法的步骤(2)中，所述的洗脱中所用洗脱剂为NaCl溶液，该NaCl溶液浓度为0～1.0mol/L；比如，所述的NaCl溶液浓度为0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0mol/L。

进一步地，所述的制备方法的步骤(2)中，所述的洗脱可以为梯度洗脱，洗脱剂浓度可以为0～1.0mol/L；比如，所述的洗脱剂浓度为0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0mol/L。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)包括：将步骤(1)所得的黄精粗多糖溶液通过纤维素柱，梯度洗脱，收集洗脱液，得到黄精多糖精提液。

进一步地，所述的制备方法的步骤(3)中，所述的凝胶色谱柱为葡聚糖凝胶色谱柱，其填料为Sephadex G-200。

进一步地，所述的制备方法的步骤(3)中，所述的洗脱中所用洗脱剂为水。

进一步地，所述的制备方法的步骤(3)中，所述的洗脱的流速为0.1～0.5mL/min；比如，所述的洗脱的流速为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mL/min；在本发明的一个实施例中，该流速为0.2mL/min。

在本发明的一个实施方式中，步骤(3)包括：将步骤(2)所得的黄精多糖精提液通过葡聚糖凝胶色谱柱，用水洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，得到黄精多糖。

本发明还提供了一种上述制备方法得到的粗多糖。

本发明还提供了一种上述多糖在制备预防和/或治疗自身免疫疾病的药物、保健品和食品中的应用。

进一步地，所述的疾病包括类风湿性关节炎、脊柱关节炎、银屑病关节炎、溃疡性结肠炎和多发性肌炎的一种或多种；优选地，所述的疾病为类风湿性关节炎。

上述应用中，上述多糖可单独使用，也可与其他活性成分联合使用。

本发明自滇黄精的根茎中分离纯化得到黄精多糖PKP2-1，并对其分子量、单糖组成、化学结构等进行了分析鉴定，确定了其分子量和结构组成。细胞实验表明，该多糖具有显著的抗炎免疫活性，该多糖能够抑制MH7A细胞的增殖，促进MH7A细胞的凋亡，以及显著降低MH7A细胞中IL-6和IL-1β的水平，增加MH7A细胞中IL-10的水平。基于此，该多糖可用于制备预防和/或治疗自身免疫疾病的药物、保健品和食品，具有较佳的应用前景和商业价值，还可提高黄精的利用价值。

