CN111956738A - 一种黄精提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种黄精提取物，该提取物是通过水提后、超滤浓缩所得。研究发现，该类提取物具有良好的抗炎活性，特别对于腹膜炎及腹膜炎所致的肺损伤有良好的保护作用。

Description

一种黄精提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于天然植物提取物领域。

背景技术

黄精属于百合科，是一种著名的食品(有甜味)和中草药，在中国作为传统的滋补食品和药材已有2000年的历史，用于治疗和预防各种疾病，包括咳嗽、疲劳、头晕和肺部问题。先前的研究表明，黄精潜在的健康益处可能归因于其生物活性成分，如多糖，甾体皂苷类，黄酮类等。其中，多糖是主要的生物活性成分之一。中国药典上，黄精的质量评价标准是多糖含量不低于7％。因此，目前的研究主要集中在黄精多糖的研究上。

发明内容

本发明中对黄精中低分子量的提取物部位进行了研究，并提供了一种黄精提取物，由如下方法制备：

(1)脱脂后的黄精；(2)水提；(3)截留水提物中分子量在1K Da以上、8K Da以下的部分，即得黄精提取物。

本发明所述黄精，其植物来源为中药黄精或其近似品种。

本发明中，可以采用超滤膜进行截留，具体使用的超滤膜型号、超滤次数，以实现本发明分子量要求为准。

其中，所述脱脂后的黄精，是以石油醚、乙醚、浓度90％以上乙醇中的一种或两种以上溶剂提取黄精制备而成。

本发明中选用的乙醇，为浓度在95％以上的乙醇。

本发明若采用乙醇进行脱脂处理，不排除可以使用梯度提取的方式，即先使用低浓度乙醇提取，再使用高浓度乙醇提取。

脱脂处理时，采用本领域常规的方法即可，例如回流、浸渍、超声、微波辅助等等。

本发明“水提”，可以采用煎煮提取、浸渍提取、超声提取、微波辅助提取等等，提取时，可以使用不同温度的水进行提取，可以是0～30℃(大于0)，也可以是温度更高的热水。

进一步地，采用50℃以上的水提取，例如，50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃……60℃……65℃……70℃……75℃……80℃……85℃……90℃……95℃……100℃等等。

进一步地，提取次数为2次以上，可以是2次、3次、4次、5次……等等。

取次数可以通过辅助检测方式进行判定，例如对每次提取物进行含量检测，查看其中的满足分子量的目标物含量多少，在平衡经济、环保原则的前提下，得到一个合理的提取次数。

本发明还提供了上述黄精提取物在制备治疗脂多糖脂多糖所致疾病的产品中的用途。

本发明还提供了上述黄精提取物在制备治疗腹膜炎的产品中的用途。

进一步地，所述腹膜炎是由脂多糖所致。

本发明中所述脂多糖，简称LPS，是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种特有成分，位于细胞壁的最外层并暴露于非荚膜细菌的细胞表面，有利于维持细胞外膜的完整性，保护细菌免受胆汁盐和脂类抗生素的破坏。结构上，脂多糖由类脂A、核心多糖和O-多糖侧链组成。其中类脂质A是构成细菌内毒素的主要成分，决定其毒性强弱；而O-多糖侧链在不同细菌间是高度变化的，特异性决定细菌的血清型。

LPS可以引起免疫刺激的级联反应和机体的毒性病理生理活动，包括释放内毒素引起感染性休克从而导致末梢血管虚脱。正是LPS与机体免疫机能的密切关系，生命科学研究常常提取LPS进行相关的研究，如阐明LPS的结构，代谢，免疫学，生理学，毒性，生物合成途径；诱导生长促进因子如白介素的合成与分泌；诱导疾病研究的动物模型如炎症反应，急性肺损伤。

多糖是一种内毒素，当其作用于人类或动物等其他生物细胞时，就会表现出多种的生物活性。当细菌死亡等时它会通过溶解、破坏细胞来脱落，并通过作用于动物细胞等而发挥其毒性。

