JP4057107B2 - ヒメマツタケの培養菌糸体又は培養濾液から分離されるグルコマンナン及びこれを有効成分とする抗腫瘍剤 - Google Patents
ヒメマツタケの培養菌糸体又は培養濾液から分離されるグルコマンナン及びこれを有効成分とする抗腫瘍剤 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ハラタケ属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）のきのこであるヒメマツタケ（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ）、通称カワリハラタケの培養物から分離されるグルコマンナン及びこれを有効成分とする抗腫瘍剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
きのこの培養物から分離される水溶性成分に各種薬理作用のあることが報告されている。ヒメマツタケについては、その子実体から分離される水溶性の酸性多糖体成分、中性多糖体成分及び蛋白多糖体成分に抗腫瘍作用のあることが報告されており（特開平１−６７１９４、特開平１−６７１９５、特開平２−７８６３０）、またその子実体から分離される水溶性の複合成分に肝機能改善作用、抗癌作用及び免疫能低下改善作用のあることが報告されていて（特開平２−１２４８２９、特開平６−１２８１６４、特開平７−２５８１０７）、更にその培養菌糸体や培養濾液から分離される水溶性の多糖体成分に抗腫瘍作用のあることが報告されている（特開昭５５−１０８２９２、特開昭５５−１０８２９３）。ところが、これら従来の報告では、ヒメマツタケ培養物から分離される多種多様の水溶性成分のうちで、何が薬理作用を示す本体であるのか、特に抗腫瘍作用を示す本体であるのか、明らかにされていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、ヒメマツタケ培養物から分離される多種多様の水溶性成分のうちで、何が強い抗腫瘍作用を示すのかを解明し、よってより有効な抗腫瘍剤を提供する処にある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
しかして本発明者らは、上記課題を解決するべく研究した結果、ヒメマツタケ培養物から分離される多種多様の水溶性成分のうちで、強い抗腫瘍作用を示すものは、ヒメマツタケの培養菌糸体又は培養濾液から分離される特定構造のグルコマンナンであることを知見した。
【０００５】
すなわち本発明は、ヒメマツタケの培養菌糸体又は培養濾液から分離される、下記の式１で示される繰返し単位で構成されたβ−１，２結合のマンノース鎖を主鎖とするグルコマンナンと、このグルコマンナンを有効成分とする抗腫瘍剤とに係る。
【０００６】
【式１】
【０００７】
式１において、
Ｇｌｃ：グルコース残基
Ｍａｎ：マンノース残基
【０００８】
本発明では、ヒメマツタケの培養菌糸体又は培養濾液を用いる。これらは、担子菌の培養に通常用いられる固体培養法又は液体培養法で得ることができるが、操作の便宜上、液体培養法で得るのが好ましい。例えば、グルコール、サッカロース、マルトース等の炭素源、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム等の窒素源、麦芽エキス、酵母エキス、コーンステイプリカ等の天然複合栄養源、リン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩等の無機塩及びその他の微量元素からなるｐＨ６．０前後に調整した通常の殺菌済み液体培地に、ヒメマツタケの種菌を接種し、温度３０℃前後で１０〜２５日間程度、雑菌汚染を防止しつつ好気条件下に振とう培養又は通気撹拌培養すると、菌糸体が生育するので、この段階で培養系を遠心分離又は濾過することによりヒメマツタケの培養菌糸体と培養濾液とを得ることができる。
【０００９】
