CN102680272A - 一种海胆多糖的提取、纯化及鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于海洋生物医药领域，特别涉及一种海胆多糖的提取、纯化及鉴定方法，本发明采用超微粉碎机将海胆进行预处理，采用超微粉碎与微波提取结合使用的方法提取粗多糖，以单克隆抗体技术为基础，采用免疫亲和层析法纯化多糖，采用斑点免疫印迹法鉴定海胆多糖。整套工艺成熟、稳定，适于工业化大生产，能够得到纯度高、生物活性好、质量稳定的海胆多糖产品。

Description

一种海胆多糖的提取、纯化及鉴定方法

技术领域

本发明属于海洋生物医药领域，特别涉及海胆多糖的提取、纯化及鉴定方法。

背景技术

现代医学和临床药理学研究表明，海胆多糖是一种硫酸多糖，具有抗凝血、降血脂、抗慢性肾衰、抗肿瘤、抗病毒、促进组织再生、抑制胃溃疡、增强机体免疫机能等多种生理活性，尤其是其确切的抗癌特性给肿瘤医学的发展带来了新的希望。

目前多糖类物质的提取多采用水提法、酸提法、碱提取法等来获取粗多糖，这些方法比较耗时、提取率低、且容易污染环境；而且常规方法提取的海胆多糖在提纯后，提取纯度越高，生物活性越差。

再者，目前动物多糖的鉴定一直是一个行业难题。薄层色谱鉴定虽然简单、快速，但必须事先进行降解，导致实验误差较大，不适用于较严格的质量控制体系；而应用传统大型仪器，如高效液相色谱法、质谱、核磁共振等进行鉴定，前处理周期长、费用高、处理量有限，不适用于工业化大生产。

发明内容

本发明旨在提供一套海胆多糖的提取、纯化及鉴定方法，通过设计筛选成熟的工艺步骤和工艺参数，以得到纯度高、生物活性好、质量稳定的海胆多糖产品。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种海胆多糖的提取方法，其特征在于，包括如下依次进行的步骤：

a、海胆洗净、晾干，采用气流粉碎机进行超微粉碎至500-3000目；

b、将步骤a所得的产物采用丙酮浸渍0.5 h，之后挥干丙酮； 

c、加入适量蒸馏水，采用微波法提取海胆多糖，所述微波法设置微波功率为400W、温度为70℃、固液比为1：20、提取时间为30 min、提取次数为1次；

d、加入壳聚糖固定化木瓜蛋白酶和α-淀粉酶，在55℃下恒温搅拌10 h；

e、离心，取上清液加入两倍量乙醇，静置5 h，离心，干燥沉淀物，即得海胆多糖粗品。

所述的提取方法制得的海胆粗多糖的纯化方法，其特征在于，包括如下依次进行的步骤：

f、将已纯化的海胆多糖单克隆抗体置于Affi-gel Hz 偶联液中，调整pH至5.5、温度为4℃，透析8-12小时；之后加入高碘酸钠，常温密闭条件下混匀1 h，再加入甘油混合10 min，之后置于Affi-gel Hz 偶联液中透析；

g、室温下，将f步骤所得产物与Affi-Gel  Hz  hydrazide  gel搅拌反应24 h，制成海胆多糖单克隆抗体-Gel悬浮液；

h、将海胆多糖单克隆抗体-Gel悬浮液加入到300mm×28mmi.d.的纯化柱中，用PB和PBS缓冲液分别洗涤后，4℃贮藏备用；所述PB缓冲液的制备方法为：取0.8 g NaH₂PO₄、4.4 g Na₂HPO₄·7H₂O、29.2 g NaCl，加800 ml水溶解，调节pH至7.0，加水定容到1000ml即得；所述PBS缓冲液的制备方法为：取8.0 g NaCl、0.2 g KH₂PO₄、0.2 g KCl、2.9 g Na₂HPO₄·12H₂O加蒸馏水至900 mL，调节pH至7.4，加入0.02%的叠氮化钠定容到1000ml即得；

i、将海胆多糖粗品溶于上样缓冲液中，过柱，洗涤液洗涤除去杂质，4℃静置2 h，再用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，获得海胆多糖纯品；所述上样缓冲液的制备方法为：取0.2 g NaH₂PO₄、1.1 g Na₂HPO₄·7H₂O、2.92 g NaCl，加800 ml水溶解，并加入50 ml 甲醇，调节pH至7.0，加水定容到1000ml即得；所述洗涤液的制备方法为：取0.2 g NaH₂PO₄、1.1 g Na₂HPO4·7H₂O、2.92 g NaCl，加800 ml水溶解，调节pH至7.0，加水定容到1000ml即得；所述洗脱液的制备方法为：取0.8 g NaH₂PO₄、4.4 g Na₂HPO₄·7H₂O、29.2 g NaCl加500 ml水溶解，并加入300 ml 甲醇，调节pH至7.0，加水定容到1000ml即得；

