CN101974097A - 一种海胆黄多糖规模化分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种海胆黄多糖规模化分离纯化方法，其特征是现有的提取分离方法基础上，浓缩步骤采用超滤浓缩，Cellulose DE52离子交换柱层析后再次进行超滤浓缩，Sephacryl S-400HR凝胶过滤柱层析后采用透析除杂质。本发明着重于海胆黄多糖的分离纯化方法及其规模化提纯工艺，不仅可以得到高产率、高纯度的海胆黄多糖，也为其进入工业化生产提供技术基础。

Description

一种海胆黄多糖规模化分离纯化方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种一种海胆黄多糖规模化分离纯化方法。

背景技术

各国科学家通过对不同来源的多糖进行广泛研究，发现多糖具有抗肿瘤、心血管疾病治疗、免疫调节等作用。海胆黄多糖是从光棘球海胆中分离纯化得到的多糖，利用物理化学分析和GC分析对其结构进行鉴定，证明为首次从海胆黄中分离到的一种结构新颖的葡聚糖。药理实验研究表明，海胆黄多糖不但具有免疫调节活性，还有具有天然抗肿瘤活性。1985年香菇多糖首先在日本被开发成注射液成进入临床应用，作为免疫调节剂和肿瘤放化疗治疗的辅助药物，效果显著。从此，关于多糖类药物的研究引起了世界各国科学家的广泛关注，逐渐成为新药研究与开发的一个热门领域。多糖本身结构多样，分离方法复杂，需要经过多个步骤多种方法并用才能得到较为理想的纯度要求，但在分离过程中样品的损失也不可避免。

据刘纯慧海(胆黄多糖SEP的制备及其抗肿瘤作用研究，刘纯慧，叶亮，林亲雄，奚涛等，[J]Pharmaceutical Biotechnology 2006，13(6)：429-432)等人报道，海胆黄多糖的提取流程一般为丙酮脱脂、热水浸提(20倍水，90℃煮6h，反复提取3次)、木瓜蛋白酶(W/V 0.5％)-Sevag法(10次)去蛋白、减压浓缩、乙醇沉淀、Cellulose DE52离子交换柱层析、SephacrylS-400HR凝胶过滤柱层析纯化、减压浓缩、冷冻干燥。其中Sevag法是根据蛋白质在氯仿和正丁醇等有机溶剂中变性的特点，将氯仿和正丁醇按5∶1配成混合试剂加入多糖提取液，或先将氯仿按多糖提取液1/5体积加入，随之再加入氯仿体积1/5的正丁醇，剧烈振摇15-20min，蛋白质变性成胶状，存在于水相与溶剂相的交界面，离心除去水层与溶剂层交界处的变性蛋白。此法条件温和，缺点是效率不高，多糖收率低，一般要重复5次甚至更多次数才能去尽蛋白。这种方法需要使用大量的有机试剂，操作要求严格，周期长。此外减压浓缩只能减少样品体积，不能出去杂质，这些对于海胆黄多糖的工业规模化生产造成不便。经研究，海胆黄多糖具有多种药理作用，因此，改进海胆黄多糖分离纯化技术和规模，才能更好的开发利用。

发明内容

本发明公开了一种分离纯化海胆黄多糖规模化分离纯化方法，本发明的方法分离得到海胆黄多糖产率高，纯度好，提取成本低，规模化生产价值高。

目前文献公开的制备方法主要包括：将光棘球海胆黄脱脂、热水浸提、木瓜蛋白酶法去蛋白、浓缩、乙醇沉淀、Cellulose DE52离子交换柱层析、Sephacryl S-400HR凝胶过滤柱层析、浓缩、干燥，本发明在此技术上进行改进，将现有的减压浓缩改进成采用超滤浓缩，并且Cellulose DE52离子交换柱层析后再次进行超滤浓缩，在Sephacryl S-400HR凝胶过滤柱层析后增加透析除杂质步骤。

