JPS6337801B2

JPS6337801B2 -

Info

Publication number: JPS6337801B2
Application number: JP13903981A
Authority: JP
Inventors: Kazuo Nakajima; Yoshiaki Hirata; Hiroyuki Uchida; Tomoko Shiomi; Tsutomu Taniguchi; Akira Oohayashi; Osamu Tanabe; Takuma Sasaki
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Priority date: 1981-09-03
Filing date: 1981-09-03
Publication date: 1988-07-27
Also published as: JPS5840301A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は抗腫瘍活性を有する新規なβ−１，３
−グルカンに関し、その目的とするところは医薬
として有用な新規β−１，３−グルカンを提供す
ることにある。本発明のβ−１，３−グルカンは下記繰返し単
位（式中Gluはグルコピラノース残基を表わす）か
らなるβ−１，３−グルカンであり、盤菌綱
（Discomycetes）のくろちやわんたけ属
（Pseudoplectania）に属する微生物の子実体、
培養菌糸体あるいは培養液から分離採取するこ
とができる。本発明の上記β−１，３−グルカンは、同種移
植腫瘍系に対して強力な抗腫瘍活性を示すだけで
なく、公知のβ−１，３−グルカンでは有効性が
報告されていない同系移植腫瘍系に対しても著し
く強い抗腫瘍活性を示し、更に比較的免疫感受性
の多いザルコーマ−180−C3H／He系腫瘍に対し
ても極めて強い抗腫瘍活性を示す。従来より、抗腫瘍活性を有するβ−１，３−グ
ルカンについては数多くの研究がなされており、
その中でグルカンの構造が報告されているものは
以下のとおりである。 (1) シゾフイラン：スエヒロタケの生産するβ−
１，３−グルカン（日本農芸化学会誌第44巻、
第337頁〜第342頁1970年：同第45巻、第162頁
〜第168頁1971年） (2) キクラゲ属の生産するβ−１，３−グルカン
（特開昭54−63012号） (3) レンチナン：シイタケの生産するβ−１，３
−グルカン（「癌と免疫増強」千原呉朗著講談
社発行、第51頁、1980年：ネイチヤー第222巻
第687頁〜第688頁1969年：カーボハイドレイ
ト・リサーチ第47巻、第99頁〜第104頁、1976
年）上記公知のβ−１，３−グルカンも本発明のβ
−１，３−グルカンも何れもβ−１，３−結合を
主鎖とし、グルコピラノース１個の長さのβ−
１，６−結合分枝を有する高分子グルカンである
が、上記各構造式から明らかなように本発明のβ
−１，３−グルカンは公知のβ−１，３−グルカ
ンと較べ主鎖のβ−１，３−結合数に対するβ−
１，６−結合分枝数の比率がそれぞれ異なつてお
り、本発明により初めて明らかにされた新規β−
１，３−グルカンである。また本発明のβ−１，３−グルカンは動物実験
による抗腫瘍活性において、同腫移植腫瘍系に対
しては勿論、上記公知のβ−１，３−グルカンで
は有効性の報告されていない同系移植腫瘍系に対
しても著しく強い活性を示し、更に比較的免疫感
受性の低いザルコーマ−180−C3H／He系腫瘍に
対しても極めて強い抗腫瘍活性を示すものであ
り、癌の免疫療法剤としての有効性は公知のβ−
１，３−グルカンと較べ極めて高いことが期待さ
れる。次に本発明のβ−１，３−グルカンの構造およ
び性質に関して説明する。 (1) 構造式(1)に示したとおりであり、本構造は以下に
示す実験により確認されたものである。 (a) 本多糖体をバシデイオマイセテQM806
（Basidiomycete QM806）の産生するエキ
ソ−β−１，３−グルカネースと作用させ、
その分解産物をペーパークロマトグラフイー
で同定したところグルコースとゲンチオビオ
ースが得られた。この分解産物をバイロゲル
−Ｐ−２、400メツシユでゲル過し、グル
コースとゲンチオビオースに分画し、そのモ
ル比を測定したところほぼ１：0.8であつた。 (b) 本多糖体をメチル化し、メチル誘導体を加
水分解したのち、ペーパークロマトグラフイ
ーおよびガスクロマトグラフイーで分析した
結果、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メチル
−Ｄ−グルコース、２，４，６−トリ−Ｏ−
メチル−Ｄ−グルコースおよび２，４−ジ−
Ｏ−メチル−Ｄ−グルコースが検出され、そ
れぞれのモル比がほぼ0.8：１：0.8の割合で
生成した。 (c) 本多糖体を0.05Mの過沃素酸で完全に酸化
すると構成糖当り0.344モルのギ酸が生成し、
0.667モルの過沃素酸が消費された。 (d) 本多糖体の過沃素酸化物をスミス分解法に
従い水素化硼素ナトリウムで還元後、酸で加
水分解すると、グリセリンとグルコースがほ
ぼ１：2.1のモル比で生成した。 (e) 上記還元物を0.03モルの硫酸で緩和加水分
解すると、グリセリンの他に水不溶性の物質
が生成し、この物質をメチル化後加水分解す
ると２，４，６−トリ−Ｏ−メチル−Ｄ−グ
ルコースのみ生成した。 (f) 本多糖体を0.03Mの硫酸で加水分解する
と、水不溶性の物質が生成し、それを除去し
た液中にはＤ−グルコースのみが検出され
た。一方水不溶物を前記エキソ−β−１，３
−グルカネースに作用させると分解産物はＤ
−グルコースのみであつた。以上の結果より本多糖体はβ−１，３−結合
で主鎖を形成するグルコピラノース残基９個の
うち４個にグルコピラノース単位１個の分枝が
β−１，６−結合でついた構造の繰り返し単位
を有するβ−１，３−グルカンであることが判
る。 (2) 元素分析Ｃ：43.88％ 6.16％ (3) 分子量約25万以上（ゲル過法による）。 (4) 融点明確な融点を示さず、強熱すると炭化する。 (5) 比旋光度〔α〕²⁵ _D＝＋35゜（0.5N NAOH Ｃ＝0.5％）。 (6) 極限粘度〔η〕＝約20〜25 極限粘度〔η〕は下記式によつて定義され
る。 η_sp＝（η−η_p）／η_p＝η／η_p−１ η溶液の粘度（0.1M NaCl30℃） η_p＝溶媒の粘度ｃ＝溶液の100ml中の溶質のｇ数 (7) 紫外吸収スペクトル未端吸収 (8) 赤外吸収スペクトル β−結合に特有な890cm^-1の吸収を有する
（第１図参照）。 (9) 溶解性水、0.5NのNaOH、ジメチルスルホキサイ
ドに可溶。石油エーテル、エーテル、アセトン、ベンゼ
ン、エタノール、メタノール等の有機溶媒に不
溶。 (10) 呈色反応モーリツシユ反応、アンスロン反応に陽性、
ヨードデンプン反応、バイアル反応、ニンヒド
リン反応、エルソン−モルガン反応、カルバゾ
ール−硫酸反応に陰性。 (11) 水溶液のPH 中性付近。 (12) 外観白色の粉末。 (13) 構成糖Ｄ−グルコースのみ（P.P.C、T.L.C、G.L.C
およびグルコースオキシデースにより確認）。以上に述べた如く、本発明のβ−１，３−グル
カンは式〔〕の構造を有し、(2)〜（13）項の理
化学的性質を有する新規なβ−１，３−グルカン
である。次に本発明のβ−１，３−グルカンの抗腫瘍性
によき、マウスを用いた動物実験の実験例により
説明する。一連の動物実験は特記した以外は常法
により行なつた。実験例１本発明のβ−１，３−グルカンを用い、ザルコ
ーマ−180−ICR系に対する抗腫瘍活性を検定し
た。その結果を第１表に示した。