本発明のグルコマンナンは前記のようなヒメマツタケの培養菌糸体又は培養濾液から分離される水溶性多糖体である。詳しくは後述するが、ヒメマツタケの培養菌糸体からは、次のようにして本発明のグルコマンナンを分離できる。先ず、ヒメマツタケの培養菌糸体の乾燥物を熱水抽出し、抽出液を得る。この抽出液を濃縮し、その濃縮液をアルコール沈澱して、沈澱物を得る。この沈澱物の水溶液を塩析により除蛋白し、非蛋白質画分を得る。次に、この非蛋白質画分をステップワイズ法によりイオン交換クロマトグラフィーで分画し、水溶出画分、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液溶出画分及び１．０Ｍ塩化ナトリウム水溶液溶出画分を得る。これらの溶出画分の主要多糖体を箱守法により完全メチル化した後、完全加水分解を行ない、アルジトール化及びアセチル化して、ＧＣ／ＭＳで解析し、併せて13Ｃ−ＮＭＲで解析すると、β−１，２結合のマンノース鎖を主鎖とする数平均分子量１０万〜２５０万（ＧＰＣ法、プルラン換算、以下同じ）のグルコマンナンが含まれている。
【００１０】
また前記０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液溶出画分をグラジェント法により更にイオン交換クロマトグラフィー及びゲルクロマトグラフィーで繰返し精製して、実質的に単一ピークの精製画分を得る。この精製画分には、これを上記と同様にＧＣ／ＭＳで解析し、併せて13Ｃ−ＮＭＲで解析すると、式１で示される繰返し単位で構成された平均分子量２０８３０００のグルコマンナンが含まれている。
【００１１】
ヒメマツタケの培養濾液から本発明のグルコマンナンを分離する場合には、培養濾液を濃縮し、その濃縮液をアルコール沈澱して、沈澱物を得る。以下この沈澱物を前記と同様に処理して、式１で示される繰返し単位で構成されたβ−１，２結合のマンノース鎖を主鎖とするグルコマンナンを得る。
【００１２】
かくしてヒメマツタケの培養菌糸体又は培養濾液から分離したグルコマンナンは、ザルコーマ１８０固型癌を移植したＩＣＲ／Ｓｌｃ系マウスに対して顕著な抗腫瘍活性を示す。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の実施形態としては、下記の１）又は２）が好適例として挙げられる。
１）担子菌用の液体培地にヒメマツタケの種菌を接種し、好気条件下に３０℃で１４日間振とう培養して菌糸体を生育させる。培養系を遠心分離して菌糸体を得る。菌糸体に１０倍量の精製水を加え、煮沸下に２時間熱水抽出し、抽出液を得る。抽出液を１／１０に減圧濃縮した後、遠心分離して上澄液を得る。上澄液に等量の９９％エチルアルコールを加えて多糖体を沈澱させ、遠心分離して沈澱物を得た後、凍結乾燥する。凍結乾燥物を硫酸アンモニウムで塩析して、蛋白質画分と非蛋白質画分とに分画する。非蛋白質画分をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ ゲルクロマトグラフィーで分画する。溶出は、ステップワイズ法により、蒸留水、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液、１．０Ｍ塩化ナトリウム水溶液及び２．０Ｍ塩化ナトリウム水溶液を用いて行なう。蒸留水溶出画分、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液溶出画分及び１．０Ｍ塩化ナトリウム水溶液画分に本発明のグルコマンナンが含まれている。
【００１４】
前記の０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液溶出画分をグラジェント法により更にＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ ゲルクロマトグラフィーで繰返し精製して、実質的に単一ピークの精製画分を得る。精製画分には本発明のグルコマンナン、すなわち式１で示される繰返し単位で構成されたβ−１，２結合のマンノース鎖を主鎖とするグルコマンナンが含まれている。かくしてヒメマツタケの培養菌糸体から分離される、式１で示される繰返し単位で構成されたβ−１，２結合のマンノース鎖を主鎖とするグルコマンナン。
【００１５】
２）前記１）のグルコマンナンを有効成分とする抗腫瘍剤。
【００１６】
【実施例】