j、洗脱完成后，免疫亲和层析柱再用PBS缓冲液洗涤，4℃保存再利用。

所述的纯化方法制得的海胆多糖的鉴定方法，其特征在于，包括如下依次进行的步骤：

k、采用还原胺法，以海胆多糖与牛血清白蛋白或者人血清白蛋白为原料合成海胆多糖人工抗原；

l、将海胆多糖人工抗原与待测样品分别点于硝酸纤维素膜上，37℃静置2 h；

m、将膜浸入10%的小牛血清溶液中，在37℃条件下封闭2 h，采用PBS-T以10 min/次的速度洗膜2次；所述PBS-T的制备方法为取8.0 g NaCl、0.2 g KH₂PO₄、0.2 g KCl、2.9 g Na₂HPO₄·12H₂O，加入0.5 mL Tween-20，加水定容到1000 ml即得；

n、将膜浸入海胆多糖单克隆抗体溶液中孵育2 h，采用PBS-T洗膜1 h；

o、将膜浸入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗溶液中孵育1 h，PBS-T 洗膜30 min；

p、对膜进行ECL显影。

本方明的有益效果：

1、本发明采用超微粉碎机将海胆进行预处理，大大缩短了微波提取和壳聚糖固定化酶提取时间，提升了提取率，其特点是节能、节省溶剂、污染小、且可避免高温引起的分解。同时，采用超微粉碎与微波提取结合使用的方法，增加了海胆多糖溶解性，改变了常规方法提取的海胆多糖提纯后，不溶于冷水，不溶于一般有机溶剂的特性，易于海胆多糖药物生产过程的质量控制。

2、针对目前海胆多糖提取纯度越高生物活性越差的不足，我们以单克隆抗体技术为基础，采用免疫亲和层析法纯化多糖。利用抗原与抗体的特异性结合反应，获得了满意的纯化效果，所得产品选择性强、纯化效率高并保持高生物活性。

3、采用斑点免疫印迹法鉴定海胆多糖，实验误差小，处理周期短，较符合工业化大生产的需要。

下面结合药理实验说明本方明方法所得产品的生物活性：

本发明方法所得海胆多糖产品对肿瘤细胞的抑制作用研究实验：

1、选用复苏的人肺腺癌细胞系A549、人乳腺癌细胞系MCF7、宫颈癌细胞系Hela、鼠肉瘤细胞株S-180、人结肠癌细胞HT-29，以MTT法测定。结果见表1。

表1  MTT法测定海胆多糖对肿瘤细胞的体外抑制作用

肿瘤细胞	A549	HeLa	S180	HT-29	MCF-7
						IC50 （μg/m l）	9.67	8.67	13.72	29.19	15.66

表明本发明方法所得海胆多糖体外抗肿瘤活性显著，且针对肿瘤细胞HeLa、A549敏感。

2、按移植性肿瘤研究法建立小鼠模型。选择A549、S180 7d接种小鼠。

接种后的小鼠随机分为5组, 每组5只。接种24 h 后开始给药, 正常对照组和模型组均给等量的生理盐水, 环磷酰胺组剂量为20mg/（kg # d） ,海胆多糖设高、中、低（20,10,5 mg/（ kg# d））3个剂量组，给药方式均为ip。每天固定时间给药一次并记录小鼠的活动情况，连续7d。结果见表2、表3。