其中超滤步骤优选采用截流分子量为100K的超滤膜。

优选透析用的是截留分子量为14000Da的透析袋。

木瓜蛋白酶去蛋白时优选加入0.6％(w/w)的木瓜蛋白酶。优选的去蛋白方法为：调海胆黄提取液pH＝6.5，加入0.6％(w/w)的木瓜蛋白酶，60℃保温20-24h，90℃加热15min使酶失活，离心收集上清液。

实验发现，加入木瓜蛋白酶的量对海胆黄多糖的收率有一定影响，对比文件中采用0.5％，其收率大概80％，发明人曾尝试过不同的酶浓度进行去蛋白，加入考马斯亮蓝试剂在595nm处检测溶液的吸光度，结果如附图1所示，在2h时，酶浓度是0.7％的提取液中蛋白含量为0.441，低于0.6％的蛋白含量0.447，但是2h后蛋白含量总体水平明显高于0.6％。10h木瓜蛋白酶去蛋白基本达到平衡。只有当酶浓度为0.6％时，海胆黄多糖提取液中的蛋白含量在10h内最低，相对于0.4％、0.5％、0.7％、0.8％去蛋白效果最好，多糖收率能达到89％。

现有技术采用的是减压浓缩，本发明进一步研究发现，采用超滤将大大提高海胆黄多糖的收率，并且有效节约生产时间，降低生产成本。

超滤在工业生产中普遍使用，超滤不但能快速截留多糖分子，在浓缩体积的同时还能将样品中的杂质和小分子蛋白，包括本提取方法中使用的分子量为21000的木瓜蛋白酶都可以较为彻底的清除。文献中报道的使用木瓜蛋白酶-Sevag法组合去蛋白，多糖回收率约为70％，本发明使用木瓜蛋白酶-超滤组合法，多糖回收率为95％，最大限度的降低除蛋白过程中多糖的损失，并避免使用大量有机试剂，多糖的生物活性得以保护。

更详细更优选的制备方法如下：

(1)丙酮脱脂：以光棘球海胆黄为原料，加入等体积的丙酮，搅拌，静置，弃上层丙酮，减压挥干，研磨制成海胆黄丙酮粉；

(2)热水浸提：将海胆黄丙酮粉置于10-50倍水中，90℃煮2-10h，收集提取液，减压浓缩至原提取液体积的1/2以下；

(3)木瓜蛋白酶法去蛋白：调海胆黄提取液pH＝6.5，加入0.6％(w/w)的木瓜蛋白酶，60℃保温20-24h，90℃加热15min使酶失活，离心收集上清液；

(4)超滤浓缩：选择截流分子量为100K的超滤膜，除去木瓜蛋白酶、残留的蛋白质和小分子杂质；经超滤后，浓缩至原溶液体积的1/4；

(5)乙醇沉淀：向超滤去蛋白浓缩后的多糖提取液，缓缓加入2-6倍体积的无水乙醇，离心收集沉淀，将沉淀用丙酮洗涤，真空干燥得海胆黄粗多糖；

(6)Cellulose DE52离子交换柱层析：将海胆黄粗多糖配成50mg/ml的水溶液，过平衡好的DE52纤维素离子交换柱，双蒸水进行洗脱，分部收集，苯酚-硫酸法逐管测定糖含量，绘制洗脱曲线，合并相同组分；

(7)超滤浓缩：选择截流分子量为100K的超滤膜，将离子交换收集到的组分浓缩至20mg/ml；

(8)Sephacryl S-400HR凝胶过滤柱层析纯化：浓缩后的多糖组分，过平衡好的SephacrylS-400HR层析柱，用双蒸水进行洗脱，分部收集，苯酚-硫酸法逐管测定糖含量，合并相同组分；