グルコース２０ｇ、酵母エキス１５ｇ、リン酸水素カリウム１０ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物２ｇ、塩化カルシウム０．１ｇ及び炭酸カルシウム０．４ｇを水１リットルに溶解したｐＨ５．５の液体培地に、ヒメマツタケの種菌を接種し、好気条件下に、３０℃で１４日間振とう培養し、菌糸体を生育させた。培養系を遠心分離して菌糸体を得た。菌糸体に１０倍量の精製水を加え、１００℃で２時間、撹拌しつつ煮沸下に熱水抽出し、抽出液を得た。抽出液を１／１０に減圧濃縮し、冷却した後、遠心分離して上澄液を得た。上澄液に等量の９９％エチルアルコールを加えて多糖体を沈澱させ、遠心分離して沈澱物を得た後、凍結乾燥した。凍結乾燥物の水溶液を硫酸アンモニウムで塩析し、蛋白質画分と非蛋白質画分とに分画した。凍結乾燥物に対する各画分の回収率は１８．０％、６６．４％であった。
【００１７】
ＩＣＲ／Ｓｌｃマウス腹腔内で継代されているサルコーマ１８０腹水癌を腋窩部皮下に移植し、移植２４時間後より、前記の蛋白質画分と非蛋白質画分とを、マウスの体重１kg当たり１０mgの割合で腹腔内に投与した。投与回数は１日に１回の割で１０日間とした。移植４週後に腫瘍の直径を測定し、それを対照群と比較して腫瘍抑制率を算出した。また移植５週後に腫瘍完全消失率と死亡率とを調べた。結果を表１に示した。
【００１８】
【表１】
【００１９】
表１において、
腫瘍抑制率：投与群の腫瘍体積をＴとし、対照群の腫瘍体積をＣとした場合の（１−Ｔ／Ｃ）×１００で示した。
腫瘍完全消失率：試験に供したマウスの数に対する腫瘍が完全に消失したマウスの数で示した。
死亡率：試験に供したマウスの数に対する死亡したマウスの数で示した。
これらは以下同じ。
【００２０】
強い抗腫瘍活性が認められた前記の非蛋白質画分をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ ゲルクロマトグラフィーで分画した。溶出は、ステップワイズ法により、蒸留水、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液、１．０Ｍ塩化ナトリウム水溶液、２．０Ｍ塩化ナトリウム水溶液を用いて行なった。非蛋白質画分に対する各溶出画分の回収率は１２．５％、７０．８％、３．８％、２．８％、０．７％であった。
【００２１】
ＩＣＲ／Ｓｌｃマウス腹腔内で継代されているサルコーマ１８０腹水癌を腋窩部皮下に移植し、移植２４時間後より、前記の各溶出画分を、マウスの体重１kg当たり１０mgの割合で腹腔内に投与した。投与回数は１日に１回の割で１０日間とした。移植３週後に腫瘍体積を求め、それを対照群と比較して腫瘍抑制率を算出した。また移植５週後に腫瘍完全消失率を調べた。結果を表２に示した。
【００２２】
【表２】
【００２３】
表２において、
ＦＡ−１ａ：蒸留水溶出画分
ＦＡ−１ｂ：０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液溶出画分
ＦＡ−１ｃ：１．０Ｍ塩化ナトリウム水溶液溶出画分
＊：対照群と比較して０．０５％の危険率で有意差のあることを示す
【００２４】
特に強い抗腫瘍活性が認められた０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液溶出画分をグラジェント法により更にＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ ゲルクロマトグラフィーで繰返し精製して、実質的に単一ピークの精製画分を得た。精製画分の平均分子量は２０８３０００であった。精製画分を箱守法により完全メチル化した後、完全加水分解を行ない、アルジトール化及びアセチル化して、ＧＣ／ＭＳに供したところ、ガスクロマトグラム上に主要な四つのピーク（Ｎｏ．１，Ｎｏ．２，Ｎｏ．４及びＮｏ．９）が検出された。これらのピークの表３に記載したマススペクトル及び表４に記載したガスクロマトグラム上の相対的保持時間から、これらのピーク（部分メチル化糖のアルジトールアセテート）は、それぞれ１−アセチル−２，３，４，６−テトラメチル−グルシトール、１，２−ジアセチル−３，４，６−トリメチル−マンニトール、１，３−ジアセチル−２，４，６−トリメチル−グルシトール及び１，２，６−トリアセチル−３，４−ジメチル−マンニトールと同定された。
【００２５】
【表３】
【００２６】
【表４】
【００２７】
表３及び表４において、