附图说明

图1所示为黄精多糖PKP2-1的制备工艺流程图；

图2A所示为DEAE-52纤维素柱的流分的紫外光谱图；

图2B所示为葡聚糖凝胶色谱柱的流分的紫外光谱图；

图2C所示为黄精多糖PKP2-1的紫外光谱图；

图2D所示为黄精多糖PKP2-1的HPGPC谱图；

图3所示为黄精多糖PKP2-1的红外光谱图；

图4所示为黄精多糖PKP2-1的GC-MS谱图；

图5A所示为黄精多糖PKP2-1的¹HNMR谱图；

图5B所示为黄精多糖PKP2-1的¹³C NMR谱图；

图5C所示为黄精多糖PKP2-1的¹H-¹H COSY谱图；

图5D所示为黄精多糖PKP2-1的HSQC谱图；

图5E所示为黄精多糖PKP2-1的HMBC谱图；

图5F所示为黄精多糖PKP2-1的NOESY谱图；

图6所示为黄精多糖PKP2-1的化学结构；

图7A所示为黄精多糖对DPPH自由基清除的实验结果；

图7B所示为黄精多糖对羟基自由基清除的实验结果；

图7C所示为黄精多糖对还原力的影响的实验结果。

图8A所示为黄精多糖PKP2-1对MH7A细胞增殖的影响的实验结果；

图8B所示为黄精多糖PKP2-1对MH7A细胞凋亡的影响的实验结果；

图8C所示为黄精多糖PKP2-1对TNF-α刺激的MH7A细胞释放细胞因子的影响的实验结果；图8D所示为黄精多糖PKP2-1对MH7A细胞周期的影响的实验结果；

图8E所示为黄精多糖PKP2-1对MH7A细胞侵袭的影响的实验结果。

具体实施方式

除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1黄精多糖PKP2-1的分离提取

黄精多糖PKP2-1的分离提取流程见图1。

1.1水提醇沉法提取黄精粗多糖

称取1300g滇黄精的干燥根茎粉碎，加入四倍体积的80～100℃水超声1h，过滤，浓缩，得到水提物。加入四倍体积的80％乙醇在25～30℃下静置12h，然后在5000rpm下离心10min，收集沉淀，经冷冻干燥得到黄精粗多糖。

1.2DEAE-纤维素柱层析分离纯化黄精粗多糖

将浓度为10mg/mL的黄精粗多糖加入DEAE-52纤维素柱(3.5×30cm)中，使用不同浓度的NaCl溶液(0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0mol/L)进行洗脱，流速为2.0mL/min。通过苯酚-硫酸比色法检测洗脱液中多糖含量。收集含多糖的洗脱液，得黄精多糖精提液。

其中，每一洗脱梯度收集40管(每管25mL)，使用SHIMADZU UV-2550紫外可见分光光度仪在490nm波长下测定每一管流分的吸光度，结果如图2A所示，其显示前两组洗脱梯度的吸光度值较高。将0mol/LNaCl溶液洗脱所得的黄精多糖精提液命名为PKP1，将0.05mol/LNaCl溶液洗脱所得的黄精多糖精提液命名为PKP2。

1.3葡聚糖凝胶色谱柱分离纯化黄精多糖精提液PKP2

将黄精多糖精提液PKP2加入Sephadex G-200柱(1.6×40cm)中，使用水进行洗脱，流速为0.2mL/min。通过苯酚-硫酸比色法检测洗脱液中多糖含量。收集含多糖的洗脱液，经真空冷冻干燥，得到黄精多糖，命名为PKP2-1。

其中，共收集80管洗脱液(每管25mL)，使用SHIMADZU UV-2550紫外可见分光光度仪在490nm波长下测定每一管流分的吸光度，结果如图2B所示。

经检测，黄精多糖PKP2-1的提取率为0.67％。

实施例2黄精多糖PKP2-1的理化性质分析

2.1蒽酮-硫酸法测定黄精多糖PKP2-1中碳水化合物含量

取经干燥至恒重的无水葡萄糖对照品33mg，精密称定，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得到浓度为0.33mg/mL的无水葡萄糖对照品溶液。精密量取0.33mg/mL的无水葡萄糖对照品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分别置10mL离心管中，分别加水至1.0mL，摇匀。在冰水浴中缓缓滴加0.2％蒽酮-硫酸溶液4mL，混匀。放冷后置于100℃沸水浴中加热20min。取出后立即置于冰水浴中冷却10min。使用SHIMADZU UV-2550紫外可见分光光度仪在582nm波长下测定吸光度。以吸光度为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

称取黄精多糖PKP2-1样品5mg，加入10mL水溶解成浓度为0.5mg/mL的样品溶液，取样品溶液0.3mL，置于10mL试管中。使用SHIMADZU UV-2550紫外可见分光光度仪在582nm波长下测定样品溶液的吸光度。根据标准曲线法，计算黄精多糖PKP2-1中碳水化合物含量。

经检测，黄精多糖PKP2-1中碳水化合物含量为84.22％。

2.2间羟基联苯法测定黄精多糖PKP2-1中糖醛酸含量

称取0.955g四硼酸钠溶于100mL浓硫酸中，得到浓度为9.55mg/mL的四硼酸钠溶液，备用。

称取0.015g间羟基联苯，加入0.5％NaOH溶液溶解，定容至10mL，得到浓度为1.5mg/mL的间羟基联苯溶液，备用。

精密称取无水半乳糖醛酸对照品5mg，加水溶解并用10mL容量瓶定容，得到浓度为0.5mg/mL半乳糖醛酸对照品溶液。精密移取0.5mg/mL半乳糖醛酸对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL分别置于10mL试管中，各管加入双蒸水补充至1.0mL。将试管置于冰浴中逐滴加入冷却的9.55mg/mL四硼酸钠溶液溶液5mL，振荡混匀后将其放入沸水浴中20min，取出后冷却至室温。每管加入1.5mg/mL间羟基联苯溶液100μL，混匀后放置30min。使用SHIMADZUUV-2550紫外可见分光光度仪在525nm波长下测定吸光度。以吸光度为纵坐标，对照品溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