基于脂多糖与革兰氏阴性菌的密切关联性，本发明也可用于对抗革兰氏阴性菌或/和脂多糖导致的疾病，包括腹膜炎、肺损伤、尿道感染、关节炎、脑膜炎以及败血型感染等等。

本发明所述革兰氏阴性菌，包括肠杆菌科细菌，其分布广，寄主范围大，人、动物、植物都有寄生或共生、附生、腐生，也可在土壤或水中生存，与人类关系密切。主要包括大肠埃希菌属、沙门氏菌属、志贺菌属、克雷伯菌属、耶尔森菌属、沙雷菌属。

本发明提供了一种产品，它包括上述的黄精提取物。

本发明中所述产品，包括以保健品、食品、药品等不同的形式存在。所述产品中，其活性成分可以只包括黄精提取物，又或者，活性成分还可以包括其他天然的活性物质，例如金银花提取物、枸杞提取物、人参提取物、三七提取物、山药提取物、葛根提取物等中药材提取物。

本发明还提供了一种黄精提取物的制备方法，包括如下内容：

(1)脱脂后的黄精；(2)水提；(3)截留水提物中分子量在1K Da以上、8K Da以下的部分，即得黄精提取物。

本发明中，采用超滤膜技术进行截留，使用超滤的次数和每次的超滤膜型号可以自行选择，只需要保证最终保留分子量在1K Da以上、8K Da以下的部分即可。

本发明在制备产品时，除了活性成分外，还可以加入辅料或/和辅助性成分。

本发明中所述的“辅料”，是药物制剂中除主药以外的一切附加材料的总称，辅料应当具备如下性质：(1)对人体无毒害作用，几无副作用；(2)化学性质稳定，不易受温度、pH、保存时间等的影响；(3)与主药无配伍禁忌，不影响主药的疗效和质量检查；(4)不与包装材料相互发生作用。

所述“辅助性成分”，它具有一定生理活性，但该成分的加入不会改变上述组合物在疾病治疗过程中的主导地位，而仅仅发挥辅助功效，这些辅助功效仅仅是对该成分已知活性的利用，是医药领域惯用的辅助治疗方式。若将上述辅助性成分与本发明组合物配合使用，仍然应属于本发明保护的范围。

药学上可以接受的辅料，如纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如

)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

其中，所述组合物为经口给药制剂。

当然，本发明组合物的施用方式没有特别限制，除了经口给药外，也可以使用局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、袋泡剂等，不限于上述剂型。在这些固体剂型中，原料或提取物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，原料或提取物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了原料或提取物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。除了原料或提取物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

附图说明

图1用LPS(25mg/kg)处理BALB/c雄性小鼠，记录7d存活率，n＝8只小鼠/组，***P<0.001，*P＜0.05，与LPS组比较；

图2PFOSs降低血清促炎细胞因子水平，ELISA结果显示血清(A)IL-1β和(B)TNF-α水平的变化。所有数据均以平均值±SEM表示，****经单因素方差分析，与LPS组比较P<0.0001；

图3不同组别肺组织切片的组织学分析

图中，LPS指脂多糖组，PFOSs为本发明黄精提取物组，其中，PFOSs-L为黄精提取物低剂量组，PFOSs-H为黄精提取物高剂量组。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

材料和试剂

根状茎采自中国四川省仁寿县，经四川大学药学院张浩教授鉴定。所有材料的标本保存在西南民族大学青藏高原研究院标本中心。不同分子量的葡聚糖和单糖右旋葡萄糖、右旋果糖、左旋阿拉伯糖、右旋木糖、右旋甘露糖、右旋半乳糖、左旋鼠李糖购自西格玛-奥尔德里奇有限公司(St.Louis,MO,USA美国密苏里州圣路易斯)。三氟乙酸(TFA)和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)购自泰迪亚公司(Fairfield,USA美国费尔菲尔德)。超滤膜(1000道尔顿和8000道尔顿的分子截止值)是从Synder(California,USA美国加利福尼亚州)获得的。Sephadex G-25购自Amersham Biosciences(Uppsala,Sweden瑞典乌普萨拉)，Water Milli-Q通过一个微孔系统获得(Bedford,MA马萨诸塞州贝德福德)。脂多糖(LPS)购自西格玛-奥尔德里奇有限公司(St.Louis,MO,USA美国密苏里州圣路易斯)。肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β细胞因子特异性酶联免疫试剂盒购自R&D系统公司(美国明尼苏达州明尼阿波利斯)。高效液相色谱级乙腈购自默克公司(德国达姆施塔特)。所有其他化学品都是分析级的。