メチル化糖：部分メチル化糖のアルジトールアセテート
相対的保持時間：ＧＣ（ガスクロマトグラム）において、ピークＮｏ．１の保持時間（分）を１としたときの各ピークＮｏ．の相対的保持時間
モル比：ＧＣ（ガスクロマトグラム）において、ピークＮｏ．１の面積を１としたときの各ピークＮｏ．の面積比
【００２８】
表３及び表４の結果から、精製された多糖体はグルコースとマンノースから構成されており、Ｃ−１置換グルコース、Ｃ−１とＣ−３置換グルコース、Ｃ−１とＣ−２置換マンノース、Ｃ−１，Ｃ−２及びＣ−６置換マンノースが、それぞれほぼ１：１：１：１の割合で構成されている構造骨格をもっていることが明らかになった。このことから式１に示した構造を有する繰返し単位の存在が解析された。
【００２９】
式１において、１，２結合のマンノース、１，６結合のグルコース及び１，３結合のグルコースについて、各結合様式がα又はβのいずれの結合様式をとっているかを確認するため、前記の精製画分を13Ｃ−ＮＭＲに供した。13Ｃ−ＮＭＲスペクトルの各シグナル面積比は２：１：１で現れ、１０５．０１４７ｐｐｍのシグナルはβ−１，２結合マンノースのＣ−１に、また１０３．３６８２ｐｐｍのシグナルはβ−１，３結合グルコースのＣ−１に、更に１０１．０４６５ｐｐｍのシグナルはグルコースからマンノースへβ−１，６結合したグルコースＣ−１に帰属された。これらの結果から、式１で示されるマンノース相互間の結合様式、マンノースとグルコースとの間の結合様式及びグルコース相互間の結合様式はいずれもβ結合であると解析された。
【００３０】
尚、ＩＣＲ／Ｓｌｃ系の雄性マウス（５週）及びウイスター系の雄性ラットの腹腔内又は経口投与による急性毒性試験（１週間観察）において、本発明のグルコマンナンはいずれも１０００mg／kgで死亡率は０／６であり、飼料摂取量、体重増加量、尿検査、血液検査結果及び相対的臓器重量比等、対照群との間に統計学的有意差は認められなかった。
【００３１】
【発明の効果】
既に明らかなように、ヒメマツタケの培養菌糸体又は培養濾液から分離される本発明の新規のグルコマンナンには強い抗腫瘍活性を示すという効果がある。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ハラタケ属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）のきのこであるヒメマツタケ（Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｌａｚｅｉ）、通称カワリハラタケの培養物から分離されるグルコマンナン及びこれを有効成分とする抗腫瘍剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
きのこの培養物から分離される水溶性成分に各種薬理作用のあることが報告されている。ヒメマツタケについては、その子実体から分離される水溶性の酸性多糖体成分、中性多糖体成分及び蛋白多糖体成分に抗腫瘍作用のあることが報告されており（特開平１−６７１９４、特開平１−６７１９５、特開平２−７８６３０）、またその子実体から分離される水溶性の複合成分に肝機能改善作用、抗癌作用及び免疫能低下改善作用のあることが報告されていて（特開平２−１２４８２９、特開平６−１２８１６４、特開平７−２５８１０７）、更にその培養菌糸体や培養濾液から分離される水溶性の多糖体成分に抗腫瘍作用のあることが報告されている（特開昭５５−１０８２９２、特開昭５５−１０８２９３）。ところが、これら従来の報告では、ヒメマツタケ培養物から分離される多種多様の水溶性成分のうちで、何が薬理作用を示す本体であるのか、特に抗腫瘍作用を示す本体であるのか、明らかにされていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明が解決しようとする課題は、ヒメマツタケ培養物から分離される多種多様の水溶性成分のうちで、何が強い抗腫瘍作用を示すのかを解明し、よってより有効な抗腫瘍剤を提供する処にある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
しかして本発明者らは、上記課題を解決するべく研究した結果、ヒメマツタケ培養物から分離される多種多様の水溶性成分のうちで、強い抗腫瘍作用を示すものは、ヒメマツタケの培養菌糸体又は培養濾液から分離される特定構造のグルコマンナンであることを知見した。