(9)透析除杂质：选择截流分子量为14000Da的透析袋对(8)中收集的组分进一步除杂质，50℃水浴透析，磁力搅拌，每3-4h更换水浴，透析1-3天；

(10)冷冻干燥：将(9)收集的组分浓缩后冷冻干燥，得到海胆黄多糖。

本发明采用超滤和透析，并且找到了木瓜蛋白酶的最佳浓度进行除蛋白，使得海胆黄粗多糖的收率由0.56％提高到0.82％，海胆黄多糖的收率由6.3％提高到10％，一次纯化后的海胆黄多糖纯度由87.9％提高到93.6％。分离纯化周期减少至原周期1/2，收率提高近一倍。本发明着重于海胆黄多糖的分离纯化方法及其规模化提纯工艺，不仅可以得到高产率、高纯度的海胆黄多糖，也为其进入工业化生产提供技术基础。

附图说明：

图1是木瓜蛋白酶解时蛋白酶用量与去蛋白效果图

图2是Cellulose DE52离子交换柱(5.0cm×75cm)洗脱曲线

图3是Sephacryl S-400HR凝胶过滤柱层析(5.8cm×50cm)洗脱曲线

图4是海胆黄多糖精品HPLC图谱，纯度为93.6％

具体实施方式

实施例1

以新鲜的光棘球海胆50kg为原料，取黄称重约10kg，切成小块，置于搅拌罐中，加入等体积的丙酮，搅拌使之与丙酮充分接触，静置30min，弃上层丙酮，反复8次至丙酮层基本无色为止，最后将丙酮减压挥干，研磨制成海胆黄丙酮粉1.5kg。将1.5kg海胆黄丙酮粉置于30倍水(112L)中，90℃煮6h，提取2次，收集提取液，减压浓缩至56L。木瓜蛋白酶法去蛋白，调整海胆黄提取液pH＝6.5，加入0.6％(w/w)的木瓜蛋白酶，60℃保温24h，90℃加热15min使酶失活，离心收集上清液。选择截流分子量为100K的超滤膜，除去木瓜蛋白酶、残留的蛋白质和小分子杂质。经超滤后，浓缩至14L。向超滤去蛋白浓缩后的多糖提取液，缓缓加入4倍体积56L的无水乙醇，4℃放置过夜，离心收集沉淀，将沉淀用丙酮洗涤3次，最后经真空干燥得海胆黄粗多糖0.43kg。将海胆黄粗多糖配成50mg/ml的水溶液，过平衡好的DE 52纤维素离子交换柱(5.0cm×75cm)。双蒸水洗脱，流速5ml/min，每管5min分部收集，苯酚-硫酸法在490nm处逐管测定糖含量，绘制洗脱曲线，合并相同组分。选择截流分子量为100K的超滤膜，将离子交换收集到的组分浓缩至20mg/ml。浓缩后的多糖组分，过平衡好的Sephacryl S-400HR层析柱(5.8cm×50cm)，双蒸水洗脱，流速0.5ml/min，每管10min分部收集。苯酚-硫酸法在490nm处逐管测定糖含量，合并相同组分。选择截流分子量为14000Da的透析袋对Sephacryl S-400HR凝胶过滤柱层析中收集的相同组分进一步除杂质，50℃水浴透析，磁力搅拌，每3-4h更换水浴，透析3天。将去除杂质后组分浓缩至一定体积冷冻干燥，得到精品海胆黄多糖0.0422kg。Agilent高效液相色谱系统，采用Shodex sugar KS-805色谱柱，2414示差折光检测器，流动相为乐百氏纯净水，样品浓度为5.0mg/ml，进样量20ul，流速1.0ml/min，柱温30℃，记录样品色谱曲线，检测纯度为93.4％。各步骤收率见表1：