精密称取黄精多糖PKP2-1样品5mg，加入10mL水溶解成浓度为0.5mg/mL的样品溶液，取样品溶液0.3mL，置于10mL试管中。使用SHIMADZU UV-2550紫外可见分光光度仪在525nm波长下测定样品溶液的吸光度。

经检测，黄精多糖PKP2-1中糖醛酸含量为6.92％。

2.3UV法测定黄精多糖PKP2-1的紫外吸收

仪器：SHIMADZU UV-2550型紫外可见分光光度仪。

扫描范围：200～800nm。

称取10mg黄精多糖PKP2-1样品溶解于10mL纯水溶剂中，得浓度为1mg/mL的黄精多糖溶液，进行紫外检测。

结果如图2C所示，推测出黄精多糖PKP2-1中无色素、蛋白和核酸。

2.4pH计测定黄精多糖PKP2-1的pH值

仪器：Starter 3100pH meter。

称取10mg黄精多糖PKP2-1样品溶解于10mL纯水溶剂中，得浓度为1mg/mL的黄精多糖溶液，进行pH值检测，平行测定3次，取平均值。

结果显示，黄精多糖PKP2-1 pH值为10.21，呈碱性。

2.5HPGPC法测定黄精多糖PKP2-1的均一性和分子量

配置分子量为1、5、12、50、150kDa的Dextran系列葡聚糖标准品溶液(浓度为1mg/mL)，在相同检测条件下的保留时间，利用Agilent GPC数据分析软件制作分子量标准曲线。称取10mg黄精多糖PKP2-1样品溶解于10mL超纯水溶剂中，进行HPGPC检测。根据标准曲线可计算出多糖样品的分子量。

检测条件：Agilent 1260Infinity系统；SRT SEC-150(7.8×300mm)色谱柱；流动相为双蒸水；进样量为10μL；流速为1.0mL/min；柱温为35℃；示差折光检测器。

图2D表明，黄精多糖PKP2-1具有均一性，依据标准曲线法计算出其分子量为1.91kDa。

2.6黄精多糖PKP2-1的红外光谱分析

将2.0mg干燥的黄精多糖PKP2-1样品与200mg KBr粉末混合压片，在Nicolet5700FT-IR型傅里叶红外光谱仪上扫描分析，扫描范围为4000cm^-1～400cm^-1。

黄精多糖PKP2-1的红外光谱图如图3所示。首先，PKP2-1不含蛋白质，因为在1541cm^-1处没有吸收峰。其次，3403cm^-1处的宽峰是PKP2-1中-OH基团存在的原因。2923cm^-1处的峰值为CH₃基团的C-H不对称拉伸振动。1666cm^-1和1452cm^-1处的两个峰为C＝O弯曲振动，进一步证实了糖醛酸存在于多糖分子中。1131cm^-1和1026cm^-1处的吸收峰表示C-O-C的不对称拉伸振动。这些结果表明PKP2-1是一种多糖。值得注意的是，在红外光谱中还可以观察到PKP2-1支架上的氨基酸残基。3403cm^-1处也可能是N-H吸收峰。1626cm^-1和1026cm^-1处的两个峰分别产生了N-H弯曲振动和C-N拉伸振动。835cm^-1处的峰与伯胺的N-H变形振动和α-D-吡喃葡萄糖信号有关。