表2 海胆多糖对人肺腺癌细胞系A549裸鼠皮下肿瘤瘤重的影响

表3 海胆多糖对小鼠S180裸鼠皮下肿瘤瘤重的影响

表明本发明方法所得海胆多糖体内抗肿瘤活性显著。

具体实施方式

为了更好地理解和实施本发明，下面结合具体实施例进一步说明本发明。

具体实施例1

1、一种海胆多糖的提取方法，包括如下依次进行的步骤：

a、海胆洗净、晾干，采用气流粉碎机进行超微粉碎至500-3000目；

b、将步骤a所得的产物采用丙酮浸渍0.5 h，之后挥干丙酮； 

c、加入适量蒸馏水，采用微波法提取海胆多糖，所述微波法设置微波功率为400W、温度为70℃、固液比为1：20、提取时间为30 min、提取次数为1次；

d、加入壳聚糖固定化木瓜蛋白酶和α-淀粉酶，在55℃下恒温搅拌10 h；

e、离心，取上清液加入两倍量乙醇，静置5 h，离心，干燥沉淀物，即得海胆多糖粗品。

2、所述的提取方法制得的海胆粗多糖的纯化方法，包括如下依次进行的步骤：

f、将已纯化的海胆多糖单克隆抗体置于Affi-gel Hz 偶联液中，调整pH至5.5、温度为4℃，透析8-12小时；之后加入高碘酸钠，常温密闭条件下混匀1 h，再加入甘油混合10 min，之后置于Affi-gel Hz 偶联液中透析；

g、室温下，将f步骤所得产物与Affi-Gel  Hz  hydrazide  gel搅拌反应24 h，制成海胆多糖单克隆抗体-Gel悬浮液；

h、将海胆多糖单克隆抗体-Gel悬浮液加入到300mm×28mmi.d.的纯化柱中，用PB和PBS缓冲液分别洗涤后，4℃贮藏备用；所述PB缓冲液的制备方法为：取0.8 g NaH₂PO₄、4.4 g Na₂HPO₄·7H₂O、29.2 g NaCl，加800 ml水溶解，调节pH至7.0，加水定容到1000ml即得；所述PBS缓冲液的制备方法为：取8.0 g NaCl、0.2 g KH₂PO₄、0.2 g KCl、2.9 g Na₂HPO₄·12H₂O加蒸馏水至900 mL，调节pH至7.4，加入0.02%的叠氮化钠定容到1000ml即得；

i、将海胆多糖粗品溶于上样缓冲液中，过柱，洗涤液洗涤除去杂质，4℃静置2 h，再用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，获得海胆多糖纯品；所述上样缓冲液的制备方法为：取0.2 g NaH₂PO₄、1.1 g Na₂HPO₄·7H₂O、2.92 g NaCl，加800 ml水溶解，并加入50 ml 甲醇，调节pH至7.0，加水定容到1000ml即得；所述洗涤液的制备方法为：取0.2 g NaH₂PO₄、1.1 g Na₂HPO4·7H₂O、2.92 g NaCl，加800 ml水溶解，调节pH至7.0，加水定容到1000ml即得；所述洗脱液的制备方法为：取0.8 g NaH₂PO₄、4.4 g Na₂HPO₄·7H₂O、29.2 g NaCl加500 ml水溶解，并加入300 ml 甲醇，调节pH至7.0，加水定容到1000ml即得；

j、洗脱完成后，免疫亲和层析柱再用PBS缓冲液洗涤，4℃保存再利用。

3、所述的纯化方法制得的海胆多糖的鉴定方法，包括如下依次进行的步骤：

k、采用还原胺法，以海胆多糖与牛血清白蛋白或者人血清白蛋白为原料合成海胆多糖人工抗原；

l、将海胆多糖人工抗原与待测样品分别点于硝酸纤维素膜上，37℃静置2 h；

m、将膜浸入10%的小牛血清溶液中，在37℃条件下封闭2 h，采用PBS-T以10 min/次的速度洗膜2次；所述PBS-T的制备方法为取8.0 g NaCl、0.2 g KH₂PO₄、0.2 g KCl、2.9 g Na₂HPO₄·12H₂O，加入0.5 mL Tween-20，加水定容到1000 ml即得；

n、将膜浸入海胆多糖单克隆抗体溶液中孵育2 h，采用PBS-T洗膜1 h；

o、将膜浸入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗溶液中孵育1 h，PBS-T 洗膜30 min；

p、对膜进行ECL显影。

4、所述海胆多糖单抗的制备方法为：采用还原胺法，以海胆多糖与牛血清白蛋白或者人血清白蛋白为原料合成海胆多糖人工抗原；利用海胆多糖人工抗原免疫BALB/c小鼠，获得针对海胆多糖的多克隆抗体，进而应用杂交瘤制备技术，获得针对海胆多糖的单克隆抗体。