【０００５】
すなわち本発明は、ヒメマツタケの培養菌糸体又は培養濾液から分離される、下記の式１で示される繰返し単位で構成されたβ−１，２結合のマンノース鎖を主鎖とするグルコマンナンと、このグルコマンナンを有効成分とする抗腫瘍剤とに係る。
【０００６】
【式１】
式１において、
Ｇｌｃ：グルコース残基
Ｍａｎ：マンノース残基
【０００８】
本発明では、ヒメマツタケの培養菌糸体又は培養濾液を用いる。これらは、担子菌の培養に通常用いられる固体培養法又は液体培養法で得ることができるが、操作の便宜上、液体培養法で得るのが好ましい。例えば、グルコール、サッカロース、マルトース等の炭素源、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム等の窒素源、麦芽エキス、酵母エキス、コーンステイプリカ等の天然複合栄養源、リン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩等の無機塩及びその他の微量元素からなるｐＨ６．０前後に調整した通常の殺菌済み液体培地に、ヒメマツタケの種菌を接種し、温度３０℃前後で１０〜２５日間程度、雑菌汚染を防止しつつ好気条件下に振とう培養又は通気撹拌培養すると、菌糸体が生育するので、この段階で培養系を遠心分離又は濾過することによりヒメマツタケの培養菌糸体と培養濾液とを得ることができる。
【０００９】
本発明のグルコマンナンは前記のようなヒメマツタケの培養菌糸体又は培養濾液から分離される水溶性多糖体である。詳しくは後述するが、ヒメマツタケの培養菌糸体からは、次のようにして本発明のグルコマンナンを分離できる。先ず、ヒメマツタケの培養菌糸体の乾燥物を熱水抽出し、抽出液を得る。この抽出液を濃縮し、その濃縮液をアルコール沈澱して、沈澱物を得る。この沈澱物の水溶液を塩析により除蛋白し、非蛋白質画分を得る。次に、この非蛋白質画分をステップワイズ法によりイオン交換クロマトグラフィーで分画し、水溶出画分、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液溶出画分及び１．０Ｍ塩化ナトリウム水溶液溶出画分を得る。これらの溶出画分の主要多糖体を箱守法により完全メチル化した後、完全加水分解を行ない、アルジトール化及びアセチル化して、ＧＣ／ＭＳで解析し、併せて13Ｃ−ＮＭＲで解析すると、β−１，２結合のマンノース鎖を主鎖とする数平均分子量１０万〜２５０万（ＧＰＣ法、プルラン換算、以下同じ）のグルコマンナンが含まれている。
【００１０】
また前記０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液溶出画分をグラジェント法により更にイオン交換クロマトグラフィー及びゲルクロマトグラフィーで繰返し精製して、実質的に単一ピークの精製画分を得る。この精製画分には、これを上記と同様にＧＣ／ＭＳで解析し、併せて13Ｃ−ＮＭＲで解析すると、式１で示される繰返し単位で構成された平均分子量２０８３０００のグルコマンナンが含まれている。
【００１１】
ヒメマツタケの培養濾液から本発明のグルコマンナンを分離する場合には、培養濾液を濃縮し、その濃縮液をアルコール沈澱して、沈澱物を得る。以下この沈澱物を前記と同様に処理して、式１で示される繰返し単位で構成されたβ−１，２結合のマンノース鎖を主鎖とするグルコマンナンを得る。
【００１２】
かくしてヒメマツタケの培養菌糸体又は培養濾液から分離したグルコマンナンは、ザルコーマ１８０固型癌を移植したＩＣＲ／Ｓｌｃ系マウスに対して顕著な抗腫瘍活性を示す。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の実施形態としては、下記の１）又は２）が好適例として挙げられる。