实施例3黄精多糖PKP2-1的结构鉴定

3.1GC-MS法测定黄精多糖PKP2-1的单糖组成

称取干燥的葡萄糖样品、甘露糖样品、半乳糖样品、葡萄糖醛酸样品、半乳糖醛酸样品各5mg分别溶解在1mL无水DMSO中，超声溶解5min，然后在80℃下搅拌10min，降至35℃搅拌5min；在上述各样品溶液中，分别加入60mg(0.21mmol，7.5eq)NaOH反应，在35℃下搅拌10min，然后缓慢滴加1mL CH₃I，在35℃避光条件下封闭反应12h，反应后加入2mL蒸馏水终止反应。用3mL二氯甲烷萃取甲基化样品，同体积蒸馏水洗涤3次，取干燥后的二氯甲烷溶液稀释后进GC-MS检测。

称取黄精多糖PKP2-1样品20mg于特弗伦管中，加入2mol/LTFA3 mL，120℃水解2h。冷却后，减压蒸干。加入甲醇1mL，蒸干，重复3次，完全除去TFA。经甲基化后，进GC-MS检测。

气相色谱条件：色谱柱：BR-17色谱柱(0.25μm×250μm×30m)；载气：高纯氦气(南京上源工业气体厂，纯度99.999％)、高纯氮气(南京上源工业气体厂，纯度99.999％)；柱流量：1.0mL/min；分流式进样；入口温度：250℃；温度程序设定为：初始温度为60℃，以20℃/min升温至100℃，保持2min，然后以4℃/min升温至180℃。

质谱条件：EI离子源；电子能量：70eV；离子源温度：220℃；输电线路温度：280℃；四级杆温：40℃；全扫描模式，扫描范围：m/z 40～600；质谱标准库：NIST 11.L。

结果如图4所示，其中峰1为葡萄糖，保留时间为14.56min，峰面积为1.17×10⁷；峰2为甘露糖，保留时间为15.96min，峰面积为6.93×10⁶；峰3为半乳糖，保留时间为16.43min，峰面积为9.49×10⁶；峰4为葡萄糖醛酸，保留时间为17.86min，峰面积为2.41×10⁵。结果表明，黄精多糖PKP2-1由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖醛酸组成，根据各单糖线性关系(葡萄糖：y＝292550x-3E+06，甘露糖：y＝351579x-3E+06，半乳糖：y＝1E+06x-1E+07，葡萄糖醛酸：y＝215422x-2E+06)代入峰面积计算可知其组成摩尔比为5:3:2:1。

3.2黄精多糖PKP2-1的甲基化与乙酰化衍生后进行GC-MS分析

称取干燥的黄精多糖PKP2-1样品10mg，加入2mL无水二甲基亚砜(DMSO)充分溶解，随后加入NaOH粉末，搅拌反应2h。反应后，再加入1mL无水碘甲烷，35℃避光反应12h，反应后加适量蒸馏水终止反应，得完全甲基化样品。

取完全甲基化样品置于10mL安瓿瓶中，加入2mol/L三氟乙酸2mL，封管，于100℃下水解6h，室温冷却，将反应液转移至旋蒸瓶内蒸干后，多次加入适量甲醇蒸干，以彻底除去残留的三氟乙酸，得甲基化完全酸水解产物。

取上述甲基化完全酸水解产物，加入1mL 0.05M NaOH溶液、30mg硼氢化钠，室温条件下反应12h，用100μL乙酸中和，并将反应液置于旋转蒸发仪上蒸干。之后依次加入1mL的乙酸酐与1mL的吡啶，密塞后于90℃下反应2h，得乙酰化产物。反应结束后，反应液用二氯甲烷萃取乙酰化产物，萃取物用无水硫酸钠去除残余水分，进行GC-MS测定。

气相色谱条件：色谱柱：BR-17色谱柱(0.25μm×250μm×30m)；载气：高纯氦气(南京上源工业气体厂，纯度99.999％)、高纯氮气(南京上源工业气体厂，纯度99.999％)；柱流量：1.0mL/min；分流式进样；入口温度：250℃；温度程序设定为：初始温度为50℃，以25℃/min升温至100℃，保持3min，然后以4℃/min升温至180℃。