具体实施例2

1、海胆壳多糖与内容物多糖都为硫酸多糖类，根据其结构特点可采用还原胺法合成海胆多糖人工抗原，以海胆壳多糖为例，方法如下：

（1）将海胆壳多糖、牛血清蛋白和NaCNBH3分别加入到反应器中，以pH为9.6的磷酸盐缓冲液为反应液，37℃条件下反应3d，得到海胆壳多糖人工抗原；

（2）采用紫外、苯酚-硫酸法、凝胶电泳、荧光法确定人工抗原中多糖的浓度、蛋白质浓度及多糖与蛋白质的偶联程度。

2、小鼠免疫及抗血清的制备

（1）选用6周龄雌性BALB/c小鼠4只。将人工抗原与佐剂（弗氏完全及弗氏不完全佐剂）按1:1比例混合，漩涡混匀器震荡30 min使其混合均匀。初免0.3mL每只（人工抗原与完全佐剂乳化，腹腔、皮下、颈部多点注射），一免3周后进行二免，剂量和途径同第一次，从二免开始换用不完全佐剂，每隔两周分别进行三免、四免，四免后采集血清，检测效价，取效价相对高的小鼠继续加强免疫，加强免疫时人工抗原不需加任何佐剂。加强免疫一周后，断尾采血于灭菌的试管内。室温放置30 min，在超净工作台内将血块和管壁剥离，37℃度恒温2 h，4℃冰箱中过夜，使血清充分析出，1000 rpm，离心10 min，收集上清，-20℃保存，备用。

（2）抗血清效价及特异性检测

包被：将抗原包被到酶标板上， 4℃反应12 h；

洗涤：倾去包被液，用PBS-T洗涤3次，3 min/次，拍干；

封闭：加入封闭液， 37℃水浴3 h，同前用PBS-T洗涤；

加一抗：加入抗血清,按200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600倍稀释，设置空白对照，并用正常小鼠血清作为阴性对照，37℃水浴l h，同前洗涤；

加二抗：加入1:1000稀释的酶标羊抗小鼠IgG-HRP， 37℃水浴l h，同前洗涤；

显色：加入OPD底物缓冲液显色， 37℃显色15 min；

终止：加入2 mol·L-1H2SO4终止显色反应，终止反应5 min；

于酶标仪492 nm波段处测吸光值，经过检测，取效价较高的小鼠抗血清；此外，采用方阵滴定法确定抗原抗体反应的最佳条件。

（3）杂交瘤细胞的制备

①骨髓瘤细胞（SP2/0）的准备

将冻存的骨髓瘤细胞快速从液氮罐内取出，立即放入37℃水浴中快速融化（不断的晃动，1 min内完全融化），融化后在无菌条件下转入离心管中，1000 r·min-1离心3 min，吸去上清液，加入适量DMEM培养液适当吹打将沉淀细胞重新悬浮，转入培养瓶中，置于5% CO2、37℃的培养箱中培养。根据细胞生长状态（细胞长得很密或培养液变黄），需按1:1的比例稀释传代或扩大培养，15 d后选处于生长旺盛、形态良好的对数生长期细胞供融合使用。

②饲养细胞的制备

将小鼠摘眼球取血（阴性对照），断颈猝死，将其浸泡在75%的酒精中5 min，随即在无菌条件下，剪开皮肤，使其腹腔暴露，不能破坏腹膜，酒精消毒。左手用镊子夹起腹膜，右手用无菌注射器吸取DMEM培养液5 mL，注入小鼠腹腔。右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1-2 min。然后用注射器在腹腔内，来回抽吸数次，将注射器抽取腹腔内的液体，放入离心管中，1000 r·min-1离心5 min，弃上清，用 5 mL HAT培养液将沉淀细胞悬浮并混匀，细胞计数，根据细胞计数结果，用HAT培养液将细胞浓度调为2×105个/mL；将细胞悬液分装到96孔细胞培养板中，0.1 mL/孔，在5% CO2、 37℃饱和湿度条件下培养。

③免疫小鼠B淋巴细胞的制备

将各小鼠的抗血清效价进行对比，取效价高的BALB/c小鼠，最后加强免疫3 d后，摘眼球取血后（收集血清做阳性对照）断颈猝死，75%酒精中浸泡5 min，在无菌条件下，取其脾脏，放入盛有5 mL-10 mL DMEM培养液的无菌平皿中清洗，清除脾脏周围的结缔组织。然后将其放入装有10 mL的DMEM的平皿内，并置于钢丝网（200目）上，用研磨棒研磨脾脏，使脾细胞全部通过钢丝网孔挤压到溶液中，制成脾细胞悬液，细胞计数。将脾细胞悬液转入离心管中，混匀，1000 r·min-1离心5 min，弃上清，沉淀细胞用DMEM培养液稀释到10 mL，置室温待用。