１）担子菌用の液体培地にヒメマツタケの種菌を接種し、好気条件下に３０℃で１４日間振とう培養して菌糸体を生育させる。培養系を遠心分離して菌糸体を得る。菌糸体に１０倍量の精製水を加え、煮沸下に２時間熱水抽出し、抽出液を得る。抽出液を１／１０に減圧濃縮した後、遠心分離して上澄液を得る。上澄液に等量の９９％エチルアルコールを加えて多糖体を沈澱させ、遠心分離して沈澱物を得た後、凍結乾燥する。凍結乾燥物を硫酸アンモニウムで塩析して、蛋白質画分と非蛋白質画分とに分画する。非蛋白質画分をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ ゲルクロマトグラフィーで分画する。溶出は、ステップワイズ法により、蒸留水、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液、１．０Ｍ塩化ナトリウム水溶液及び２．０Ｍ塩化ナトリウム水溶液を用いて行なう。蒸留水溶出画分、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液溶出画分及び１．０Ｍ塩化ナトリウム水溶液画分に本発明のグルコマンナンが含まれている。
【００１４】
前記の０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液溶出画分をグラジェント法により更にＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ ゲルクロマトグラフィーで繰返し精製して、実質的に単一ピークの精製画分を得る。精製画分には本発明のグルコマンナン、すなわち式１で示される繰返し単位で構成されたβ−１，２結合のマンノース鎖を主鎖とするグルコマンナンが含まれている。かくしてヒメマツタケの培養菌糸体から分離される、式１で示される繰返し単位で構成されたβ−１，２結合のマンノース鎖を主鎖とするグルコマンナン。
【００１５】
２）前記１）のグルコマンナンを有効成分とする抗腫瘍剤。
【００１６】
【実施例】
グルコース２０ｇ、酵母エキス１５ｇ、リン酸水素カリウム１０ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物２ｇ、塩化カルシウム０．１ｇ及び炭酸カルシウム０．４ｇを水１リットルに溶解したｐＨ５．５の液体培地に、ヒメマツタケの種菌を接種し、好気条件下に、３０℃で１４日間振とう培養し、菌糸体を生育させた。培養系を遠心分離して菌糸体を得た。菌糸体に１０倍量の精製水を加え、１００℃で２時間、撹拌しつつ煮沸下に熱水抽出し、抽出液を得た。抽出液を１／１０に減圧濃縮し、冷却した後、遠心分離して上澄液を得た。上澄液に等量の９９％エチルアルコールを加えて多糖体を沈澱させ、遠心分離して沈澱物を得た後、凍結乾燥した。凍結乾燥物の水溶液を硫酸アンモニウムで塩析し、蛋白質画分と非蛋白質画分とに分画した。凍結乾燥物に対する各画分の回収率は１８．０％、６６．４％であった。
【００１７】
ＩＣＲ／Ｓｌｃマウス腹腔内で継代されているサルコーマ１８０腹水癌を腋窩部皮下に移植し、移植２４時間後より、前記の蛋白質画分と非蛋白質画分とを、マウスの体重１kg当たり１０mgの割合で腹腔内に投与した。投与回数は１日に１回の割で１０日間とした。移植４週後に腫瘍の直径を測定し、それを対照群と比較して腫瘍抑制率を算出した。また移植５週後に腫瘍完全消失率と死亡率とを調べた。結果を表１に示した。
【００１８】
【表１】
表１において、
腫瘍抑制率：投与群の腫瘍体積をＴとし、対照群の腫瘍体積をＣとした場合の（１−Ｔ／Ｃ）×１００で示した。
腫瘍完全消失率：試験に供したマウスの数に対する腫瘍が完全に消失したマウスの数で示した。
死亡率：試験に供したマウスの数に対する死亡したマウスの数で示した。
これらは以下同じ。
【００２０】
強い抗腫瘍活性が認められた前記の非蛋白質画分をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ ゲルクロマトグラフィーで分画した。溶出は、ステップワイズ法により、蒸留水、０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液、１．０Ｍ塩化ナトリウム水溶液、２．０Ｍ塩化ナトリウム水溶液を用いて行なった。非蛋白質画分に対する各溶出画分の回収率は１２．５％、７０．８％、３．８％、２．８％、０．７％であった。
【００２１】
ＩＣＲ／Ｓｌｃマウス腹腔内で継代されているサルコーマ１８０腹水癌を腋窩部皮下に移植し、移植２４時間後より、前記の各溶出画分を、マウスの体重１kg当たり１０mgの割合で腹腔内に投与した。投与回数は１日に１回の割で１０日間とした。移植３週後に腫瘍体積を求め、それを対照群と比較して腫瘍抑制率を算出した。また移植５週後に腫瘍完全消失率を調べた。結果を表２に示した。