表1海胆黄多糖分离纯化收率

实施例2

以新鲜的光棘球海胆100kg为原料，取黄称重约20kg，切成小块，置于搅拌罐中，加入等体积的丙酮，搅拌使之与丙酮充分接触，静置30min，弃上层丙酮，反复数次至丙酮层基本无色为止(约6-8次)，最后将丙酮减压挥干，研磨制成海胆黄丙酮粉3kg。将3kg海胆黄丙酮粉置于30倍水(225L)中，90℃煮6h，提取2次，收集提取液，减压浓缩至112L。木瓜蛋白酶法去蛋白，调整海胆黄提取液pH＝6.5，加入0.6％(w/w)的木瓜蛋白酶，60℃保温20h，90℃加热15min使酶失活，离心收集上清液。选择截流分子量为100K的超滤膜，除去木瓜蛋白酶、残留的蛋白质和小分子杂质。经超滤后，浓缩至28L。向超滤去蛋白浓缩后的多糖提取液，缓缓加入4倍体积112L的无水乙醇，4℃放置过夜，离心收集沉淀，将沉淀用丙酮洗涤3次，最后经真空干燥得海胆黄粗多糖0.84kg。将海胆黄粗多糖配成50mg/ml的水溶液，过平衡好的DE52纤维素离子交换柱(5.8cm×100cm)。双蒸水洗脱，流速5ml/min，每管5min分部收集，苯酚-硫酸法在490nm处逐管测定糖含量，绘制洗脱曲线，合并相同组分。选择截流分子量为100K的超滤膜，将离子交换收集到的组分浓缩至20mg/ml。浓缩后的多糖组分，过平衡好的Sephacryl S-400HR层析柱(5.8cm×50cm)，双蒸水洗脱，流速0.5ml/min，每管10min分部收集。苯酚-硫酸法在490nm处逐管测定糖含量，合并相同组分。选择截流分子量为14000Da的透析袋对Sephacryl S-400HR凝胶过滤柱层析中收集的相同组分进一步除杂质，50℃水浴透析，磁力搅拌，每3-4h更换水浴，透析3天。将去除杂质后组分浓缩至一定体积冷冻干燥，得到精品海胆黄多糖0.084kg。Agilent高效液相色谱系统，采用Shodex sugar KS-805色谱柱，2414示差折光检测器，流动相为乐百氏纯净水，样品浓度为5.0mg/ml，进样量20ul，流速1.0ml/min，柱温30℃，记录样品色谱曲线，检测纯度为94％。各步骤收率见表2：

表2.海胆黄多糖分离纯化收率

实施例3

以新鲜的光棘球海胆200kg为原料，取黄称重约40kg，切成小块，置于搅拌罐中，加入等体积的丙酮，搅拌使之与丙酮充分接触，静置30min，弃上层丙酮，反复数次至丙酮层基本无色为止(约6-8次)，最后将丙酮减压挥干，研磨制成海胆黄丙酮粉6kg。将3kg海胆黄丙酮粉置于30倍水(450L)中，90℃煮6h，提取2次，收集提取液，减压浓缩至224L。木瓜蛋白酶法去蛋白，调整海胆黄提取液pH＝6.5，加入0.6％(W/W)的木瓜蛋白酶，60℃保温22h，90℃加热15min使酶失活，离心收集上清液。选择截流分子量为100K的超滤膜，除去木瓜蛋白酶、残留的蛋白质和小分子杂质。经超滤后，浓缩至56L。向超滤去蛋白浓缩后的多糖提取液，缓缓加入4倍体积224L的无水乙醇，4℃放置过夜，离心收集沉淀，将沉淀用丙酮洗涤3次，最后经真空干燥得海胆黄粗多糖1.65kg。将海胆黄粗多糖配成50mg/ml的水溶液，过平衡好的DE52纤维素离子交换柱(7.5cm×75cm)。双蒸水洗脱，流速5ml/min，每管5min分部收集，苯酚-硫酸法在490nm处逐管测定糖含量，绘制洗脱曲线，合并相同组分。选择截流分子量为100K的超滤膜，将离子交换收集到的组分浓缩至20mg/ml。浓缩后的多糖组分，过平衡好的Sephacryl S-400HR层析柱(5.8cm×50cm)，双蒸水洗脱，流速0.5ml/min，每管10min分部收集。苯酚-硫酸法在490nm处逐管测定糖含量，合并相同组分。选择截流分子量为14000Da的透析袋对Sephacryl S-400HR凝胶过滤柱层析中收集的相同组分进一步除杂质，50℃水浴透析，磁力搅拌，每3-4h更换水浴，透析3天。将去除杂质后组分浓缩至一定体积冷冻干燥，得到精品海胆黄多糖0.173kg。Agilent高效液相色谱系统，采用Shodex sugar KS-805色谱柱，2414示差折光检测器，流动相为乐百氏纯净水，样品浓度为5.0mg/ml，进样量20ul，流速1.0ml/min，柱温30℃，记录样品色谱曲线，检测纯度为93.6％。各步骤收率见表3：