【表】腫瘍：ザルコーマ−180固形癌移植細胞数：４×10⁶個／マウスマウス：ICR系♀ 投与：腹腔内、腫瘍移植後１日目から隔日に１回
×５回判定：腫瘍移植後４週目腫瘍阻止率（％）＝−）／×100 ：対照群の平均腫瘍重量：治療群の平均腫瘍重量実験例２実験例１と同様にして本発明によるβ−１，３
−グルカンのザルコーマ−180−C3H／He系、エ
ールリツヒ固形癌−ICR系およびMethA−
BALB／ｃ系に対する抗腫瘍活性を検定した。
その結果をそれぞれ第２表、第３表および第４表
に示した。

【表】腫瘍：ザルコーマ−180固形癌移植細胞数：４×10⁶個／マウスマウス：C3H／He♀ 投与：腹腔内、腫瘍移植後１日目から隔日に１回
×10回判定：腫瘍移植後５週目

【表】腫瘍：エールリツヒ固形癌移植細胞数：４×10⁶個／マウスマウス：ICR系♀ 投与：腹腔内、腫瘍移植後１日目から隔日に１回
×８回判定：腫瘍移植後５週目

【表】腫瘍：Meth Ａ固形癌移植細胞数：１×10⁵個／マウスマウス：BALB／ｃ系♀ 投与：腹腔内、腫瘍移植後１日目から隔日に１回
×10回判定：腫瘍移植後５週目実験例３実験例１と同様にして本発明によるβ−１，３
−グルカンのエールリツヒ腹水癌−ICR系に対す
る抗腫瘍活性を検定した。その結果を第５表に示
した。