动物

雄性BALB/c小鼠(6-8周龄，体重18-22g，无特定病原体)，喂养在单独的通风笼子里，可以自由获取食物和水。

实施例1提取物的制备

将黄精的新鲜根茎切成薄片，然后在室温下用95％乙醇浸泡2天进行脱脂。过滤后，残留物用沸腾水提取3小时，该过程重复3次。然后，将水提物合并，用1K Da和8K Da超滤膜通过超滤浓缩，得到低分子量黄精提取物(PFOSs)。

实施例2提取物的制备

将黄精的新鲜根茎切成薄片，然后在室温下用无水乙醇浸泡4天进行脱脂。过滤后，残留物用水在50℃下提取4小时，该过程重复3次。然后，将水提物合并，用1K Da和8K Da超滤膜通过超滤浓缩，得到低分子量黄精提取物(PFOSs)。

实施例3提取物的制备

将黄精的新鲜根茎切成薄片，然后在室温下用石油醚浸泡1天，回流提取进行脱脂。过滤后，残留物用水在80℃下提取3小时，该过程重复2次。然后，将水提物合并，用1K Da和8K Da超滤膜通过超滤浓缩，得到低分子量黄精提取物(PFOSs)。

实施例4产品的制备

取实施例1制备的提取物，加入适量的微晶纤维素，混匀，制备胶囊剂。

实施例5产品的制备

取实施例1制备的提取物，加入适量的矫味剂、淀粉等辅料，制备丸或片。

实施例6产品的制备

取实施例1制备的提取物，加入适量的矫味剂、水等辅料，制备成口服液或糖浆。

实验例1黄精提取物对脂多糖诱导的小鼠腹膜炎的抗炎作用

小鼠急性炎症是通过腹腔注射脂多糖(15毫克/千克，0.2毫升)产生的。将小鼠随机分为四组(每组8只):对照组、脂多糖、脂多糖+黄精提取物(0.3毫克/千克)和脂多糖+黄精提取物(1毫克/千克)。小鼠口服预处理的生理盐水3天，或指定剂量的黄精提取物。第4天，脂多糖组和治疗组小鼠腹腔注射脂多糖(15毫克/千克，0.2毫升)，而正常对照组接受无菌生理盐水。黄精提取物给药的剂量和时间是根据我们实验室以前的研究选择的。腹膜炎诱导1小时后，处死小鼠，收集肺组织、血清用于以下实验。

对接受上述处理的另外四组小鼠进行了进一步的存活实验。在用生理盐水或黄精提取物(分别为0.3毫克/千克和1毫克/千克)预处理3天后，小鼠注射脂多糖(25毫克/千克，0.2毫升)以诱导急性腹膜炎炎症。记录存活情况并监测7天(每组8只小鼠)。

1细胞因子分析

血清中肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β的水平用细胞因子特异性酶联免疫试剂盒(R&D公司，美国明尼阿波利斯)重复分析。结果用微孔板读数器在450纳米记录的光密度表示。

2肺组织的组织学分析

肺组织病理学分析按照以下方案进行。首先，将肺组织在4％福尔马林中固定24小时，然后包埋在石蜡中切片，厚度为5微米左右。最后，将肺切片进行标准苏木精-伊红染色，并用光学显微镜(Olympus)观察。