黄精多糖PKP2-1的甲基化及乙酰化结果如表1所示。

表1黄精多糖PKP2-1的甲基化及乙酰化分析结果

3.3黄精多糖PKP2-1的NMR谱分析

称取20mg黄精多糖PKP2-1样品溶于99.9％的D₂O中，装入核磁管中，在25℃下分别测定¹H、¹³C、¹H-¹H COSY、HSQC、HMBC、NOESY谱，结果如图5所示。

检测条件：VNMRS600超导核磁共振波谱仪；One NMRprobe(5mm)探头；¹H谱工作频率为599.81MHz；¹³C谱工作频率为150.84MHz。

五种糖残基的化学位移分析见表2。众所周知，异位质子信号的化学位移在>5ppm时为α型，在<5ppm时为β型。从¹HNMR谱来看，δ5.21ppm信号的出现表明在PKP2-1的结构中存在α-构型的残基，其归属于残基A的H1。此外，该区域(4.03-3.36ppm)是PKP2-1中存在的H2-H6残基(A-E)的来源。δ1.70或1.71ppm的信号是由于NH₂的存在，这与红外分析结果一致。在¹³C NMR谱中，103.88、103.70、103.56、103.06和92.05ppm的5个峰分别来自于位于残基A、B、C、D和E的C1上的信号。在高场区，δ181.46和δ162.51ppm的碳信号分别负责糖醛酸和酯基的羰基。为了寻找异位碳信号与对应质子之间的关系，我们研究了HSQC谱，¹H-¹H COSY和NOESY谱在δ5.24/3.38、3.38/3.74、3.74/3.88、3.88/3.59和3.59/3.51ppm处有5个交叉峰，与残留E在3.38、3.74、3.88、3.59和3.51ppm处的H2-H6信号一致。

利用一维¹H、¹³C NMR、二维COSY、HSQC、HMBC和NOESY对五种残基(A-E)之间的相关性分析。残基B的信号H-2(3.65ppm)与残基C的C-4(76.22ppm)相关，残基C的信号H-4(3.85ppm)与残基B的C-2(79.97ppm)相关，表明B与C之间存在2,4连接。残基A的信号C-1(103.88ppm)与残基D的H-4(3.57ppm)相关，残基D的信号C-4(80.91ppm)与残基A的H-1(5.22ppm)相关，表明A与D之间存在1,4连接。残基D的信号H-2(3.50ppm)与残基C的C-3(76.33ppm)相关，残基D的信号C-2(81.90ppm)与残基C的H-3(3.82ppm)相关，表明C与D之间存在2,3连接。残基E的信号C-3(79.90ppm)与残基A的H-4(3.88ppm)相关，残基E的信号H-3(3.77ppm)与残基A的C-4(80.91ppm)相关，表明E与A之间存在3,4连接。

结果表明，糖残基构型为α和β型，其一级结构单元含有→2)Glcp(4→,Glcp(3→,→2)Manp(3→,→2,3)Galp(4→,→1)Galp(4→五种糖残基，其连接方式如图6所示。