【００２２】
【表２】
表２において、
ＦＡ−１ａ：蒸留水溶出画分
ＦＡ−１ｂ：０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液溶出画分
ＦＡ−１ｃ：１．０Ｍ塩化ナトリウム水溶液溶出画分
＊：対照群と比較して０．０５％の危険率で有意差のあることを示す
【００２４】
特に強い抗腫瘍活性が認められた０．５Ｍ塩化ナトリウム水溶液溶出画分をグラジェント法により更にＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ ゲルクロマトグラフィーで繰返し精製して、実質的に単一ピークの精製画分を得た。精製画分の平均分子量は２０８３０００であった。精製画分を箱守法により完全メチル化した後、完全加水分解を行ない、アルジトール化及びアセチル化して、ＧＣ／ＭＳに供したところ、ガスクロマトグラム上に主要な四つのピーク（Ｎｏ．１，Ｎｏ．２，Ｎｏ．４及びＮｏ．９）が検出された。これらのピークの表３に記載したマススペクトル及び表４に記載したガスクロマトグラム上の相対的保持時間から、これらのピーク（部分メチル化糖のアルジトールアセテート）は、それぞれ１−アセチル−２，３，４，６−テトラメチル−グルシトール、１，２−ジアセチル−３，４，６−トリメチル−マンニトール、１，３−ジアセチル−２，４，６−トリメチル−グルシトール及び１，２，６−トリアセチル−３，４−ジメチル−マンニトールと同定された。
【００２５】
【表３】
【表４】
表３及び表４において、
メチル化糖：部分メチル化糖のアルジトールアセテート
相対的保持時間：ＧＣ（ガスクロマトグラム）において、ピークＮｏ．１の保持時間（分）を１としたときの各ピークＮｏ．の相対的保持時間
モル比：ＧＣ（ガスクロマトグラム）において、ピークＮｏ．１の面積を１としたときの各ピークＮｏ．の面積比
【００２８】
表３及び表４の結果から、精製された多糖体はグルコースとマンノースから構成されており、Ｃ−１置換グルコース、Ｃ−１とＣ−３置換グルコース、Ｃ−１とＣ−２置換マンノース、Ｃ−１，Ｃ−２及びＣ−６置換マンノースが、それぞれほぼ１：１：１：１の割合で構成されている構造骨格をもっていることが明らかになった。このことから式１に示した構造を有する繰返し単位の存在が解析された。
【００２９】
式１において、１，２結合のマンノース、１，６結合のグルコース及び１，３結合のグルコースについて、各結合様式がα又はβのいずれの結合様式をとっているかを確認するため、前記の精製画分を13Ｃ−ＮＭＲに供した。13Ｃ−ＮＭＲスペクトルの各シグナル面積比は２：１：１で現れ、１０５．０１４７ｐｐｍのシグナルはβ−１，２結合マンノースのＣ−１に、また１０３．３６８２ｐｐｍのシグナルはβ−１，３結合グルコースのＣ−１に、更に１０１．０４６５ｐｐｍのシグナルはグルコースからマンノースへβ−１，６結合したグルコースＣ−１に帰属された。これらの結果から、式１で示されるマンノース相互間の結合様式、マンノースとグルコースとの間の結合様式及びグルコース相互間の結合様式はいずれもβ結合であると解析された。
【００３０】
尚、ＩＣＲ／Ｓｌｃ系の雄性マウス（５週）及びウイスター系の雄性ラットの腹腔内又は経口投与による急性毒性試験（１週間観察）において、本発明のグルコマンナンはいずれも１０００mg／kgで死亡率は０／６であり、飼料摂取量、体重増加量、尿検査、血液検査結果及び相対的臓器重量比等、対照群との間に統計学的有意差は認められなかった。
【００３１】
【発明の効果】
既に明らかなように、ヒメマツタケの培養菌糸体又は培養濾液から分離される本発明の新規のグルコマンナンには強い抗腫瘍活性を示すという効果がある。
Claims (2)
- ヒメマツタケの培養菌糸体又は培養濾液から分離される、下記の式１で示される繰返し単位で構成されたβ−１，２結合のマンノース鎖を主鎖とするグルコマンナン。
【式１】
（式１において、
Ｇｌｃ：グルコース残基
Ｍａｎ：マンノース残基） - 請求項１記載のグルコマンナンを有効成分とする抗腫瘍剤。
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