3.结果和讨论

3.1黄精提取物对脂多糖(LPS)诱导的小鼠腹膜炎死亡率的影响

腹膜炎死亡率高，炎症反应复杂。通过对数秩检验比较腹膜炎小鼠的存活率。给小鼠腹腔注射一定剂量的脂多糖(25毫克/千克)以诱发严重的腹膜炎。如图1所示，黄精提取物以剂量依赖的方式显著提高了小鼠的存活率。与脂多糖组相比，腹腔感染小鼠的存活率显著提高(P<0.05)，腹腔感染小鼠的存活率从15％提高到54.3％。然而，与脂多糖组相比，摄入低剂量的黄精提取物(0.3毫克/毫升)时没有观察到显著差异。

3.2黄精提取物对腹膜炎小鼠血清细胞因子水平的影响

针对脂多糖诱导的腹膜炎，炎症的关键因子巨噬细胞通过分泌促炎性细胞因子(如肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6)来介导炎症反应，然而，这些细胞因子的过度表达会导致过度的炎症反应。研究了两种关键的炎症细胞因子白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α，以检测黄精提取物的抗炎活性。结果表明，与脂多糖组相比，用黄精提取物预处理小鼠显著抑制了脂多糖诱导的腹膜炎小鼠中白介素-1β和肿瘤坏死因子-α的产生(P<0.0001)(图2)。此外，与低剂量组(0.3毫克/千克)相比，高剂量组(1毫克/千克)明显降低了白细胞介素-1β和肿瘤坏死因子-α的水平，这与腹膜炎小鼠的存活试验一致。

3.3黄精提取物对脂多糖诱导的肺损伤的影响

肺是对脂多糖诱导的腹膜炎最敏感的器官。为了进一步证实黄精提取物对脂多糖诱导的腹膜炎的保护作用，对接受治疗的小鼠的肺组织进行了组织学检查。如图3所示，对照组的肺细胞结构正常，但脂多糖组小鼠肺组织结构发生明显变化，肺组织结构被破坏，肺组织间隔有明显增厚，可见大量炎性细胞浸润。

相比之下，经黄精提取物处理的组可显著减轻这种损伤，显示炎症细胞浸润减少，毛细血管渗出阻塞减少，肺间质细胞变性和坏死水平降低，其中黄精提取物高剂量组(1.0mg/mL)比低剂量组抗炎效果更明显。

Claims (10)

1.一种黄精提取物，其特征在于：由如下方法制备：

(1)脱脂后的黄精；(2)水提；(3)截留水提物中分子量在1K Da以上、8K Da以下的部分，即得黄精提取物。

2.根据权利要求1所述的黄精提取物，其特征在于：采用超滤膜进行截留。

3.根据权利要求1所述的黄精提取物，其特征在于：所述脱脂后的黄精，是以石油醚、乙醚、浓度90％以上乙醇中的一种或两种以上溶剂提取黄精制备而成。

4.根据权利要求1所述的黄精提取物，其特征在于：所述水提，是指采用50℃以上的水提取；进一步地，采用沸水提取；更进一步地，提取次数为2次以上。

5.权利要求1-3任意一项所述黄精提取物在制备治疗革兰氏阴性菌或/和脂多糖所致疾病的产品中的用途；进一步地，所述疾病包括腹膜炎、肺损伤、尿道感染、关节炎、脑膜炎、败血型感染中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述革兰氏阴性菌选自肠杆菌科细菌；所述脂多糖源于肠杆菌科细菌；进一步地，所述肠杆菌科细菌选自大肠埃希菌属、沙门氏菌属、志贺菌属、克雷伯菌属、耶尔森菌属、沙雷菌属。

7.权利要求1-3任意一项所述黄精提取物在制备治疗腹膜炎或肺损伤的产品中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述肺损伤是由腹膜炎所致。

9.一种产品，其特征在于：它包括权利要求1-3任意一项所述的黄精提取物；进一步地，所述产品中还含有辅料或/和辅助性成分。

10.黄精提取物的制备方法，其特征在于：包括如下内容：

(1)脱脂后的黄精；(2)水提；(3)截留水提物中分子量在1K Da以上、8K Da以下的部分，即得黄精提取物。

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