表2黄精多糖PKP2-1的¹H NMR和¹³C NMR化学位移

糖残基

H-1/C-1

H-2/C-2

H-3/C-3

H-4/C-4

H-5/C-5

H-6/C-6

A

→1)-α-D-Galp(4→

5.22/103.88

3.38/70.76

3.74/71.43

3.88/80.91

3.59/76.33

3.51/60.13

B

→2)-α-D-Manp(3→

5.20/103.70

3.65/79.97

3.78/80.91

3.90/70.76

3.68/79.07

3.31/62.14

C

→2,3)-α-D-Galp(4→

5.21/103.56

3.47/82.56

3.82/76.33

3.85/76.22

3.61/74.51

3.51/61.95

D

→2)-β-D-Glcp(4→

4.46/103.06

3.50/81.90

3.82/74.34

3.57/80.91

3.64/74.20

3.46/62.42

E

α-D-Glcp(3→

5.24/92.03

3.37/62.27

3.77/79.90

3.86/74.34

3.72/76.57

3.44/63.09

实施例4黄精多糖PKP2-1的抗炎免疫活性研究

4.1抗氧化实验

DPPH自由基清除实验：新制备的反应混合物DPPH(0.2mM甲醇溶液，2.0mL)和不同浓度多糖以及阳性对照抗坏血酸Vc(2.0mL，2、4、6、8、10mg/mL)溶液在室温下(25℃)黑暗中持续反应30分钟。然后在517nm处测定混合物。A_control表示无样品的混合物吸收，A_blank表示实验组的吸收，A_sample表示混合物的吸收，DPPH自由基清除率(％)＝(1-(A_sample-A_control)/A_blank)×100％。

羟基自由基清除实验：1mL不同浓度的多糖溶液以及阳性对照抗坏血酸Vc(2、4、6、8、10mg/mL)，1.0mL硫酸亚铁溶液(6mM)，1.0mL混合H₂O₂(6mM)和1mL水杨酸(2mM乙醇)均匀地在37℃下一起孵育持续30分钟。样品的吸光度然后在510nm处测量混合物。A_control表示无样品的混合物吸收，A_blank表示实验组的吸收，A_sample表示混合物的吸收，羟基自由基清除率(％)＝(1-(A_sample-A_control)/A_blank)×100％。

还原力测定：将不同浓度的多糖溶液1mL以及阳性对照抗坏血酸Vc(2、4、6、8、10mg/mL)与磷酸盐缓冲溶液(1.6mL，0.2M，pH＝6.6)和铁氰化钾K₃[Fe(CN)₆](1.6mL，1.0％(w/v)混合)，并在50℃孵育均匀摇动后20分钟。通过添加1.6mL 10％(w/v)三氯乙酸停止反应，然后以5500rpm离心10min。将上清液(2.0mL)与FeCl₃溶液(0.5mL，0.1％(w/v))和蒸馏水(2.0mL)混合，然后置于室温(25℃)搅拌10分钟。最后，在700nm处测量所得溶液的吸光度。

4.2细胞培养

含10％FBS(胎牛血清)和1％双抗的DMEM(含各种氨基酸和葡萄糖)细胞培养基，于37℃、5％CO₂、饱和湿度恒温培养箱中培养。当MH7A(类风湿关节炎滑膜成纤维)细胞生长铺满培养瓶底70％～80％时，用3mL移液管吸取PBS溶液洗3次，用含0.25％胰蛋白酶消化液消化细胞，用含血清的DMEM完全培养基终止细胞消化，按1:2进行细胞传代。

4.3细胞增殖活力测定

取对数期正常生长的MH7A细胞，消化、离心收集细胞，计数板下计数，制成1×105个/ml的单细胞悬液，每孔100μL接种于96孔板，37℃、5％CO₂培养过夜后，待细胞贴壁生长24h后，用TNF-α(10ng/mL)刺激细胞，并用不同浓度(50、100、200μg/mL)的黄精多糖PKP2-1处理24小时,每孔加入10μL CCK-8溶液，放入培养箱继续孵育1h。用酶标仪测定450nm处的各孔吸光度(OD)值，试验重复3次，取均值，并计算细胞存活率。

4.4细胞因子IL-10，IL-6，IL-1β含量的测定

取对数生长期细胞，将细胞以1×106个/孔的密度接种于24孔板，每孔液体积为1mL，每组4个复孔，放入培养箱中培养过夜。待细胞贴壁后，分别标记为空白组(normol)、TNF-α组(control)、低剂量组(50μg/mL)、中剂量组(100μg/mL)和高剂量组(200μg/mL)。0时刻，低剂量组、中剂量组以及高剂量组分别更换含药浓度不同的培养基，其药物终浓度分别为50、100以及200μg/mL。0.5h时刻，除空白组外，各组以TNF-α(10ng/mL)刺激。继续孵育培养24h后，收集各孔上清液，用于各细胞因子检测。