④细胞融合

 取1.0×108个脾细胞，2.0-5.0×107个SP2/0细胞（二者比例在1: 1-10之间）先后加入到 50 mL的融合管中，轻轻摇匀；1000 r·min-1离心10 min，弃上清液（离心时必须注意平衡）；将融合管置于掌心轻轻摩擦，使沉淀细胞松散均匀成糊状；将融合管置于37℃水浴中，吸取1mL 37℃预热的PEG-4000，逐滴加入到融合管中，并不断摇匀融合管，45 s内加完，37℃静置1 min；在90 s内缓慢滴加30-40 mL无血清的DMEM培养液，终止融合；37℃条件下，静置10 min后，1000 r·min-1，离心10 min，弃上清液；将融合管置于手掌，摩擦使之松散均匀成糊状，加入60-80 mL HAT 使细胞悬浮，混匀，再加入到含有饲养细胞的96孔细胞培养板里，100 μL/孔，37℃，5% CO2培养；5 d后用根据生长情况，用HAT培养基换出1/2培养基；7-10 d后用HT培养基换出HAT培养基，第14 d后可用普通完全培养基；前3 d不要轻易移动细胞培养板，5 d后，要经常观察细胞，待细胞长满低孔1/10面积，上清液开始变黄时吸取上清进行效价检测。

（4）阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆

①阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆

细胞融合后12-16 d后收集上清液，进行筛选，并将阳性孔的细胞转移至24孔培养板扩大培养。阳性孔筛选方法如下：

包被：将抗原包被到酶标板上，4℃反应12 h；

洗涤：倾去包被液，用PBS-T洗涤3次，3 min/次，拍干；

封闭：加入封闭液，37℃水浴3 h，同前用PBS-T洗涤；

加一抗：加入上清液，设置空白对照，并用正常小鼠血清作为阴性对照，37℃水浴l h，同前洗涤；

加二抗：加入1:1000稀释的酶标羊抗小鼠IgG-HRP，100 μL/孔，37℃水浴l h，同前洗涤；

显色：加入OPD底物缓冲液显色，100 μL/孔，37℃显色15 min；

终止：加入2 mol·L-1H2SO4终止显色反应，50 μL/孔，终止反应5 min；

于酶标仪492 nm波段处测吸光值，以样品孔的OD值大于阴性孔的2倍为阳性。

②阳性孔亚克隆

亚克隆前1 d 制备饲养细胞，置于96孔板中。

采用有限稀释法：

制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，并细胞计数，用含12%小牛血清的HT培养基稀释至每毫升含5、10和15个细胞3种不同的稀释度；

杂交瘤细胞分装于培养有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每个稀释度分装32孔，每孔量为0.1 mL，每孔的杂交瘤细胞数分别为0、1和2；

37℃、5% CO2湿润培养7-10 d，出现肉眼可见的克隆即用间接ELISA法检测抗体效价；

取检测为阳性孔的细胞继续扩大培养并冻存。

（5）腹水型单克隆抗体的制备

接种杂交瘤细胞前7-10 d左右，先给6-8周龄雌性BALB/c小鼠腹腔注射灭菌液体石蜡，每只小鼠0.3-0.5 mL；

7-10 d后用无血清培养基稀释的杂交瘤细胞腹腔接种，每只小鼠注射5-10×105个细胞； 

间隔5 d后，观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，手摸有紧张感，即用16号针头采集腹水，连续采2-3次，每只小鼠采5-10 mL腹水；

将腹水在2000 r·min-1条件下离心8 min，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-80℃冻存，或冻干保存。

3、免疫亲和层析法（侧重于纯化海胆多糖）

（1）纯化后的海胆壳多糖单抗在buffer中透析，4℃过夜；

（2）高碘酸钠氧化海胆壳多糖单抗，常温下在密闭容器中轻轻混合1 h；

（3）氧化后立即加入甘油混合10 min；

（4）上述溶液在条件1中透析；

（5）在室温下，氧化的海胆壳多糖单抗与Affi-Gel Hz 偶联（轻柔搅拌24h）；

（6）海胆壳多糖单抗-Gel混合液装柱，并洗涤，4℃贮藏备用；

（7）海胆壳粗多糖液过柱，并洗涤；

（8）反冲洗，获得海胆壳多糖纯品。

4、斑点免疫印迹法（侧重于鉴定海胆多糖）

将海胆壳多糖人工抗原于未知样品液分别点于硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉封闭2 h后，室温下先用海胆壳多糖（1∶1000 稀释）孵育2 h，PBS-T洗膜1 h，再用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（1∶2000 稀释）孵育1 h，PBS-T 洗膜30 min后，按Amersham公司试剂盒说明书进行ECL显影。