表3.海胆黄多糖分离纯化收率

Claims (5)

1.一种海胆黄多糖规模化分离纯化方法，包括将光棘球海胆黄脱脂、热水浸提、木瓜蛋白酶法去蛋白、浓缩、乙醇沉淀、Cellulose DE52离子交换柱层析、Sephacryl S-400HR凝胶过滤柱层析、浓缩、干燥，其特征是：浓缩步骤采用超滤浓缩，Cellulose DE52离子交换柱层析后再次进行超滤浓缩，Sephacryl S-400HR凝胶过滤柱层析后采用透析除杂质。

2.权利要求1的分离纯化方法，其中超滤步骤采用截流分子量为100K的超滤膜。

3.权利要求1的分离纯化方法，其中透析用的是截留分子量为14000Da的透析袋。

4.权利要求1的分离纯化方法，其中木瓜蛋白酶去蛋白时加入0.6％w/w的木瓜蛋白酶。

5.权利要求1的分离纯化方法，依次包括下列步骤：

(1)丙酮脱脂：以光棘球海胆黄为原料，加入等体积的丙酮，搅拌，静置，弃上层丙酮，减压挥干，研磨制成海胆黄丙酮粉；

(2)热水浸提：将海胆黄丙酮粉置于10-50倍水中，90℃煮2-10h，收集提取液，减压浓缩至原提取液体积的1/2以下；

(3)木瓜蛋白酶法去蛋白：调海胆黄提取液pH＝6.5，加入0.6％w/w的木瓜蛋白酶，60℃保温20-24h，90℃加热15min使酶失活，离心收集上清液；

(4)超滤浓缩：选择截流分子量为100K的超滤膜，除去木瓜蛋白酶、残留的蛋白质和小分子杂质；经超滤后，浓缩至原溶液体积的1/4；

(5)乙醇沉淀：向超滤去蛋白浓缩后的多糖提取液，缓缓加入2-6倍体积的无水乙醇，离心收集沉淀，将沉淀用丙酮洗涤，真空干燥得海胆黄粗多糖；

(6)Cellulose DE52离子交换柱层析：将海胆黄粗多糖配成50mg/ml的水溶液，过平衡好的DE52纤维素离子交换柱，双蒸水进行洗脱，分部收集，苯酚-硫酸法逐管测定糖含量，绘制洗脱曲线，合并相同组分；

(7)超滤浓缩：选择截流分子量为100K的超滤膜，将离子交换收集到的组分浓缩至20mg/ml；

(8)Sephacryl S-400HR凝胶过滤柱层析纯化：浓缩后的多糖组分，过平衡好的SephacrylS-400HR层析柱，用双蒸水进行洗脱，分部收集，苯酚-硫酸法逐管测定糖含量，合并相同组分；

(9)透析除杂质：选择截流分子量为14000Da的透析袋对(8)中收集的组分进一步除杂质，50℃水浴透析，磁力搅拌，每3-4h更换水浴，透析1-3天；

(10)冷冻干燥：将(9)收集的组分浓缩后冷冻干燥，得到海胆黄多糖。

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