4.5细胞凋亡的测定

准备试剂盒，按说明书指示使用检用洗液浸泡微孔板30s，弃去洗液，在吸水纸上扣干微孔板以备用。分别向标准品孔、空白孔中加入缓冲液和各梯度标准品稀释液，向样本孔中加入缓冲液和样本。向每孔中依次加入检测抗体然后封板，300rpm振荡，室温下孵育2h。弃去液体，向每孔中加入300μL洗液洗板，洗板6次，每次均在吸水纸上扣干。每孔加入100μL稀释(1:100)的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素后封板，300rpm振荡，室温下孵育45min。向每孔中加入100μL显色底物TMB(避光操作)，室温孵育30min。向每孔中加入100μL终止液终止反应，观察到颜色由蓝色变为黄色。使用ELISA酶标仪进行双波长检测，测定450nm最大吸收波长和630nm参考波下的OD值，最终数值为450nm的测定值减去630nm的测定值。

4.6细胞周期的测定

MH7A细胞(1×10⁶个/孔)接种于6孔板上，培养12h；待细胞贴壁后，10ng/ml TNF-α对细胞进行诱导，同时加入不同浓度的PKP2-1(50、100和200μg/mL)孵育24h。待细胞贴壁后，弃去含药上清，消化吹打贴壁细胞，预冷的PBS洗1次后使用75％冰冷乙醇固定，-20℃放置过夜；将过夜固定好的细胞用预冷PBS洗两次，2000rpm 5min去除PBS后加入500μLPBS。移至1.5ml EP管中,轻轻弹击离心管底，以适当分散细胞，避免细胞成团,加入20μLRNase(50μg/ml)，重悬细胞，37℃水浴30min，加入PI染液400μL重悬细胞，避光4℃染色30min，用流式细胞仪检测细胞周期。

4.7细胞侵袭的测定

将matrigel胶(0.1％)均匀涂在Transwell上室底部膜上，37℃环境下温育30min使基底膜水化，用PBS洗三次。胰蛋白酶消化吹打收集细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤一次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为5×10⁵个/ml，在下室(即24孔板底部)加入600-800μL含10％血清的培养基，上室加入100μL细胞悬液，继续在孵箱培养24小时。用镊子小心取出小室，吸干上室液体，移到预先加入约1ml 4％多聚甲醛的孔中，室温固定30分钟，取出小室，吸干上室固定液，移到预先加入约1ml 0.5％结晶紫的孔中，室温染色20分钟，轻轻用清水冲洗浸泡数次，取出小室，吸去上室液体，用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞，晾干，显微镜下随机取6个视野计数，统计结果。

4.8结果

4.8.1黄精多糖PKP2-1抗氧化活性筛选

如图7A和7B所示，PKP2部分表现出更高的自由基清除能力。随后，通过SephadexG-200柱进一步纯化PKP2，以获得PKP2-1。PKP1、PKP2和PKP2-1表现出有效的抗氧化活性。三种成分在2～10mg/mL范围内的自由基清除率依次为：PKP2-1>PKP2>PKP1，表明PKP2-1具有更强的抗氧化性能。因此，选择PKP2-1进一步研究。

4.8.2黄精多糖PKP2-1对MH7A细胞增殖的影响

如图8A所示，与空白组相比，MH7A细胞的存活率随着黄精多糖PKP2-1浓度增加而明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。黄精多糖PKP2-1在50、100、200μg/ml浓度下干预MH7A细胞24h时相应细胞活力分别为：120％、110％、91％，提示黄精多糖PKP2-1能抑制MH7A细胞的增殖且呈浓度和时间依赖性。

4.8.3黄精多糖PKP2-1对MH7A细胞凋亡的影响

如图8B所示，对于正常(正常组)和TNF-α刺激的MH7A细胞(对照组)，可以观察到完整的细胞核DAPI的微弱荧光染色。然而，黄精多糖PKP2-1(50、100、200μg/mL)处理的MH7A细胞显示出典型的凋亡细胞核形态学变化，如细胞核凝聚、亮度增加和细胞核皱褶。此外，流式细胞术分析和AnnexinV-FITC/PI染色进一步证实了黄精多糖PKP2-1的促凋亡作用。