【表】腫瘍：エールリツヒ腹水癌移植細胞数：５×10₅個／マウスマウス：ICR系♀ 投与：腹腔内、腫瘍移植後１日目から毎日１回×
10回判定：腫瘍移植後７週目におけるマウス生存匹数
および平均生存日数で示した。以上の実験例により示した如く、本発明のβ−
１，３−グルカンはザルコーマ−180−ICR系等
の同種移植腫瘍系に対しては勿論のこと、公知の
β−１，３−グルカンでは有効性の報告されてい
ないMeth Ａ−BALB／ｃ系の同系移植腫瘍系に
対しても極めて強い抗腫瘍活性を示し、更に比較
的免疫感受性の低い腫瘍系のザルコーマ−180−
C3H／He系に対しても著しく強い抗腫瘍活性を
示すことが判明した。なお本発明のβ−１，３−グルカンの急性毒性
をマウスに腹腔内投与して検べたところLD50は
1000mg／Kg以上であつた。本発明のβ−１，３−グルカンは特願昭56−
32797号に記載された方法により作ることができ
る。即ちくろちやわんたけ属に属する微生物の子
実体または培養菌体を水性溶媒で抽出して得た抽
出液もしくは上記微生物を培養して得た培養液
から塩析、溶媒沈澱、透析、限外過、イオン交
換クロマトグラフイー等の手段を単独あるいは適
宜組み合わせて分離精製することにより容易に採
取することができる。上記くろちやわんたけ属に
属する微生物としては例えばくろちやわんたけ
〔Pseudoplectania nigrella（Pers）Fuckel〕ｋ−
1426株（微工研菌寄第5803号）がある。くろちやわんたけＫ−1426株を培養する際の培
地および培養条件としては通常の微生物の培養に
用いられる手段を応用することができる。即ち培
地としては上記菌株の利用可能な炭素源、窒素
源、無機塩等を適当量含有するものであればよ
く、培養の初発PHは２〜９が、培養温度は15〜35
℃が適当である。通気撹拌培養を行なう場合は、
通気量は0.1〜2.0／・分、撹拌速度は30〜
50rpmの条件が好ましい。培養時間は培地条件、
培養条件により異なるが、目的とするβ−１，３
−グルカンの生産量が最高に達した時点で培養を
終了させるのが有利である。上記の如くして得た培養液から過等の手段に
よつて培養菌糸体と培養液に分け、培養菌糸体
は水性溶媒で抽出して抽出液となし、培養液は
そのままで用い、前述した分離精製手段を施すこ
とにより本発明のβ−１，３−グルカンや白色の
粉末として採取される。以下に本発明の実施例を示す。実施例１グルコース2.0％、コーンスチープリカー0.5
％、大豆粉0.1％、酵母エキス0.1％、KH₂PO₄0.1
％、MgSO₄・7H₂Oを0.05％からなる液体培地
（PH5.6）に100mlを500ml溶のヒダ付三角フラスコ
に分注し綿栓を付した後、120℃で20分間殺菌し
た。冷却後、これに別にグルコース2.0％、エビ
オス0.5％、寒天1.5％からなる培地に斜面培養し
ておいたくろちやわんたけ〔Pseudoplectania
nigrella（Pers） Fuckel〕Ｋ−1426株の菌糸を
接種し、27℃で10日間振盪培養して種菌とした。
別に30容ジヤー・フアーメンターに前記の組成
の液体培地20を分注し、120℃で20分間殺菌し、
上記種菌を接種して27℃、12日間、通気量0.5
／・min、撹拌220rpmの条件下で通気撹拌
培養を行なつた。培養終了後培養液を過し菌糸
体130ｇ（乾物）と培養液17を得た。実施例２実施例１で得た培養菌糸体130ｇに水15を加
え、120℃で30分間加熱抽出し、過して抽出液
と抽出残渣とに分離し、抽出残渣からの再抽出
を、上記と同様の手段で２回繰返して行ない抽出
液43を得た。この抽出液を約1/10容まで濃縮
し、濃縮液に等量のエタノールを加えて多糖体を
沈澱させて分離し、これに少量の水を加えて溶解
した後透析した。透析内液をDEAE−セフアデツ
クスで処理して非吸着区分を得、この区分をさら
にSP−セフアデツクスで処理して非吸着区分を
得、これを再び透析し凍結乾燥して白色の粉末
8.6ｇを得た。このものは前記(a)〜(f)の実験により、前記式
〔〕の繰返し単位を有するβ−１，３−グルカ
ンであることが同定された。平均分子量は約100
万であつた（ゲル過法による）。実施例３実施例１で得た培養液17を実施例２の菌糸
体抽出液と同様に処理して白色の粉末13.2ｇを得
た。このものは前記(a)〜(f)の実験により、前記式
〔〕の繰返し単位を有するβ−１，３−グルカ
ンであることが同定された。平均分子量は約100
万であつた（ゲル過法による）。本物質の赤外吸収スペクトルは第１図に示した
とおりである。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例３の本発明による物質の赤外吸
収スペクトルである。

Claims

【特許請求の範囲】１下記繰返し単位（式中Gluはグルコピラノース残基を表わす）からなるβ−１，３−グルカン。