Claims (3)

1.一种海胆多糖的提取方法，其特征在于，包括如下依次进行的步骤：

a、海胆洗净、晾干，采用气流粉碎机进行超微粉碎至500-3000目；

b、将步骤a所得的产物采用丙酮浸渍0.5 h，之后挥干丙酮； 

c、加入适量蒸馏水，采用微波法提取海胆多糖，所述微波法设置微波功率为400W、温度为70℃、固液比为1：20、提取时间为30 min、提取次数为1次；

d、加入壳聚糖固定化木瓜蛋白酶和α-淀粉酶，在55℃下恒温搅拌10 h；

e、离心，取上清液加入两倍量乙醇，静置5 h，离心，干燥沉淀物，即得海胆多糖粗品。

2.按照权利要求1所述的提取方法制得的海胆粗多糖的纯化方法，其特征在于，包括如下依次进行的步骤：

f、将已纯化的海胆多糖单克隆抗体置于Affi-gel Hz 偶联液中，调整pH至5.5、温度为4℃，透析8-12小时；之后加入高碘酸钠，常温密闭条件下混匀1 h，再加入甘油混合10 min，之后置于Affi-gel Hz 偶联液中透析；

g、室温下，将f步骤所得产物与Affi-Gel  Hz  hydrazide  gel搅拌反应24 h，制成海胆多糖单克隆抗体-Gel悬浮液；

h、将海胆多糖单克隆抗体-Gel悬浮液加入到300mm×28mmi.d.的纯化柱中，用PB和PBS缓冲液分别洗涤后，4℃贮藏备用；所述PB缓冲液的制备方法为：取0.8 g NaH₂PO₄、4.4 g Na₂HPO₄·7H₂O、29.2 g NaCl，加800 ml水溶解，调节pH至7.0，加水定容到1000ml即得；所述PBS缓冲液的制备方法为：取8.0 g NaCl、0.2 g KH₂PO₄、0.2 g KCl、2.9 g Na₂HPO₄·12H₂O加蒸馏水至900 mL，调节pH至7.4，加入0.02%的叠氮化钠定容到1000ml即得；

i、将海胆多糖粗品溶于上样缓冲液中，过柱，洗涤液洗涤除去杂质，4℃静置2 h，再用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥，获得海胆多糖纯品；所述上样缓冲液的制备方法为：取0.2 g NaH₂PO₄、1.1 g Na₂HPO₄·7H₂O、2.92 g NaCl，加800 ml水溶解，并加入50 ml 甲醇，调节pH至7.0，加水定容到1000ml即得；所述洗涤液的制备方法为：取0.2 g NaH₂PO₄、1.1 g Na₂HPO4·7H₂O、2.92 g NaCl，加800 ml水溶解，调节pH至7.0，加水定容到1000ml即得；所述洗脱液的制备方法为：取0.8 g NaH₂PO₄、4.4 g Na₂HPO₄·7H₂O、29.2 g NaCl加500 ml水溶解，并加入300 ml 甲醇，调节pH至7.0，加水定容到1000ml即得；

j、洗脱完成后，免疫亲和层析柱再用PBS缓冲液洗涤，4℃保存再利用。

3.按照权利要求2所述的纯化方法制得的海胆多糖的鉴定方法，其特征在于，包括如下依次进行的步骤：

k、采用还原胺法，以海胆多糖与牛血清白蛋白或者人血清白蛋白为原料合成海胆多糖人工抗原；

l、将海胆多糖人工抗原与待测样品分别点于硝酸纤维素膜上，37℃静置2 h；

m、将膜浸入10%的小牛血清溶液中，在37℃条件下封闭2 h，采用PBS-T以10 min/次的速度洗膜2次；所述PBS-T的制备方法为取8.0 g NaCl、0.2 g KH₂PO₄、0.2 g KCl、2.9 g Na₂HPO₄·12H₂O，加入0.5 mL Tween-20，加水定容到1000 ml即得；

n、将膜浸入海胆多糖单克隆抗体溶液中孵育2 h，采用PBS-T洗膜1 h；

o、将膜浸入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG二抗溶液中孵育1 h，PBS-T 洗膜30 min；

p、对膜进行ECL显影。