4.8.4黄精多糖PKP2-1对TNF-α刺激的MH7A细胞释放细胞因子的影响

如图8C所示，通过用TNF-α(20ng/mL)刺激，MH7A细胞中的促炎细胞因子IL-6和IL-1β均显著高于正常细胞，抗炎细胞因子IL-10显著低于正常细胞(p<0.01)，然而用不同浓度的黄精多糖PKP2-1作用细胞后(50、100、200μg/mL)显著降低MH7A细胞中IL-6和IL-1β的水平，增加MH7A细胞中IL-10的水平(与对照组相比，p<0.01)。

4.8.5黄精多糖PKP2-1对MH7A细胞周期的影响

细胞周期是指细胞以有丝分裂进行增殖，从亲代分裂结束到子代分裂结束的过程。细胞周期分为分裂间期和分裂期(M期)，其中分裂间期又分为G1期(DNA合成前期)、S期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)、G0期(某些细胞分裂结束后暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，但在一定刺激下又可进入细胞周期)。如图8D所示，第一个峰代表G0/G1期；第二个峰代表G2/M期，位于第一个峰横坐标2倍的位置上。由流式细胞仪检测不同浓度PKP2-1处理MH7A细胞24h的细胞周期各时期分布，并由Flowjo合成细胞周期拟合曲线分析不同浓度各时期占比变化。如图8D所示，与对照组相比，PKP2-1(50、100、200μg/mL)处理细胞24h后，G0/G1期细胞数量由44.03％分别增加至46.96％、50.50％、54.55％，S期细胞数量由33.07％分别降低至26.57％、23.77％、21.47％，结果表明随着PKP2-1浓度的增加，MH7A细胞G0/G1期细胞数量逐渐增多，S期细胞数量逐渐减少，细胞周期被阻滞于G0/G1期。

4.8.6黄精多糖PKP2-1对MH7A细胞侵袭的影响

如图8E所示，与对照组相比，药物组穿过小室，至小室外膜固定染色的细胞数明显减少，且随药物浓度增加可计数穿过小室的细胞数相应明显减少，差异有统计学意义(p＜0.05)。PKP2-1在50、100、200μg/ml浓度下干预MH7A细胞的平均迁移穿膜数分别为339，197和79，证明PKP2-1能抑制MH7A细胞的侵袭且呈浓度依赖性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。

本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。

Claims

1.黄精多糖在制备预防和/或治疗类风湿性关节炎的药物、保健品和食品中的应用，其特征在于，所述黄精多糖的制备方法包括如下步骤：

(3)将步骤(2)所得的黄精多糖精提液通过凝胶色谱柱层析，洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥；

其中，在步骤 (1) 中，所述的黄精粉末为滇黄精的根茎粉末，水提的温度为80~100℃；所述的水提物与醇的体积比为1:(4~6)；所述的醇为80~90%的乙醇；

在步骤 (2) 中，所述的离子交换柱为DEAE-52纤维素柱，洗脱剂为0.05mol/L的NaCl溶液；

在步骤 (3) 中，所述的凝胶色谱柱为SephadexG-200柱，洗脱剂为水。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在步骤 (1) 中，所述的超声的时间为0.5~2 h；所述的滇黄精根茎粉末与水的料液比为1:(2~6)；所述的醇沉温度为25~30 ℃；所述的醇沉时间为6~24 h；所述的离心的转速为1000~5000 rpm；所述的离心时间为5~20 min。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在步骤 (3) 中，所述的洗脱的流速为0.1~0.5 mL/min。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的多糖由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖醛酸组成，其摩尔比为5:3:2:1。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的多糖包含如下结构：

其中，n为1或2。

6. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的多糖的分子量为1.91 kDa；所述的多糖为碱性多糖。